CN103409442A - 一种nad激酶变体基因及其用途 - Google Patents
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Abstract
一种NAD激酶变体基因及其用途，利用易错PCR技术对NAD激酶基因进行随机突变，通过筛选获得NAD激酶变体基因，该基因中编码第43位的原脯氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，第182位的原丝氨酸的密码子突变为精氨酸的密码子，该变体基因核苷酸序列为SEQ ID No.1，可编码NAD激酶变体酶。本发明创造了对NAD+有较高催化活性的NAD激酶变体酶，能催化NAD+生成辅酶NADP+。与NAD激酶相比较，NAD激酶变体酶在测定的一例中活性提高了1-1.5倍，为生物转化生产辅酶NADP+提供了广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种NAD激酶变体基因及其用途。属于生物化工技术领域。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸又称为三磷酸吡啶核苷酸是一种广泛参与生命体氧化还原代谢及其它一系列生物化学反应的氧化性辅酶,在生物氧化过程中作为氢传递体，以还原态NADPH形式参与脂类，核苷酸以及脂肪酸等合成，是生物体内不可缺少的重要辅酶。
在生物体内，NADP的产生基本通过NAD激酶利用ATP或多聚磷酸盐作为磷酸供体催化NAD+发生磷酸化获得。NAD激酶在生物体内通常分为两类，一类是能以ATP和poly(P)作为磷酰基供体催化NAD+发生磷酸化的ATP/poly(P)-NAD激酶；而另一类仅以ATP作为磷酰基供体的酶催化NAD+发生磷酸化的ATP-NAD激酶。
NAD激酶的发现最早是在1950年，Kornberg从酵母酿酒细胞获得，之后在产朊假丝酵母等许多物种中均获得了NAD激酶。2000年Kawai等首次鉴定了结核分支杆菌H37RV的poly(P)/ATP-NAD激酶PpnK激酶基因，他们发现这一酶能催化NAD+生成NADP+。最近发现在嗜热脂肪地芽孢杆菌体内存在一个NAD激酶（对应基因NADK），是仅以ATP作为磷酰基供体的酶，能催化NAD+发生磷酸化的ATP-NAD激酶.但目前来源于该菌的NAD激酶催化能力还不够高，大规模产业化生物合成NADP+还有一定困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种NAD激酶变体基因及其用途，克服现有NAD激酶在催化合成NADP+过程中催化活性差的缺点。本发明获得的NAD激酶变体基因所表达的NAD激酶变体酶对NAD+具有更高催化活力，与具有NAD激酶基因所表达的NAD激酶相比较，催化效率上升了1-1.5倍。该变体基因的获得为NADP+的生物生产提供了广阔的应用前景。
本发明技术方案是这样实现的：
一种NAD激酶变体基因，利用易错PCR技术对NAD激酶基因进行随机突变，通过筛选获得，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，原来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的NAD激酶基因中的编码第43位的原脯氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，第182位的原丝氨酸的密码子突变为精氨酸的密码子。
一种NAD激酶变体基因的用途：所述变体基因通过基因工程技术重组表达NAD激酶变体酶，可用于催化NAD+生成NADP+。
本发明利用定向进化中的易错PCR技术对NAD激酶基因进行随机突变，根据NAD激酶基因设计一对引物，通过降低传统PCR中四种dATP、dGTP、dCTP和dTTP中任意两种的浓度并且加入一定量的MnCl2，使基因在体外扩增时随机错误引入突变获得突变基因文库，并通过一定的筛选方法获得一种NAD激酶变体基因，按此设计思想，以pET30α(+)nadk作为模板DNA，采用易错PCR定向进化技术获得易错PCR扩增产物，经NdeI–BamHI双酶切易错PCR扩增产物后，提取大小约为816bp的基因产物并与同样的酶双酶切后的大小大约为5423bp的线性质粒pET30α(+)进行连接反应,连接完毕后将连接产物转化E.Coli BL21中，涂布到到含有40μg/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到相应的突变体库。
