CN103421082B - 一种开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片及其制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片及其制作方法，特别适用于生物学过程研究和新药设计，它包括基底和基片；基片上有若干个蛋白质结晶单元；基片与基底相结合的平面上有环形微流主通道；环形微流主通道通过微流扩散通道与蛋白质结晶单元联通；环形微流主通道顺序串接联通并与其中部的蛋白质结晶单元一起构成一个单列结晶单元阵列，或由若干个单列结晶单元阵列并联构成多列结晶单元阵列。本发明的优点是：蛋白质结晶速度快，晶体簇群密度高；在结晶单元中形成的蛋白结晶体不受到剪切力作用，并能方便地被提取和分析；蛋白质耗量少、操作灵活、适用于结晶条件的高通筛选；芯片的制作简单，结构紧凑，成本低，并可大批量生产。

Description

一种开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片及其制作方法

技术领域

本发明涉及一种开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片及其制作方法，是一种通过蛋白质结晶来直接、有效和全面了解蛋白质高级结构和功能的装置，特别适用于生物学过程研究和新药设计，属于生物技术领域。

背景技术

蛋白质结构与功能的研究对了解分子水平上的生命过程和新药设计有着十分重大的意义。而蛋白质的晶体解析是全面了解蛋白质三维结构最直接和有效的方法，因而受到人们的广泛关注。

为高效获得可用于晶体解析的蛋白质结晶体,需要利用少量的蛋白质溶液进行合理的条件筛选（如蛋白质溶液浓度、沉淀剂浓度、溶液的pH、温度、缓冲溶液的类型等）。传统的方法是通过大量试验去筛选合适的结晶条件，但由于蛋白质的结晶条件相当苛刻，而晶体形成的过程十分耗时,需要对多个变量进行调节，所以蛋白质溶液的用量一般较大，代价昂贵。事实上，目前能够结晶并了解其三维结构的蛋白质只占已知有功能的蛋白质中极少的一部分。因而，如何迅速、高效地的筛选出蛋白质结晶的条件，是当前生命科学的重大课题之一。

微流控芯片技术用于蛋白质的结晶条件的筛选具有一定的优势，如：1、 减少单个试验所需的样品量；2、 增加条件试验的总数；3、 对影响蛋白质结晶的变量进行较系统的研究；4、 加快试验速度等。目前，国内外研究用微流控芯片实现蛋白质结晶有以下几类主要思路：

(1) 利用阀门控制的微流芯片中实现条件筛选 (S. R. Quake等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 16531; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 14431)；

(2) 利用液滴法引入沉淀剂、缓冲溶液和待结晶蛋白质的溶液，从而实现条件筛选(R. F. Ismagilov等, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 11170; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 19243)；

(3) 利用微流芯片中的透析过程实现蛋白质的结晶过程(S. Fraden等，Cryst. Growth Des. 2007, 7, 2192)；(4) 利用滑动微流芯片(SlipChip)的方式实现不同溶液的混合(R. F. Ismagilov等, Lab Chip 2009, 9, 2286)。

以上试验中一个普遍的问题在于，在液体体积不变的情况下，所含蛋白质分子的总量是十分有限的，难以促使蛋白质分子结晶。如果增加蛋白质的浓度，可以增加其结晶的效率，但所得的蛋白质晶体体积小，簇群密度低，因而较难直接用于衍射分析。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有技术的缺点，提供开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片及其制作方法，它不仅能用于迅速和高效地获得蛋白质结晶体，而且可用于蛋白质结晶条件的高通筛选，同时，芯片结构紧凑，且成本低，并可大批量生产；制作方法简单，易于操作；本发明提供的蛋白质结晶阵列芯片用于生物学过程研究和新药设计等高效高，具有普适性。

