CN103421779B - 猪脂肪特异性磷脂酶a2基因启动子 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到猪的脂肪特异性酶A2基因ADPLA的不同长度启动子区域的分离鉴定和功能验证。从猪的基因组中克隆了脂肪特异性酶A2基因ADPLA（GeneBank登录号为100512584）上游13个个不同长度的启动子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：14所示；结果表明-656bp到-616bp和-521bp到-347bp有独立的启动活性。本发明同时公开了13个不同缺失启动子片段、相应重组表达载体的制备方法及双荧光素酶活性检测系统对启动子活性分析的应用。

Description

猪脂肪特异性磷脂酶A2基因启动子

发明领域

本发明属于动物基因工程领域，具体涉及一种猪脂肪特异性磷脂酶A2基因启动子，该启动子可以作调控目的基因猪脂肪特异性磷脂酶A2的特异性表达。

发明背景

启动子是一段位于结构基因5′端上游区域的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。

在真核生物中，结构基因的核心启动子是能与由RNA聚合酶II组成的前起始复合物结合而启动基因转录的最短的一段连续DNA序列。通常情况下，核心启动子包括转录起始位点及其约40bp的上游和/或下游区域。核心启动子基序一般包括TATA框（TATA box）、起始子（initiator，Inr)、TFIIB识别元件（TFIIBrecognition element，BRE）、下游核心启动子元件（downstream core promoter element，DPE）以及基序十元件（Motif Ten Element，MTE）等。起始子是一包含转录起始位点的最常见的核心启动子基序，在哺乳动物中发现其核心序列为YYANWYY，其中“A”处一般定义为是+1，为转录起始位点。虽然有几种因子都能识别起始子，但TFIID因子的作用最重要。TATA框，又名戈德堡霍格内斯盒(Goldberg-Hogness box)，是第一个被发现的真核生物核心启动子元件，但在哺乳动物中只有10-15%的启动子中发现TATA框。在多细胞动物的TATA框的共有序列为TATAWAAR，其序列中上游“T”通常位于转录起始位点上游31bp或30bp处。TATA框可以被TFIID复合物的亚单位TBP蛋白识别，并与之结合。TFIIB识别元件是TFIIB结合序列，紧挨着TATA框，根据其与TATA框的相对位置分为TFIIB上游识别元件（upstream TFIIB recognitionelement，BREu）和TFIIB下游识别元件（downstream TFIIB recognition element，BREd）。TFIIB识别元件一般都与TATA框一起发挥作用。下游核心启动子元件是位于起始子下游的TFIID识别序列，其核心序列为RGWYV，一般位于转录起始位点下游28～32bp处。

基序十元件位于下游核心启动子元件的上游，即转录起始位点下游18～27bp处，也是TFIID的识别位点。

近些年来，随着猪基因组学的研究深入，人们已经对猪部分重要功能基因的启动子转录调控进行了研究。但其转录调控研究刚刚起步，还有许多问题有待解决。

猪脂肪特异性磷脂酶A2基因ADPLA即adipose-specific phospholipase A2，又称PLA2G16（phospholipase A2，group XVI）、H-rev107、HRASLS3（HRAS-like suppressor 3），由于活化的HRAS基因将会促使大鼠成纤维细胞向恶性方向转化，在1994年研究抗恶性转化过程中发现H-rev基因特异性表达，从而首次将其分离出来。因此，H-rev107基因在之后很大长段时间内被作为肿瘤抑制因子去研究，而且研究表明H-rev107基因确实在各种肿瘤细胞系中低表达或不表达。直到近几年才发现该基因在脂肪组织中有着重要的作用，与脂类代谢密切相关，发现其能通过自分泌或旁分泌调控脂解。

