CN103370332B - 生物学活性的经放射性标记的Cry1Fa和受体结合测定方法 - Google Patents
生物学活性的经放射性标记的Cry1Fa和受体结合测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
半胱氨酸特异性的经放射性标记的Cry1Fa蛋白保留针对昆虫有害生物的杀昆虫活性，并且以可饱和方式结合昆虫刷状缘膜囊受体。生物学活性的经放射性标记的Cry1Fa蛋白可用于与其它Cry毒素的竞争性结合测定法。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2010年12月16日提交的美国临时申请流水号61/423,844的权益，其公开内容在此通过提及完整(包括所有图、表和氨基酸和核酸序列)并入。
发明背景
本领域的一般领域是生命科学，特别是农业科学和测试方法的领域。具体地，本发明的领域是苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)晶体(Cry)内毒素及其与昆虫Cry毒素受体相互作用的生物化学和作用模式。
Cry杀昆虫性蛋白质是由苏云金芽孢杆菌(Bt)(即一种在不同土壤类型中分布的在全球发现的革兰氏阳性细菌)生成的内毒素。各类Cry蛋白针对某些昆虫有害生物是选择性毒性的。内毒素通常以位于细菌的较大包含体中的晶体蛋白质形式找到。Cry毒素具有相当大的序列多样性(Crickmore等,1998;deMaagd等,2003)，但是具有针对鳞翅目有害生物的活性的大多数毒素是具有三域活性核心毒素结构的130kDa原毒素(deMaagd等,见上文)。
本发明的主题涉及Cry1Fa毒素，即一种三域Cry蛋白。此毒素已经表明针对各种鳞翅目昆虫，包括草地夜蛾(J.E.Smith)(秋季粘虫)和玉米螟(Ostrinianubilalis)(Hübner)(欧洲玉米螟)(它们是两种经济上最重要的玉米昆虫有害生物)的杀昆虫活性。Cry1Fa是称为玉米中的事件TC1507和棉中的事件281-24-236的两种USDA脱调节的转基因植物掺入的杀虫剂的毒素组分。
与其它三域Cry毒素一样，Cry1Fa全长全毒素蛋白需要N端和C端末端的蛋白水解切割以活化其杀昆虫活性。鳞翅目昆虫的中肠含有多种胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样蛋白酶，其将全长全毒素加工成具有约68kDa的大小的核心毒素结构(Christeller等,1992;Gatehouse等,1997;Bernardi等,1996)。该加工牵涉从N端除去约28个氨基酸及从C端除去约530氨基酸(原毒素区段)，并且所得的核心毒素区段得到释放，并且结合位于昆虫肠内的特定受体。
昆虫可以经由结合Cry蛋白核心毒素的中肠定位受体的变化而形成对Cry蛋白毒素活性的抗性(Heckel等,2007;VanRie等,1990b)。此外，已经证明其它抗性形成机制，包括：降低的原毒素活化、昆虫中肠中Cry受体数目的变化、和通过形成促成昆虫死亡率的膜孔而响应毒素的能力的丧失(参见Griffitts和Aroian,2005;及VanRie等,1990b)。
在本发明前，尚未报告表征Cry1Fa核心毒素蛋白对不同昆虫受体的结合的研究。原因在于牵涉氧化的碘同位素与Cry1Fa毒素中的酪氨酸残基起反应的传统放射性标记方法生成丧失其结合从甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和草地夜蛾的中肠制备的刷状缘膜囊(BBMV)(brushbordermembranevesicle)中的受体的能力的经放射性标记的核心毒素蛋白(Luo等,1999)。此外，发现了传统上经放射性标记的Cry1Fa核心毒素蛋白丧失其杀昆虫活性，并且在针对这些夜蛾(Spodoptera)物种的饮食生物测定法中是无活性的。已经尝试了其它蛋白质标记方法诸如荧光标记，以及其它测量配体-受体结合的方法诸如等温量热学，但是已经发现了或是太不灵敏，或是由于昆虫BBMV的颗粒特性而太难以致于不能使用的光学方法。
Palmer等(1997)描述了一种在半胱氨酸残基处特异性放射性标记蛋白质的间接方法。在此方法中，首先使中间化合物荧光素-5-马来酰亚胺与放射性碘起反应，然后，使用放射性标记的荧光素-5-马来酰亚胺来在可用的半胱氨酸残基处化学修改蛋白质。本发明描述了使用Palmer等的高度特异性方法通过靶向位于Cry1Fa核心毒素的域1中的单一半胱氨酸残基(C205)放射性标记Cry1Fa蛋白。
最令人感兴趣的是发现将此空间上难处理的经放射性标记的5-马来酰亚胺导入通过此方法制备的Cry1Fa核心毒素蛋白中没有导致对其受体结合的丧失或者引起毒素失活。因此，此非传统放射性标记的Cry1Fa核心毒素维持足够的三级蛋白质结构，从而保留其杀昆虫活性和其特异性结合来自多种昆虫的BBMV制备物中的受体的能力两者。
发现了非传统放射性标记的Cry1Fa蛋白以可饱和方式结合受体，并且在竞争性结合测定法中使用以测定其它Cry毒素是否竞争其结合。使用此测定法，证明了波多黎各中收集的草地夜蛾群体中形成的对Cry1Fa毒素的田间抗性是由于这些昆虫的BBMV中的受体结合Cry1Fa核心毒素蛋白的能力丧失所致。
附图简述
图1是经胰蛋白酶截短的Cry1Fa和经荧光素-5-马来酰亚胺标记的、经胰蛋白酶截短的Cry1Fa针对草地夜蛾幼虫的生物测定法。该图汇总了使用通过本发明的方法制备的碘化(非放射性)Cry1Fa核心毒素蛋白用草地夜蛾新生幼虫的昆虫饮食生物测定法的结果。
图2显示了放射性碘化的Cry1Fa核心毒素蛋白对欧洲玉米螟(ECB)BBMV的饱和结合曲线。该图描绘了通过本发明的方法制备的放射性碘化的Cry1Fa核心毒素蛋白对从玉米螟(Ostrinianubilalis)幼虫中肠制备的BBMV的饱和结合。
序列标识符的简述
SEQIDNO:1是编码Cry1Fa全毒素的合成DNA序列。
SEQIDNO:2是Cry1Fa全毒素。
发明详述
Cry1Fa蛋白的三个结构域位于对进一步胰蛋白酶消化有抗性的“胰蛋白酶酶解核心”内。域I由7个α-螺旋构成，认为所述α-螺旋插入昆虫中肠的膜中，并且形成孔样结构(Ballester等,1999)。域II由三个反向平行β-片层组成，而域III形成β-三明治式结构(Pigott和Ellar,2007)。认为域II和III的暴露区与位于昆虫中肠的腔体表面上的特定受体相互作用，并且紧密结合这些受体(Bravo等,2007;deMaagd等,1996;deMaagd等,1999;Gomez等,2006;Herrero等,2004;Lee等,1999)。毒素对受体的结合是杀昆虫活性的必需要求，并且提供了毒素的特异性和选择性(Pigott和Ellar,2007;Rausell等,2004)。已经显示了不同Cry蛋白针对不同昆虫物种的活性的特异性与存在于不同昆虫中的受体差异部分相关(Gomez等,2003;Gomez等,2007;VanRie等,1990a)。
