CN103436512A - 一种通过缺失单个盐键来提高pae比活力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法。利用定点突变技术，通过缺失催化腔附近的单个盐键，本发明提高了PAE的活力，本发明不但对揭示M4家族金属蛋白酶的结构和功能关系具有重要意义，同时，由于很多M4家族蛋白酶是重要的医学、工业用酶，因此本发明对该家族蛋白酶的分子改造研究和相关新产品的开发也具有重要指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程方法提高酶活力技术领域，特别是涉及一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法。
背景技术
蛋白酶（peptidase, proteases, proteinases或proteolytic enzymes）是一类可催化蛋白质或肽类肽键水解的酶类。
弹性蛋白（elastin）在动物组织中广泛存在，如富有弹性的组织、肺、大动脉、某些韧带、皮肤及耳部软骨等。弹性蛋白由多条弹性蛋白原（tropoelastin）多肽链以共价交联方式连接而成（Yeo et al., 2011），具有非常稳定的结构，而且不含常见蛋白酶识别的氨基酸和酶切位点，使得弹性蛋白只能被弹性蛋白酶分解。能够水解弹性蛋白的蛋白酶称为弹性蛋白酶（elastase）。
按照来源分，弹性蛋白酶可分为微生物弹性蛋白酶和动物弹性蛋白酶。其中，哺乳动物弹性蛋白酶主要存在于动物的胰腺和吞噬细胞中（Horwitz et al., 1999; Mason et al., 1986; Bode et al., 1989; Antonicelli et al., 2007）。研究比较多的细菌来源的弹性蛋白酶有金属蛋白酶M4家族的PAE/pseudolysin (Morihara and Homma,1985)和vibriolysin（Lutfullah et al., 2008）、M9家族的MAP1 peptidase(Dumont et al., 1994)、M12家族的myroilysin(Chen et al., 2009a)、M23家族的staphylolysin（Kessler and Ohman, 2004b）和丝氨酸蛋白酶S8家族的A1p1（Behnsen et al., 2010）等。
弹性蛋白酶在医学、食品学和日用化学上有着广泛应用。在医药方面主要作为治疗药物：（1）治疗高脂血症，（2）防治动脉粥样硬化，（3）抑制脂肪肝发展，（4）治疗慢性气管炎及其它结缔组织纤维增生性疾病，（5）外用于消除皮肤焦痂、碎屑，用于烧伤患者的治疗以及皮肤溃疡、口腔溃疡等症。在食品工业方面常用于对动物难以处理和食用的韧带、大动脉血管、筋腱等蛋白质废料进行加工。日用化学工业方面，弹性蛋白酶主要用于疗效化妆品的生产。
PAE （Pseudomonas aeruginosa Elastase, pseudolysin）是革兰氏阴性机会致病菌铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）分泌的一种胞外弹性蛋白酶，可以降解酪蛋白、血红蛋白、卵清蛋白、纤维蛋白等。在底物特异性方面，PAE倾向降解P1’位为疏水或芳香族氨基酸的肽键（Morihara 1995; Morihara et al., 1965）。目前，已经商品化的PA来源的PAE售价昂贵，EPC公司（Elastin Products Company Inc.）每0.1 mg PAE售价183美元（PE961，https://www.elastin.com/storefront/tabid/58/c/Metalloproteinases/CategoryID/19/Default.aspx），Merck公司每0.1mg PAE售价4500元人民币（324676-100UG，http://www.millipore.com/catalogue/item/324676-100ug）。PAE能够在原核细胞和真核细胞中异源表达并且重组酶有酶活（Ogino,H. et al., 2000; Lin et al., 2009）。我们前期研究表明将构建好的含lasB基因的表达载体转化至E.coli BL21(DE3)中， 1 L培养物细胞经超声破碎和柱层析纯化后，可获得纯酶4.5 mg，总酶活285984个酶活单位（酶活力定义为60 ??C，每分钟催化酪蛋白水解生成1 μg 酪氨酸的酶量为1个单位U）（Xie et al., 2009）。
作为PA分泌的主要胞外内切蛋白酶以及它本身的降解宿主蛋白的能力，PAE可以用作模式蛋白来生产特殊的蛋白酶抑制剂，用于疾病治疗(Jan Potempa and Robert N. Pike, 2009；Maciej Sataga et al., 2013)。PAE具有在有机溶剂中仍能保持高活性和热稳定性的特性使得其在工业催化方面具有巨大的应用潜力。Ogino通过构建Cys30-Cys58、Cys270-Cys297 二硫键缺失的PAE突变体证实了Cys30-Cys58二硫键对维持PAE在有机溶剂中的热稳定性有重要意义（Ogino H. et al., 2001），Lousa,D.利用分子动力学模拟验证了上述结论（Lousa,D. et al., 2012）。将PAE的114位Tyr突变为Phe使得突变体在有机溶剂环境中催化合成阿巴斯甜前体时具有与thermolysin相同的活力，而将Tyr突变为Ser和Arg后这种活力提高得更明显（Ogino et al., 2010）。利用定点突变技术研究PAE的活性和稳定性的研究主要集中在上述文献中。