2008年，Duncan等发现了一种新的、细胞内的、与膜相关的、钙依赖性磷脂酶A2（PLA2）。序列分析显示它就是H-Rev-107/HRASLS3，一种肿瘤抑制因子，但由于研究表明它在白色脂肪组织中特异性高表达且在前脂肪细胞分化成脂肪细胞的过程中被诱导，故将命名为adipose-specific phospholipase A2（ADPLA）。研究者还发现，虽然ADPLA与卵磷脂视黄醇酰基转移酶（Lecithin retinol acyltransferase，LRAT）在序列上具有高度同源性，但是分析ADPLA的酶活性时，结果显示其水解产物是游离脂肪酸（freefatty acid，FFA）和溶血性磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）而不是三酰甘油（triacylglycerol，TAG），同时，还发现了它的最适反应位置是sn-2，这些都说明了ADPLA是一种PLA2，但进行序列、抑制因素及突变和缺失等分析时发现它与现存的各类PLA2都是不尽相同，这就表明ADPLA可能是一种新的磷脂酶A2，不属于之前所定义的几种类型，故将其归纳为PLA2G16的第一个新成员。

紧接着，在2009年，Jaworski等通过基因敲除的方法来研究ADPLA的作用机制。作者发现，ADPLA是通过旁分泌/自分泌的方式来调节脂肪分解的：ADPLA是脂肪组织中主要PLA2，它催化磷脂（phospholipid）水解，并在sn-2处产生花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA），然后AA在环氧化酶1（COX-1）的作用下形成前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），接着PGE2通过自分泌或旁分泌到细胞外与以G抑制蛋白偶联的方式与细胞膜上的前列腺素EP3受体结合，从而导致细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）下降，而cAMP的下降将通过cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）的活性和激素敏感性脂酶（hormone-sensitive lipase，HSL）的磷酸化降低最终导致脂解作用也降低，这样细胞内的三酰甘油分解降低，增加脂肪的储存和肥胖的形成，敲除ADPLA后发现了脂解增加肥胖受阻，而且这种肥胖无论是由于先天性缺失瘦蛋白导致的还是由于后天饲喂高脂肪饲料导致的，都会受到阻止。同时，作者还发现敲除ADPLA将会导致胰岛素抵抗，脂质沉积异位，及能量消耗和脂肪酸氧化增加等。因此，该基因被作为研究肥胖病的候选基因之一。而猪ADPLA基因的启动子尚未研究过，因此，本发明的目的是提供猪ADPLA启动子及其含有该启动子的载体。

发明内容

本发明的目的在于分离得到一种猪脂肪特异性磷脂酶A2基因启动子，调控目的基因即猪脂肪特异性磷脂酶A2的特异性表达。

本发明的技术路线见图1所示：

本发明利用QT-PCR检测了猪ADPLA基因在不同组织中的表达情况，并扩增了猪ADPLA基因5’端上游1513bp，将其命名为M，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

通过RACE鉴定了猪ADPLA基因的转录起始位点。

以M为模板设计了9条上游引物和5条下游引物扩增出13个不同长度的启动子缺失片段，即F1-F9和R2-R5，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2-13所示。

将上述表SEQ ID NO：2-13所示启动子缺失片段插入pGL3-Basic载体中，在不同细胞系中对不同长度的启动子活性进行了鉴定，进而来确定其核心启动子区。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪ADPLA基因的5’端上游核苷酸序列，其长度为1513bp。

序列表SEQ ID NO：2是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子F1应用的核苷酸序列，其长度为1405bp。

序列表SEQ ID NO：3是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子F2应用的核苷酸序列，其长度为1238bp。

序列表SEQ ID NO：4是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子F3应用的核苷酸序列，其长度为1186bp。

序列表SEQ ID NO：5是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子F4应用的核苷酸序列，其长度为917bp。

序列表SEQ ID NO：6是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子F5应用的核苷酸序列，其长度为761bp。

序列表SEQ ID NO：7是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子F6应用的核苷酸序列，其长度为607bp。

序列表SEQ ID NO：8是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子F7应用的核苷酸序列，其长度为533bp。

序列表SEQ ID NO：9是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子F8应用的核苷酸序列，其长度为338bp。

序列表SEQ ID NO：10是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子F9应用的核苷酸序列，其长度为242bp。

序列表SEQ ID NO：11是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子R2应用的核苷酸序列，其长度为692bp。

序列表SEQ ID NO：12是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子R3应用的核苷酸序列，其长度为625bp。

