CN103316162B - 藏药仁青芒觉在制备治疗腹泻型肠易激综合征药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了仁青芒觉在制备用于治疗腹泻型肠易激综合征的药物中的新用途。通过临床试验证明了仁青芒觉胶囊在腹泻型IBS患者中的疗效和安全性与对照药肠胃康胶囊相当，可以安全、有效的用于治疗腹泻型IBS。

Description

藏药仁青芒觉在制备治疗腹泻型肠易激综合征药物中的应用

本申请要求中国专利申请NO.201210072540.1的优先权，该中国专利申请的名称为《藏药仁青芒觉在制备治疗腹泻型肠易激综合征药物中的应用》。

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及藏药仁青芒觉的新用途。

背景技术

仁青芒觉为藏药四大珍宝之一，成方于公元八世纪，始载于藏医古典巨著《四部医典》中。本品被列入国家保密品种、国家中药保护品种，国药准字Z20050177。根据藏医学原理，选用生长在世界屋脊特殊生态环境下的天然、珍贵、稀有藏药材，由毛诃子、蒲桃、西红花、牛黄、麝香、朱砂等近百药味组成，并以现代科学方法与传统工艺相结合精制而成，具有清热解毒，益肝养胃，明目醒神，愈疮，滋补强身之功效。现代药效学研究证明，仁青芒觉胶囊有保肝降酶、保护胃粘膜、促进溃疡愈合、抗炎退热，耐缺氧、抗心律失常等作用，在藏区临床应用千余年，主要用于急慢性肠胃炎、胃溃疡等肠胃道疾病。

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种一种与胃肠功能改变有关，以慢性或复发性腹痛、腹泻、排便习惯和大便性状异常为主要症状而又缺乏胃肠道结构或生化异常的综合征。其特征为腹痛、腹胀、腹泻或便秘，而病因尚不明确。情绪因素、饮食、药物或激素均可促发或加重这种高张力的胃肠道运动。有些患者有焦虑症，尤其是恐惧症，成年抑郁症和躯体症状化障碍，尚无明确有效的药物治疗。按照目前新的罗马Ⅲ标准，IBS的分型为便秘型、腹泻型、混合型和不确定型四型。

肠易激综合征的药物治疗现状主要有以下几种：

一、调节肠道运动及纠正内脏感觉异常的药物

胃肠平滑肌选择性钙离子通道阻滞剂,例如:匹维溴胺、奥替溴胺等；离子通道调节剂,例如:曲美布汀、曲美布汀；5-HT3受体拮抗剂,例如:阿洛司琼、西兰司琼；5-HT4激动剂,例如西沙比利；5-HT4受体的部分激动剂,例如马来酸替加色罗；多巴胺D2受体拮抗剂,例如依托必利(itopride)；阿片肽激动剂,①洛哌丁胺；②非多托嗪；③地芬诺酯(苯乙哌啶)；胆囊收缩素受体拮抗剂,例如氯谷胺；生长抑素衍生物,例如奥曲肽；胆碱酯酶抑制剂,例如新斯的明；通便剂对以便秘为主要表现的IBS患者提倡应用膨胀或渗透性泻剂。

二、微生态制剂（又称微生态调节剂）

根据微生态学原理,通过调整微生态失调,保持微生态平衡,提高宿主的健康水平,利用对宿主有益的正常微生物或促进物质所制成的制剂。

三、抗生素类药物

肠道菌群紊乱与IBS的关系仍有很大争议,目前尚缺乏抗生素治疗IBS的充分证据。

四、抗抑郁药物

三环类抗抑郁药(TCA)选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI),多虑平、曲米帕明、阿米替林抑制CNS神经末梢突轴前膜对神经递质如5-HT,多巴胺、去甲肾的摄取阻碍了外界刺激的传导。

五、中药类

如肠胃康胶囊、固本益肠片等。

发明内容

本发明的目的在于提供藏药仁青芒觉的新用途，具体为仁青芒觉在制备治疗腹泻型肠易激综合征药物中的新应用。

其中，所述仁青芒觉制备为选自丸剂、胶囊剂、片剂、散剂和颗粒剂的药学制剂中的任一口服制剂。

根据本发明的一方面，藏药仁青芒觉可用于制备治疗腹泻型肠易激综合征药物，动物实验数据表明，仁青芒觉可显著降低腹泻指数，减少腹泻率，增加实验模型动物体重，仁青芒觉胶囊对腹泻型IBS大鼠模型有很好的治疗作用。

根据本发明的另一方面，藏药仁青芒觉通过提高血清IL-10含量调节Th1，TNFa，Th2，IL-10等细胞因子的平衡，促进Th1/Th2免疫应答平衡的重建，发挥对IBS的治疗作用。因此本发明提供藏药仁青芒觉在制备药物中的应用，该药物可调节由细胞因子介导的肠道粘膜免疫反应失衡。

根据本发明的再一方面，藏药仁青芒觉可通过抑制胃肠激素P物质（sp）的异常分泌改善胃肠道的分泌和运动功能,达到对腹泻型IBS的治疗效果。因此，本发明也提供了藏药仁青芒觉在制备抑制sp异常分泌的药物中的应用。

根据本发明的再一方面，仁青芒觉胶囊可通过提高乳酸脱氢酶活性，改善IBS的症状。因此，本发明也提供藏药仁青芒觉在制备通过提高乳酸脱氢酶活力改善腹泻型肠易激综合征症状的药物中的应用。

根据本发明的再一方面，提供藏药仁青芒觉在制备调节5-羟色胺（5-HT）表达的药物中的应用，5-HT在胃肠道中扮演着神经递质以及旁分泌信号分子的角色，可直接或间接影响肠道动力以及分泌功能，导致IBS患者出现便秘或者腹泻症状，仁青芒觉胶囊可可明显提高模型大鼠结肠5-HT的表达，因此可用于治疗和改善由5-HT表达降低而致的IBS。

根据本发明的又一方面，实验动物研究表明，仁青芒觉胶囊不同剂量对不同状态的胃肠道具有不同影响，仁青芒觉胶囊360mg/kg对正常小鼠的肠蠕动有一定的促进作用，仁青芒觉胶囊180mg/kg对模型小鼠的肠蠕动亢进有明显的抑制作用。因此，本发明也提供藏药仁青芒觉在制备刺激或抑制肠蠕动药物中的应用，其中所述药物用于治疗便秘性IBS或腹泻型IBS。

本发明通过高乳糖饲料联合束缚应激致腹泻型IBS模型对仁青芒觉治疗腹泻型IBS进行药效学评价，并通过单中心、随机、对照试验，以试验组20例和对照组20例进行临床试验，结果说明了仁青芒觉胶囊在腹泻型IBS患者中的疗效和安全性与对照药肠胃康胶囊相当，可以安全、有效的用于治疗腹泻型IBS。