Thermolysin与PAE同为金属蛋白酶M4家族的蛋白酶，两者不仅序列相似性很高，而且具有几乎完全一致的三维结构（Holmes and Matthews,1982; Thayer et al., 1991）：N 端结构域主要由反向β-片层构成，C 端结构域由α-螺旋组成，两个结构域之间有一个催化腔，结合Zn 的残基与结合底物的残基都位于催化腔内壁上（图1）。利用定点突变技术对thermolysin的活性和热稳定性进行研究的例子非常多。例如，thermolysin N端结构域G8C/N60C/S65C三个位点的同时突变使得突变体中结合Ca的残基与Ca的亲和力增强而导致突变体的热稳定性增强（Kawasaki Y. et al., 2013; Yasukawa K. and Inouye K., 2007）。Thermolysin N端结构域中连接2个反向β-片层的Asn116-Gly117转角中的Asn残基对稳定thermolysin的β发卡结构至关重要，Asn突变为Asp后导致thermolysin突变体活性提高同时热稳定性降低（Menach E. et al., 2012）。在前期研究单点突变（L144S，D150E，I168A）提高thermolysin的活性和单点突变（S53D，L155A）提高thermolysin稳定性的基础上，Kusano M （2010）研究了双突和三突产生的突变体的活性和稳定性的变化，发现L144S/D150E突变体活性最高，S53D/L155A突变体热稳定性最好，L144S/D150E/ S53D突变体的活性和热稳定性都提高了，这些多突变体的效果是单突的叠加（Kusano M. et al., 2010）。通过对thermolysin活性中心附近的几个结构域，包括N端β片层、2个α-螺旋和C端2个loop上氨基酸残基的单点突变，Kusano M.等揭示了N端β片层和2个α-螺旋对thermolysin的催化至关重要，而C端2个loop负责了酶对底物的识别（Kusano M. et al., 2009）。通过将thermolysin中的Ser残基突变为Asp来向thermolysin引入负电荷，研究发现在高盐条件下大多数突变体的催化效率k cat /k m 提高了，在10 mM CaCl2条件下两个突变体S53D和S65D的热稳定性也有所提高（Takita T. et al., 2008）。将thermolysin的一个自溶位点Gly154-Leu155中的Leu155分别突变为Ala/Ser/Phe/Gly后，各突变体的热稳定性都有所提高，但同时产生了新的自溶位点（Matsumiya Y. et al., 2004）。
前期生化实验、分子动力学模拟和计算分析表明，盐键的差异很可能是PAE与同源酶之间热稳定性差异的主要原因（Xie et al., 2009）。但结合文献发现，目前对PAE的活性和热稳定性的研究很少，对M4家族中研究更深入的模式蛋白酶thermolysin的活性和热稳定性的研究也并未把盐键的作用深入分析。
发明内容
针对上述PAE的研究现状，本发明提供了一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法。利用定点突变技术，通过缺失催化腔附近的单个盐键，本发明提高了PAE的活力，对形成盐键2（Asp189－Arg179）的Asp189定点突变为Ala，构建突变体D189A，在E.coli中异源表达并测得D189A仍具有蛋白酶活力。将D189A利用DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析分离纯化，获得了电泳纯的重组酶。Folin-酚法测定D189A和PAE水解酪蛋白的酶活，在60 ??C条件下D189A比PAE的比活力提高了30%。本发明不但对揭示M4家族金属蛋白酶的结构和功能关系具有重要意义，同时，由于很多M4家族蛋白酶是重要的医学、工业用酶，因此本发明对该家族蛋白酶的分子改造研究和相关新产品的开发也具有重要指导意义。
本发明的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法技术方案为，通过缺失催化腔附近的单个盐键，提高PAE的比活力。
如说明书附图图1所示，PAE中含有6个盐键（残基正负电荷间距离小于4 ??，不考虑His形成的盐键）。将PAE与同源蛋白进行序列比对分析表明，盐键1、2和6是保守存在的，说明这些盐键对维持PAE的活性起重要作用。PAE中的6个盐键分属两个区域，盐键1-3位于催化腔附近，盐键4-6位于C端结构域的C末端。催化腔附近的3个盐键都位于稳定性很差的loop区或相邻区域。
形成盐键1-3的氨基酸在PAE一维序列中的位置（盐键1：Asp168-Arg198；盐键2：Asp189-Arg179；盐键3：Asp201-Arg205）如下：
将形成盐键2的Asp189-Arg179中的Asp189进行定点突变，提高PAE比活力。
将形成盐键2的Asp189-Arg179中的Asp189定点突变为Ala，构建突变体D189A。
突变体D189A的引物：
两端引物：
正向引物：GCTTGGACCATATGAAGAAGGTTTCTACGCTTGACC，划横线部分表示Nde I酶切位点；
反向引物：CGCGCTCGAGTTACAACGCGCTCGGGCAG，划横线部分表示Xho I酶切位点；
D189A中间引物：
3’ 端引物：TTCCTGATCGGCTACGCGATCAAGAAGGGCAGCG
5’ 端引物：GCCCTTCTTGATCGCGTAGCCGATCAGGAAGTCGTTC。
突变体的原核表达为：