定量生物化学测定法提供了测量Cry毒素与存在于昆虫中肠中的受体蛋白质的相互作用的手段。在饱和型结合测定法中，将经标记的Cry毒素蛋白(配体)在缓冲溶液中温育，所述缓冲溶液促进Cry毒素蛋白对昆虫受体蛋白的结合。在饱和结合测定法的一个实施方案中，固定量的昆虫受体蛋白(通常是从昆虫中肠制备的刷状缘膜囊)与增加量的碘化的Cry毒素蛋白混合(在分开的管中)，并且容许起反应固定(set)的时间量。通过多种方法之一将未结合的Cry蛋白(也就是说，没有结合昆虫受体蛋白)与结合的蛋白质分开，并且结合的蛋白质级分中的放射性量提供了与昆虫受体结合的Cry蛋白量的指示。生物化学领域技术人员会认识到很少或没有观察到结合的放射性会指示生成受体制备物的昆虫物种中研究的特定Cry毒素受体的缺乏。
结合测定法的第二个实施方案是竞争性测定法。在竞争性结合测定法中，将反应性Cry毒素蛋白与过量的第二、非放射性Cry蛋白混合，并且容许Cry蛋白在标准条件下结合昆虫受体蛋白。若第二、非放射性Cry毒素蛋白能够与放射性Cry毒素蛋白竞争对昆虫受体的结合，则放射性蛋白质会从受体结合位点置换，并且很少的放射性会以结合状态回收。若非放射性和放射性Cry毒素蛋白结合不同昆虫受体蛋白，则它们不会在结合相同昆虫受体蛋白中不会彼此竞争。在此情况中，结合的蛋白质级分中回收的放射性量会是相同的，或几乎相同的，因为此时非放射性第二Cry毒素蛋白不存在于结合反应中。多种方法可用于量化结合的蛋白质级分中的放射性量。
使用125I-Cry1Fa核心毒素蛋白和非放射性Cry1Fa核心毒素蛋白(对照反应)或Cry1Ab核心毒素蛋白的竞争性结合测定法表明这两种非放射性核心Cry毒素蛋白都能够从来自草地夜蛾的BBMV中的其受体位点置换经标记的Cry1Fa核心毒素。相反，竞争性结合测定法表明所述Cry1Ca核心毒素蛋白不竞争Cry1Fa核心毒素结合。这些结合测定法的结果表明在波多黎各收集的草地夜蛾群体中在田间研究中观察到的对Cry1Fa毒素的昆虫抗性可以通过来自这些昆虫的刷状缘膜囊中的受体不能结合Cry1Fa核心毒素来解释。
本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物通过提及以它们不与本申请的明确教导不一致的程度完整并入。
核酸序列以标准5’至3’方向呈现，而蛋白质序列以标准氨基(N)端至羧基(C)端方向呈现。
除非明确指示或暗示，如本文中所使用的，术语“一个/一种”、“该/所述”表示“至少一个/种”。
下文是例示实施本发明的规程的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。除非另有记录，所有百分比以百分比计，并且所有溶剂混合物比例按体积计。所有温度以摄氏度计。
实施例
实施例1
编码Cry1Fa毒素蛋白的表达质粒的构建及在细菌宿主中的表达
在构建pDAB1817，即工程化改造为生成由植物优化的编码序列(CDS;SEQIDNO:1)编码的由Cry1Fa核心毒素区段(氨基酸1至603)和Cry1Ab原毒素区段(氨基酸604至1148)构成的嵌合毒素蛋白(本文中称为Cry1Fa毒素；SEQIDNO:2)的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens,Pf)表达质粒中使用标准克隆方法(如例如Sambrook等,(1989)及Ausubel等,(1997)及其更新提供的)。
pDAB1817源自pMYC1803(美国专利No.7338794)。基本克隆策略需要将侧翼有SpeI和KpnI限制酶识别位点且含有Cry1Fa毒素CDS的DNA片段与通过用SpeI和KpnI限制酶切割pMYC1803DNA制备的pMYC1803大片段连接。质粒pMYC1803是一种自基于RSF1010的质粒pTJS260衍生的中等拷贝质粒(参见美国专利No.5169760)，并且携带调节型四环素抗性标志物和来自RSF1010质粒的复制和移动基因座。通过此手段，Cry1Fa毒素CDS置于来自质粒pKK223-3(PLPharmacia,Milwaukee,WI)的Ptac启动子和rrnBT1T2终止子的表达控制下。通过电穿孔将表达质粒pDAB1817转化入荧光假单胞菌菌株MB217(一种菌株MB101衍生物；荧光假单胞菌生物变型I)中，选择对四环素有抗性。通过对微量制备质粒DNA的限制性消化鉴定重组体菌落。
在发酵罐中的生长和表达分析：通过发酵罐培养的荧光假单胞菌表达菌株隔离群DR1649实现Cry1Fa毒素蛋白的生成，用于生物化学操作和昆虫生物测定法。将种子培养物在含有600mL补充有15μg/mL四环素的Ps20培养基的摇瓶中于32°培养20小时(600nm的最终光密度=14)，并用于接种20L发酵罐罐体(NewBrunswickScientificBioFlo4500,Edison,NJ)中6.6L具有四环素的DGMp2.2培养基。于32°在以200至1000rpm搅拌的情况下实施发酵。荧光假单胞菌的微生物学操作的详情在Squires等(2004),美国专利申请No.20060008877,美国专利No.7681799,美国专利申请No.20080058262,及Huang等(2007)中可得到，它们通过提及并入本文。响应溶解氧浓度以10gm/L周期性分批补料甘油。通过添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导经由Ptac启动子表达Cry1Fa毒素CDS。贯穿诱导后发酵时间监测培养物以测定细胞密度、靶基因表达水平、及其它参数。对于SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)和免疫印迹分析，冷冻0.1mL全发酵培养液的等分试样以进行随后的分析。在IPTG诱导后48小时的最终时间点(600nm的光密度=222；最终培养物体积=13.5L)，通过以10000×g离心90分钟收获来自4L培养物的细胞。将细胞团粒于-20°或-80°冷冻，用于进一步加工。
对发酵样品的SDS-PAGE分析：将冷冻的发酵罐细胞培养液(0.1mL)在冷水中稀释5倍，并使用具有20个单位的恒定输出的1/8英寸直径微尖端使用Branson250超声波仪(BransonUltrasonics,DanburyCT)将200μL在冰中超声处理10分钟。将溶胞物以14000rpm离心20分钟(4°)，并除去上清液(可溶性级分)。然后，将团粒在200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS;11.9mMNa2HPO4,137mMNaCl,2.7mMKCl,pH7.4;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中重悬。在PBS中实施将多至20倍初始发酵培养液的等同物的可溶性和不溶性级分两者的进一步稀释。然后，将这些级分以1:1与含有5%β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液(Bio-RadInc.,Hercules,CA;)混合，并煮沸5分钟，之后在具有MOPS缓冲液的Criterion10%Bis-Tris凝胶(Bio-RadInc.)上加载10μL至20μL。用SimplyBlueSafeStainTM(Invitrogen,Carlsbad,CA)依照制造商的方案染色凝胶。
