CN103397075A - 一种辣根过氧化物酶的新底物体系及其配制方法 - Google Patents

Abstract

一种辣根过氧化物酶的新底物体系及其配制方法，所述新底物体系以天然抗氧化剂白藜芦醇作为HRP催化反应的氢供体，以H₂O₂为氧化剂。其配制方法为：将2.28-22.8毫克白藜芦醇溶于200毫升N,N-二甲基甲酰胺中，形成A液；以含有H₂O₂浓度为0.01-0.2%H₂O₂的柠檬酸-磷酸盐底物缓冲液为B液，使用时将1-5微升的A液与5-20微升的B液混合后即可使用。本发明主要针对辣根过氧化物酶的传统化学合成底物稳定性、溶解性较差，使用中对人体毒副作用大等缺陷，而新辣根过氧化物酶底物白藜芦醇性质较稳定，对酶反应灵敏性高，对人体无毒副作用，具有取代传统HRP底物的潜力。

Description

一种辣根过氧化物酶的新底物体系及其配制方法

技术领域

本发明属于生物化学领域,它涉及一种测定辣根过氧化物酶的新底物体系及其配制方法。

背景技术

辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，是一种重要的分析化学试剂。已被广泛用于临床化学、环境化学和食品工业等领域。例如，HRP酶应用于免疫分析中，形成具有重要意义的酶联免疫分析法（ELSA）.酶联免疫分析将酶的催化放大作用与免疫反应的特异性结合，使得免疫分析方法的灵敏度大大提高，因而在实际中获得了较广泛的应用，辣根过氧化物酶（HRP）基型酶联免疫分析是其中应用最成功的方法之一.该方法一般是利用HRP-抗体/抗原连接物催化H₂O₂氧化酶底物，生成不同二聚或多聚产物，如醌式或偶氮类物质等，通过分光光度、电化学、化学/电化学发光等方法测定这些酶催化产物的光谱信号、电化学活性等，间接测定抗体/抗原或半抗原，因此，HRP底物体系的选择直接关系着这些方法的灵敏性、检测限及稳定性等性能。

目前常用的HRP底物主要为苯酚类、苯胺类和其衍生物，诸如苯二胺类、氨基酚类、联苯胺类、以及由苯胺类衍生出来的一些偶氮染料等，这些底物存在：（1）多数稳定性差，见光或空气极易被氧化底物保存困难，需现配新用；（2）由H₂O₂单独氧化的信号与HRP-H₂O₂催化氧化的信号比值大，背景信号较强；（3）其中有的底物或反应产物对人类身体有毒害作用，如偶氮染料、苯胺、苯二胺等。针对上述问题，发明人对HRP底物开展了较为有效的研究。本发明开发了一种新型HRP底物：反式-3，4，5-三羟基-12-二苯乙烯（白藜芦醇，如下式所示）。白藜芦醇（resveratrol）是一种从葡萄皮、虎杖等植物中提取得到的天然活性成分，对人体健康具有重要保健作用^[8]；用作HRP底物具有对反应灵敏、在空气中稳定等特点。同时，开发了底物体系的配制方法，该体系配制简单易操作、酶催化反应效率高，现象明显。

上式为白藜芦醇的结构。

发明内容

本发明目的是开发一种以天然活性成分为HRP底物的反应体系，及其酶催化反应体系的配制方法。开发成功的天然抗氧化剂白藜芦醇在空气中相对稳定，对HRP酶反应敏感，对操作人员安全无毒；底物溶解性好、颜色对比度高。具体内容如下：

1. 底物体系的供氢体为白藜芦醇。白藜芦醇存在于葡萄（红葡萄酒）、虎杖、花生、桑椹等植物的天然抗氧化剂。白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，是肿瘤的化学预防剂，对降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病，对骨质疏松、痤疮及老年痴呆症有预防作用。本发明首次将白藜芦醇用作HRP催化反应体系的供氢体，即HRP底物。

2. 该底物体系组成包括：白藜芦醇、双氧水和磷酸盐缓冲体系。HRP催化该体系反应原理同已报导的底物，分三步进行：

第一步，形成绿色有活性的酶一底物复合物I：

HRP + H₂O₂ Û 复合物I

第二步，复合物Ⅰ转变成褐色有活性的复合物II：

复合物I+白藜芦醇复合物II+ 氧化白藜芦醇

第三步，复合物Ⅱ被还原，释放出酶：

复合物II + 白藜芦醇 ® HRP + 氧化白藜芦醇 + H₂O

3.本发明底物体系的配制方法为：首先将2.28-22.8毫克白藜芦醇溶于200毫升N,N-二甲基甲酰胺中，形成A液；以含有H₂O₂浓度为0.01-0.2% H₂O₂的磷酸盐底物缓冲液为B液，使用时将1-5微升的A液与5-20微升的B液混合后即可使用。