①以含Nde I酶切位点的正向引物和突变体中间引物的3’引物为两端引物，以lasB质粒为模板，扩增产物标为Ⅰ；以含Xho I酶切位点的反向引物和突变体中间引物的5’引物为两端引物，以lasB质粒为模板，扩增产物标为Ⅱ；
②回收Ⅰ和Ⅱ，通过PCR 反应程序，将Ⅰ基因和Ⅱ 基因相互融合；
③最后再加入两侧正、反向引物通过PCR反应程序，得到突变体基因。
有酶活突变体的筛选：
①利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，EB染色，切取目的片段大小的DNA，回收DNA；
②DNA用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切，连接同样酶切过的pET-22b表达载体；
③连接产物转化E. coli DH5α；
④从转化平板上挑取转化子至液体LB培养基中培养，利用提质粒酶切验证的方法筛选携带目的基因的转化子；
⑤将测序正确的含目的基因的质粒转化E. coli BL21(DE3)；
⑥从平板上挑取转化子单菌落到试管中，37??C 过夜培养后按1%接种量转接到三角瓶中，37??C 培养至OD600 ＝1.0 左右加入终浓度1 mM 的IPTG 继续培养过夜；
⑦发酵液离心收集菌体，菌体用三蒸水洗涤3遍以上后用50 mM,pH 8.0的Tris-HCl 缓冲液重悬，超声破碎至菌液澄清，超声完毕后离心，上清在30??C 保温2 h；
⑧用Folin－酚法测粗酶液酶活。
步骤⑦发酵液离心收集菌体，超声破碎条件为：功率300 w，超声5 s，间隔10 s，超声10 次。
重组酶分离纯化：
①按1%接种量扩大培养含各突变体质粒的E. coli BL21(DE3)，当菌浓OD600=1.0时，添加终浓度1 mM IPTG，在37??C，160-180 rpm诱导12 h；
②发酵液离心收集菌体，用50 mM,pH 8.0的Tris-HCl 缓冲液重溶菌体，超声破碎；超声完毕后离心，上清在30??C 保温2 h 后用60%硫酸氨沉淀过夜；
③沉淀的蛋白用Tris-HCl 缓冲液重溶、透析，进行DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析分离；
④测各收集管中样品的酶活，酶活高的组分进行SDS-PAGE 分析，收集电泳纯的酶组分混合，装在透析袋里用pH 8.0, 50 mM 的Tris-HCl缓冲液透析后分装。
步骤②发酵液离心收集菌体，超声破碎条件为：功率300 w，超声5 s，间隔10 s，每100 ml 菌体超声30 次。
步骤③DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析柱层析分离前，先用50 mM,pH 9.5的Tris-HCl 缓冲液平衡；洗脱时仍采用相同的缓冲系统，梯度洗脱时NaCl 浓度范围为0-0.5 M；
本发明的有益效果为：如说明书附图图1所示，三维结构（PDB：1EZM）分析表明，PAE中含有6个盐键（残基正负电荷间距离小于4 ??，不考虑His形成的盐键）。将PAE与同源蛋白进行序列比对分析表明，盐键1、2和6是保守存在的，说明这些盐键对维持PAE的活性起重要作用。PAE中的6个盐键分属两个区域，盐键1-3位于催化腔附近，盐键4-6位于C端结构域的C末端。催化腔附近的3个盐键都位于稳定性很差的loop区或相邻区域。盐键1的残基Asp168位于α3上，残基Arg198位于loop上，盐键1把该loop “锚定”到稳定的α3上，因此，对整个区域的稳定性具有很大的贡献。盐键2所在的loop弯成“U”型， Ca 2+离子同时与该“U”型loop底部的残基和α3上的残基形成离子键，把该“U”型loop锚定到α3上从而对PAE三维结构起稳定作用，而盐键2正处在“U”型loop的开口处稳定“U”型结构，从而对整个PAE结构的稳定起作用。
实验结果表明位于PAE催化腔附近的保守盐键1和2对维持PAE的活性非常重要。Asp168-Arg198形成盐键1，无论将盐键1的成键氨基酸中的任何一个氨基酸突变为Ala造成该盐键的缺失，突变体都没有活力。盐键1为维持PAE活力所必须。Asp189－Arg179形成盐键2，Asp189位于loop上，Arg179位于α3上，这两个氨基酸分别突变成Ala造成盐键2的缺失，对PAE的影响是不同的。位于α3上的Arg突变成Ala（R179A），突变体失活；位于loop上的Asp突变成Ala(D189A)，突变体仍具有水解酪蛋白的活力，且在60 ??C的比活力比PAE提高了30%。盐键被认为是稳定PAE结构的重要因素，盐键2缺失后，突变体D189A刚性结构减弱，柔性增强，表现为对底物的催化效率提高。
综上，盐键1为维持PAE活性所必须，缺失该盐键后，突变体失活；盐键2虽是保守盐键，但并非维持PAE活性所必须。缺失盐键2后，突变体D189A 仍具有水解酪蛋白的活力，并且，D189A在最适酶活温度下的比活力比PAE提高30%。
本发明不但对揭示M4家族金属蛋白酶的结构和功能关系具有重要意义，同时，由于很多M4家族蛋白酶是重要的医学、工业用酶，因此本发明对该家族蛋白酶的分子改造研究和相关新产品的开发也具有重要指导意义。
附图说明：
图1所示为PAE结构中的盐键(PDB：1EZM)；
图2所示为为缺失催化中心附近的保守盐键1和2的4个突变体的PCR结果，1为靠近5’的PCR产物，2为靠近3’的PCR产物，3为突变体PCR产物；
图3所示为双酶切筛选携带目的基因的转化子；
图4所示为SDS-PAGE分析盐键缺失突变体的发酵液超声破碎结果，其中，标注+的表示有酶活的突变体；
图5所示为SDS-PAGE分析纯化后的PAE和突变体D189A的纯度 (蛋白浓度0.18 mg/ml)；
图6所示为PAE与D189A酶活曲线比较。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例１