免疫印迹：使用标准生物化学方法(如例如Sambrook等,(1989)和Ausubel等,(1997)及其更新提供的)进行蛋白质分离和免疫印迹分析。制备样品，并依照制造商关于变性电泳建议的方案(Invitrogen)通过电泳通过MES运行缓冲液中的NuPAGE4-12%Bis-Tris凝胶分离蛋白质。将蛋白质在NuPAGE转移缓冲液中于30V转移到硝酸纤维素膜上达80分钟。将印迹于室温在5%乳/PBST(具有0.05%Tween-20的PBS)中封闭1小时，然后，用一抗(对Cry1Fa核心毒素区段特异性)，然后用二抗于室温在封闭溶液中各探查1小时，在每种抗体间在PBST中漂洗15分钟。使用Pierce的ECLWestern印迹底物依照制造商的方案(ThermoFisherScientific,Rockford,IL)完成印迹显现。
实施例2
从荧光假单胞菌生成的包含体纯化Cry1Fa核心毒素蛋白
包含体制备物：从含有不溶性Cry1Fa毒素蛋白的荧光假单胞菌DR1649细胞制备蛋白质包含体(IB)，如通过SDS-PAGE和MALDI-MS(基质辅助激光解吸/离子化质谱术)证明的。使用来自Micromass(Milford,MA)的MALDI-R(Reflectron)质谱仪依照制造商规定的方法和推荐测量肽质量。将冷冻的细胞团粒在室温水浴中融化。将细胞在裂解缓冲液(50mMTrisHCl,pH7.5;200mMNaCl;5%甘油;2mMEDTA二钠盐(乙二胺四醋酸);0.5%TritonX-100;和1mMDTT(二硫苏糖醇，刚好在使用前添加))中重悬至10%w/v。对于每100gm处理的细胞糊，添加25mL蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)。将浆体两次通过12000+psi的MicrofluidicsMicrofluidizer(MicrofluidicsIntern.Corp.,Newton,MA)。将溶胞物以18000xg于4°离心30分钟，并保留上清液。将内含物团粒在没有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中清洗，直到没有细菌气味残留(通常清洗2或3次)，其通过使用刮勺或机械混合器温和均质化(至约10%w/v固体)，并如上文所描述的那样离心来进行。将所得的上清液和最终的团粒保留，并于-20°贮存。将每个样品的小等分试样采集，并在微量离心管中贮存，用于SDS-PAGE分析。然后，使用VirtisAdvantage冷冻干燥器(ViopharmaProcessSystemsLTD,Winchester,UK)于周围架(ambientshelf)温度冷冻干燥包含体制备物团粒，并以最大真空抽吸2天。然后，将所得的粉末于-20°贮存，直到分析。
IB制备物的SDS-PAGE分析和定量：将25mgIB团粒在1mLHTS缓冲液(20mMTrisHCL,pH7.5;50mMNaCl;5%v/v甘油,10mMEDTA二钠盐;0.5%v/vTritonX-100)中重悬，并如上文那样在冰上超声处理1分钟。然后，将重悬的样品以1:1在含有0.2MDTT的Laemmli样品缓冲液中稀释。然后，将样品用没有DTT的Laemmli样品缓冲液稀释10倍和20倍，并将10μL加载到用1XNuPAGEMES缓冲液(Invitrogen)运行的Criterion18孔10%Bis-Tris凝胶(Bio-RadInc.)上。将凝胶于100V运行5分钟，然后于200V运行45分钟。将凝胶在水中漂洗并清洗20分钟，并用SimplyBlueSafeStainTM染色。通过相对于同一块凝胶上运行，并扫描以产生密度计量标准曲线的一系列牛血清清蛋白(BSA)标准样品比较条带的密度计量数值来完成靶条带的量化。
Cry1Fa核心毒素蛋白的截短和纯化：将纯化的包含体用无菌水清洗，然后通过于室温摇动蛋白质溶液1小时在含有10mMDTT的20mMCAPS,pH11(3-(环己氨基)1-丙磺酸)中溶解。在通过离心(30000xg于4°持续30分钟)除去不溶性材料后，将用0.5%(w/v)甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮(TPCK)(Sigma-Aldrich)处理的胰蛋白酶添加至上清液。将此溶液于室温在混合情况下温育1小时，过滤，并使用AmiconUltra-15再生性纤维素离心滤器装置(30000分子量截留;Millipore)浓缩5倍，然后加载到用20mMCAPSpH10.5平衡的PharmaciaMonoQ1010柱上。用2个柱体积缓冲液清洗加载柱后，以1.0mL/分钟的流速使用15个柱体积的20mMCAPSpH10.5中0至0.5MNaCl的线性梯度洗脱截短的毒素蛋白质。纯化的经胰蛋白酶截短的Cry1Fa核心毒素在约0.2M至0.3MNaCl洗脱。通过使用考马斯亮蓝染料(下述)显现通过SDS-PAGE检查蛋白质的纯度。在一些情况中，将纯化毒素的组合级分浓缩，并加载到Superose6柱(1.6cm直径,60cm长;GEHealthcareLifeSciences)上，并通过大小排阻层析进一步纯化。将包含与截短的核心毒素的单体大小(约68kDa)对应的单一峰的级分组合并浓缩，产生在具有约68kDa的分子量的蛋白质方面大于95%同质的制备物，如通过SDS-PAGE判断的。
对纯化的Cry1Fa核心毒素的SDS-PAGE分析：通过Laemmli的方法(按照Sambrook等,见上文)在还原性和变性条件下进行经胰蛋白酶截短的Cry1Fa毒素蛋白的SDS-PAGE分析。使用5%β-巯基乙醇实现蛋白质的还原，并于90°在存在2%SDS的情况中实施热变性5分钟。将蛋白质加载到4%至20%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)的孔中，并于200伏特分离60分钟。将蛋白质条带用考马斯亮蓝R-250(Bio-Rad)染色1小时，然后，在存在纤维素泡沫的情况中用7%乙酸中的5%甲醇溶液脱色。使用Bio-RadFluro-SMultiImagerTM及QuantityOneTM成像软件将凝胶成像并分析。通过纳入BenchMarkTM蛋白质梯(LifeTechnologies,Rockville,MD)的样品测定蛋白质条带的相对分子量或者查看一个凝胶孔中BlueTM预先染色的分子量标志物(Invitrogen)。