序列表SEQ ID NO：13是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子R4应用的核苷酸序列，其长度为406bp。

序列表SEQ ID NO：14是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为一个启动子R5应用的核苷酸序列，其长度为271bp。

图1.本发明的技术路线图。

图2.载体pMD18-T结构示意图。

图3.载体pGL3-basic结构示意图。

图4.载体pGL3-control结构示意图。

图5.载体pRL-TK结构示意图。

图6.猪ADPLA基因在不同组织中的表达情况

图7.猪ADPLA启动子的克隆。图中泳道1、2、4、5代表1513bp ADPLA基因的启动子，3代表2000bpDNA maker

图8.猪ADPLA启动子转录起始位点的鉴定。图中泳道1代表2000bp DNA maker，2代表空白，3代表阳性

图9.猪ADPLA启动子序列的生物信息学分析。图中：阴影区代表的是潜在转录因子结合位点，画线处代表的是预测的核心启动子，画线处斜体加粗A为预测转录起始位点，两处斜体加粗G为5’RACE鉴定的转录起始位点

图10.猪ADPLA启动子不同缺失片段荧光素酶报告基因载体的酶切鉴定。图中各泳道表示：2000bp DNAmaker，F1，F2，F3，F4，F5，F6，F7，F8，F9，R2，R3，R4，R5

图11.猪ADPLA启动子不同缺失片段在C2C12细胞中的活性检测。

图12.猪ADPLA启动子不同缺失片段在3T3-L1细胞中的活性检测。

图13.猪ADPLA启动子不同缺失片段在分化的3T3-L1细胞中的活性检测。

图14.猪ADPLA启动子不同缺失片段在SP2.0细胞中的活性检测。

具体实施方式

实施例1、猪基因组DNA和RAN的提取及cDNA的合成

利用TRIzol试剂（Invitrogen公司）同时从猪的不同组织中提取DNA和RNA，具体步骤如下：

（1）将猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃脏、小肠、背肌、背脂样分别在液氮中磨碎，每50～100mg组织中加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆。将匀浆后的样品在室温放置5min后就可以加入氯仿，约每使用1ml TRIzol加氯仿0.2ml，加完后立即剧烈振荡15s，室温放置3min。之后在4℃，12000×g离心15min，样品将分三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。将水相转入一新管中开始RNA的提取，剩下的可以用来提取DNA和蛋白。

（2）每使用1mlTRIzol加0.5ml异丙醇到水相中，室温放置10分钟后4℃，12000×g离心10min，弃上清；接着加1ml 75℅乙醇，混匀后7500×g离心5min，弃上清；在室温放置5-10min，晾干后加入50μl焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液，55～60℃放置10min使RNA溶解，-70℃保存。

（3）每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇到中间层和有机相中，室温放置3min后4℃，2000×g离心5min。弃上清；用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀，约每使用1mlTRIzol加1ml，室温放置30min后4℃，2000×g离心5min，弃上清，重复一次；再加入75%乙醇，约每使用1ml TRIzol加入1.5～2ml，室温放置10～20min后（不时颠倒混合），4℃，2000×g离心5min，弃上清；室温放置晾干DNA 5～10min，每50～70mg组织用300～600μl 8mM NaOH（氢氧化钠）溶解DNA，4℃，12000×g离心10min除去组织中的一些不溶物，最后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸;N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES）调pH值至7-8并加入乙二胺四乙酸（EDTA）至1mM，-20℃保存。

（4）用浓度测定仪直接测定所提取的RNA和DNA的浓度值和A260/A280比值。

（5）将提取好RNA用DNase Ⅰ处理去除RNA中的DNA污染（见表1）。

表1去除RNA中的DNA的体系

（6）将处理过的RNA用Fermentas公司的RevertAidTM First Strand cDNA SynthesisKit反转录成cDNA,-20℃保存（见表2）。

