CN103439516A - HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，本发明采用免疫组化方法检测HNF4α蛋白在肝癌组织中的表达量，能够判断肝癌患者出现远处转移的风险及术后状况。本发明提供了HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。本发明用HNF4α蛋白作为判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝细胞癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种HNF4α蛋白的应用，具体地说，涉及HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。
背景技术
肝癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率长期居高不下。我国是世界上肝癌发病最多的国家，每年新发病例约占全球50%。统计资料表明，肝癌术后高复发转移率（5年复发率达70％，小肝癌也达50％）已成为进一步提高远期疗效的瓶颈，肝癌预后判断指标匮乏。
肝癌转移是一个多因素参与并相互作用的复杂过程，既关乎癌细胞本身、又与癌细胞同癌周微环境及宿主免疫状态的相互作用有关。在肝癌中显著升高或降低的数百种基因和/或蛋白中，至少有20余种基因和/或蛋白的表达目前被确定与肝癌的转移相关，但这些基因和/或蛋白的敏感性及特异性尚难以满足临床预测要求。
本领域迫切需要寻找能预测肝癌病情及预后的相关基因和/或蛋白，这方面的研究对临床治疗肝癌及预防肝癌复发具有重要意义。
HNF4α蛋白(hepatocyte nuclear factor4α,HNF4α，GeneID:3172)。肝细胞核因子4（hepatocyte nuclear factor4,HNF4α）是一种属于细胞核激素受体家族的转录因子，在分化成熟的肝细胞中高表达，其中HNF4α是HNF4的重要亚型。HNF4α参与维护肝细胞脂肪代谢、白蛋白合成、药物解毒、能量代谢、胆汁酸合成等重要功能，也是维持肝细胞上皮表型的重要基因。对肝癌研究发现，肝癌去分化状态伴随大量肝细胞核因子表达下调，其中HNF4α表达下调是肝癌发生的重要环节。（参见文献：Odom DT,et al.Control of pancreas and livergene expression by HNF transcription factors.Science2004;303:1378-1381.Beifang Ning,et al.Hepatocyte nuclear factors4αprevents the development ofhepatocellular carcinoma.Cancer Research2010:70(5):7640-7651）目前为止，肝癌转移的分子机制仍不清楚，有效的治疗靶点和预后标志物也十分有限。
目前还未见HNF4α可调控肝癌转移并用于肝癌病人预后判定的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供HNF4α蛋白的新应用，特别是在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测HNF4α蛋白在肝癌组织中的表达量，能够判断肝癌患者出现远处转移的风险及术后状况。基于HNF4α蛋白的表达量与肝细胞癌的这种相关性，以该蛋白作为分子标记对其表达量进行检测可以用于指导肝癌病人的预后判断。
本发明提供了HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，该应用是指将HNF4α蛋白作为分子标记，利用HNF4α单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，分析HNF4α蛋白在肝癌组织中的表达量。
所述的HNF4α单克隆抗体为商品化抗体，（制备方法参见文献YokoyamaWM,et al.2001.Production of Monoclonal Antibodies.Current Protocols inImmunology.74:2.5.1-2.5.25.）相应的，利用特异性抗HNF4α蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，用于制备确定肝癌手术预后的制剂或试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
本发明还提供了使用上述试剂盒用于体外检测HNF4α蛋白在肝癌组织中的表达量的方法，该方法包括以下步骤：
（a）利用本试剂盒中的二甲苯，乙醇，3%H2O2溶液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG将肝癌组织切片进行免疫组化染色；
（b）利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；
（c）利用生物图像处理软件分析肿瘤中阳性信号强度，给出评分。
所述的该方法具体步骤如下：
(1)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜；
(2)切片脱腊至水；
（二甲苯Ⅰ①10min→二甲苯Ⅱ②10min→二甲苯Ⅲ③10min→100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→双蒸水5min）
(3)3%H2O2溶液，室温放置20min；
(4)双蒸水洗5min×3；
(5)抗原修复：切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸30min；
(6)自然冷却至室温，双蒸水洗5min×3；
(7)1%BSA封闭30min，37℃；
(8)甩去封闭液，不洗，直接加一抗（鼠HNF4α单克隆抗体,购自R&D公司，稀释比例1：200）。置入湿盒中4℃冰箱过夜16小时；
(9)4℃取出，室温复温15min，然后0.01M PBS洗5min×4；
(10)滴加二抗（辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，购自丹麦DAKO公司，即用型，无需稀释）45min，37℃；
(11)0.01M PBS洗5min×4，DAB显色2-10min，镜下观察；
(12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
(13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
(14)脱水透明，盖玻片覆盖；
(15)显微镜下观察阳性染色，于肝癌组织随机选取3个视野并拍照；
(16)采用Image Scope（Aperio公司）软件对组织样本进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count)程序对每个样本进行“阳性Pixel”计算，获得计算数据如下表：