本发明也通过对仁青芒觉治疗IBS机理的探讨，发现仁青芒觉在治疗或改善IBS中的作用方式，提出仁青芒觉的新治疗用途。

附图说明

图1是IL-10（白介素10）标准曲线。

图2是TNF-α（肿瘤细胞坏死因子-α）标准曲线。

具体实施方式

以下实施例1-8通过高乳糖饲料联合束缚应激致腹泻型IBS模型对仁青芒觉治疗腹泻型IBS进行药效学评价。

动物实验的基本情况如下：

1．动物

动物品种：	大鼠
		品系：	Wistar大鼠
等级：	SPF级
		繁育单位：	北京维通利华试验动物技术有限公司
合格证号：	SCXK（京）2012-0001
		购入动物性别及数量	35只雌性35只雄性
购入时体重范围	100-120克

2．药物

2.1供试品（甘南佛阁藏药有限公司提供）

2.2阳性药:（购自Abbott Healthcare SAS）

名称：	得舒特
		批号：	624521
规格	50mg/片
		厂家	Abbott Healthcare SAS
配制方法	灭菌注射用水溶解

3.高乳糖饲料配制

高乳糖饲料配方：酪蛋白22.05%、乳糖45.58%、蔗糖15.00%、大豆油3.75%、纤维素8%、DL-蛋氨酸0.4%、胆碱0.2%、维生素混合物0.02%、无机盐混合物5%。其中维生素混合物为:Ikg基础饲料含维生维A(干、稳定)2000IU，维生素D(干、稳定)2000IU，维生素El00IU，维生素K5mg，胆碱2000mg，肌醇l00mg，对氨基苯甲酸100mg，尼克酸40mg，泛酸钙40mg，维生素B₁5mg，维生素B₂8mg，维生素B₆5mg，维生素B₁₂0.03mg，叶酸2mg，生物素0.4mg。无机盐混合物为:1kg。基础饲料含：NaC169.9g，K10.395g。KH₂PO₄194.5g，MgSO₄28.65g。CaCO₃190.7g，MnSO₄·H₂O2.05g，CuS0₄·5H₂O0.239g，COC1₂·6H₂O0.012g，FeSO₄·7H₂O0.274g。由北京科澳协力饲料有限公司生产。

4.药效学试验剂量设计

仁青芒觉胶囊的临床用量为1.5g生药/日（人用剂量），即0.02g生药/kg(按70kg人折算)

阳性药：得舒特，0.035g/Kg大鼠（约相当于临床人用量的7倍）。

5.取材

模型制备结束，禁食12小时，次日上午处死大鼠，心脏取血分别置于抗凝离心管与非抗凝离心管，室温下4000rpm/min，离心10min，分离血浆和血清，置-20℃冰箱保存，备测。取脑，分离下丘脑、垂体，放液氮，备测。小肠黏膜组织留取:剖开腹腔,摘取自幽门下10cm处小肠组织,冰浴下纵向剖开,常规冲洗,吸干水分,载玻片刮取黏膜组织,生理盐水制成20%匀浆，低温离心15min，3000rpm/min，取上清液，置-20℃冰箱保存，备测。大鼠结肠组织标本留取：摘取距回盲部2cm处升结肠组织200mg,纵向剖开,常规冲洗,迅速放液氮，备测。

6．指标检测

(1)对腹泻型IBS大鼠体重、腹泻指数、大便含水量的观察

(2)对腹泻型IBS大鼠消化酶的影响

(3)对腹泻型IBS大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴干预作用研究

(4)对腹泻型IBS大鼠下丘脑及结肠黏膜5-HT表达的影响

(5)对腹泻型IBS大鼠胃肠激素的影响

(6)对腹泻型IBS大鼠TH1/TH2细胞因子的影响

7统计学处理

采用Spss for windowsl6.0统计软件处理，实验数据以表示，多组间样本均数比较采用方差分析，采用Leven检验法进行方差齐性检验，当方差齐性时，采用LSD法进行均值多重比较，当方差不齐性时，采用Tamhane'sT2法进行均值多重比较。P<0.05具有统计学意义。

【实施例1】仁青芒觉胶囊对腹泻型IBS大鼠体重、腹泻指数以及大便含水量的影响

目的：大鼠体内缺少乳糖酶，给大鼠一定剂量的乳糖后，乳糖在体内蓄积，实验动物即出现持续性水样泻，通过比较体重增长率、腹泻率、腹泻指数的变化，评价仁青芒觉胶囊对腹泻型IBS大鼠的治疗作用。

方法：

1.腹泻型IBS大鼠模型制备：参考文献（胡瑞,张桐茂,唐方.胃肠安丸对腹泻型肠易激综合征大鼠的止泻作用及其机制研究[J].中草药,2010，10(41)：2039-2043），以高乳糖饲料喂养加束缚应激，建立腹泻型肠易激综合征大鼠模型。各组大鼠以高乳糖饲料喂饲,每天行束缚应激,将大鼠置于一限制其肢体运动但不影响其呼吸的特制透明圆柱形筒内2h后解除束缚将大鼠放回饲养笼中。

2.动物分组、给药及模型制备：动物随机分6组，即正常组、模型组、阳性药得舒特，仁青芒觉胶囊大、中、小剂量组。每组10只大鼠，雌雄各半。动物单笼饲养，除正常组大鼠外，各组大鼠以高乳糖饲料喂饲,每天行束缚应激2h（下午4时-6时）。束缚应激结束后30分钟，各给药组灌胃给药；正常组、模型组灌胃给等容量的生理盐水。正常对照组喂食基础饲料，不予应激。连续给药6天。

3．对腹泻型IBS大鼠体重、腹泻指数、大便含水量观察：各组动物单笼饲养，笼底为不锈钢网，底有托盘，上垫滤纸，每日上午8时-11时观察腹泻情况。以体重增长率、腹泻率、腹泻指数、大便含水量作为主要指标。

3.1体质量增长率:于高乳糖饲料喂饲前称取实验大鼠体质量作为初始体质量，实验期间观测每日体质量，求得体质量增长率。

体质量增长率=(每日体重一初始体重)/初始体重╳100%。

3.2腹泻率观测:腹泻率=腹泻的动物数/该组动物总数╳100%。

干便和稀便的区分以滤纸上有无污迹为标准。

3.3腹泻指数观测:腹泻指数=稀便率╳平均稀便级。

稀便率:每只动物所排的稀便数与总便数之比。粪便次数:以每粒或每堆(不能分清粒数者)为一次。

稀便级:表示每只动物稀便的程度，以稀便污染滤纸所形成污迹的直径定级，分为4级:<lcm(l级)，l-2cm(2级)，2-3cm(3级)，>3cm(4级)（稀便直径的测量:圆形者测其直径;椭圆形或不规则形状测其最长和近似圆的直径，两数相加除以2。）