表2反转录体系

实施例2、猪ADPLA基因在不同组织中的表达检测

设计特异性荧光定量PCR引物ADPLA-qPCR-F/R，以大白猪2月龄的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃脏、小肠、背肌、背脂cDNA为模板，以猪ACTB基因为内参，采用SYBR Green Ⅰ荧光染料，在Roche公司的LightCycler480仪器中进行实时定量PCR。利用2^-Δ△Ct法进行数据分析。实验结果见图6，表明猪ADPLA主要在不同组织中泛表达，但在背脂中表达显著高于其他组织（qPCR反应体系见表3，反应条件见表4）。

表3荧光定量PCR体系

表4荧光定量PCR程序

实施例3、猪ADPLA启动子的克隆

根据NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上提供的猪ADPLA基因（GenBank登录号：100512584）的序列，利用Primer5软件分别设计出一对特异性引物ADPLA-5’URR-F/R，并以大白猪（来自中国湖北省武汉市华中农业大学精品猪场）基因组DNA为模板，扩增ADPLA基因5’端上游包括ATG及完整第一内含子在内的1513bp（见图7）。按以下PCR体系及条件进行扩增（PCR体系见表5，条件见表6）。

表5PCR反应体系

表6PCR反应程序

再使用北京百泰可公司（BioTeKe）的Gel PurificationKit（Spin-column)试剂盒将其回收。

(1)将目的条带在紫外灯下快速切下，放入2mL离心管中。

(2)往离心管中加上200mL的溶胶/结合液DB（试剂盒自带），置60℃左右的烘箱中直至完全溶解，期间可上下颠倒离心管数次。

(3)完全溶解后，将其全部转入已放置收集管的吸附柱AC中（试剂盒自带），12000r/min离心1min后倒掉收集管中的废液。

(4)加上700μL已加过无水乙醇的漂洗液WB（试剂盒自带），2000r/min离心1min后倒掉收集管中的废液。

(5)接着12000r/min空转2min，之后取出吸附柱AC放入1.5mL离心管中，在吸附膜中间加30μL洗脱液EB（试剂盒自带），室温静置2min后12000r/min离心1min。将回收产物放-20℃保存。

接着取7.2μL的回收产物混合宝生物工程大连有限公司的pMD18-T vector 0.3μL和solution1.5μL，过夜连接。

第二天晚上开始做转化：

（1）在超净工作台里取一离心管，将连接液全部加入其中，再加入30μL的感受态（DH5α，购自北京全式金公司），充分混匀，冰浴30min。

（2）然后在42℃水浴中热激90s，之后在冰浴2min。

（4）接着加入400μL无抗生素的LB液体培养基，即每1L双蒸馏水中加入10g胰蛋白胨(TRYPTONE)、5g酵母提取物(YEAST EXTRACT)和10g氯化钠(NaCl)即为无抗性LB液体培养基，高压灭菌后冷却了就可以使用，放到37℃，220r/min摇床中扩大培养50min左右。

（5）5000r/min，5min离心，弃400μL的培养基，吹打均匀，铺涂到含氨苄抗性的LB固体培养基的平板上（1L无抗性LB液体培养基中加入15g琼脂粉即为固体培养基，高压灭菌后待其冷却但未凝固前加入1mL的100mg/mL的氨苄青霉素，摇匀倒入平板中即为氨苄抗性的LB固体培养基），放入37℃培养箱中先正置培养1h左右，后倒置过夜培养。

于超净工作台中用灭菌的抢头挑取平皿上的单菌落，置于事先加好400μL含有氨苄抗性的LB液体培养基的1.5mL的离心管中（1L无抗性LB液体培养基中加入1mL的100mg/mL的氨苄青霉素，摇匀倒入平板中即为氨苄抗性的LB液体培养基），每皿挑取6个；37℃，220r/min的摇床中扩大培养4h左右至菌液变浑浊，以1μL菌液作模板，用特异性引物通用引物进行PCR扩增，之后电泳检测确定阳性克隆并将菌液送去测序。

选取上述测序正确的阳性克隆进行扩大培养，采用TIANGEN公司的TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒提取质粒，-20℃保存。

（1）取原菌液50μL加入5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220r/min摇床过夜培养12-14h。

