CN103320505A - 一种hsd11b1基因的原位杂交的探针制定及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HSD11B1基因mRNA原位杂交的探针及检测方法,按照如下步骤:(1)根据HSD11B1的Genebank序列我们设计HSD11B1特异的探针序列;(2)合成HSD11B1的mRNA原位杂交的探针质粒,并将探针标记上地高辛;(3)检测HSD11B1的mRNA探针的原位杂交。
Description
技术领域
本发明属于生物病理诊断领域,涉及一个HSD11B1基因的原位杂交检测方法和应用。
背景技术
HSD11B1(羟基类固醇脱氢酶)是一种低亲和力的NADP(H)依赖性脱氢酶.氧化还原酶,在人类,催化GC C11位的酮基与羟基之间的氧化还原反应,使有生物活性的皮质醇(cortisol)与无活性的17.羟.11.脱氢皮质酮(cortisone,可的松)相互转化;在啮齿类,它催化皮质酮(corticosterone)与脱氢皮质酮(dehydro corticosterone)之间的转化。HSD11B1广泛分布于肝、肾、脉管系统、睾丸、卵巢、脂肪组织及中枢神经系统等糖皮质激素的靶器官。具有催化皮质醇与可的松双向转化的作用。HSD11B1的表达、活性及分布与代谢综合征各方面相关联。抑制或下调HSD11B1的活性为治疗代谢综合征提供了一种新的方法。研究已发现两型11β.羟基类固醇脱氢酶(HSD11B1,HSD11B2)。据推测两型11β.HSD约有20%为同源性。HSD11B1首先从大鼠肝脏基因文库中被克隆,是一种相对分子质量为34000的糖蛋白。人HSD11B1cDNA基因定位于1号染色体,包含6个外显子,其5′末端存在一个CAAT共有序列及一个由8个碱基对组成的徊文结(CTGTACAG),类似GC反应位点。HSD11B2cDNA已相继在羊、人、兔中克隆。人HSD11B2基因定位于16号染色体长臂上,包含5个外显子,其5′末端启动基因部分缺乏TATA和CAAT共有序列,但富含GC结构域,且HSD11B2基因转录起始位点因组织而异。
发明内容:
本发明的目的在于提供一种HSD11B1基因mRNA原位杂交的探针及检测方法和应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来解决的:
一种HSD11B1基因mRNA原位杂交的探针,该探针的序列为:
5’CGAGTTCAAGGCAGCGAGACACTACCTTCTGGAGACC3’。
所述探针的设计方法:
(1)根据HSD11B1的Gene bank序列我们设计了HSD11B1特异的探针序列;
(2)合成HSD11B1的mRNA原位杂交的探针,并将探针标记上地高辛;
(3)检测HSD11B1的mRNA探针的原位杂交
所述步骤(2)按照如下步骤进行:
(a)按照步骤(1)设计的序列合成探针;
(b)将探针用HPLC纯化;
(c)将纯化后的产物标记上非放射性标记物-地高辛。
所述步骤(3)按照如下步骤进行:
(a)将小鼠用0.4%戊巴比妥钠深麻后,经左心室插管至升主动脉,用0.01mol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液,再以4%多聚甲醛灌注固定;所述的0.01mol/L DEPC-PBS是2.9克磷酸氢二钠,0.29克磷酸二氢钠,9.0克氯化钠用超纯水定容至1L后,再加入体积百分比为0.1%的DEPC1ml放置过夜后,高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液;所述4%的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸馏水加热使之解聚溶解后,再加入500.0ml的0.2mol/L PB缓冲液定容至1000ml所述0.2mol/L PB缓冲液是用29.01克磷酸氢二钠,2.96克磷酸二氢钠加超纯水定容至500ml配制而成;
(b)取材后进行脑组织的后固定:于4℃,用4%的多聚甲醛后固定24小时;
(c)将固定好的组织进行切片:将组织切成25~30μm组织切片,并将切好的切
片保存于0.01mol/L的DEPC-PBS中,放于4℃冰箱备用;
(d)将切好的组织片用0.01mol/L的DEPC-PBS清洗1次,室温,每次5-10分钟;
(e)将上述清洗过的片子用5x SSC清洗2次,室温,每次5-10分钟;所述5x SSC
是由20x SSC用超纯水稀释的,20x SSC为一种柠檬酸缓冲液;
(f)将5x SSC清洗后的组织片浸入预杂交液中,于55℃,在杂交炉孵育1-2小时;
所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺,2.5ml的20x SSC溶液,200μl的50x Denhardt’s