实施例3
特异性放射性碘化的Cry1Fa核心毒素蛋白的制备
Cry1Fa核心毒素蛋白的碘化：先前的工作表明Cry1Fa毒素蛋白的碘化破坏碘化蛋白质结合其在昆虫刷状缘膜囊(BBMV)中的受体的能力，及该蛋白质的昆虫毒性(Luo等,1999)。在所述研究中，使用标准碘化珠方法(Pierce碘化珠;ThermoFisherScientific)放射性碘化Cry1Fa毒素蛋白，并且结合研究揭示了该蛋白质已经丧失所有其在特异性结合来自甜菜夜蛾和草地夜蛾的BBMV中的受体方面的能力。此外，在采用碘化珠法使用非放射性标记的NaI来碘化Cry1Fa毒素蛋白时，发现碘化的Cry1Fa在饮食生物测定法中已经丧失其针对夜蛾幼虫的杀昆虫活性。
通过碘化珠方案的蛋白质碘化在酪氨酸上的羟基基团邻位发生；可以发生单或二取代。如此，碘化的位置取决于主题蛋白质内酪氨酸残基的放置，并且多次碘化可以具有破坏蛋白质的结构和/或功能的后果。注意到Cry1Fa核心毒素区段包含20个酪氨酸残基，其可以充当碘化靶物。
本实施例教导一种用放射性碘标记Cry1Fa核心毒素蛋白的备选方法。随后的实施例教导经放射性标记的核心毒素蛋白结合昆虫BBMV，并且碘化的Cry1Fa核心毒素蛋白在昆虫饮食生物测定法中有活性。此外，这些实施例教导经酪氨酸截短的Cry1Fa核心毒素蛋白可以使用荧光素-5-马来酰亚胺在与Cry1Fa毒素蛋白的C205残基对应的半胱氨酸处特异性荧光标记，而且经荧光标记的蛋白质有生物学活性，在与非标记的、经酪氨酸截短的Cry1Fa核心毒素的那些剂量相等的剂量引起昆虫死亡率。
Cry1Fa核心毒素区段在第9位、第14位、和第205位含有三个半胱氨酸氨基酸残基。通过胰蛋白酶处理截短蛋白质除去C9和C14，提供保留与C205残基对应的半胱氨酸的核心毒素区段。Palmer等(1997)证明可以将荧光素-5-马来酰亚胺的苯基环放射性碘化，然后与含有硫氢基基团(例如由游离的半胱氨酸残基提供)的蛋白质起反应，导致蛋白质中游离的半胱氨酸的烷基化，而且如此提供经放射性标记的蛋白质。经胰蛋白酶截短的Cry1Fa核心毒素在与C205对应的位置处含有单一半胱氨酸残基，如此为蛋白质在单一(特异性)位点处的烷基化和放射性标记提供底物。
将荧光素-5-马来酰亚胺(F5-M)在DMSO(二甲亚砜)中溶解至10mM，然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS;20mM磷酸钠,0.15MNaCl,pH7.5)中稀释至1mM，如通过F5-M的摩尔消化系数(68,000M-1cm-1)测定的。在铅防护后面向70μL含有两个Pierce碘化珠(ThermoFisherScientific)的PBS溶液添加0.5mCiofNa125I。(使用非放射性NaI实施类似的规程以制备(碘化的、非放射性)经荧光标记的Cry1Fa核心毒素蛋白)。容许溶液于室温混合5分钟，然后添加10μL1mMF5-M溶液。在起反应10分钟后，通过移液自碘化取出溶液，并对该溶液添加PBS中的2μg高度纯化的经胰蛋白酶截短的Cry1Fa核心毒素蛋白。将蛋白质于4°与碘化的F5-M溶液一起温育48小时，此时通过将β-巯基乙醇添加至14mM终浓度来终止反应。将反应混合物添加至20mMCAPS,150mMKCl,pH9中平衡的ZebraTM旋转柱(Invitrogen)，并以1500xg离心2分钟以分离非反应性碘化染料与蛋白质。在gamma计数器中计算经125I放射性标记的荧光素-Cry1Fa核心毒素蛋白以测定其比放射性(假设输入毒素蛋白的80%回收率)。
经放射性标记的Cry1Fa核心毒素蛋白的比活是约1.1μCi/μg蛋白。与使用碘化珠规程标记类似大小的蛋白质的典型预期水平相比，此比活是较低的。据推测，这是由于标记的单一位点(对应于C205)，及由于(可能地)所述位点的相对难接近所致，所述位点假设深入位于核心毒素区段的域I内(基于使用Cry1Aa蛋白的比较晶体结构的定位)。
还通过SDS-PAGE表征经放射性标记的蛋白质，并通过磷光体(phosphor)成像来显现以确认测量的放射性与Cry1Fa核心毒素蛋白共价联合。通过SDS-PAGE、磷光体成像和gamma计数测定经放射性碘化的Cry1Fa核心毒素蛋白的放射性纯度(随后检测与其BBMV受体结合的Cry1Fa)。如下对经考马斯染色的SDS-PAGE凝胶成像，即将它们在MylarTM膜(厚12μm)包裹，并将它们在MolecularDynamics(Sunnyvale,CA)贮存磷光体屏(35cmx43cm)下暴露1小时。使用MolecularDynamicsStorm820磷光体成像仪显现板，并使用ImageQuantTM软件分析图像。使用刀片从凝胶切出放射性条带以及刚好在该条带之上和之下的区域，并在gamma计数器中计数。在Cry1Fa核心毒素蛋白条带中及在该条带下的区域中检测放射性。在Cry1Fa核心毒素蛋白条带上的凝胶区域中没有检出放射性。一些放射性在Cry1Fa核心毒素蛋白条带下的凝胶区域(即，比Cry1Fa核心毒素蛋白小的片段)中可检出。这些放射性污染物可能代表Cry1Fa核心毒素蛋白的降解产物。
在昆虫饮食喂养生物测定法中使用如此制备的经荧光标记的(非放射性、碘化的)Cry1Fa核心毒素蛋白以证明昆虫毒性尚未受到影响，并且在与BBMV制备物的结合研究中使用放射性碘化的(经荧光标记的)Cry1Fa核心毒素蛋白以证明受体结合活性尚未受到影响。
实施例4
昆虫饮食喂养生物测定法
对经胰蛋白酶截短的Cry1Fa核心毒素蛋白(或是经非放射性碘荧光素-5-马来酰亚胺标记的，或是未标记的)个别测试其在针对草地夜蛾(秋季粘虫；FAW)幼虫的最高负荷(topload)饮食生物测定法中的杀昆虫活性。从获自由商业昆虫饲养所(BenzonResearchInc.,Carlisle,PA)维持的集落的卵孵出FAW的幼虫。
在特别为昆虫生物测定法设计的128孔塑料盘(C-DInternational,Pitman,NJ)中进行生物测定法。每孔含有0.5mL多物种鳞翅目饮食(SouthlandProducts,LakeVillage,AR)。通过移液管将40μL纯化的Cry1Fa核心毒素蛋白(其在10mMCAPS,pH10.5中稀释至多个浓度)的等分试样，或40μL对照溶液投递至每孔的饮食表面(26.7μL/cm2)上。每份样品测试16个孔。阴性对照是不含蛋白质的CAPS缓冲溶液空白。阳性对照包括全长Cry1Fa毒素的制备物。将经处理的盘在通风橱中保持，直到饮食表面上的液体已经蒸发或者吸收到饮食中。Cry1F毒素蛋白的饮食浓度以孔中每平方厘米表面(1.5cm2)的Cry1F毒素蛋白量(ng)计算。