平均稀便级=稀便级数总和/稀便次数。统计时先逐个统计每堆稀便的级数,然后将该鼠所有稀便级数相加除以稀便次数得稀便的平均级数,简称稀便级。

3.4大便湿重和含水量：含水量＝（湿重－干重）／湿重×100％

将收集的每只大鼠3h内的大便用电子天平称湿重,烘烤8min后称干重,计算大便含水量。

结果

1．各组大鼠腹泻率观测:

高乳糖饲料喂养加束缚应激在24小时内即可使部分动物出现腹泻，48小时后各组大鼠腹泻率达100%，实验第7天，仁青芒觉胶囊420mg/kg和得舒特组大鼠腹泻率均为50%，如表1所示。

表1各组大鼠腹泻率比较

2．对腹泻型IBS大鼠体重的影响

各组大鼠初始体重没有明显差异，高乳糖饲料喂养加束缚应激在24小时后，动物体重持续下降。实验开始第4天，仁青芒觉胶囊420mg/kg、140mg/kg、得舒特组大鼠体重较模型组明显增高（P<0.05）；实验开始第5天，仁青芒觉胶囊50mg/kg组大鼠体重也较模型组增高（P<0.05）。这一结果与腹泻指数的变化趋势相吻合。如表2-3所示。

表2各组大鼠体重比较

注：与模型组比较﹡P<0.05

表3各组大鼠体重比较

注：与模型组比较﹡P<0.05

3．对腹泻型IBS大鼠体重增长率的影响

高乳糖饲料喂养加束缚应激在24小时后，模型组动物体重出现持续负增长，实验第6天后，体重开始恢复；仁青芒觉胶囊140mg/kg大鼠体重在实验第3天开始增长，实验第4天后，体重增长率较模型组明显增高（P<0.05）；仁青芒觉胶囊420mg/kg大鼠体重在实验第4天开始增长，体重增长率较模型组差异显著（P<0.05）；仁青芒觉胶囊50mg/kg大鼠体重在实验第5天体重增长率较模型组明显提高（P<0.05）。实验期间，得舒特组大鼠体重未出现负增长，实验第4、5、7天体重增长率较模型组明显提高（P<0.05）。这一结果与腹泻指数的变化趋势相吻合。如表4-5所示。

表4各组大鼠体重增长率比较

注：与模型组比较﹡P<0.05

表5各组大鼠体重增长率（%）比较

注：与模型组比较﹡P<0.05

4．腹泻指数观测:腹泻指数=稀便率╳平均稀便级。

4.1稀便率观测

高乳糖饲料喂养加束缚应激大鼠在24小时内稀便率较正常组明显增高（P<0.05）；实验第5天，仁青芒觉胶囊50mg/kg、420mg/kg大鼠稀便率较模型组明显减少（P<0.05）；实验第6天，得舒特组大鼠稀便率较模型组明显减少（P<0.05）。如表6所

表6各组大鼠稀便率比较

注：与模型组比较﹡P<0.05

4.2稀便级观测

稀便级表示动物稀便的程度，实验第2天，模型大鼠平均稀便级较正常组明显增高（P<0.05）；实验第5天，仁青芒觉胶囊50mg/kg、420mg/kg大鼠稀便率较模型组明显减少（P<0.05）；实验第6天，得舒特组大鼠稀便率较模型组明显减少（P<0.05）。如表7所示。

表7各组大鼠平均稀便级比较

注：与模型组比较﹡P<0.05

4.3腹泻指数观测:腹泻指数=稀便率╳平均稀便级。

高乳糖饲料喂养加束缚应激大鼠腹泻指数在24小时内增高,实验第6天达到高峰,实验第7天腹泻指数开始下降；实验第4天，仁青芒觉胶囊140mg/kg、420mg/kg及得舒特组大鼠腹泻指数较模型组明显降低（P<0.05）；实验第6天，仁青芒觉胶囊50mg/kg大鼠腹泻指数也较模型组差异显著（P<0.05）。如表8所示。

表8各组大鼠腹泻指数比较

注：与模型组比较﹡P<0.05

5．大便含水量观测

实验第2天，模型大鼠大便含水量较正常组持续增加（P<0.05）；实验第7天，仁青芒觉胶囊140mg/kg、420mg/kg大鼠大便含水量较模型组明显降低（P<0.05）；在实验第4天，得舒特组大鼠大便含水量较模型组明显减少（P<0.05）。如表9所示。

表9各组大鼠含水量比较

注：与模型组比较﹡P<0.05

结论

1．高乳糖饲料喂养加束缚应激在24小时内即可使部分大鼠出现腹泻，大便含水量明显增高。48小时后大鼠腹泻率达100%，腹泻指数在实验第6天达到高峰,实验第7天腹泻指数开始下降。动物体重出现持续负增长趋势，实验第6天后，体重开始恢复。

2．各给药组大鼠48小时后腹泻率达100%，实验第7天，仁青芒觉胶囊420mg/kg组大鼠腹泻率为50%。实验第4天，仁青芒觉胶囊140mg/kg、420mg/kg大鼠腹泻指数较模型组明显降低（P<0.05），体重明显增长（P<0.05）；仁青芒觉胶囊50mg/kg大鼠体重在实验第5天体重明显增长，实验第6天大鼠腹泻指数明显降低（P<0.05）；实验第7天，仁青芒觉胶囊140mg/kg、420mg/kg大鼠大便含水量较模型组明显降低（P<0.05）。

【实施例2】仁青芒觉胶囊对腹泻型IBS大鼠肠黏膜消化酶的影响

目的：乳糖摄入与腹泻型IBS关系密切，是诱发IBS症状出现或加重的重要因素。小肠黏膜MDH,LDH活性是反映细胞内糖有氧氧化和无氧酵解水平的客观指标，肠黏膜上皮细胞内的二糖酶是衡量小肠吸收功能的标志酶。本研究通过检测小肠黏膜乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、二糖(乳糖)酶活性,探讨药物对腹泻型IBS大鼠小肠消化的影响。

材料

1．试剂：二糖酶（20120814）测试盒,苹果酸脱氢酶（20120812），乳酸脱氢酶（20120727），以上均购自南京建成生物工程研究所。

2．仪器：紫外分光光度计：UV-1700，日本岛津；低温离心机：eppendorfcentrifuge5810R，电子分析天平：JA-1003，上海精科天平厂；电动匀浆机：PRO200Oxford CT USA；电热恒温水浴锅：HHSY11-Ni北京市长风仪器仪表有限公司；涡旋混匀器：VORTEX-52005海门市其林贝尔仪器制造有限公司；酶标仪：BIO-RAD680。