本发明的一种开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片技术方案是：

一种开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，它包括一个基底和固定在基底上的基片；所述基片上分布有若干个圆柱孔形的蛋白质结晶单元；每个蛋白质结晶单元一端有朝上的上口，另一端有朝向基底表面的下口；基片与基底相结合的平面上有环绕于蛋白质结晶单元下口的环形微流主通道；所述环形微流主通道通过若干个微流扩散通道与蛋白质结晶单元联通；基片的两端上分别有与环形微流主通道联通的蛋白质溶液的入口和出口；若干个环形微流主通道沿着从入口到出口方向通过连接通道顺序串接联通并与其中部的蛋白质结晶单元一起构成一个单列结晶单元阵列，或由若干个单列结晶单元阵列并联构成多列结晶单元阵列。

在上述技术方案基础上更进一步的技术方案是：

所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其多列结晶单元阵列的单列结晶单元阵列共有入口和出口。

所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其多列结晶单元阵列由两个单列结晶单元阵列组成。

所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其多列结晶单元阵列有两组，并连构成组合多列结晶单元阵列。

所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其入口与其直接相联通的环形微流主通道之间有用于从入口注入的蛋白质溶液处理的分流结构和/或混合结构；所述的分流结构和混合结构为弯曲的微流通道。

所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其上口为与外界环境相通的开放的孔口，用于调控蛋白质结晶单元内结晶时所需的湿度，以及用于向蛋白质结晶单元注入沉淀溶液。

所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其微流扩散通道在基片与基底相结合的平面上，或在基片中间。

所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其环形微流主通道为圆环形，或多边环形；微流扩散通道为辐射状。

所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其扩散通道的高度小于等于5微米，宽度小于等于5微米；环形微流主通道、连接通道、以及分流结构的微流通道和混合结构的微流通道的高度均小于等于200微米，宽度均小于等于500微米；蛋白质结晶单元的直径大于等于0.1毫米, 小于等于10毫米，高度小于等于8毫米。

一种本发明的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片制作方法，包括如下步骤：

A、制作基片：

1)制作阳模：

先绘图并制作光学模板，包括环形微流主通道、微流扩散通道、连接通道、蛋白质结晶单元、分流结构和/或混合结构，并附加“X”字型的定位标记；“＋”字型的定位标记；然后用光学曝光和/或离子刻蚀的方法制作包括环形微流主通道和微流扩散通道、连接通道、分流结构和/或混合结构的阳模；

2)基片成型：

通过软光刻和热压印的方法复制阳模，制成具有环形微流主通道、微流扩散通道、连接通道、蛋白质结晶单元、分流结构和/或混合结构相对位置对准定位标记的PDMS，或PMMA，或PC，或PS基片；

3)加工蛋白质结晶单元和进口及出口：

通过微细加工机床定位打通基片上的各蛋白质结晶单元和相应进口及出口；

B、基片与基底粘合：

   将具有环形微流主通道、微流扩散通道5、连接通道、蛋白质结晶单元、分流结构和/或混合结构的结晶单元阵列基片粘合到基底表面上。

对本发明的原理和技术效果说明如下：

本发明的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片其蛋白质结晶单元3是开放式的，而蛋白质溶液被连续注入到环形微流主通道4中，使蛋白质分子通过扩散通道5源源不断地进入蛋白质结晶单元3，形成在环形微流主通道和蛋白质结晶单元间稳定而高的蛋白质浓度梯度，提高了蛋白质结晶速率和产量。

1、开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片用于高效蛋白质结晶实验或蛋白质结晶条件的高通量筛选，在整个结晶过程中，蛋白质溶液在环形微流主通道中连续流动，通过扩散进入开放式的蛋白质结晶单元，并保持动态的高浓度梯度，从而显著提高了结晶效率。

2、由于进入蛋白质结晶单元的蛋白质分子量不再受蛋白质结晶单元大小的限制，所得到的蛋白质结晶具有晶体尺寸大、结晶速率高和簇群密度大等优点；

3、蛋白质结晶单元中的液体是不流动的，故作用于蛋白质结晶体的剪切力为零。

4、每个蛋白质结晶单元上口与外界是相通的,以保证蛋白质结晶所需的湿度环境和结晶产物的方便提取或分析。

5、通过调控环形微流主通道中蛋白质溶液的浓度、流速及进样频率，可改变结晶条件，实现高通筛。相对于传统的蛋白质结晶体系而言,基于微流扩散的结晶阵列芯片可更好地用于结晶条件的筛选，且结晶速率高，晶体簇群密度大。