溶液,50μl的浓度为200mg/ml的Heparin溶液,100μl的浓度为10mg/ml的tRNA溶液,
100μl的浓度为10%的CHAPS溶液,100μl的浓度为10%的Tween-20溶液,100μl的浓度为0.5mol/L的pH8.0的EDTA溶液和1.85ml的DEPC-H2O混合配制而成;所述50xDenhardt’s为一种常用的杂交试剂;所述200mg/ml的Heparin为200mg的Heparin粉末溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成;所述10mg/ml的tRNA为10mg的tRNA粉末溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成;所述10%的CHAPS为1g的CHAPS溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成;所述10%的Tween-20为100μl的Tween-20溶于900μl的DEPC-H2O中配制而成;所述0.5mol/L的pH8.0的EDTA为186.1g二水乙二胺四乙酸二钠加入800ml的DEPC-H2O中在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用NaOH调pH值至8.0然后定容至1L配制而成高压灭菌备用;所述DEPC-H2O为1L超纯水加入体积百分比为0.1%的DEPC1ml,放置过夜并高压灭菌处理后的水;
(g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中,于55℃,在杂交炉中孵育16-20小时;所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为1.0ug/ml的mRNA探针配置成的;
(h)杂交后用1x SSC洗涤杂交的组织切片,37℃,2次,每次10分钟;
(i)用2x SSC洗涤上述的组织切片,37℃,2次,每次10-15分钟;
(j)用10ug/ml的RNase A处理,37℃,1次,每次30-40分钟;
(k)用2x SSC洗涤上述的组织切片,室温,1次,每次10分钟;
(1)用0.01mol/L PBS洗涤上述的组织切片,室温,1次,每次10分钟;所述0.01mol/L PBS是2.9克磷酸氢二钠,0.29克磷酸二氢钠,9.0克氯化钠用超纯水定容至1L配置的磷酸缓冲液;
(m)按1∶2000的抗体效价,在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗体,对洗涤后的组织切片进行孵育,室温,放置过夜;
(n)将经过上步抗体孵育的组织片用0.01mol/L PBS洗涤,于室温,清洗3次,每次10-15分钟;
(o)用TS9.5洗涤上述PBS洗涤后的组织片,室温,清洗2次,每次15-20分钟;所述TS9.5为是由终浓度为摩尔浓度为0.1mol/L Tris-HCl(PH9.5),摩尔浓度为0.1mol/L NaCl溶液和摩尔浓度为50mmol/LMgCL2用超纯水配制而成;
(p)将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4~6小时,在此过程中观察切片呈色强度;所述NBT-BCIP是一种Roche公司生产的呈色反应液;
(q)当呈色完成后,将切片用PBS清洗3次,室温,每次10-15分钟;
(r)将上述洗涤后切片表于载玻片上;
(s)晾干切片,再经过二甲苯脱色,复染核固红,封片,以备观察。
本发明的有益效果是:本发明对活体动物建立模型后进行灌注、取材、切片,通过地高辛标记的mRNA探针与组织中HSD11B1基因的mRNA发生特异性的结合,从而方便准确的观察到组织中HSD11B1基因mRNA水平的变化。本发明使用的HSD11B1的探针序列,对HSD11B1基因mRNA的显示有明确的特异性,实现了对HSD11B1基因mRNA水平的显示作用。
附图说明:
图1为本发明的HSD11B1探针的序列比对图及地高辛标记位置;
图2为本发明的HSD11B1在小鼠在肺部的表达分布图(X20倍)。
具体实施方式:
下面结合附图对本发明做进一步详细描述:
参见图1,HSD11B1基因mRNA原位杂交的探针的设计方法,按照如下步骤
(1)根据HSD11B1的Gene bank序列我们设计了HSD11B1特异的探针序列;
(2)合成HSD11B1的mRNA原位杂交的探针,并将探针标记上地高辛;
(3)检测HSD11B1的mRNA探针的原位杂交
探针的设计:
根据HSD11B1的Gene bank序列我们设计了HSD11B1特异的探针序列;
HSD11B1特异的探针序列:
5’CGAGTTCAAGGCAGCGAGACACTACCTTCTGGAGACC3’
HSD11B1的mRNA原位杂交探针的制备:
(a)按照步骤(1)设计的序列合成探针;
(b)将探针用HPLC纯化;