含有双氧水的柠檬酸-磷酸盐底物缓冲溶液为：

0.1M柠檬酸 48.6 mL

0.2M Na₂HPO₄ 51.4 mL

白藜芦醇 10 mg

30% H₂O₂ 125 mL

4.辣根过氧化物酶的测定方法。HRP活力测定方法操作如下：

取2个比色池（带盖，光程1厘米），按下表加入反应物

*酶液：将1 mg蛋白/mL的酶液用柠檬酸-磷酸盐缓冲液稀释10倍后应用。加好反应物，摇匀，在457nm 读出OD值，为t=0 的读数。立即加0.01毫升40 mM过氧化氢溶液于2个比色池中，即刻摇匀并记时，每隔30秒钟读数一次，约5分钟。并记下实验时的室温。将所测样品的OD值减去相应时间对照的OD值，然后以OD值为纵坐标，时间为横坐标作图。得一直线，计算出平均每分钟光密度的增加值，即求出△x/△t，按公式求出k₄值。

本发明与现有辣根过氧化物酶比色底物相比具有以下优点和突出效果：

（1）白藜芦醇对HRP反应敏感性高，用于测定HRP的灵敏度较高。我们对比测试了白藜芦醇和传统比色底物对HRP和H₂O₂的反应，结果见下表1

表1 白藜芦醇、OAP、OPD和TMB对HRP+ H₂O₂和H₂O₂的反应吸光值（OD）变化。

由表上可以看出，白藜芦醇对HRP的响应值较大，故用于测定HRP的灵敏性较高。

（2）白藜芦醇对温度和氧气反应不敏感，在空气中相对稳定。对白藜芦醇和HRP传统底物OAD、OPD和TMB对温度的敏感性进行了测试，实验结果显示，在温度达到65度时，白藜芦醇被分解仅为8%，而OPD、OAD和TMB分别达到16%、27%和20%。

（3）白藜芦醇为天然提取物，对人体无毒副作用，操作安全。

具体实施方式：

在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。

实施例 1

称取2.28 mg白藜芦醇，加入到20 ml的N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌使之完全溶解，然后密封放入低温（4℃）保存，用微型注射器吸取10 ml体积的底物与10 ml含有H₂O₂的柠檬酸-磷酸盐底物缓冲液混合。由于白藜芦醇在水中的溶解度很小，不能溶解于缓冲液中，而其在乙醇、N,N-二甲基甲酰胺中等级性溶剂中溶解度大，但是用乙醇溶解用缓冲液稀释时易于析出。所以，选用N,N-二甲基甲酰胺预溶解，用时只需吸取所需量的底物直接加入到柠檬酸-磷酸盐底物缓冲液中。

实施例 2

称取11.4 mg白藜芦醇，加入到50 ml的N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌使之完全溶解，然后密封放入低温（4℃）保存，用微型注射器吸取30 ml体积的底物与30 ml含有H₂O₂的柠檬酸-磷酸盐底物缓冲液混合。由于白藜芦醇在N,N-二甲基甲酰胺中溶解度大，以11.4 mg白藜芦醇溶解于50 ml的N,N-二甲基甲酰胺中，很容易实现，用时只需吸取所需量的底物直接加入到柠檬酸-磷酸盐底物缓冲液中即可。

实施例 3

称取11.4 mg白藜芦醇，加入到100 ml的N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌使之完全溶解，储备液放入低温（4℃）保存。根据实际要求分装到10-20 ml的小透明玻璃瓶或棕色瓶中，每瓶可分装成5 ml，一般每瓶分装底物的量为2 mg左右。这样分装的底物由于是一次称量，分装成一批等量的底物，分装量一致，而且白藜芦醇底物溶液的体积只有5ml左右，一个分装瓶可以供一块96孔酶标反应板使用。用前只要将10 ml含有双氧水的柠檬酸-磷酸盐底物缓冲液加入底物瓶中摇匀即可使用。这种方式配制的底物溶液相对一致，可以降低误差，而且底物溶液很容易溶解缓冲液中。

实施例 4

称取22.8 mg白藜芦醇，加入到200 ml的N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌使之完全溶解。然后分装到10-20 ml的小透明玻璃瓶或棕色瓶中，根据实际需要每瓶可分装成5 ml，一般每瓶分装底物的量为2 mg左右，分装好后放入低温（4℃）保存。这样分装的底物由于是一次称量，分装成一批等量的底物，分装量一致，而且白藜芦醇底物溶液的体积只有5ml左右，一个分装瓶可以供一块96孔酶标反应板使用。用前只要将10 ml含有双氧水的柠檬酸-磷酸盐底物缓冲液加入底物瓶中摇匀即可使用。这种方式配制的底物溶液相对一致，可以降低误差，而且底物溶液很容易溶解缓冲液中。

Claims (2)

1.一种辣根过氧化物酶的新底物体系，其特征在于：该底物为一种从植物中提取纯化的天然活性成分，即白藜芦醇在辣根过氧化物酶测定方面的应用。

2.根据权利1要求所述的一种辣根过氧化物酶的新底物体系 底物的应用在于测定辣根过氧化物酶，测定HRP时底物溶液体系的配制方法，其特征在于底物溶液体系组成为白藜芦醇、双氧水和柠檬酸-磷酸盐缓冲液，其配制比例为：

0.1M柠檬酸 48.6 mL

0.2M Na₂HPO₄ 51.4 mL

白藜芦醇 4.56 mg

30% H₂O₂ 125 mL　。