每个组织的组化评分计算方法为Log10[255/Iavg]，其中其中Iavg=(Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即平均强度，计算方法：平均强度=（弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度）/（弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量），即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。
HNF4α高低表达标准以429例肝癌组织中HNF4α表达评分的中位数（0.24）为界；当Image Scope评分高于0.24为HNF4α蛋白高表达，低于0.24为HNF4α蛋白低表达。
本发明的HNF4α蛋白与肝癌相关性的发现为预测肝细胞癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡提供一条全新的途径，对判断肝细胞癌患者预后具有重要作用，对于肝细胞癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。当Image Scope评分低于0.24时，肝细胞癌易出现复发或远处转移，肝癌患者术后易死亡。
本发明利用免疫组化技术、显微镜拍照和计算机图像处理软件测定肿瘤组织中HNF4α蛋白的表达量，并结合术后随访信息，确定HNF4α蛋白表达量与手术后肝细胞癌患者预后存在相关性，HNF4α蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝细胞癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。
附图说明
图1为HNF4α体外抑制肝癌细胞转移。
图2为HNF4α体内抑制肝癌细胞转移。
图3为依据HNF4α表达高低将肝癌患者分组的3年无瘤生存曲线图。
图4为依据HNF4α表达高低将肝癌患者分组的3年总生存曲线图。
图5为HNF4α在肝癌组织中免疫组化染色结果图，可见肿瘤组织中HNF4α着色相对较弱。
图6为HNF4α在肝癌组织中免疫组化染色结果图，可见肿瘤组织中阳性着色相对较弱。
图7为HNF4α在肝癌组织中免疫组化染色结果图，可见肿瘤组织中HNF4α着色相对较强。
图8为HNF4α在肝癌组织中免疫组化染色结果图，可见肿瘤组织中HNF4α着色相对较强。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
2×104过表达HNF4α的SMMC-7721肝癌细胞和过表达GFP的对照细胞分别接种于聚碳酸酯膜小室(Corning公司产品)的上层，培养24小时后用结晶紫将穿过聚碳酸酯膜的细胞染色后，在显微镜下观察并照相，分别记数每个视野穿过聚碳酸酯膜的肝癌细胞，求平均值并计算标准差。结果显示，与对照细胞相比较，HNF4α高表达的肝癌细胞体外迁移能力显著下降（图1），提示HNF4α可能抑制肝癌细胞转移。
实施例2：
44只8周龄的裸鼠分别经尾静脉注射2×106稳定表达萤光素酶的SMMC-7721肝癌细胞后，分成实验组和对照组（每组22只）。实验组每周经尾静脉注射过表达HNF4α的腺病毒，对照组小鼠注射过表达GFP的腺病毒，连续注射6周。自接种细胞约11周后，向小鼠腹腔注射萤光素酶底物，活体成像仪下观察肝癌转移情况。处死的小鼠取肺脏观察并照相，计算转移灶的数量并测量体积（图2）。结果显示HNF4α可显著抑制肝癌细胞体内转移。
实施例3：
随机选取429例肝癌患者术后肝癌组织的石蜡切片(肝癌组织切片均来自东方肝胆外科医院，由2名病理科医生确诊为肝细胞癌)，采用免疫组化方法检测HNF4α蛋白在肝癌组织中的表达量并计算免疫组化评分，具体步骤如下：
(1)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜；
(2)切片脱腊至水；
（二甲苯Ⅰ①10min→二甲苯Ⅱ②10min→二甲苯Ⅲ③10min→100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→双蒸水5min）
(3)3%H2O2溶液，室温放置20min；
(4)双蒸水洗5min×3；
(5)抗原修复：切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸30min；
(6)自然冷却至室温，双蒸水洗5min×3；
(7)1%BSA封闭30min，37℃；
(8)甩去封闭液，不洗，直接加一抗（1：200）。置入湿盒中,4℃冰箱过夜16小时；
(9)4℃取出，室温复温15min，然后0.01M PBS洗5min×4；
(10)滴加二抗，45min，37℃；
(11)0.01M PBS洗5min×4，DAB显色2-10min，镜下观察；
(12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
(13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
(14)脱水透明，盖玻片覆盖；
(15)显微镜下观察阳性染色，分别于肝癌组织和癌旁组织各随机选取3个视野，拍照；
(16)利用生物图像处理软件Image-Pro plus(Media Cybernetics,Inc.)分析肿瘤和瘤旁组织阳性信号强度，给出评分；具体方法为，采用Image Scope（Aperio公司）软件对组织样本进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count)程序对每个样本进行“阳性Pixel”计算，
每个组织样本的组化评分计算方法为Log10[255/Iavg]，其中每个组织的组化评分计算方法为Log10[255/Iavg]，其中其中Iavg=(Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即平均强度，计算方法：平均强度=（弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度）/（弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量），即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。429例肝癌组织中HNF4α表达评分的中位数（0.24）为界将肝癌患者分组，Image Scope评分高于0.24的患者入高表达组；Image Scope评分低于0.24的患者入低表达组。
绘制3年总生存曲线图（图3）和3年无瘤生存曲线图（图4）。结果表明，肿瘤中HNF4α呈高表达的患者手术后无瘤生存期和总生存期明显长于低表达者。
实施例4：
样本：某肝癌细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测HNF4α蛋白在肝癌组织中的表达量。肝癌组织的显微图片如图5所示。经计算，该组织的Image Scope评分0.12，低于0.24。
经术后随访知，该患者术3.5个月死亡，无瘤生存期仅1.5个月。
实施例5：
样本：某肝癌细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测HNF4α蛋白在肝癌组织中的表达量。肝癌组织的显微图片如图6所示。经计算，该组织的Image Scope评分0.14，低于0.24。