方法

1．小肠黏膜组织匀浆的制备：剖开腹腔,摘取自幽门下10cm处至回盲部空肠、回肠组织,冰浴下纵向剖开,常规冲洗,吸干水分,载玻片刮取黏膜组织,加生理盐水制成匀浆，匀浆液在低温离心机2000rpm/min，处理15分钟，取上清液，制作10%小肠黏膜组织匀浆,按试剂盒说明操作,计算LDH,MDH和二糖酶活力。

2．二糖(乳糖)酶检测：按试剂盒说明书，乳糖酶作用于相应的底物产生单糖，该单糖在其氧化酶的作用下产生过氧化氢，过氧化氢同显色剂结合产生红色的产物，用分光光度计测定其光密度，从而测定乳糖酶的活性。考马斯亮兰法测定蛋白质含量。

操作步骤：

混匀，37度水浴15分钟，505nm,0.5cm光径，双蒸水调零，测各管OD值。

计算公式：

3．苹果酸脱氢酶检测：按试剂盒说明书测定。

操作步骤：

a:准备工作：取两只0.5cm光径石英比色皿，用蒸馏水冲洗干净，一只加入蒸馏水于340nm处调零，另一只作测定用。

b：在测定管中加入混合试剂1ml,37度预温3分钟，取出试管加入样本的同时立即计时，随即混匀，混匀后将试管内的反应液倒入0.5cm光径石英比色皿中，于340nm处测20秒时的吸光度OD值（OD1），在1分20秒时再测吸光度值OD2。△A340nm/分*=OD1-OD2

计算公式：

单位定义：每毫克组织蛋白在本反应系统中每分钟催化1umol底物转变成产物定义为为一个酶活力单位。

4.乳酸脱氢酶检测：按试剂盒说明书测定。

操作步骤：

混匀，37度烘箱3分钟，450nm酶标仪测定吸光度值。

组织乳酸脱氢酶定义及计算公式:

定义：每克组织蛋白37度与基质作用15分钟，反应体系产生1umol丙酮酸为1单位。

结果

结果显示，给与高乳糖饲料喂饲加束缚应激，实验动物小肠粘膜乳酸脱氢酶（LDH）活性显著下降，仁青芒觉及阳性药均可提高LDH活力，较模型组差异显著（P<0.05）。

和正常大鼠相比，模型大鼠肠粘膜苹果酸脱氢酶（MDH）活性呈下降趋势，乳糖酶有增高趋势，仁青芒觉及得舒特均能不同程度提高MDH及乳糖酶活性，但均较模型组没有显著性差异。如表10所示。

表10仁青芒觉胶囊对腹泻型IBS大鼠肠黏膜消化酶的影响

注：与模型组比较﹡P<0.05

结论

1.腹泻型IBS大鼠小肠粘膜乳酸脱氢酶（LDH）活性较正常组大鼠显著下降（P<0.05）；和正常组相比，苹果酸脱氢酶（MDH）活性呈下降趋势，乳糖酶呈增高趋势，但均没有统计学差异。

2.仁青芒觉胶囊可明显提高腹泻型IBS大鼠小肠粘膜LDH活力，较模型组差异显著（P<0.05）。

【实施例3】仁青芒觉胶囊对腹泻型IBS大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响

目的：精神病学家认为IBS是一种精神因素躯体化症状的疾病。心理应激或焦虑症状常常是诱发或加重IBS患者间断性腹痛或腹泻症状的主要原因之一，近年来，不断有研究报道大多数肠易激综合症患者有精神障碍，并且这些病人在发病前常有应激事件发生。

下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）是机体内分泌系统的重要调节通路，主要作用是对外界刺激作出生理心理反应以维持人体内环境的稳定。HPA轴为机体提供一个将神经信息转换成生理反应的模式。机体接收到的各种信号可激活下丘脑室旁核(PVN)分泌下丘脑促皮质激素释放激素（CRH），CRH经垂体门脉血流到达垂体，与相应受体结合刺激垂体分泌促肾上腺皮质激素（ACTH），ACTH经由血液循环到达肾上腺，刺激肾上腺皮质合成分泌糖皮质激素，主要为皮质醇（CORT），糖皮质激素作为一种终末激素发挥广泛的生理或病理生理作用。CRH、ACTH和CORT的释放从三个层次反映了HPA轴的功能。

本实施例通过检测动物下丘脑CRH、垂体ACTH及血清CORT的变化，探讨药物对腹泻型IBS大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响。

材料

1．试剂  皮质酮（CORT）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）放免检测药盒，北京华英生物技术研究所提供。

2．仪器  放免仪器:r-911全自动放免计数仪（中国科技大学实业总公司生产）；Biofuge15R低温离心机（Heraeus sepatech德国）；JA-1003电子分析天平（上海精科天平厂）。Biofuge15R低温离心机，Heraeus sepatech德国；JA-1003电子分析天平（上海精科天平厂）；超细匀浆器（上海季诺科贸有限公司），水浴锅（型号02810202，天津市中环实验电炉有限公司）；Multiskan MK3型酶标仪，芬兰Thermo Labsystem公司。

方法

1．下丘脑促皮质激素释放激素（CRH）的检测

混匀，室温放置15分钟，3500转/分离心15分钟。弃上清，测沉淀计数（cpm）。

2．垂体促肾上腺皮质激素（ACTH）检测

混匀，静置15分钟，3500转/分，离心20分钟，去上清，测沉淀CPM。

3．血清皮质酮（CORT）

混匀，室温放置15分钟，3500转/分离心15分钟，吸弃上清液，测沉淀cpm值。

结果

结果见表11，腹泻型IBS大鼠血清CORT较正常组大鼠明显增高（P<0.05）下丘脑CRH及垂体ACTH较正常没有显著性差异。仁青芒觉各剂量组大鼠血清CORT、下丘脑CRH及垂体ACTH均较模型组大鼠没有显著性差异。

表11各组大鼠下丘脑CRH、垂体ACTH及血清CORT的变化

注：与模型组比较﹡P<0.05

结论

1.腹泻型IBS大鼠血清CORT较正常组大鼠明显增高（P<0.05）

2.仁青芒觉胶囊组大鼠下丘脑CRH、垂体ACTH及血清CORT的变化较模型组没有明显差异，提示仁青芒觉胶囊对腹泻型IBS大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）没有明显干预作用。

【实施例4】仁青芒觉胶囊对腹泻型IBS大鼠下丘脑及结肠5-HT表达的影响

目的：5-HT是维持肠道正常生理功能的重要递质，在IBS发病机制中起着重要作用。体内95%的5-HT储存于肠上皮的嗜铬细胞中,在外周调节胃肠道的分泌、运动和感觉;而存在于中枢神经系统的5-HT,其作用是调节情绪和认知,因此被认为是脑-肠轴的重要递质。近年来,许多研究证实5-HT在IBS发病机制中起着重要作用。本实验通过检测模型大鼠下丘脑及结肠5-HT的变化,研究药物对脑-肠轴的影响。