6、相对于现行的微流芯片而言,开放式恒流扩散阵列芯片避免了蛋白质液体体积的限制，可在正常浓度条件下完成优质的结晶工作和分析。

7、根据具体实验的需要,可改变环形微流主通道的设计方案,通过微流控在同一芯片上实现不同浓度或不同蛋白质结晶的实验。

8、本发明特别适用于蛋白质三维结构的发现和相应药物靶点的筛选。

9、本发明芯片的制作简单，结构紧凑，成本低，适用性强，并能大批量生产。

附图说明：

图1为本发明开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片立体示意图；

图2为图1的单个蛋白质结晶单元局部放大的立体示意图；

图3为图1的单个蛋白质结晶单元横切面放大示意图；

图4为图3的A-A剖视示意图；

图5为本发明开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片一个实施例的功能结构原理示意图；

图6为本发明开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片中的扩散通道阵列示意图；

图中各附图标记的名称为：1－基片；2－基底；3－蛋白质结晶单元；3.1－上口；3.2－下口；4－环形微流主通道；4.1－连接通道；5－扩散通道；6－蛋白质液体的进口；7－蛋白质液体的出口；8－“X”字型的定位标记；9－“ ＋”字型的定位标记；10－分流结构；11－混合结构；12.1－单列结晶单元阵列；12.2－多列结晶单元阵列；12.3－组合多列结晶单元阵列。

具体实施方式

结合附图和实施例对本发明作进一步说明如下

实施例l：为本发明基本实施例。如图1-5所示，一种开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，它包括一个基底2和固定在基底2上的基片1；所述基片1上分布有若干个圆柱孔形的蛋白质结晶单元3；每个蛋白质结晶单元3一端有朝上的上口3.1，另一端有朝向基底2表面的下口3.2；基片1与基底2相结合的平面上有环绕于蛋白质结晶单元3下口3.2的环形微流主通道4；所述环形微流主通道4通过若干个微流扩散通道5与蛋白质结晶单元3联通；基片1的两端上分别有与环形微流主通道4联通的蛋白质溶液的入口6和出口7；若干个环形微流主通道4沿着从入口6到出口7方向通过连接通道4.1顺序串接联通并与其中部的蛋白质结晶单元3一起构成一个单列结晶单元阵列12.1，或由若干个单列结晶单元阵列12.1并联构成多列结晶单元阵列12.2。环状微流主通道4中的蛋白质分子通过微流扩散通道5进入蛋白质结晶单元3，并与其中沉淀溶液作用产生蛋白质晶核并使之生长。

实施例2：是上述实施例1中的单列结晶单元阵列的实施例。开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片由4个环形微流主通道4沿着从1个入口6到另一个出口7方向通过连接通道4.1顺序串接联通并与其中部的蛋白质结晶单元3一起构成一个单列结晶单元阵列12.1。上口3.1为与外界环境相通的开放的孔口，用于调控蛋白质结晶单元3内结晶时所需的湿度，以及用于向蛋白质结晶单元3注入沉淀溶液。微流扩散通道5在基片1与基底2相结合的平面上，或在基片1中间。环形微流主通道4为圆环形，或多边环形；微流扩散通道5为辐射状。扩散通道5的高度小于等于5微米，宽度小于等于5微米；环形微流主通道4、连接通道4.1、以及分流结构10的微流通道和混合结构11的微流通道的高度均小于等于200微米，宽度均小于等于500微米；蛋白质结晶单元3的直径大于等于0.1毫米, 小于等于10毫米，高度小于等于8毫米。

基片1及基底2材料选自于聚合物聚二甲基硅氧烷PDMS，或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，或聚碳酸酯PC，或聚苯乙烯PS，或石英，或玻璃、或单晶硅。