在孵化的几个小时内，用湿润的骆驼毛刷挑出个体幼虫，并在经处理的饮食上放置，每孔一个幼虫。然后，将经侵袭的孔用经开孔以容许气体交换的透明塑料粘合片(C-DInternational,Pitman,NJ)密封。将生物测定盘在受控的环境条件(28°，约40%相对湿度，16:8(光照:黑暗))下保持5天，在该时间后，记录暴露于每种蛋白质样品的昆虫总数、死亡昆虫数目、和存活昆虫重量。对每个处理计算百分比死亡率和百分比生长抑制。生长抑制(GI)如下计算：
GI=[1–(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]
其中TWIT是处理中的昆虫总重量，
TNIT是处理中的昆虫总数，
TWIBC是背景检验(缓冲液对照)中的昆虫总重量，且
TNIBC是背景检验(缓冲液对照)中的昆虫总数。
GI50测定为GI值是50%时饮食中Cry1Fa毒素蛋白的浓度；即含有Cry1Fa的饮食上的昆虫生长仅是没有Cry1Fa蛋白的饮食上的昆虫生长的一半，如上文计算的。没有测定LC50(50%致死浓度；以50%测试昆虫被杀死时饮食中Cry1Fa毒素蛋白的浓度计算)，因为在5天实验期期间观察到非常小的死亡率。使用JMP软件(SAS,Cary,NC)完成统计学分析(单因素one-wayANOVA)。
经标记的和未标记的Cry1Fa核心毒素蛋白在抑制草地夜蛾幼虫的生长方面是大致相等活性的，在介于33ng/cm2和100ng/cm2的浓度引起50%生长抑制(图1)。此结果显示用碘化的荧光素-5-马来酰亚胺标记经胰蛋白酶截短的Cry1Fa核心毒素蛋白没有导致杀昆虫活性的丧失。
实施例5
刷状缘膜囊(BBMV)的制备物
溶解的BBMV的制备：将草地夜蛾和玉米螟(欧洲玉米螟)的末龄幼虫在没有食物的情况下保持过夜，然后在冰上冷却15分钟后解剖。从体腔取出中肠组织，留下与体壁附接的后肠。将中肠在9倍体积的补充有如供应商推荐的那样稀释的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-AldrichP-2714)的冰冷均质化缓冲液(17mMTris碱,pH7.5,300mM甘露糖醇,和5mMEGTA(乙二醇四乙酸))中放置。混合物组分的终浓度(以μM计)是AEBSF(500)、EDTA(250)、苯丁抑制素(Bestatin)(32)、E-64(0.35)、亮抑酶肽(0.25)、和抑肽酶(Aprotinin)(0.075)。通过玻璃组织匀浆器的15次击打使组织均质化。通过Wolfersberger(1993)的MgCl2沉淀法制备BBMV。简言之，将等体积24mMMgCl2溶液与中肠匀浆混合，搅拌5分钟，并容许在冰上竖立20分钟。将溶液于4°以2500xg离心15分钟。将上清液保留，并将团粒悬浮入0.5倍体积的均质化缓冲液中，并再次离心。将两份上清液组合，于4°以27000xg离心30分钟以形成BBMV级分。将团粒悬浮到BBMV贮存缓冲液(10mMHEPESpH7.4(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸),130mMKCl,10%甘油)中至约3mg/mL蛋白质的浓度。通过用BSA作为标准品使用Bradford法(Bradford,1976)测定蛋白质浓度。在冷冻样品前使用Sigma-Aldrich测定试剂盒遵循制造商的用法说明书进行用于氨肽酶N测定的亮氨酸-对-硝基苯胺测定法。与中肠匀浆级分中找到的比活相比，BBMV级分中此标志物酶的比活通常增加7倍。将BBMV制备物分配成250μL样品，在液氮中快速冷冻，于-80°贮存。
实施例6
针对BBMV的碘化Cry1Fa核心毒素蛋白结合测定法
125I-Cry1Fa核心毒素蛋白对BBMV的结合：为了测定BBMV蛋白在竞争性结合测定法中使用的最佳量，产生饱和曲线。将经125I放射性标记的Cry1Fa核心毒素蛋白(0.5nM)于28°与结合缓冲液(8mMNaHPO4,2mMKH2PO4,150mMNaCl,0.1%BSA,pH7.4)中范围为0至500μg/mL的浓度的玉米螟(ECB)BBMV蛋白一起温育1小时。总体积是0.5mL。如下分开结合的125I-Cry1Fa核心毒素蛋白与未结合的材料，即一式三份取样150μL反应混合物，并于室温以14000xg将样品离心8分钟。温和取出上清液，并用冰冷的结合缓冲液将团粒清洗三次。将含有团粒的离心管的底部切出，并放入13x75-mm玻璃培养管中。在gamma计数器中将每份样品计数10分钟。将每分钟计数(CPM)减去背景(没有添加蛋白质的反应)的数值相对于BBMV蛋白浓度绘图。BBMV蛋白在每个结合反应中使用的最佳范围测定是100μg/mL至150μg/mL。
结合动力学：为了测定结合动力学，产生饱和曲线。简言之，将150μg/mLECBBBMV蛋白于28°与增加浓度(范围为0.5nM至20nM)的125I-Cry1Fa核心毒素蛋白一起温育1小时。如下测定总体结合，即一式三份取样150μL每个浓度，接着离心并计数，如上文所描述的。对一式三份数值取平均值。通过添加1,000nM非放射性(竞争物)Cry1Fa核心毒素蛋白以相同的方式测定非特异性结合。此浓度比使用的经放射性标记的Cry1Fa核心毒素蛋白的最高浓度高至少50倍；如此，预期它会结合所有可用的受体位点，同时置换经放射性标记的Cry1Fa核心毒素蛋白。特异性结合以总体结合和非特异性结合之间的CPM(减去背景)的差异计算。测定(图2)125I-Cry1Fa核心毒素蛋白以11nM的Kd和37fmoles/mgECBBBMV蛋白的Bmax以可饱和方式特异性结合ECBBBMV蛋白。非特异性结合的水平是总体结合的几乎70%；然而，特异性结合的水平明显饱和，显示了相互作用是受体介导的结合响应。
实施例7
与BBMV的竞争结合测定法
使用“下拉”型受体测定法来测定经放射性标记的Cry1Fa核心毒素蛋白和其它(非标记的)Cry毒素蛋白之间竞争对受体位点的结合的量。在此测定法中，通过SDS-PAGE分离表征与受体结合的配体的相对分子量，并通过磷光体成像通过检测凝胶中的放射性测量与BBMV受体结合的经放射性标记的配体量。使用100μg/mL或150μg/mLBBMV蛋白(来自多种昆虫来源)和0.5nM或2.5nM125I-Cry1Fa核心毒素蛋白进行同质的和异质的竞争结合测定法。在将竞争性配体(即，1000nM非放射性标记的Cry毒素蛋白)与放射性配体同时添加至反应混合物以确保真实的竞争性结合相互作用。温育于28°实施1小时，并通过离心反应混合物将与其BBMV受体结合的125I-Cry1Fa核心毒素蛋白与未结合的蛋白质分开，如上文所描述的。将团粒用冰冷的结合缓冲液清洗三次，然后通过添加25μL具有5%β-巯基乙醇的2倍Laemmli缓冲液，并于95°快速混合样品10分钟来溶解。将样品离心，并将一式两份样品加载到4%至20%Tris甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上，并通过SDS-PAGE分离。通过凝胶的磷光体成像和板暴露3天后与放射性Cry1Fa核心毒素蛋白对应的条带的密度测定法测量与受体结合的125I-Cry1Fa核心毒素蛋白量。