（2）将上述扩大培养的菌液多次转入2mL离心管中，12000r/min，离心1min，弃掉上清。

（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL的事先已加入RNase A的溶液P1（试剂盒自带），使用移液器反复吹打彻底悬浮菌体。

（4）向管内加入250μL的溶液P2（试剂盒自带），温和的上下翻转离心管6-8次以使菌体裂解完全，此时菌液变得清亮粘稠。

（5）再向离心管中加入350μL的溶液P3（试剂盒自带），立即温和的转动离心管6-8次，充分混匀，可见白色絮状沉淀。12000r/min，离心10min，此时离心管底部将形成沉淀

（6）在离心过程中将柱平衡：将吸附柱放入收集管中后，向其内加入500μL的平衡液BL（试剂盒自带），12000r/min，离心1min，倒掉收集管中的废液，将柱子重新放入收集管。

（7）将（5）的上清液转入已平衡好的柱子中，12000r/min，离心1min，弃废液。

（8）向吸附柱中加入600μL已加过无水乙醇的漂洗液，12000r/min，离心1min，弃废液

（9）重复（8）操作。

（10）将吸附柱放入收集管中，12000r/min，离心2min，保证漂洗液完全去除，然后将吸附柱的盖子打开，室温静置几分钟，让残留的乙醇挥发掉，以免影响下一步试验。

（11）将吸附柱放入一1.5mL离心管中，向吸附膜的中间部位加入80μL左右的洗脱缓冲液EB（试剂盒自带），室温静置2min，12000r/min，离心1min，将质粒收集到离心管中，置于-20℃保存。

实施例4、猪ADPLA转录起始位点的鉴定

为了确定ADPLA的转录起始位点，采用Clontech公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit和2PCRKit试剂盒进行5’RACE。实验流程如下（详细步骤请见试剂盒说明书）：

（1）根据试剂盒中对基因特异性引物（Gene-Specific Primers，GSPs）的要求，设计了一条反向引物ADPLA-TSS-R1备用。

（2）采用TRIzoL法从猪被最长肌组织中提取总RNA。

（3）合成cDNA第一条链：

首先进行反应1，待反应1结束后将产物于14000r/min离心10s接着进行反应2。反应2结束后，根据总RNA的量用Tricine-EDTA Buffer对产物进行相应的稀释。此稀释液可在-20℃保存3个月（反应1体系见表7，条件见表8，反应2体系见表9，条件见表10）。

表7：反应体系1

表8：反应条件1

表9：反应体系2

表10：反应条件2

（4）采用反应3进行5’RACE（反应体系3见表11，条件见表12）：

表11：反应体系3

表12：反应条件3

对反应3的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现单一、明亮的目的条带则需要对其进行克隆测序鉴定（至少挑选10个阳性克隆进行测序鉴定）。

图8结果表明5’RACE成功了，经过测序发现该基因存在两个转录起始位点，即翻译起始位点上游635bp处的鸟嘌呤G和翻译起始位点上游350bp处的鸟嘌呤。

实施例5、猪ADPLA启动子的生物信息学分析

图9表示通过不同的在线软件预测的结果：

（1）利用TFSEARCH（http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html）在线预测该区域内潜在的转录因子结合位点，发现这段区域内存在很多转录因子结合位点，而且发现TATA-box。

（2）利用MethPrimer（http://www.urogene.org/methprimer/indexl.html）在线预测该区域内潜在的CpG岛，没有发现CpG岛。

（3）利用NNPP（http://fruitfly.org:9005/seq_tools/promoter.html）在线预测该区域内存在一个潜在的启动子和转录起始位点。