实施例3：与上述实施例2不同的是本实施例为多列结晶单元阵列的实施例。开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片由2个单列结晶单元阵列12.1并联构成多列结晶单元阵列12.2。多列结晶单元阵列12.2的2个单列结晶单元阵列12.1共有1个入口6和1个出口7。

实施例4：是一个优选的实施例。与实施例3不同的是：所述开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片含有4×4个蛋白质结晶单元。多列结晶单元阵列12.2有两组，并连构成组合多列结晶单元阵列12.3。入口6与其直接相联通的环形微流主通道4之间有用于从入口6注入的蛋白质溶液处理的分流结构10和混合结构11；分流结构10和混合结构11为弯曲的微流通道。如图6所示，每个蛋白质结晶单元3有6条辐射型扩散通道5形成，以保证相对应的蛋白质结晶单元3和环形微流主通道4的联通。如图5所示为本实施例阵列芯片功能结构原理示意图，该图展示了蛋白质结晶单元3，环形微流主通道4和扩散通道5的相对位置；还展示了蛋白质液体进口6和出口7，以及基底2与基片1定位标记8、9的位置；还展示了环形微流主通道、连接通道、分流结构及混合结构的功能结构原理：两种不同浓度的蛋白质溶液分别注入到芯片上端的两个入口处6，通过两级分流结构10和微流混合结构11，得到四种不同浓度的蛋白质溶液，分别送入4个平行的环形微流主通道中，最后经出口7流出。本实施例在同一芯片中能获得4种不同蛋白质分子的结晶体。

实施例5：为本发明的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片制作方法的实施例，步骤如下：

A、制作基片：

1)制作阳模：

先绘图并制作光学模板，包括环形微流主通道4、微流扩散通道5、连接通道4.1、蛋白质结晶单元3、分流结构10和混合结构11，并附加“X”字型的定位标记8；“ ＋”字型的定位标记9；然后用光学曝光和/或离子刻蚀的方法制作包括环形微流主通道4和微流扩散通道5、连接通道4.1、分流结构10和/或混合结构11的阳模；

2)基片成型：

通过软光刻和热压印的方法复制阳模，制成具有环形微流主通道4、微流扩散通道5、连接通道4.1、蛋白质结晶单元3、分流结构10和/或混合结构11相对位置对准定位标记的PDMS，或PMMA，或PC，或PS基片1；

3)加工蛋白质结晶单元3和进口6及出口7：

通过微细加工机床定位打通基片1上的各蛋白质结晶单元3和相应进口6及出口7；

B、基片与基底粘合：

   将具有环形微流主通道4、微流扩散通道5、连接通道4.1、蛋白质结晶单元3、分流结构10和/或混合结构11的结晶单元阵列基片1粘合到基底2表面上。

本发明的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片进行溶菌酶蛋白质结晶条件的筛选试验，包括如下步骤：

1）利用蠕动泵或注射泵在进口6分别通入两种不同浓度的溶菌酶蛋白质水溶液（25 毫克/毫升和150 毫克/毫升），使环形微流主通道4中蛋白质浓度控制在25-150毫克/毫升，注射速度控制在0.5-8 微升/分；

2）在蛋白质结晶单元3中加入沉淀溶液(沉淀剂和缓冲溶液的混合液)，控制沉淀剂浓度在0.5-5 摩尔/升，溶液pH在4-7之间；

3）继续通入蛋白质水溶液，保持注射速度（或蠕动进样速度），在出口7将蛋白质水溶液进行收集并重新注入进口6，保持进样1-24小时。

所述的沉淀剂选自氯化钠，磷酸钠，氯化钙。缓冲溶液选自醋酸钠/醋酸，磷酸/磷酸二氢钠。

本发明权利要求保护范围不限于上述实施例。

Claims (9)