从上述突变体库中任意挑选克隆接种到300μL含有30μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基的96微孔板中，37℃过夜培养，取50μL该过夜培养液加入到一个新的800μL含有30μg/mL卡拉霉素的TB液体培养基的1.5mL容积的96微孔板中，在37℃培养至OD600为0.6时，加入IPTG（终浓度0.4mmol/L）诱导并在25℃继续培养24h，5000r/min离心半个小时收获细胞，用500μL的pH7.2磷酸盐裂解缓冲液（0.1mg/mL溶菌酶，1μg/mL DNAseI）重悬细胞，在37℃培育2h后，立即置于-80℃冷冻2h，室温解冻，5000r/min离心20min，吸取400μL的含有NAD激酶变体酶的上清液到一个新的96微孔分析板中，加入5μL100mmol/LNAD+底物和5μL100mmol/L ATP，在28℃反应50分钟，沸水浴加热3min钝化NAD激酶变体酶酶活，并置于冰上冷却，冷冻离心收集上清液，然后在上清液中加入75μL100mM的6-磷酸葡萄糖，混匀，测定反应前OD340值，最后加入7.5μL0.1U/μL的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，在37℃反应12min，测定反应后OD340值，反应前后OD340值差值越高代表NAD激酶酶活越高，以此为指标筛选出活力高于原酶的菌株并提取质粒进行全自动DNA测序，发现突变位点为第43位的原脯氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，第182位的原丝氨酸的密码子突变为精氨酸的密码子。
本发明获得的NAD激酶变体基因所表达的NAD激酶变体酶对NAD+具有更高催化活力，与具有NAD激酶基因所表达的NAD激酶相比较，催化效率显著提高，上升了1-1.5倍。该变体基因的获得为NADP+的生物生产提供了广阔的应用前景。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细说明，但本实施例并不用于限制本发明，凡是采用本发
明的相似方法及其相似变化，均应列入本发明的保护范围。
1.突变体库的构建
A)易错PCR扩增产物的获得：
易错PCR引物设计根据NAD激酶基因设计的，为了方便以后的单一酶切在引物的5′端分别引入BamHI和NdeI位点。
向500μl的eppendorf管中加入100pmol的dNTPs,上游引物，下游引物各20pmol,大约1ng pET30α(+)nadk作为模板DNA，以及最终浓度为0.07mM MnCl2，2uTaqDNA聚合酶，5μl的PCR缓冲液,15μl25mM的MgCl2，然后加无菌的蒸馏水至总体积50μl。反应参数是通过95℃变性5分钟后，在95℃1min,54℃2min,72℃1min，经过35个循环，然后72℃延伸2min，得到PCR扩增产物。
B)重组载体pET28α(+)nadk的构建
易错PCR扩增产物经1μl10u/μl NdeI和1μl10u/μl BamHI在20μl反应体系中双酶切后提取大小约为816bp的基因产物并与同样的酶双酶切后的大小大约为5423bp的线性质粒pET30α(+)进行连接反应,连接完毕后将连接产物转化E.Coli BL21中，涂布到到含有30μg/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到相应的突变体库。
质粒pET30α(+)－nadk连接时连接酶和质粒的配比:
2.对NAD+具有高催化活性的NAD激酶变体基因的筛选