在对照反应中，将0.5nM125I-Cry1Fa核心毒素蛋白与草地夜蛾(FAW)BBMV蛋白一起温育1小时，并通过SDS-PAGE和磷光体成像测量与BBMV结合的125I-Cry1Fa蛋白量，如上文的。添加1000nM未结合的Cry1Fa核心毒素蛋白的并发实验证明2000倍过量浓度的未标记的Cry1Fa核心毒素蛋白的此添加完全消除经放射性标记的Cry1Fa蛋白的结合。这些结果证明此测定法有效测量Cry毒素蛋白置换Cry1Fa核心毒素蛋白对其FAWBBMV受体的结合的能力。在类似的方式中，测定1000nMCry1Ab核心毒素蛋白完全消除125I-Cry1Fa核心毒素蛋白对FAWBBMV蛋白的结合。此结果与其它报告一致，指示Cry1Ab毒素蛋白和Cry1Fa毒素蛋白共享类似的受体结合位点(Banks等,2001;HernandezandFerre,2005)。
此外，发现1000nMCry1Ca核心毒素蛋白和0.5nM125I-Cry1Fa核心毒素蛋白之间没有竞争对FAWBBMV受体的结合，指示Cry1Ca蛋白结合与Cry1Fa受体不同的受体。此结果与用小蔗杆草螟(Diatraeasaccharalis)(甘蔗螟)BBMV进行的其它研究一致，其中发现了过量的Cry1Fa蛋白没有将生物素的Cry1Ca蛋白从其受体置换。
实施例8
Cry1Fa核心毒素对从对Cry1Fa毒素有抗性的FAW昆虫制备的BBMV的结合
使用对由于摄取的Cry1Fa毒素引起的中毒有抗性的昆虫幼虫制备的BBMV实施下拉竞争性结合测定法。草地夜蛾(rFAW)的Cry1Fa抗性幼虫自从专有集落(DowAgroSciencesLLC,Indianapolis,IN)收获的卵孵出。rFAW幼虫对Cry1Fa毒素的毒性具有超过30倍的抗性。BBMV以与自其Cry1Fa敏感性对应物相同的方式自rFAW幼虫制备。
如上文所显示的，来自野生型(即，Cry1Fa敏感性)FAW幼虫的BBMV结合125I-Cry1Fa，并且结合可以通过非标记的Cry1Fa蛋白的2000倍添加置换。比较而言，从rFAW幼虫制备并以100μg/mL在用2.5nM125I-Cry1Fa的下拉结合测定法中使用的BBMV没有结合任何125I-Cry1Fa核心毒素蛋白。这些结果指示rFAW中对Cry1Fa毒素的抗性可以是由于BBMV中的Cry1Fa受体不能结合Cry1Fa核心毒素蛋白所致。或者，抗性可以是昆虫缺乏所述受体的结果。在任何情况中，似乎这些rFAW幼虫中对Cry1Fa毒素的抗性机制是基于受体的。
实施例9
Cry1Fa核心毒素对从对Cry1Fa毒素有抗性的ECB昆虫制备的BBMV的结合
使用对由于摄取的Cry1Fa毒素引起的中毒有抗性的昆虫幼虫制备的BBMV实施下拉竞争性结合测定法。玉米螟(rECB)的Cry1Fa抗性幼虫自从专有集落(DowAgroSciencesLLC,Indianapolis,IN)收获的卵孵出。rECB幼虫对Cry1Fa毒素的毒性具有超过30倍的抗性。BBMV以与自其Cry1Fa敏感性对应物相同的方式自rECB幼虫制备。
使用100μg/mL从野生型ECB幼虫(即，Cry1Fa敏感性)和Cry1Fa抗性(rECB)幼虫制备的BBMV，并使用2.5nM125I-Cry1Fa核心毒素蛋白进行下拉实验。放射性碘化的蛋白质与来自ECB幼虫的BBMV结合，但是其程度比对结合来自FAW幼虫的BBMV看到的程度小。非放射性标记的(竞争物)Cry1Fa蛋白竞争125I-Cry1Fa对ECBBBMV的结合，但是竞争小于在使用FAWBBMV的竞争实验中测量的竞争。
检测出125I-Cry1Fa对rECBBBMV的某种检测，并且结合量小于使用ECBBBMV测量的。非放射性标记的(竞争物)Cry1Fa蛋白没有与125I-Cry1Fa核心毒素蛋白完全竞争对rECBBBMV的结合。这些数据支持使用来自ECB和rECB的BBMV通过表面等离振子共振完成的较早的Cry1Fa结合研究。那些研究显示了非碘化的Cry1Fa毒素蛋白可以结合从ECB或rECB幼虫制备的BBMV级分，但是毒素从ECBBBMV的解离比它从rECBBBMV的解离慢。在本文描述的下拉型测定法中检出的125I-Cry1Fa核心毒素蛋白结合没有充分定量以测量结合亲和力，但是确实指示Cry1Fa毒素蛋白以显著的程度结合rECBBBMV。如此，rECB中对Cry1Fa毒素的抗性可能是由于与结合易感性幼虫的受体相比Cry1Fa核心毒素蛋白对rECBBBMV受体结合不太有效所致。这可以表现为膜孔形成不太有效，因为毒素在受体上保留的时间比在易感性昆虫中短。
表1汇总了来自使用放射性碘化的Cry1Fa核心毒素蛋白及来自各种昆虫来源的BBMV制备物的测定法的相对结合结果。百分比指示在有和没有非放射性竞争物配体的情况下与BBMV结合的放射性的相对量。100%值不代表相等数目；ECBBBMV比FAWBBMV结合更少的总体Cry1Fa蛋白。
*在适当的情况中添加1000nM非放射性竞争物Cry核心毒素蛋白
**N/A=不适用，因为非常少的125I-Cry1Fa核心毒素蛋白是结合的。
本发明表明，令人惊讶地，可以使用125I标记的荧光素-5-马来酰亚胺放射性标记Cry1Fa核心毒素蛋白以特异性烷基化半胱氨酸残基，同时维持杀昆虫活性和受体结合能力。Cry1Fa核心毒素的经胰蛋白酶截短的形式仅含有单一半胱氨酸残基(对应于Cry1Fa的域I内的C205)，其必须包含放射性标记位点。此区域构成蛋白质的孔结构的部分，并且认为其不牵涉受体结合。蛋白质生物化学和结构领域技术人员会认识到与荧光素-5-马来酰亚胺类似的分子(其含有与马来酰亚胺官能附接的酚环)可以通过氯胺化学碘化，并且可以用于碘化蛋白质诸如Cry1Fa中的特定半胱氨酸残基。特别地，比荧光素-5-马来酰亚胺小的类似物可以更易接近Cry1Fa核心毒素的内部，如此可以导致经标记的蛋白质的更大的比放射性。
本文中生成的半胱氨酸烷基化的Cry1Fa蛋白针对FAW幼虫是有杀昆虫活性的。未标记的Cry1Fa蛋白和未标记的Cry1Ab蛋白，而非未标记的Cry1Ca蛋白可以从FAWBBMV置换经放射性标记的Cry1Fa蛋白的结合。生物测定法数据证明Cry1Ca针对FAW和rFAW幼虫两者是有活性的，而Cry1Ab针对rFAW幼虫不太有活性。如此，Cry1Fa、Cry1Ab、和Cry1Ca蛋白针对FAW和rFAW幼虫的生物学活性通过BBMV结合测定法结果方便地解释并预测。因此，本发明的一个方面是可以采用依照本发明的方法放射性标记的Cry1Fa蛋白使用竞争性结合测定法预测可用于昆虫管理策略的Cry蛋白组合。
参考文献
Ausubeletal.,eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,Chapter2(GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork).