材料

1．试剂  5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）（批号N-5785-250MG）；内标物3,4-二羟基苄胺氢溴酸盐（3,4-Dihydroxybenzylamine hydrobromide,3,4-DHBA）购自美国Sigma公司（批号16290-26-9）；乙二胺四乙酸二钠（分析纯）北京现代东方精细化学品有限公司（批号：20090415）；L-半胱氨酸（L-Cysteine）国药集团化学试剂有限公司（批号：F20100705）；高氯酸（分析纯）天津市鑫源化工有限公司（CN.NO.51015）

2．仪器  美国ESA公司高效液相色谱仪（包括Model582型泵，Model542型自动进样器，柱温箱，Model5600A型CoulArray电化学检测器,CoulArray软件工作站，ESA公司）；紫外可见分光光度计（UV-1700，SHIMADZU公司）；手持式匀浆仪（Model PRO20003522,PRO公司）；低温高速离心机（5810R，eppendorf公司）；电子天平（AR1140型，Ohuas公司）

方法

1．匀浆液的配制配制方法：高氯酸、Na2EDTA、L-半胱氨酸、DHBA终浓度为0.4mol·L-1、0.5mmol·L-1、0.83mmol·L-1、0.36μmol·L-1。

2．组织匀浆将待测脑组织从-80℃冰箱中取出熔化，放入匀浆管中，按照1:7的比例加入4℃的匀浆液，冰浴中进行组织匀浆。将脑组织匀浆置低温离心机中，4℃，10000r·min-1，离心25min。离心完成后小心吸取各管上清液300μL，-80℃避光保存待测。将待测结肠组织从-80℃冰箱中取出熔化，放入匀浆管中，按照1:4的比例加入4℃的匀浆液，冰浴中进行组织匀浆。将结肠组织匀浆置低温离心机中，4℃，10000r·min-1，离心25min。离心完成后小心吸取各管上清液100μL，加入400ul匀浆液，混匀，-80℃避光保存待测。

3．5-HT测定流动相：乙酸钠70mmol·L-1，柠檬酸50mmol·L-1，EDTA100μmol·L-1，辛烷磺酸钠200　mol·L-1,pH4.1。经0.22M滤膜过滤。色谱柱：ZORBAX ODS柱（4.6　150mm，5m，Agilent公司）及相同填充材料的预柱（4.6x12.5mm，5m,Agilent公司）。流速：1ml/min；柱温：29°C；进样量：20L；电压：500mV；定量方法：内标法；信噪比大于3；检测下限：250pg/mL。5-HT标准曲线方程Y=0.02992X+0.0003161，线性范围为2ng·mL-1-400ng·mL-1。

结果

结果见表12，和正常组相比，模型大鼠下丘脑、结肠5-HT表达均呈上升趋势；仁青芒觉胶囊140mg/kg和阳性药得舒特结肠5-HT表达明显增高（P<0.05）。

表12各组大鼠下丘脑及结肠5-HT的表达

与正常组比较#P<0.05

结论

1．腹泻型IBS大鼠下丘脑、结肠5-HT表达较正常大鼠均呈上升趋势。与模型组相比，仁青芒觉胶囊和得舒特组大鼠下丘脑5-HT表达有下降趋势，结肠5-HT呈上升趋势。

2．仁青芒觉胶囊140mg/kg和阳性药得舒特结肠5-HT表达较正常大鼠明显增高，（P<0.05）。

【实施例5】仁青芒觉胶囊对腹泻型IBS大鼠胃肠激素的影响

目的：胃肠道的激素变化可引起肠道运动功能紊乱或黏膜感受器阈值下降,从而引发肠易激综合征的诸多症状。胃肠激素可分为兴奋性和抑制性两大类，血管活性肠肽(VIP)主要作用是舒张胃肠平滑肌、舒张血管和刺激腺体分泌。SP为胃肠感觉和运动神经元的兴奋性递质,其生理作用为强烈促消化道平滑肌收缩,刺激小肠、结肠黏膜分泌水和电解质等。本实验通过检测模型大鼠血浆VIP、SP的变化，研究药物对胃肠激素的影响。

材料

1．试剂  血管活性肠肽（VIP）放免药盒、P物质（SP）放免检测药盒，北京华英生物技术研究所提供。

2．仪器  放免仪器:r-911全自动放免计数仪（中国科技大学实业总公司生产）；Biofuge15R低温离心机（Heraeus sepatech德国）；JA-1003电子分析天平（上海精科天平厂）。Biofuge15R低温离心机，Heraeus sepatech德国；JA-1003电子分析天平（上海精科天平厂）；超细匀浆器（上海季诺科贸有限公司），水浴锅（型号02810202，天津市中环实验电炉有限公司）；Multiskan MK3型酶标仪，芬兰Thermo Labsystem公司。

方法

1．血管活性肠肽（VIP）的检测

混匀，室温放置20分钟，3500转/分离心15分钟。弃上清，测沉淀计数（cpm）。

2．P物质（SP）的检测

混匀，室温放置20分钟，3500转/分离心25分钟。弃上清，测沉淀计数（cpm）。

结果

结果见表13，模型大鼠血浆SP活性较正常组明显增加（P<0.05），VIP活性与正常组相比没有显著性差异；仁青芒觉胶囊420mg/kg血浆SP活性较模型组明显降低（P<0.05）。

表13仁青芒觉胶囊对腹泻型IBS大鼠血浆VIP、SP的影响

注：与模型组比较﹡P<0.05

结论

1．腹泻型IBS大鼠血浆SP活性较正常组明显增加（P<0.05）。

2．仁青芒觉胶囊420mg/kg可明显降低模型大鼠血浆SP活性（P<0.05）。

【实施例6】仁青芒觉胶囊对腹泻型IBS大鼠TH1/TH2细胞因子的影响

目的：Th1（CD4阳性细胞）和Th2细胞间的平衡是维持正常免疫功能和身体健康的基础，目前疾病的Th1/Th2免疫应答模式成为疾病免疫病理中的主要环节。近年来大量临床及动物实验研究发现IBS存在肠道黏膜免疫激活的现象，表现为Thl细胞因子活性的增强和Th2细胞因子的减弱，提示IBS与免疫功能紊乱有一定关系。

本实施例通过检测模型大鼠血清Th1细胞因子TNFa和Th2类细胞因子IL-10的变化，探讨药物对IBS大鼠肠道免疫失调的的影响。

材料

1．检测试剂盒大鼠IL-10、TNF-αELISA试剂盒均由上海森雄科技实业有限公司提供。

2．仪器Biofuge15R低温离心机，Heraeus sepatech德国；JA-1003电子分析天平（上海精科天平厂）；超细匀浆器（上海季诺科贸有限公司），水浴锅（型号02810202，天津市中环实验电炉有限公司）；Multiskan MK3型酶标仪，芬兰Thermo Labsystem公司。