(c)将纯化后的产物标记上非放射性标记物-地高辛。
参见图2,HSD11B1的mRNA探针的原位杂交检测:
1.将小鼠用0.4%戊巴比妥钠深麻后,经左心室插管至升主动脉,用0.01mol/L的
DEPC-PBS的快速冲洗去除血液,再以4%多聚甲醛灌注固定。
2.取材后进行脑组织的后固定:于4℃,用4%的多聚甲醛后固定24小时。
3.将固定好的组织进行切片:将组织切成25~30μm组织切片,并将切好的切片保存于0.01mol/LDEPC-PBS中,放于4℃冰箱备用。
4.将切好的组织片用0.01mol/LDEPC-PBS清洗1次,室温,每次5分钟。
5.将上述清洗过的片子用5x SSC清洗2次,室温,每次5分钟。
6.将5x SSC清洗后的组织片浸入预杂交液中,于55℃,在杂交炉孵育1小时。
7.将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中,于55℃,在杂交炉中孵育16-20小时。
8.杂交后用1x SSC洗涤杂交的组织切片,37℃,2次,每次10分钟。
9.用2x SSC洗涤上述的组织切片,37℃,2次,每次10分钟。
10.用10ug/ml的RNase A处理,37℃,1次,每次30分钟。
11.用2x SSC洗涤上述的组织切片,室温,1次,每次10分钟。
12.用0.01mol/L PBS洗涤上述的组织切片,室温,1次,每次10分钟。
13.加入抗体Anti-Digoxigenin-AP对洗涤后的组织切片进行孵育,于室温,放置过夜。
14.将经过上步抗体孵育的组织片用0.01mol/L PBS的洗涤,于室温,清洗3次,每次10分钟。
15.用TS9.5洗涤上述0.01mol/L PBS洗涤后的组织片,室温,清洗2次,每次15分钟。
16.将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4~6小时,在此过程中观察切片呈色强度。
17.当呈色完成后,将切片用0.01mol/L PBS清洗3次,室温,每次10分钟。
18.将上述洗涤后切片表于载玻片上。
19.晾干切片,再经过二甲苯脱色,复染核固红,封片,以备观察。
所用试剂:
TIANGEN胶回收试剂盒公司:天根货号:DP214-02
两端具有T7,SP6启动子的载体 公司:invitrogen 货号:K466001
BamH I限制性内切酶 公司:Takara 货号:D1010A
SP6RNA聚合酶试剂盒 公司:Ambion 货号:AM1330
20x SSC 公司:invitrogen 货号:AM9763
50x Denhardt’s 公司:invitrogen 货号:750018
Heperine 公司:sigma 货号:H3393
tRNA 公司:sigma 货号:R8759
CHAPS 公司:sigma 货号:C9426
Tween-20 公司:sigma 货号:P9416
Anti-Digoxigenin-AP 公司:Roche 货号:11093274910
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (4)
1.一种HSD11B1基因mRNA原位杂交的探针,其特征在于,该探针的序列为:
5’CGAGTTCAAGGCAGCGAGACACTACCTTCTGGAGACC 3’。
2.一种如权利要求1所述探针的设计方法,其特征在于:
(1)根据HSD11B1的Gene bank序列设计HSD11B1特异的探针序列;
(2)合成HSD11B1的mRNA原位杂交的探针,并将探针标记上地高辛;
(3)检测HSD11B1的mRNA探针的原位杂交
3.如权利要求2所述的设计方法,其特征在于,所述步骤(2)按照如下步骤进行:
(a)按照步骤(1)设计的序列合成探针;
(b)将探针用HPLC纯化;
(c)将纯化后的产物标记上非放射性标记物-地高辛。
4.如权利要求2所述的设计方法,其特征在于,所述步骤(3)按照如下步骤进行:
(a)将小鼠用0.4%戊巴比妥钠深麻后,经左心室插管至升主动脉,用0.01mol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液,再以4%多聚甲醛灌注固定;所述的0.01mol/L DEPC-PBS是2.9克磷酸氢二钠,0.29克磷酸二氢钠,9.0克氯化钠用超纯水定容至1L后,再加入体积百分比为0.1%的DEPC1ml放置过夜后,高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液;所述4%的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸馏水加热使之解聚溶解后,再加入500.0ml的0.2mol/L PB缓冲液定容至1000ml;所述0.2mol/L PB缓冲液是用29.01克磷酸氢二钠,2.96克磷酸二氢钠加超纯水定容至500ml配制而成;