从上述突变体库中任意挑选克隆接种到300μL含有30μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基的96微孔板中，37℃过夜培养，取50μL该过夜培养液加入到一个新的800μL含有30μg/mL卡拉霉素的TB液体培养基的1.5mL容积的96微孔板中，在37℃培养至OD600为0.6时，加入IPTG（终浓度0.4mmol/L）诱导并在25℃继续培养24h，5000r/min离心半个小时收获细胞，用500μL的pH7.2磷酸盐裂解缓冲液（0.1mg/mL溶菌酶，1μg/mL DNAseI）重悬细胞，在37℃培育2h后，立即置于-80℃冷冻2h，室温解冻，5000r/min离心20min，吸取400μL的含有NAD激酶变体酶的上清液到一个新的96微孔分析板中，加入5μL100mmol/LNAD+底物和5μL100mmol/L ATP，在28℃反应50分钟，沸水浴加热3min钝化NAD激酶变体酶酶活，并置于冰上冷却，冷冻离心收集上清液，然后在上清液中加入75μL100mM的6-磷酸葡萄糖，混匀，测定反应前OD340值，最后加入7.5μL0.1U/μL的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，在37℃反应12min，测定反应后OD340值，反应前后OD340值差值越高代表NAD激酶酶活越高，以此为指标筛选出活力高于原酶的菌株并提取质粒进行全自动DNA测序，发现突变位点为Pro43→Gla,Ser182→Arg。
本发明的优点是创造了一种对NAD+具有更高催化活力的NAD激酶变体基因，其突变位点为Pro43→Gla和Ser182→Arg，与NAD激酶基因相比较，在测定的一例中活性提高了1-1.5倍。该变体基因的获得为生物合成NADP+提供了广阔的应用前景。
3.含有NAD激酶变体基因的重组大肠杆菌生物催化合成NADP+
a)挑取含有该NAD激酶变体基因第43位的原脯氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，第182位的原丝氨酸的密码子突变为精氨酸的密码子的阳性克隆接入到含有30μg/ml卡拉霉素的种子培养基中，200r/min，37℃摇床过夜培养12h。将种子液按1%(v/v)的接种量接入到含有30μg/mL卡拉霉素的1L发酵培养基中(5L的发酵罐)，200r/min，37℃培养至菌体OD600约为0.6，加IPTG至终浓度0.4mmol/L，于25℃,150r/min发酵培养培养10小时，收集菌体沉淀。
b)将上述菌体用预冷的含有50mmol/L pH7.5磷酸钾裂解缓冲液进行重悬(浓缩20倍)，然后用带探头的超声细胞破碎仪在冰浴中对细胞进行破碎。超声程序为；200W，工作30s，间隙60s，共进行8次。将细胞破碎液在4℃，14,000r/min离心30min，取上清液，即得到了含有NAD激酶变体基因表达的NAD激酶变体酶的粗酶液。吸取含有NAD激酶变体酶的粗酶液到一个新的反应器中，加入10g NAD底物，10g ATP，在28℃反应50分钟，沸水浴加热3min钝化NAD激酶变体酶酶活，并置于冰上冷却，冷冻离心收集上清液，此上清液含有产物NADP+。
c)NADP+产量采用液相色谱法测定。利用
4.6×150mm安捷伦反相C18液相柱，在254nm处对产物进行分析。采用梯度洗脱，流速为1mL/min.使用内标法定量反应液中产物，进样量为2μl。实验结果显示，当添加底物NAD+的初始浓度为15g/L时，用含有NAD激酶变体基因Asp99→Gln,Asn147→His重组大肠杆菌在5升发酵罐中进行发酵并通过超声破碎获得酶液生产NADP+，NADP+产量可达到14.5g/L，比原始NAD激酶生产NADP+能力提高了30-60%。证明了含有该NAD激酶变体基因Pro43→Gla和Ser182→Arg重组大肠杆菌的确能高效表达NAD激酶变体酶，并用来高效生物催化合成NADP+。
Claims (2)
1.一种NAD激酶变体基因，其特征在于：利用易错PCR技术对NAD激酶基因进行随机突变，通过筛选获得，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，原来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的NAD激酶基因中的编码第43位的原脯氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，第182位的原丝氨酸的密码子突变为精氨酸的密码子。
2.根据权利要求1所述的一种NAD激酶变体基因的用途，其特征在于：所述变体基因通过基因工程技术重组表达NAD激酶变体酶，用于催化NAD+生成NADP+。
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