Ballester,V.,Granero,F.,deMaagd,R.A.,Bosch,D.,Mensua,J.L.,andFerre,J.(1999)RoleofBacillusthuringiensisToxinDomainsinToxicityandReceptorBindingintheDiamondbackMoth.Appl.Environ.Microbiol.65:1900-1903.
Banks,D.J.,Jurat-Fuentes,J.L.,Dean,D.H.,andAdang,M.J.(2001)BacillusthuringiensisCry1AcandCry1Fadelta-endotoxinbindingtoanovel110kDaaminopeptidaseinHeliothisvirescensisnotN-acetylgalactosaminemediated.InsectBiochem.Mol.Biol.31:909-918.
Bernardi,R.,Tedeschi,G.,Ronchi,S.,andPalmieri,S.(1996)Isolationandsomemolecularpropertiesofatrypsin-likeenzymefromlarvaeofEuropeancornborerOstrinianubilalisHubner(Lepidoptera:pyralidae).InsectBiochem.Molec.Biol.26:883-889.
Bradford,M.M.(1976)Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72,248-254.
Bravo,A.,Gill,S.S.,andSoberon,M.(2007)ModeofactionofBacillusthuringiensisCryandCyttoxinsandtheirpotentialforinsectcontrol.Toxicon.49:423-435.
Christeller,J.T.,Laing,W.A.,Marwick,N.P.,andBurgess,E.P.J.(1992)Midgutproteaseactivitiesin12phytophagouslepidopteranlarvae:Dietaryandproteaseinhibitorinteractions.InsectBiochem.Molec.Biol.22:735-746.
Crickmore,N.,Zeigler,D.R.,Feitelson,J.,Schnepf,E.,VanRie,J.,Lereclus,D.,Baum,J.,andDean,D.H.(1998)RevisionofthenomenclaturefortheBacillusthuringiensispesticidalcrystalproteins.Microbiol.Molec.Biol.Rev.62:807-813.
deMaagd,R.A.,Bakker,P.L.,Masson,L.,Adang,M.J.,Sangadala,S.,Stiekema,W.,andBosch,D.(1999)DomainIIIoftheBacillusthuringiensisdelta-endotoxinCry1AcisinvolvedinbindingtoManducasextabrushbordermembranesandtoitspurifiedaminopeptidaseN.Molec.Microbiol.31:463-471.
deMaagd,R.A.,Bravo,A.,Berry,C.,Crickmore,N.,andSchnepf,H.E.(2003)Structure,diversity,andevolutionofproteintoxinsfromspore-formingentomopathogenicbacteria.Annu.Rev.Genet.37:409-433.
deMaagd,R.A.,Kwa,M.S.,vanderKlei,H.,Yamamoto,T.,Schipper,B.,Vlak,J.M.,Stiekema,W.J.,andBosch,D.(1996)DomainIIIsubstitutioninBacillusthuringiensisdelta-endotoxinCryIA(b)resultsinsuperiortoxicityforSpodopteraexiguaandalteredmembraneproteinrecognition.Appl.Environ.Microbiol.62:1537-1543.
Gatehouse,L.N.,Shannon,A.L.,Burgess,E.P.,andChristeller,J.T.(1997)CharacterizationofmajormidgutproteinasecDNAsfromHelicoverpaarmigeralarvaeandchangesingeneexpressioninresponsetofourproteinaseinhibitorsinthediet.InsectBiochem.Molec.Biol.27:929-944.
Gomez,I.,Arenas,I.,Benitez,I.,Miranda-Rios,J.,Becerril,B.,Grande,R.,Almagro,J.C.,Bravo,A.,andSoberon,M.(2006)SpecificepitopesofdomainsIIandIIIofBacillusthuringiensisCry1Abtoxininvolvedinthesequentialinteractionwithcadherinandaminopeptidase-NreceptorsinManducasexta.J.Biol.Chem.281:34032-34039.
Gomez,I.,Dean,D.H.,Bravo,A.,andSoberon,M.(2003)MolecularbasisforBacillusthuringiensisCry1Abtoxinspecificity:twostructuraldeterminantsintheManducasextaBt-R1receptorinteractwithloopsalpha-8and2indomainIIofCry1Abtoxin.Biochem.42:10482-10489.
Gomez,I.,Pardo-Lopez,L.,Munoz-Garay,C.,Fernandez,L.E.,Perez,C.,Sanchez,J.,Soberon,M.,andBravo,A.(2007)RoleofreceptorinteractioninthemodeofactionofinsecticidalCryandCyttoxinsproducedbyBacillusthuringiensis.Peptides28:169-173.
Griffitts,J.S.andAroian,R.V.(2005)Manyroadstoresistance:howinvertebratesadapttoBttoxins.Bioessays27:614-624.
Heckel,D.G.,Gahan,L.J.,Baxter,S.W.,Zhao,J.Z.,Shelton,A.M.,Gould,F.,andTabashnik,B.E.(2007)ThediversityofBtresistancegenesinspeciesofLepidoptera.J.Invert.Pathol.95:192-197.
Hernandez,C.S.andFerre,J.(2005)CommonreceptorforBacillusthuringiensistoxinsCry1Ac,Cry1Fa,andCry1JainHelicoverpaarmigera,Helicoverpazea,andSpodopteraexigua.Appl.Environ.Microbiol.71:5627-5629.
Herrero,S.,Gonzalez-Cabrera,J.,Ferre,J.,Bakker,P.L.,anddeMaagd,R.A.(2004)MutationsintheBacillusthuringiensisCry1CatoxindemonstratetheroleofdomainsIIandIIIinspecificitytowardsSpodopteraexigualarvae.Biochem.J.384:507-513.
Huang,K-X.,Badger,M.,Haney,K.,Evans,S.L.(2007)LargescaleproductionofBacillusthuringiensisPS149B1insecticidalproteinsCry34Ab1andCry35Ab1fromPseudomonasfluorescens.Prot.Express.Purific.53:325-330.
Lee,M.K.,You,T.H.,Gould,F..L.,andDean,D.H.(1999)IdentificationofresiduesindomainIIIofBacillusthuringiensisCry1Actoxinthataffectbindingandtoxicity.Appl.Environ.Microbiol.65:4513-4520.
Luo,K.,Banks,D.,andAdang,M.J.(1999)Toxicity,binding,andpermeabilityanalysesoffourBacillusthuringiensisCry1delta-endotoxinsusingbrushbordermembranevesiclesofSpodopteraexiguaandSpodopterafrugiperda.Appl.Environ.Microbiol.65:457-464.
Palmer,M.,Buchkremer,M,Valeva,A,andBhakdi,S.(1997)Cysteine-specificradioiodinationofproteinswithfluoresceinmaleimide.Anal.Biochem.253:175-179.