实施例6、猪ADPLA启动子不同缺失载体的构建

申请人成功构建了16个缺失载体：DB-ADPLA-PGL3-F1/2/…/9（以大白猪DNA为模板，R1为下游引物），长度分别为1405bp（-1414～-10），1238bp（-1247～-10），1186bp（-1195～-10），917bp（-926～-10），761bp（-770～-10），607bp（-616～-10），533bp（-542～-10），338bp（-347～-10），242bp（-251～-10）；DB-Adpla-PGL3-R2/3/4/5（以大白猪DNA为模板，F4为上游引物），长度分别为692bp（-926～-235），625bp（-926～-302），406bp（-926～-521），271bp（-926～-656）（以翻译起始位点的A为+1，上游第一个碱基为-1）。引物两端分别都添加了Bgl II和Hind III限制性酶切位点，并加上保护碱基。然后以大白猪的ADPLA启动子全长片段为模板，通过普通PCR将缺失片段一一扩增出来（同时还扩增梅山猪的ADPLA启动子缺失片段F4），连接到pMD18T载体上，经过双酶切回收所有点缺失片段及PGL3-basic空载，这样就可以将缺失片段一一连到空载上经测序鉴定后测定其浓度及纯度备用，并进行双酶切验证（见图10）。

实施例7、转染C2C12细胞、3T3-L1细胞、分化的3T3-L1细胞和SP2.0

（1）细胞的复苏

从液氮罐中取出细胞冻存管，在37-42℃水浴下溶解冻存液，用吸管将其转移至细胞培养瓶中，加入3mL配制好正常细胞培养基，即含10%胎牛血清（购自Gibco公司）的DMEM培养基（购自Gibco公司），反复吹打，并十字摇晃培养瓶使细胞分布均匀，之后在37℃，5%CO2培养箱内培养，6h后换液。

（2）细胞的培养

根据细胞的生长密度及时更换培养液：当细胞培养液变黄时应更换培养液，一般是每48h更换一次。待细胞生长至80-90%的汇合度后将其传代：

贴壁细胞(如C2C12、3T3-L1)传代过程：吸出旧的培养基，用1×PBS（购自Gibco公司）冲洗两次，再加入200μL左右的0.25%胰蛋白酶（购自Gibco公司），使其充分接触细胞，置于培养箱中消化1min左右，待细胞松动后，迅速的向培养瓶中加入10mL左右含10%FBS的细胞培养基，终止胰蛋白酶的作用，再用吸管吹打瓶壁细胞使之脱落，同时也吹打培养基使之成为单细胞悬液，最后一传三将其接种在3个细胞瓶中培养。

半贴壁细胞(如SP2.0)传代过程：吸出旧的培养基，然后直接换上新的培养基，吹打均匀，一传三于3个细胞瓶中即可。

（3）细胞的冻存

取对数生长期的细胞，先用1×PBS洗两遍，再用0.25%胰蛋白酶将其消化下来，接着加入细胞冻存液，并将其吹打均匀，最后转移至细胞冻存管中，4℃放置30min，-20℃放置1h，-70℃放置过夜，次日放入液氮中备用。

（4）3T3-L1细胞诱导分化的培养过程：

1)将消化后的3T3-L1细胞接种到24孔板中，每孔500μL细胞培养液，放入CO2培养箱中进行培养。

2)每天观察细胞的细胞生长形态及密度，隔48h换一次液，待细胞长满后继续抑制生长两天。之后将正常培养基吸出，换诱导培养基按照每孔500μL加入(诱导培养基：含10%FBS的DMEM中加入1μg/μL的胰岛素、0.25μM的地塞米松、0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)。

3)3T3-L1细胞在诱导培养基中分化2天后，将细胞培养基换为维持培养基，继续在培养箱中进行培养(维持培养基：含10%FBS的DMEM中加入1μg/μL的胰岛素)。

4)培养4天后，可以观察到大小不一的各种透明脂滴，随着分化时间的延长，脂滴越来越多，越来越大，细胞形态变为椭圆形或圆形。之后换回正常培养基，约每2天换一次液。

5)在3T3-L1细胞诱导分化7天后，可以进行转染试验了。

（5）细胞的转染

本实验采用Lipofectamine 2000试剂（购自Invitrogen公司）在24孔板中进行细胞转染：

1)在24孔板中用不含抗生素的培养基进行培养，当每孔的细胞密度达到90%左右时就可以开始转染了。

2)将每孔转染的1μg质粒加入到50μLOPTI-MEM（购自Gibco公司）培养基中，吹打均匀；再取2.5μL的Lipofectamine 2000和1/20～1/50μg的PRL-TK（购自Clontech公司）加入到50μLOPTI-MEM培养基中，混合均匀后室温静置5min。