突变体原核表达及有酶活突变体的筛选
如说明书附图图1所示，PAE中含有6个盐键（残基正负电荷间距离小于4 ??，不考虑His形成的盐键）。PAE中的6个盐键分属两个区域，盐键1-3位于催化腔附近，盐键4-6位于C端结构域的C末端。通过丙氨酸扫描定点突变（Alanine scanning mutagenesis）对催化腔附近的2个保守盐键，盐键1和2进行研究。将形成盐键1的Asp168、Arg198，形成盐键2 的Asp189、Arg179分别突变为Ala，构建4个单盐键缺失突变体（D168A、R198A、D189A、R179A），并进行原核表达和重组蛋白酶活力的测定。
(a) 突变体引物设计：
引物设计利用Primer Premier 5.0软件完成。引物在华大基因（BGI）公司合成。
两端引物：
正向引物：GCTTGGACCATATGAAGAAGGTTTCTACGCTTGACC，划横线部分表示Nde I酶切位点。
反向引物：CGCGCTCGAGTTACAACGCGCTCGGGCAG，划横线部分表示Xho I酶切位点。
盐键1突变体引物设计：
D168A中间引物：
3’端引物：AACGAAGCGTTCTCCGCGATGGCCGGCGAGG
5’ 端引物：CTCGCCGGCCATCGCGGAGAACGCTTCGTTCATTCC
R198A中间引物：
3’ 端引物：GGCAGCGGTGCGCTGGCGTACATGGACCAGCCCAG
5’ 端引物：CTGGTCCATGTACGCCAGCGCACCGCTGCCC
盐键2突变体引物设计：
D189A中间引物：
3’ 端引物：TTCCTGATCGGCTACGCGATCAAGAAGGGCAGCG
5’ 端引物：GCCCTTCTTGATCGCGTAGCCGATCAGGAAGTCGTTC
R179A中间引物：
3’ 端引物：GCCGAGTTCTACATGGCGGGCAAGAACGACTTCCTG
5’ 端引物：GTCGTTCTTGCCCGCCATGTAGAACTCGGCAGCCTC
实施例2
上述突变体的原核表达为：
重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR）采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸将不用来源的扩增片段重叠拼接起来。本发明所有突变体DNA片段的构建都采用此方法。
①以含Nde I酶切位点的正向引物和突变体中间引物的3’引物为两端引物，以lasB质粒为模板，扩增产物标为Ⅰ；以含Xho I酶切位点的反向引物和突变体中间引物的5’引物为两端引物，以lasB质粒为模板，扩增产物标为Ⅱ；
②回收Ⅰ和Ⅱ，通过PCR 反应程序：98oC 变性30 sec；98oC 变性10 sec；60oC 退火30 sec；72oC 延伸1 min，7 个循环，72oC 保温7 min，将Ⅰ基因和Ⅱ 基因相互融合；
③最后再加入两侧正、反向引物通过PCR反应程序：98oC 变性30 sec；98 oC 变性10 sec，60oC 退火30 sec，72oC 延伸1 min，30 个循环；98oC 变性10 sec；72oC 延伸1 min；9 个循环，72oC 保温10 min，得到突变体基因。
实施例3
有酶活突变体的筛选：
①利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，EB染色，在紫外灯下用刀片切取目的片段大小的DNA，利用胶回收试剂盒回收DNA；
②DNA用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切，连接同样酶切过的pET-22b表达载体；
③连接产物转化E. coli DH5α，转化方法参照《分子克隆实验指南》（第三版）（上册）（萨姆布鲁克等，2002）；
④从转化平板上挑取转化子至液体LB培养基中培养，利用提质粒酶切验证的方法筛选携带目的基因的转化子；
⑤将测序正确的含目的基因的质粒转化E. coli BL21(DE3)；
⑥从平板上挑取转化子单菌落到5 ml 液体LB 试管中，37??C 过夜培养后按1%接种量转接到新鲜的30 ml 液体LB三角瓶中，37??C 培养至OD600 ＝1.0 左右加入终浓度1 mM 的IPTG 继续培养过夜；
⑦发酵液离心收集菌体，菌体用三蒸水洗涤3遍后用3 ml Tris-HCl 缓冲液（50 mM，pH 8.0）重悬，超声破碎。超声破碎条件为：功率300 w，超声5 s，间隔10 s，超声10 次至菌液澄清。超声完毕后离心，上清在30??C 保温2 h；
⑧用Folin－酚法测粗酶液酶活，以2% 酪蛋白为底物。用50 mM Tris-HCl（pH 7.5）将酶液稀释合适的倍数，取100 μl 稀释好的酶液，加入同样温度的底物100 μl，特定温度下反应10 min 后，加入200 μl 0.4 M 的三氯乙酸终止反应。12,000 rpm 离心1 min，取100 μl 上清液加入500 μl 0.4 M 的碳酸钠，混匀后加入100 μl Folin试剂，混匀后在40 ??C 保温20 min，然后用分光光度计测定660 nm 处的吸光值。标准曲线用不同浓度的酪氨酸来制定。酶活力定义为在一定温度下，每分钟催化酪蛋白水解生成1 μg 酪氨酸的酶量为1个单位（U）。筛选出有酶活的突变体进行后续的酶学性质研究。
实施例2和实施例3中使用载体和菌株：