经术后随访知，该患者术9个月死亡，无瘤生存期仅1.5个月。
实施例6：
样本：某肝癌细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测HNF4α蛋白在肝癌组织中的表达量。肝癌组织的显微图片如图7所示。经计算，该组织的Image Scope评分0.36，高于0.24。
经术后随访知，该患者术后健在，无复发。
实施例7：
样本：某肝癌细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测HNF4α蛋白在肝癌组织中的表达量。肝癌组织的显微图片如图8所示。经计算，该组织的Image Scope评分0.49，高于0.24。
经术后随访知，该患者术后健在，无复发。
由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测HNF4α蛋白分子表达量能预测肝细胞癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当免疫组化评分低于0.24时，肝细胞癌易出现远处转移，肝癌患者术后易死亡。显然，HNF4α蛋白与肝细胞癌的转移潜能具有相关性，因此，以HNF4α蛋白作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能预测肝癌手术后复发转移等事件，并判断预后。相应的，特异性抗HNF4α蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，能用于制备确定肝癌手术预后的制剂或试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (6)
1.HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。
2.制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，使用上述试剂盒用于体外检测HNF4α蛋白在肝癌组织中的表达量的方法，该方法包括以下步骤：根据权利要求1所述的HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，该应用是指将HNF4α蛋白作为分子标记，利用HNF4α单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，分析HNF4α蛋白在肝癌组织中的表达量。
3.根据权利要求2所述的HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，其中的免疫组化实验试剂是指二甲苯、乙醇、3%H2O2溶液、1%BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素和辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求2或3所述的HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述的HNF4α单克隆抗体是鼠HNF4α单克隆抗体。
5.根据权利要求2或3所述的HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，该方法包括以下步骤
（a）利用本试剂盒中的二甲苯，乙醇，3%H2O2溶液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG将肝癌组织切片进行免疫组化染色；
（b）利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；
（c）利用生物图像处理软件分析肿瘤中阳性信号强度，给出评分。
6.根据权利要求5所述的HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，当步骤（c）的评分高于0.24为HNF4α蛋白高表达，低于0.24为HNF4α蛋白低表达。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107153116A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-09-12 | 南通大学附属医院 | Fndc3b的用途、诊断肺腺癌的试剂盒及肺组织中fndc3b表达水平的检测方法 |
| CN115305257A (zh) * | 2022-08-19 | 2022-11-08 | 复旦大学附属中山医院 | 一种肝细胞-胆管细胞混合型肝癌小鼠模型及其构建方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101524529A (zh) * | 2008-03-04 | 2009-09-09 | 中国人民解放军第二军医大学 | HNF4α诱导分化治疗人体恶性实体瘤 |
| WO2013025322A2 (en) * | 2011-08-15 | 2013-02-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Marker-based prognostic risk score in liver cancer |
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2013
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101524529A (zh) * | 2008-03-04 | 2009-09-09 | 中国人民解放军第二军医大学 | HNF4α诱导分化治疗人体恶性实体瘤 |
| WO2013025322A2 (en) * | 2011-08-15 | 2013-02-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Marker-based prognostic risk score in liver cancer |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 秦如斋: "EpCAM及HNF4alpha蛋白在肝细胞癌中的表达及其与预后的相关性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库，医药卫生科技辑》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107153116A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-09-12 | 南通大学附属医院 | Fndc3b的用途、诊断肺腺癌的试剂盒及肺组织中fndc3b表达水平的检测方法 |
| CN115305257A (zh) * | 2022-08-19 | 2022-11-08 | 复旦大学附属中山医院 | 一种肝细胞-胆管细胞混合型肝癌小鼠模型及其构建方法 |
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