方法

1.建立标准曲线  设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100μl，第一孔加标准品100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100μl弃去，使之体积均为100μl。第八孔为空白对照。

2.样品测定  将待测血清100μl加入到预先已用抗大鼠TNF-α、IL-10单克隆抗体包被的酶标板上；将反应板充分混匀后置37℃温箱120min，使标准品、待测样品中的抗原与单抗充分结合；用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；每孔中加入生物素化的一抗（TNF-α/IL-10）工作液50μl，置37℃温箱60min；洗板；每孔加辣根过氧化物酶标记的Streptavidin抗体工作液100μl，将反应板置37℃温箱60min，使酶标抗体工作液与生物素化一抗结合成复合物；洗板；每孔加入OPD（邻苯二胺）底物工作液100μl，置37℃暗处反应5-10min；每孔加入1滴终止液（2M硫酸）混匀；在酶标仪上492nm处测各孔吸光值。

3.结果计算  用curve expert1.3软件，IL-10以标准品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、0pg/ml之OD值做出标准曲线，如图1所示。根据样品OD值在该曲线图上求出每ml血清中IL-10的含量。

用curve expert1.3软件，TNF-α以标准品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、0pg/ml之OD值做出标准曲线，如图2所示。根据样品OD值在以下曲线图上求出每ml血清中TNF-α的含量。

结果

结果见表14，模型组大鼠血清TNFa较正常大鼠有增高趋势，IL-10较正常大鼠有降低趋势，TNFa与IL10比值明显高于正常组（P<0.05）；与模型组相比，仁青芒觉胶囊140mg/kg组大鼠血清IL-10明显增高（P<0.05）；仁青芒觉胶囊420mg/kg、140mg/kg及阳性药得舒特大鼠TNFa/IL10均明显降低（P<0.05）。

表14仁青芒觉胶囊对腹泻型IBS大鼠血清细胞因子的影响

注：与模型组比较﹡P<0.05

结论

1．腹泻型IBS大鼠血清Thl细胞因子TNFa和Th2细胞因子IL10比值明显增高，提示IBS与免疫功能紊乱有一定关系。

2．仁青芒觉胶囊140mg/kg可明显提高腹泻型IBS大鼠血清Th2细胞因子IL-10的水平；仁青芒觉胶囊420mg/kg、140mg/kg及阳性药得舒特可降低模型大鼠TNFa与IL10的比值。

【实施例7】仁青芒觉胶囊对正常小鼠肠推进的影响

材料

1药物

2动物  ICR小鼠50只，雌雄各半，体质量18～22g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2012-0001。

方法

1．动物分组、给药及检测动物随机分为5组，即正常组、阳性药莫沙必利组（2.25mg/kg）、仁青芒觉胶囊大、中、小剂量组（720、360、180mg/kg）。小鼠灌胃给药，各给组予相应浓度的药物，正常对照组给蒸馏水，连续给药4天。实验前小鼠禁食不禁水16小时，末次给药30分钟后，灌胃给10％的活性炭混悬液0.4ml/只，15分钟后，小鼠脱颈椎处死，迅速取出小肠，轻轻剥离后直铺于白纸上，测量幽门至回盲部全长及幽门至黑色肠内容物前沿的距离。

小肠推进率＝幽门至黑色肠内容物前沿的距离/幽门至回盲部全长×100％

2.统计方法用SPSS11.0软件分析，采用One-Way ANOVA统计方法，数据以均数±标准差

结果

仁青芒觉胶囊360mg/kg及阳性药对正常小鼠的肠推进有明显的促进作用（P<0.05），仁青芒觉胶囊720、180mg/kg对正常小鼠的肠推进作用不明显（P>0.05）。如表15所示。

表15仁青芒觉胶囊对正常小鼠小肠碳末推进的影响

与正常组比较#P<0.05

【实施例8】仁青芒觉胶囊对新斯的明致小肠运动亢进的影响

材料

1.药物

2.动物  ICR小鼠60只，雌雄各半，体质量18～22g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2012-0001。

方法

1．动物分组、给药及检测实验动物随机分6组，即正常组、模型组、阳性药莫沙必利组（2.25mg/kg）、仁青芒觉胶囊大、中、小剂量组（720、360、180mg/kg）。小鼠灌胃给药，各给组予相应浓度的药物，正常组、模型组给等容量蒸馏水，连续给药4天。

实验前小鼠禁食不禁水16小时，末次给药30分钟后，各组皮下注射1％的新斯的明溶液0.1ml/10g，正常组不给。20分钟后灌胃给予10％的活性炭混悬液，0.4ml/只，10分钟后，小鼠脱颈椎处死，迅速取出小肠，轻轻剥离后直铺于白纸上，测量幽门至回盲部全长及幽门至黑色肠内容物前沿的距离。

小肠推进率＝幽门至黑色肠内容物前沿的距离/幽门至回盲部全长×100％

2.统计方法  用SPSS11.0软件分析，采用One-Way ANOVA统计方法，数据以均数±标准差表示。

结果

动物给予新斯的明后，小肠推进速度明显增快，仁青芒觉胶囊180mg/kg可明显抑制新斯的明引起的小鼠肠蠕动加快（P<0.05）。仁青芒觉胶囊720、360mg/kg对抗新斯的明致胃肠功能亢进的作用不明显（P>0.05）。如表16所示。

表16仁青芒觉胶囊对新斯的明致小肠运动亢进的影响

注：与模型组比较﹡P<0.05。

以下实施例9-10中使用的仁青芒觉胶囊由甘南佛阁藏药有限公司生产，胶囊内容物为给药物，为棕褐色粉末；其规格：0.25g/粒，批号：100501，生产日期：2010年5月10日，批准文号：国药准字Z20050177。

【实施例9】仁青芒觉胶囊治疗腹泻型IBS病的临床疗效及安全性、前瞻性、探索性临床研究方案设计

一、试验方法

试验设计：采用单中心、随机、对照试验设计方法。

病例数：总例数40例，试验组20例，对照组20例。

二、病例选择标准

诊断标准

罗马Ⅲ诊断标准：在最近的3个月内每月至少有3天具有反复发作的腹痛或腹部不适,并有下列症状中的2个或以上：①排便后症状改善；②排便频率的改变；③粪便性状的改变。在诊断前6个月出现症状，最近3个月症状发作符合上述诊断标准。

腹泻型IBS诊断标准：①符合罗马Ⅲ诊断标准；②便常规显示：稀便糊状便或水样便占大便量≥25%,硬便或块状便占大便量＜25%，稀便糊状便或水样便bristol分级6-7级；③结肠镜显示无其他肠道器质性病变。