(b)取材后进行组织的后固定:于4℃,用4%的多聚甲醛后固定24小时;
(c)将固定好的组织进行切片:将组织切成25~30μm组织切片,并将切好的切片保存于0.01mol/L的DEPC-PBS中,放于4℃冰箱备用;
(d)将切好的组织片用0.01mol/L的DEPC-PBS清洗1次,室温,每次5-10分钟;
(e)将上述清洗过的片子用5x SSC清洗2次,室温,每次5-10分钟;所述5x SSC是由20xSSC用超纯水稀释的,20x SSC为一种柠檬酸缓冲液;
(f)将5x SSC清洗后的组织片浸入预杂交液中,于55℃,在杂交炉孵育1-2小时;所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺,2.5ml的20x SSC溶液,200μl的50x Denhardt’s溶液,50μl的浓度为200mg/ml的Heparin溶液,100μl的浓度为10mg/ml的tRNA溶液,100μl的浓度为10%的CHAPS溶液,100μl的浓度为10%的Tween-20溶液,100μl的浓度为0.5mol/L的pH8.0的EDTA溶液和1.85ml的DEPC-H2O混合配制而成;所述50x Denhardt’s为一种常用的杂交试剂;所述200mg/ml的Heparin为200mg的Heparin粉末溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成;所述10mg/ml的tRNA为10mg的tRNA粉末溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成;所述10%的CHAPS为1g的CHAPS溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成;所述10%的Tween-20为100μl的Tween-20溶于900μl的DEPC-H2O中配制而成;所述0.5mol/L的pH8.0的EDTA为186.1g二水乙二胺四乙酸二钠加入800ml的DEPC-H2O中在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用NaOH调pH值至8.0然后定容至1L配制而成高压灭菌备用;所述DEPC-H2O为1L超纯水加入体积百分比为0.1%的DEPC1ml,放置过夜并高压灭菌处理后的水;
(g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中,于55℃,在杂交炉中孵育16-20小时;
所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为1.0ug/ml的mRNA探针配置成的;
(h)杂交后用1x SSC洗涤杂交的组织切片,37℃,2次,每次10分钟;
(i)用2x SSC洗涤上述的组织切片,37℃,2次,每次10-15分钟;
(j)用10ug/ml的RNase A处理,37℃,1次,每次30-40分钟;
(k)用2x SSC洗涤上述的组织切片,室温,1次,每次10分钟;
(1)用0.01mol/L PBS洗涤上述的组织切片,室温,1次,每次10分钟;所述0.01mol/L PBS是2.9克磷酸氢二钠,0.29克磷酸二氢钠,9.0克氯化钠用超纯水定容至1L配置的磷酸
缓冲液;
(m)按1∶2000的抗体效价,在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗体,对洗涤后的组织切片进行孵育,室温,放置过夜;
(n)将经过上步抗体孵育的组织片用0.01mol/L PBS洗涤,于室温,清洗3次,每次10-15分钟;
(o)用TS9.5洗涤上述PBS洗涤后的组织片,室温,清洗2次,每次15-20分钟;所述TS9.5为是由终浓度为摩尔浓度为0.1mol/L Tris-HCl(PH9.5),摩尔浓度为0.1mol/L NaCl溶液和摩尔浓度为50mmol/LMgCL2用超纯水配制而成;
(p)将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4~6小时,在此过程中观察切片呈色强度;所述NBT-BCIP是一种Roche公司生产的呈色反应液;
(q)当呈色完成后,将切片用PBS清洗3次,室温,每次10-15分钟;
(r)将上述洗涤后切片表于载玻片上;
(s)晾干切片,再经过二甲苯脱色,复染核固红,封片,以备观察。
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2013
- 2013-03-09 CN CN2013100912402A patent/CN103320505A/zh active Pending
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130925 |