E. coli DH5α：基因型F - φ80d lacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，endA1，recA1，hsdR17 (rk - ,mk + )，supE44，λ - ，thi -1 ，gyrA96，relA1，phoA，购自TransGen Biotech。
E. coli BL21(DE3)：基因型F - ompT hsdS (rB - mB - ) gal dcm (DE3)，购自TransGen Biotech。
LasB质粒：本实验室保存。
pET-22b（+）载体：Ampr，T7 lac 启动子，5.49 kb，基因表达用载体，购自Novagen。
分子试剂及试剂盒：
PCR用酶：Q5 High-Fidelity DNA Polymerases（New England BioLabs Inc. #M0491），PCR体系及PCR程序参照该产品说明书。
限制性内切酶： Thermo Scientific FastDigest Nde I and Xho I。酶切体系及酶切条件参照该产品说明书。
DNA 电泳：DNA 琼脂糖凝胶电泳分子量Marker、10×loading buffer(Takara)；
琼脂糖（上海生工）。
ampicillin(Amp)、Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) (上海生工)。
胶回收试剂盒：Omega，D2500-01，操作按照说明书进行。
连接试剂盒：Takara DNA Ligation Kit Ver.2.1，操作按照说明书进行。
质粒提取试剂盒：北京百泰克生物技术有限公司，操作按照说明书进行。
生化试剂：均为国产分析纯。
实施例4
重组酶分离纯化：
①按1%接种量扩大培养含各突变体质粒的E. coli BL21(DE3)，当菌浓OD600=1.0时，添加终浓度1 mM IPTG，在37??C，160-180 rpm诱导12 h；
②1 L发酵液12000rpm离心1 min收集菌体，用100 ml Tris-HCl 缓冲液(50 mM，pH 8.0)重溶菌体，超声破碎。超声破碎条件为：功率300 w，超声5 s，间隔10 s，每100 ml 菌体超声30 次。超声完毕后12000rpm离心5 min，上清在30??C 保温2 h 后用60%硫酸氨沉淀过夜；
③沉淀的蛋白用10 ml Tris-HCl 缓冲液(50 mM，pH 9.5)重溶、透析，进行DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析分离。层析柱事先用Tris-HCl 缓冲液(50 mM，pH 9.5)平衡。洗脱时仍采用相同的缓冲系统，梯度洗脱时NaCl 浓度范围为0-0.5 M；
④测各收集管中样品的酶活，酶活高的组分进行SDS-PAGE 分析。收集电泳纯的酶组分混合，装在透析袋里（NMWL 10 kDa）用pH 8.0, 50 mM Tris-HCl透析后分装冻在-20 ??C。
实施例5
酶活曲线测定：在50 mM pH 7.5 Tris-HCl 缓冲液中，45-75??C 范围内，每隔5??C 取一个点，测定重组酶在不同温度下水解酪蛋白的酶活。反应体系中酶浓度为2.5 ??g/ml。
利用BCA试剂盒测定蛋白浓度。方法参见说明书。
实施例4和实施例5中主要生化试剂、耗材和仪器：
酪素和Folin试剂：上海生工。硫酸铵：上海国药。其他试剂为国产分析纯。
DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂：GE Healthcare Life Sciences。
10 kDa NMWL透析袋：北京索莱宝solarbio。
Scientz-IID超声波破碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司。
层析设备：玻璃层析柱(20 cm×16 mm，上海华美玻璃仪器厂)；TH-300梯度混合器(上海沪西分析仪器厂有限公司)；DDB-300电子蠕动泵(上海之信仪器有限公司)；LM17-1A台式记录仪、Z1C-A核酸蛋白检测仪、BSZ-100自动部分收集器(上海康华生化仪器制造有限公司)。
SP-723分光光度计：上海光谱仪器有限公司。
实施例6
（1）表达载体构建
以D168A突变体为例，以含Nde I酶切位点的正向引物和D168A中间引物的3’引物为两端引物，以lasB质粒为模板，扩增目的片段1095bp。以含Xho I酶切位点的反向引物和D168A中间引物的5’引物为两端引物，以lasB质粒为模板，扩增目的片段399bp。回收2条片段。通过PCR将2条片段融合，最后再加入两侧正、反向引物通过PCR获得D168A突变体PCR片段。
图2所示为缺失催化腔附近的保守盐键1和2的4个突变体的PCR结果，1为靠近5’的PCR产物，2为靠近3’的PCR产物，3为突变体PCR产物。
DNA用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切，连接同样酶切过的pET-22b表达载体。连接产物转化E. coli DH5α。利用提质粒酶切验证的方法筛选携带目的基因的转化子（如说明书附图图3）。将测序正确的含目的基因的质粒转化E. coli BL21(DE3)。
实施例7
有酶活的重组酶的筛选及重组酶分离纯化
将缺失盐键1 的突变体D168A 和R198A、缺失盐键2的突变体D189A和R179A的构建好的表达载体转化E. coli BL21(DE3)。从平板上挑取转化子单菌落37??C 过夜培养后按1%接种量扩大培养至OD600 ＝1.0 左右加入终浓度1 mM 的IPTG 继续培养过夜。发酵液离心收集菌体，超声破碎，超声完毕后离心，上清在30??C 保温2 h（请见说明书附图图4）。用Folin－酚法测上清液酶活。结果显示缺失盐键1的突变体D168A 和R198A都丧失活力；缺失盐键2的突变体仅D189A有活力，R179A丧失了活力。