注：Bristol分级：1级：分散的硬块，似坚果；2级:腊肠状,但成块;3级腊肠状,但表面有裂缝;4级似腊肠或蛇,光滑柔软;5级:软团,边缘清楚;6级:绒状物,边缘不清,糊状便;7级：水样便,无固体成分,完全是液体。

纳入标准

（1）符合罗马Ⅲ标准的腹泻型IBS患者；

（2）腹泻频次平均≥3次/天；

（3）年龄在18岁～65岁之间者；

（4）自愿作为受试对象，签署知情同意书，获得知情同意书过程应符合

GCP规定。

排除标准

（1）年龄在18周岁以下，65周岁以上者；

（2）便秘型、腹泻便秘交替型IBS患者；

（3）腹泻频次≤2次/天的腹泻型IBS患者；

（4）具有心、肝、肺、肾、血液等器质性疾病或影响其生存的严重疾病，如肿瘤或艾滋病；有临床意义的心电图异常；ALT＞1.5N（N为正常值上限）；肾功能异常；尿蛋白＞＋，镜下尿红细胞＞＋（尿Hb不作为判断指标）；血白细胞＜3.5×10⁹/L；

（5）行粪常规及粪培养等检查发现细菌等病原微生物感染所致腹泻；

（6）由于智力或行为障碍不能给予充分知情同意者；

（7）有胃肠、胆囊手术史患者；

（8）肿瘤患者或放化疗导致的腹泻；

（9）妊娠或准备妊娠妇女，哺乳期妇女；

（10）过敏体质，如对两种以上（含两种）药物或食物过敏史者；已知对本药成分过敏者；

（11）试验前三个月内参加过其他药物临床试验或正在参加其他药物临床试验的患者。

病例的剔除

（1）试验期间未能按规定用药或中途退出者（用药量或试验时间未超过1/3者）。

（2）纳入后发现不符合纳入标准。

（3）受试者依从性差（试验用药依从性小于80%或者大于120%），中途停药或者换药、加药，或合并使用本方案禁止使用的中西药物，影响疗效或者安全性判定者。资料统计分析前，由统计人员及主要研究者讨论判断病例是否剔除；

（4）入组后使用了其他治疗腹泻型IBS或影响疗效评价的药物，如抗炎药、解痉药、止泻药、微生态制剂和其他类治疗腹泻型IBS的中药。

病例的脱落

脱落的标准：经知情同意、并筛选合格进入随机化试验的受试者，因故未完成本方案所规定的疗程及观察周期，作为脱落病例。

脱落病例的处理：

（1）当受试者脱落后，研究者应采取登门、预约随访、电话、信件等方式，尽可能与受试者联系，询问理由、记录最后一次服药时间、完成所能完成的评估项目。

（2）因过敏或其他不良反应、治疗无效而退出试验病例，研究者应根据受试者实际情况，采取相应的治疗措施。

（3）脱落病例均应妥善保存有关试验资料，既作留档，也是进行全分析集统计所需。脱落病人无需另补。

中止试验标准

（1）用药过程中出现严重不良事件，根据医生判断应该停止该病例临床试验者。

（2）病程中病情加重，或试验中出现了其他影响试验观察的病证，根据医生判断应该停止临床试验者。作无效病例处理。

（3）临床试验方案实施中发生了严重偏差，如依从性太差等，难以评价药物效应。

（4）受试者在临床试验过程中不愿意继续进行临床试验，向主管医生提出退出临床试验的要求者。

三、治疗方案

试验药物：仁青芒觉胶囊

给药方案：

试验组：仁青芒觉胶囊，1g/次，1次/天；

对照组：肠胃康胶囊，2粒/次,3次/天。

疗程：治疗4周。

禁用药物：抗炎药、解痉药、止泻药、微生态制剂和其他类用于治疗腹泻型IBS的中药。

四、观测指标

排除性检测指标:电子肠镜

安全性检测指标

（1）一般体检项目；

（2）血常规、尿常规、粪便常规及粪培养；

（3）心电图、肝肾功能及电解质

疗效性指标:消化道症状、焦虑自评和抑郁自评，分别如下方表17、表18和表19所示：

表17.IBS患者消化道症状评分

编号：   姓名：   性别：   年龄(岁)：   分数：   填表时间：

表18.焦虑自评量表(SAS)

焦虑是一种比较普遍的精神体验，长期存在焦虑反应的人易发展为焦虑症。本量表包含20个项目，分为4级评分，请您仔细阅读以下内容，根据最近一星期的情况如实回答。

填表说明：所有题目均共用答案，请在A、B、C、D下划“√”，每题限选一个答案。

姓名____________性别：□男□女

自评题目：

答案：A没有或很少时间；B小部分时间；C相当多时间；D绝大部分或全部时间。

1.我觉得比平时容易紧张或着急         A B C D

2.我无缘无故在感到害怕               A B C D

3.我容易心里烦乱或感到惊恐           A B C D

4.我觉得我可能将要发疯               A B C D

*5.我觉得一切都很好                  A B C D

6.我手脚发抖打颤                     A B C D

7.我因为头疼、颈痛和背痛而苦恼       A B C D

8.我觉得容易衰弱和疲乏               A B C D

*9.我觉得心平气和，并且容易安静坐着  A B C D

10.我觉得心跳得很快                  A B C D

11.我因为一阵阵头晕而苦恼            A B C D

12.我有晕倒发作，或觉得要晕倒似的    A B C D

*13.我吸气呼气都感到很容易           A B C D

14.我的手脚麻木和刺痛                A B C D

15.我因为胃痛和消化不良而苦恼      A B C D

16.我常常要小便                    A B C D

*17.我的手脚常常是干燥温暖的       A B C D

18.我脸红发热                      A B C D

*19.我容易入睡并且一夜睡得很好     A B C D

20.我作恶梦                        A B C D

评分标准：正向计分题A、B、C、D按1、2、3、4分计；反向计分题（标注*的题目题号：5、9、13、17、19）按4、3、2、1计分。总分乘以1.25取整数，即得标准分。低于50分者为正常；50-60分者为轻度焦虑；61-70分者为中度焦虑，70分以上者为重度焦虑。

表19.抑郁自评量表(SDS)