1.一种开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其特征在于，它包括一个基底（2）和固定在基底（2）上的基片（1）；所述基片（1）上分布有若干个圆柱孔形的蛋白质结晶单元（3）；每个蛋白质结晶单元（3）一端有朝上的上口（3.1），另一端有朝向基底（2）表面的下口（3.2）；基片（1）与基底（2）相结合的平面上有环绕于蛋白质结晶单元（3）下口（3.2）的环形微流主通道（4）；所述环形微流主通道（4）通过若干个微流扩散通道（5）与蛋白质结晶单元（3）联通；基片（1）的两端上分别有与环形微流主通道（4）联通的蛋白质溶液的入口（6）和出口（7）；若干个环形微流主通道（4）沿着从入口（6）到出口（7）方向通过连接通道（4.1）顺序串接联通并与其中部的蛋白质结晶单元（3）一起构成一个单列结晶单元阵列（12.1），或由若干个单列结晶单元阵列（12.1）并联构成多列结晶单元阵列（12.2）；所述入口（6）与其直接相联通的环形微流主通道（4）之间有用于从入口（6）注入的蛋白质溶液处理的分流结构（10）和/或混合结构（11）；所述的分流结构（10）和混合结构（11）为弯曲的微流通道。

2.根据权利要求1所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其特征在于，多列结晶单元阵列（12.2）的单列结晶单元阵列（12.1）共有入口（6）和出口（7）。

3.根据权利要求2所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其特征在于，多列结晶单元阵列（12.2）由两个单列结晶单元阵列（12.1）组成。

4.根据权利要求3所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其特征在于，多列结晶单元阵列（12.2）有两组，并连构成组合多列结晶单元阵列（12.3）。

5.根据权利要求1所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其特征在于，上口（3.1）为与外界环境相通的开放的孔口，用于调控蛋白质结晶单元（3）内结晶时所需的湿度，以及用于向蛋白质结晶单元（3）注入沉淀溶液。

6.根据权利要求1所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其特征在于，微流扩散通道（5）在基片（1）与基底（2）相结合的平面上，或在基片（1）中间。

7.根据权利要求1所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其特征在于，环形微流主通道（4）为圆环形，或多边环形；微流扩散通道（5）为辐射状。

8.根据权利要求1所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片，其特征在于，扩散通道（5）的高度小于等于5微米，宽度小于等于5微米；环形微流主通道（4）、连接通道（4.1）、以及分流结构（10）的微流通道和混合结构（11）的微流通道的高度均小于等于200微米，宽度均小于等于500微米；蛋白质结晶单元（3）的直径大于等于0.1毫米, 小于等于10毫米，高度小于等于8毫米。

9.一种权利要求1所述的开放式恒流扩散蛋白质结晶阵列芯片制作方法，包括如下步骤：

A、制作基片：

1)制作阳模：

先绘图并制作光学模板，包括环形微流主通道（4）、微流扩散通道（5）、连接通道（4.1）、蛋白质结晶单元（3）、分流结构（10）和/或混合结构（11），并附加“X”字型的定位标记（8）；“ ＋”字型的定位标记（9）；然后用光学曝光和/或离子刻蚀的方法制作包括环形微流主通道（4）和微流扩散通道（5）、连接通道（4.1）、分流结构（10）和/或混合结构（11）的阳模；

2)基片成型：

通过软光刻和热压印的方法复制阳模，制成具有环形微流主通道（4）、微流扩散通道（5）、连接通道（4.1）、蛋白质结晶单元（3）、分流结构（10）和/或混合结构（11）相对位置对准定位标记的PDMS，或PMMA，或PC，或PS基片（1）；

3)加工蛋白质结晶单元（3）和进口（6）及出口（7）：

通过微细加工机床定位打通基片（1）上的各蛋白质结晶单元（3）和相应进口（6）及出口（7）；

B、基片与基底粘合：

    将具有环形微流主通道（4）、微流扩散通道（5）、连接通道（4.1）、蛋白质结晶单元（3）、分流结构（10）和/或混合结构（11）的结晶单元阵列基片（1）粘合到基底（2）表面上。