将D189A利用硫酸铵沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析分离纯化，获得了电泳纯的重组酶（请见说明书附图图5）。
实施例8
突变体活性测定
将PAE与D189A分别用pH 7.5 Tris-HCl 缓冲液（50 mM）稀释至浓度5 ??g/ml。45-75??C 范围内，每隔5??C 取一个点，测定重组酶在不同温度下水解酪蛋白的酶活。反应体系中酶浓度为2.5 ??g/ml。以温度（??C）为x，660nm的吸光值（absorbance）为y轴作图（请见说明书附图图6）。结果显示PAE与D189A水解酪蛋白的最适酶活温度均在60～65??C。不同的是D189A在50-70??C的比活均高于PAE，在60～65??C 时D189A比活力比PAE高～30%。
表1所示为45-75??C温度范围内，PAE与D189A水解酪蛋白的酶活（以Abs660数值表示），酶浓度2.5 ??g/ml，底物浓度1%
表1
| 45℃ | 50℃ | 55℃ | 60℃ | 65℃ | 70℃ | 75℃ | |
| PAE | 0.501 | 0.6245 | 0.765 | 0.8275 | 0.8795 | 0.501 | 0.24 |
| D189A | 0.4605 | 0.6545 | 0.8995 | 1.0745 | 1.1255 | 0.612 | 0.1605 |
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心
<120> 一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法
<130> 无
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 498
<212> PRT
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 1
Met Lys Lys Val Ser Thr Leu Asp Leu Leu Phe Val Ala Ile Met Gly
1 5 10 15
Val Ser Pro Ala Ala Phe Ala Ala Asp Leu Ile Asp Val Ser Lys Leu
20 25 30
Pro Ser Lys Ala Ala Gln Gly Ala Pro Gly Pro Val Thr Leu Gln Ala
35 40 45
Ala Val Gly Ala Gly Gly Ala Asp Glu Leu Lys Ala Ile Arg Ser Thr
50 55 60
Thr Leu Pro Ser Gly Lys Gln Val Thr Arg Tyr Glu Gln Phe His Asn
65 70 75 80
Gly Val Arg Val Val Gly Glu Ala Ile Thr Glu Val Lys Gly Pro Gly
85 90 95
Lys Ser Val Ala Ala Gln Arg Ser Gly His Phe Val Ala Asn Ile Ala
100 105 110
Ala Asp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Ala Thr Val Ser Ala Glu Gln Val
115 120 125
Leu Ala Gln Ala Lys Ser Leu Lys Ala Gln Gly Arg Lys Thr Glu Asn
130 135 140
Asp Lys Val Glu Leu Val Ile Arg Leu Gly Glu Asn Asn Ile Ala Gln
145 150 155 160
Leu Val Tyr Asn Val Ser Tyr Leu Ile Pro Gly Glu Gly Leu Ser Arg
165 170 175
Pro His Phe Val Ile Asp Ala Lys Thr Gly Glu Val Leu Asp Gln Trp
180 185 190
Glu Gly Leu Ala His Ala Glu Ala Gly Gly Pro Gly Gly Asn Gln Lys
195 200 205
Ile Gly Lys Tyr Thr Tyr Gly Ser Asp Tyr Gly Pro Leu Ile Val Asn
210 215 220
Asp Arg Cys Glu Met Asp Asp Gly Asn Val Ile Thr Val Asp Met Asn
225 230 235 240
Ser Ser Thr Asp Asp Ser Lys Thr Thr Pro Phe Arg Phe Ala Cys Pro
245 250 255
Thr Asn Thr Tyr Lys Gln Val Asn Gly Ala Tyr Ser Pro Leu Asn Asp
260 265 270
Ala His Phe Phe Gly Gly Val Val Phe Lys Leu Tyr Arg Asp Trp Phe
275 280 285
Gly Thr Ser Pro Leu Thr His Lys Leu Tyr Met Lys Val His Tyr Gly
290 295 300
Arg Ser Val Glu Asn Ala Tyr Trp Asp Gly Thr Ala Met Leu Phe Gly