3)将2)中的两份混合液混合均匀，室温静置20min。

4)期间弃除各孔中原来的细胞培养基，并且用1×PBS或OPTI-MEM清洗两遍。

5)将每孔细胞加入(3)中混合液100μL，后用OPTI-MEM填补至总体积为500μL，混合均匀。

6)37℃，5%CO2细胞培养箱培养6h后更换成不含任何抗生素的10%的正常细胞培养基继续培养。24h左右后就可以收集细胞了。

注：①对于需要进行诱导分化的细胞，待其加入分化培养基诱导7天左右后，按上述相同的步骤进行转染。

②每个样品都做3次以上的重复以校正误差。

③除了转染不同的缺失载体外，还设置了阴性对照PGL3-basic载体（购自Clontech公司）、阳性对照PGL3-control载体（购自Clontech公司）和空白对照。

④海肾荧光素酶报告基因pRL-TK为转染过程中的内参，以校正转染过程中的各种误差。

（6）双荧光素酶活性的检测

我们采用Reporter Assay System在多功能酶标仪中测定不同缺失载体的活性：

1)试剂的配制：1×PLB即4倍体积的去离子水加上1倍体积的5×PLB(现配现用)，LARⅡ即将10mL的Luciferase Assay Buffer II全部加入到Luciferase Assay Substrate中(-70℃避光保存备用)，Stop＆Glo Reagent即1倍体积的Stop&Glo Substrate混合50倍体积的Stop&Glo Buffer(现配现用，避光)。

2)当细胞转染24h-48h后，用1×PBS清洗细胞两次，然后在每孔中加入100μL 1×PLB用枪吹打至细胞完全裂解，后收集到1.5mL离心管中，-70℃长期保存。

3)每个样品吸取10μL的细胞裂解液至酶标版中，首先加入50μL的LARⅡ读取样品中荧光虫荧光素酶的活性值A，然后加入50μL的Stop＆Glo Reagent读取样品中海肾荧光素酶的活性值B。

4)比值A/B的大小即代表该缺失载体的启动子的活性，之后采用SAS软件进行单因素方差分析，当P<0.05时为差异显著，P<0.01时为差异极显著。

图11、12、13、14表面在不同细胞系中所有缺失载体活性变化趋势一样，而且发现从F5到F6时活性显著下调，到F8和F9时基本没有活性了，且从F4到R2再到R3活性都显著下调，直到R5时就没有活性了，而且R5-F6（-656到-616）和R4-F8（-521到-347）这两个区域内分别各存在之前通过5’RACE鉴定的转录起始位点一个，说明这两个区域均能独立启动基因的表达，且R5-F6内存在一处CRE原件可能增强启动子活性，而R4-F8在CpG岛内可能由于甲基化抑制启动子活性。5′端缺失表明-1414～-1247缺失将会导致启动子活性在不同细胞中呈不同程度的上调，-1247～-1195缺失会导致启动子活性在不同细胞中呈不同程度的下调，而-1195～-926～770缺失分别后启动子活性在不同细胞中变化趋势不同，3′端缺失表明-302～-235～-10缺失将会导致启动子活性在不同细胞中呈不同程度的下调，而-521～-302缺失后启动子活性在不同细胞中变化趋势不同。在不同细胞系中荧光活性均下调说明缺失区域内可能存在正调控位点，均上调则说明可能存在负调控位点，而趋势变化不同则说明有可能是存在组织特异性调控位点。

表13：实验过程中所用引物

Claims (4)

1.一种猪脂肪特异性磷脂酶A2基因的启动子，其特征在于：该启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

2.猪脂肪特异性磷脂酶A2基因启动子的活性片段，其特征在于：所述片段的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:3-6及11所示。

3.权利要求1所述启动子在调控猪脂肪特异性磷脂酶A2基因表达中的应用。

4.权利要求2所述启动子的活性片段在调控猪脂肪特异性磷脂酶A2基因表达中的应用。