Pigott,C.R.andEllar,D.J.(2007)RoleofreceptorsinBacillusthuringiensiscrystaltoxinactivity.Microbiol.Molec.Biol.Rev.71:255-281.
Rausell,C.,Garcia-Robles,I.,Sanchez,J.,Munoz-Garay,C.,Martinez-Ramirez,A.C.,Real,M.D.,andBravo,A.(2004)RoleoftoxinactivationonbindingandporeformationactivityoftheBacillusthuringiensisCry3toxinsinmembranesofLeptinotarsadecemlineata(Say).Biochim.Biophys.Acta1660:99-105.
Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,N.Y.)
Squires,C.H.,Retallack,D.M.,Chew,L.C.,Ramseier,T.M.,Schneider,J.C.,Talbot,H.W.(2004)HeterologousproteinproductioninP.fluorescens.BioprocessIntern.2:54-59.
VanRie,J.,Jansens,S.,Hofte,H.,Degheele,D.,andVanMellaert,H.(1990a)ReceptorsonthebrushbordermembraneoftheinsectmidgutasdeterminantsofthespecificityofBacillusthuringiensisdelta-endotoxins.Appl.Environ.Microbiol.56:1378-1385.
VanRie,J.,McGaughey,W.H.,Johnson,D.E.,Barnett,B.D.,andVanMellaert,H.(1990b)MechanismofinsectresistancetothemicrobialinsecticideBacillusthuringiensis.Science247:72-74.
Wolfersberger,M.G.(1993)Preparationandpartialcharacterizationofaminoacidtransportingbrushbordermembranevesiclesfromthelarvalmidgutofthegypsymoth(Lymantriadispar).Arch.InsectBiochem.Physiol24:139-147.
Claims (4)
1.选自下组的蛋白质：Cry1Fa全毒素和Cry1Fa核心毒素，其中所述蛋白质在C205位处用放射性碘同位素标记，且其中所述标记的全毒素是杀昆虫性的，且保留选择性结合从甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的中肠制备的刷状缘膜囊中的受体的能力。
2.一种用于测定Cry1Fa核心毒素对给定昆虫物种的中肠上的受体的结合活性的饱和型结合测定方法，该方法包括：
a)制备含有自所述昆虫物种的中肠分离的已知浓度的刷状缘膜囊的悬浮液；
b)在分开的容器中将增加量的经标记的Cry1Fa，即权利要求1的Cry1Fa全毒素或Cry1Fa核心毒素，在如下的时间和缓冲液条件下添加至固定量的所述刷状缘膜囊悬浮液，所述时间和缓冲液条件容许所述经标记的Cry1Fa结合所述刷状缘膜囊上的受体；
c)分开未结合的经标记的Cry1Fa与同所述刷状缘膜囊上的所述受体结合的经标记的Cry1Fa；并
d)计算从与所述刷状缘膜囊结合的所述经标记的Cry1Fa发射的任何放射性信号。
3.一种用于测定交叉反应性的竞争性结合测定方法，该方法包括：
a)制备含有自昆虫物种的中肠分离的刷状缘膜囊的悬浮液；
b)在如下的时间和缓冲液条件下混合经标记的Cry1Fa，即权利要求1的Cry1Fa全毒素或Cry1Fa核心毒素，与过量的未标记的不同蛋白质和所述刷状缘膜悬浮液，所述时间和缓冲液条件容许所述经标记的Cry1Fa和未标记的蛋白质结合所述刷状缘膜囊上的受体；
c)从未结合的经标记的Cry1Fa和未结合的未标记的蛋白质混合物分离结合的刷状缘膜囊；并
d)将从所述结合的刷状缘膜囊级分发射的放射性与从所述未结合的混合物级分发射的放射性比较。
4.权利要求3的方法，其中所述未标记的蛋白质是Cry蛋白。
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| WO2019204784A1 (en) * | 2018-04-19 | 2019-10-24 | First Light Biosciences, Inc. | Detection of targets |
| EP3837278A1 (en) * | 2018-08-13 | 2021-06-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel insecticidal toxin receptors and methods of use |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050064386A1 (en) * | 2003-07-25 | 2005-03-24 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Identification of toxin-binding protein involved in resistance to Cry1 toxins, and related screening methods |
| US20100017914A1 (en) * | 2007-03-28 | 2010-01-21 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal proteins |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5169760A (en) | 1989-07-27 | 1992-12-08 | Mycogen Corporation | Method, vectors, and host cells for the control of expression of heterologous genes from lac operated promoters |
| CA2070961C (en) * | 1991-06-14 | 2004-12-07 | Michael Chorev | Thiol-reactive maleimido-based radiolabeling reagents |
| AR025349A1 (es) * | 1999-08-23 | 2002-11-20 | Mycogen Corp | Metodos para controlar las plagas del gusano gris |
| US7490774B2 (en) | 2003-11-13 | 2009-02-17 | Metrologic Instruments, Inc. | Hand-supportable imaging based bar code symbol reader employing automatic light exposure measurement and illumination control subsystem integrated therein |
| RU2335535C2 (ru) | 2002-10-08 | 2008-10-10 | Дау Агросайенсиз Ллс | Измененные рекомбинантные клетки (arc), предназначенные для продуцирования и доставки антивирусных агентов, адъювантов и акселераторов вакцин |
| AU2004317306B2 (en) | 2003-11-21 | 2010-09-02 | Pelican Technology Holdings, Inc. | Improved expression systems with Sec-system secretion |
| ATE523206T1 (de) | 2006-05-30 | 2011-09-15 | Pfenex Inc | Anthrax-impfstoff |
-
2011
- 2011-12-14 AR ARP110104686A patent/AR084293A1/es unknown
- 2011-12-16 BR BR112013014843A patent/BR112013014843A2/pt not_active Application Discontinuation
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- 2011-12-16 KR KR1020137018411A patent/KR20140032979A/ko not_active Application Discontinuation
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- 2011-12-16 CA CA2821255A patent/CA2821255C/en active Active
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- 2011-12-16 CN CN201180067859.9A patent/CN103370332B/zh active Active
-
2013
- 2013-05-21 ZA ZA2013/03693A patent/ZA201303693B/en unknown
- 2013-05-30 IL IL226662A patent/IL226662A/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050064386A1 (en) * | 2003-07-25 | 2005-03-24 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Identification of toxin-binding protein involved in resistance to Cry1 toxins, and related screening methods |
| US20100017914A1 (en) * | 2007-03-28 | 2010-01-21 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal proteins |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Application for licence for dealings involving intentional release of a GMO into the environment-DIR 044/2003;Dow AgroSciences Australia Ltd;《Risk Assessment and Risk Management Plan》;20061030;section 3.3 * |
| Toxicity, Binding, and Permeability Analyses of Four Bacillus thuringiensis Cry1 d-Endotoxins Using Brush Border Membrane Vesicles of Spodoptera exigua and Spodoptera frugiperda;Ke Luo et al.;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;19990228;第65卷(第2期);第458页左栏的toxin purification和iodination以及第459页右栏图2 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2014503536A (ja) | 2014-02-13 |
| CA2821255A1 (en) | 2012-06-21 |
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