305 310 315 320
Asp Gly Ala Thr Met Phe Tyr Pro Leu Val Ser Leu Asp Val Ala Ala
325 330 335
His Glu Val Ser His Gly Phe Thr Glu Gln Asn Ser Gly Leu Ile Tyr
340 345 350
Arg Gly Gln Ser Gly Gly Met Asn Glu Ala Phe Ser Asp Met Ala Gly
355 360 365
Glu Ala Ala Glu Phe Tyr Met Arg Gly Lys Asn Asp Phe Leu Ile Gly
370 375 380
Tyr Asp Ile Lys Lys Gly Ser Gly Ala Leu Arg Tyr Met Asp Gln Pro
385 390 395 400
Ser Arg Asp Gly Arg Ser Ile Asp Asn Ala Ser Gln Tyr Tyr Asn Gly
405 410 415
Ile Asp Val His His Ser Ser Gly Val Tyr Asn Arg Ala Phe Tyr Leu
420 425 430
Leu Ala Asn Ser Pro Gly Trp Asp Thr Arg Lys Ala Phe Glu Val Phe
435 440 445
Val Asp Ala Asn Arg Tyr Tyr Trp Thr Ala Thr Ser Asn Tyr Asn Ser
450 455 460
Gly Ala Cys Gly Val Ile Arg Ser Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Ala
465 470 475 480
Ala Asp Val Thr Arg Ala Phe Ser Thr Val Gly Val Thr Cys Pro Ser
485 490 495
Ala Leu
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 合成
<400> 2
gcttggacca tatgaagaag gtttctacgc ttgacc 36
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成
<400> 3
cgcgctcgag ttacaacgcg ctcgggcag 29
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 合成
<400> 4
aacgaagcgt tctccgcgat ggccggcgag g 31
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 合成
<400> 5
ctcgccggcc atcgcggaga acgcttcgtt cattcc 36
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成
<400> 6
ggcagcggtg cgctggcgta catggaccag cccag 35
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 合成
<400> 7
ctggtccatg tacgccagcg caccgctgcc c 31
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 合成
<400> 8
ttcctgatcg gctacgcgat caagaagggc agcg 34
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成
<400> 9
gcccttcttg atcgcgtagc cgatcaggaa gtcgttc 37
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 合成
<400> 10
gccgagttct acatggcggg caagaacgac ttcctg 36
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 合成
<400> 11
gtcgttcttg cccgccatgt agaactcggc agcctc 36
Claims (9)
1.一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，PAE中残基正负电荷间距离小于4 ??，不考虑His形成的盐键之外含有6个盐键，盐键1-3位于催化腔附近，盐键4-6位于C端结构域的C末端，将形成盐键2的Asp189-Arg179中的Asp189进行定点突变，提高PAE比活力。
2. 根据权利要求1所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，将形成盐键2的Asp189-Arg179中的Asp189定点突变为Ala，构建突变体D189A。
3. 根据权利要求2所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，突变体D189A的引物：
两端引物：
正向引物：GCTTGGACCATATGAAGAAGGTTTCTACGCTTGACC，划横线部分表示Nde I酶切位点；
反向引物：CGCGCTCGAGTTACAACGCGCTCGGGCAG，划横线部分表示Xho I酶切位点；
D189A中间引物：
3’ 端引物：TTCCTGATCGGCTACGCGATCAAGAAGGGCAGCG
5’ 端引物：GCCCTTCTTGATCGCGTAGCCGATCAGGAAGTCGTTC。
4.根据权利要求3所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，突变体的原核表达为：
①以含Nde I酶切位点的正向引物和突变体中间引物的3’引物为两端引物，以lasB质粒为模板，扩增产物标为Ⅰ；以含Xho I酶切位点的反向引物和突变体中间引物的5’引物为两端引物，以lasB质粒为模板，扩增产物标为Ⅱ；
②回收Ⅰ和Ⅱ，通过PCR 反应程序，将Ⅰ基因和Ⅱ 基因相互融合；
③最后再加入两侧正、反向引物通过PCR反应程序，得到突变体基因。
5. 根据权利要求4所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，有酶活突变体的筛选：
①利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，EB染色，切取目的片段大小的DNA，回收DNA；
②DNA用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切，连接同样酶切过的pET-22b表达载体；
③连接产物转化E. coli DH5α；
④从转化平板上挑取转化子至液体LB培养基中培养，利用提质粒酶切验证的方法筛选携带目的基因的转化子；
⑤将测序正确的含目的基因的质粒转化E. coli BL21(DE3)；
⑥从平板上挑取转化子单菌落到试管中，37??C 过夜培养后按1%接种量转接到三角瓶中，37??C 培养至OD600 ＝1.0 左右加入终浓度1 mM 的IPTG 继续培养过夜；
⑦发酵液离心收集菌体，菌体用三蒸水洗涤3遍以上后用50 mM,pH 8.0的Tris-HCl 缓冲液重悬，超声破碎至菌液澄清，超声完毕后离心，上清在30??C 保温2 h；
⑧用Folin－酚法测粗酶液酶活。
6. 根据权利要求5所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，步骤⑦发酵液离心收集菌体，超声破碎条件为：功率300 w，超声5 s，间隔10 s，超声10 次。
7. 根据权利要求6所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，重组酶分离纯化：
①按1%接种量扩大培养含各突变体质粒的E. coli BL21(DE3)，当菌浓OD600=1.0时，添加终浓度1 mM IPTG，在37??C，160-180 rpm诱导12 h；
②发酵液离心收集菌体，用50 mM,pH 8.0的Tris-HCl 缓冲液重溶菌体，超声破碎；超声完毕后离心，上清在30??C 保温2 h 后用60%硫酸氨沉淀过夜；
③沉淀的蛋白用Tris-HCl 缓冲液重溶、透析，进行DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析分离；
④测各收集管中样品的酶活，酶活高的组分进行SDS-PAGE 分析，收集电泳纯的酶组分混合，装在透析袋里用pH 8.0, 50 mM 的Tris-HCl缓冲液透析后分装。
8.根据权利要求7所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，步骤②发酵液离心收集菌体，超声破碎条件为：功率300 w，超声5 s，间隔10 s，每100 ml 菌体超声30 次。
9.根据权利要求7所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，步骤③DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析柱层析分离前，先用50 mM,pH 9.5的Tris-HCl 缓冲液平衡；洗脱时仍采用相同的缓冲系统，梯度洗脱时NaCl 浓度范围为0-0.5 M。
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Non-Patent Citations (3)
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|---|
| BINBIN XIE等: "Cold Adaptation of Zinc Metalloproteases in the Thermolysin Family from Deep Sea and Arctic Sea Ice Bacteria Revealed by Catalytic and Structural Properties and Molecular Dynamics", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》, vol. 284, no. 14, 3 April 2009 (2009-04-03), XP055120430, DOI: doi:10.1074/jbc.M808421200 * |
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| 范汉东 等: "Lys121-Ile的定点突变对人尿胰蛋白酶抑制剂热稳定性的影响", 《武汉大学学报(理学版)》, vol. 56, no. 1, 28 February 2010 (2010-02-28) * |
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