本量表包含20个项目，分为4级评分，为保证调查结果的准确性，务请您仔细阅读以下内容，根据最近一星期的情况如实回答。

填表说明：所有题目均共用答案，请在A、B、C、D下划“√”，每题限选一个答案。

姓名__________性别：□男□女

自评题目：

答案：A没有或很少时间；B小部分时间；C相当多时间；D绝大部分或全部时间。

1.我觉得闷闷不乐,情绪低沉                A B C D

*2.我觉得一天之中早晨最好                A B C D

3.我一阵阵哭出来或想哭                   A B C D

4.我晚上睡眠不好                         A B C D

*5.我吃得跟平常一样多                    A B C D

*6.我与异性密切接触时和以往一样感到愉快  A B C D

7.我发觉我的体重在下降                   A B C D

8.我有便秘的苦恼                         A B C D

9.我心跳比平时快                         A B C D

10.我无缘无故地感到疲乏                  A B C D

*11.我的头脑跟平常一样清楚               A B C D

*12.我觉得经常做的事情并没困难           A B C D

13.我觉得不安而平静不下来                A B C D

*14.我对将来抱有希望                     A B C D

15.我比平常容易生气激动                  A B C D

*16.我觉得作出决定是容易的               A B C D

*17.我觉得自己是个有用的人，有人需要我   A B C D

*18.我的生活过得很有意思               A B C D

19.我认为如果我死了别人会生活得更好些  A B C D

*20.平常感兴趣的事我仍然照样感兴趣     A B C D

评分标准：正向计分题A、B、C、D按1、2、3、4分计；反向计分题（标注*的题目，题号：2、5、6、11、12、14、16、17、18、20）按4、3、2、1计分。总分乘以1.25取整数，即得标准分。低于50分者为正常；50-60分者为轻度焦虑；61-70分者为中度焦虑，70分以上者为重度焦虑。

五、疗效及安全性评价标准

疗效评价

有效性评价

腹痛、腹泻疗效判定参考Bensoussan等的研究制定。腹痛、腹泻、腹胀的临床疗效均按痊愈、显效、有效及无效四级评定。

腹痛疗效判定标准：①痊愈：用药后腹痛消失，腹痛症状积分之和为0；②显效：用药后腹痛明显减轻，腹痛症状积分之和较用药前下降≥70%；③有效：用药后腹痛有所减轻，腹痛症状积分之和较用药前下降≥30%，<70%；④无效：用药后腹痛无明显减轻，腹痛症状积分之和较用药前下降<30%。

腹泻疗效判定标准：①痊愈：用药后大便次数及性状均恢复正常，大便性状及次数积分之和为0；②显效：用药后大便次数及性状明显改善，大便性状及次数积分之和较用药前下降≥70%；③有效：用药后大便次数及性状有所改善，大便性状及次数积分之和较用药前下降≥30%，<70%。④无效：用药后大便次数及性状无明显改善，大便性状及次数积分之和较用药前下降<30%。

腹胀疗效判定标准：①痊愈：用药后腹胀消失，腹胀症状积分之和为0；②显效：用药后腹胀明显减轻，腹胀症状积分之和较用药前下降≥70%；③有效：用药后腹胀有所减轻，腹胀症状积分之和较用药前下降≥30%，<70%；④无效：用药后腹胀无明显减轻，腹胀症状积分之和较用药前下降<30%。

粪便性状变化评定：按照Bristol粪便性状分型标准进行评定：1级：分散的硬块，似坚果；2级:腊肠状,但成块;3级腊肠状,但表面有裂缝;4级似腊肠或蛇,光滑柔软;5级:软团,边缘清楚;6级:绒状物,边缘不清,糊状便;7级:水样便,无固体成分,完全是液体，6、7级为腹泻型，4、5级为正常。1-7级分别对应1～7分。

排便频率评分：以24小时为计量单位，在24小时内每排1次粪便计算1

分，根据粪便次数累计分数。

消化道症状评分（附件1）

焦虑自评量表（附件2）

抑郁自评量表（附件3）

安全性评价

1级：安全，无任何不良反应。

2级：比较安全，如有不良反应，不需做任何处理可继续给药。

3级：有安全性问题，有中等程度的不良反应，做处理后可继续给药。

4级：因不良反应中止试验。

六、不良事件的记录与报告

定义

不良事件的术语涵盖了在临床研究观察期间患者出现的并会影响患者健康的任何症状、综合征或疾病，也包括了实验室或其他诊断过程中发现的与临床相关的情况，如需要计划外诊治措施，或导致从研究中退出，或有临床意义的实验室检查项目异常。

不良事件可能是：新的疾病；治疗状态症状或体征的恶化，或伴随疾病的恶化；对照药物的作用；与参加该试验无关；一个或多个因素的组合。所以，“不良事件”这一术语并不意味着与试验药物有因果关系。

严重不良事件是在研究药物任何剂量下或在观察期间任何时候出现的以下不良事件，包括：导致死亡；即刻危及生命；需住院治疗或延长住院时间；导致永久的或严重的残疾；超剂量而引起的；引起癌症；导致先天畸形；有重要的医学意义（指那些不会立即危及生命或导致死亡或需住院的事件，但可能危害患者或需要采取措施来预防上述所定义的一种后果）；需要医学处理来防止永久性的损伤或损害。

不良事件与药物因果关系判断

研究者应对不良事件和研究药物以及合并药物之间可能存在的关联做出评估，参照以下五级分类标准评定。

因果关系判断指标

因果关系判断的5个指标：①开始用药时间与可疑不良事件出现时间有无合理的先后关系。②可疑的不良事件是否符合该药品已知的不良反应类型。③所怀疑的不良事件是否可以用患者的病理状况、合并用药、并用疗法、曾用疗法来解释。④停药或降低用量，可疑不良事件能否减轻与消失。⑤再次接触同样药物后是否再次出现同样反应。

因果关系的判断

依据上述五个指标，分析因果关系为肯定、很可能、可能、可疑和不可能5级。见表20。

表20.中药不良事件因果判断表

说明：①肯定，很可能两级可认为是不良事件。②实验室检查项目超过正常值的20%可判为异常。

不良事件的处理

观察与记录：研究者应要求患者如实反映用药后的病情变化，避免诱导性提问。试验期间出现的任何不良反应均应填写“不良事件表”，并追踪调查，详细记录处理经过及结果，直到化验检查恢复正常，症状体征消失。追踪随访方式可以根据不良反应的轻重选择住院、门诊、家访、电话、通讯等多种形式。

医疗处理：发现不良反应时，研究者根据病情决定诊治措施，并决定是否中止观察。出现严重不良事件，承担临床研究的单位须立即采取必要处理措施，保护受试者安全。同时通知监查员。

报告：研究者填写《严重不良事件报告表》，在24小时内分别报告国家药品监督管理局药品注册司、安全监管司和省级药品监督管理局、申办者及伦理委员会，并在报告上签名及注明日期。申办者还应及时向各参研单位通报，并保证满足所有法律法规要求的报告程序。紧急情况，包括严重，特别是致死的不良反应，应以最快的通讯方式（包括电话、传真、特快专递、E-mail等）向所在省、自治区、直辖市药品不良反应监测专业机构报告。

七、试验质量的控制

数据管理

CRF填写与移交

CRF由研究者填写，每个入选病例必须完成CRF。数据不能出现修改，填写错误必须修改者，研究者必须在修改处签字。完成的CRF由临床监查员审查后，移交数据管理员，进行数据录入与管理工作。

数据的录入与修改

数据录入与管理由医学统计室指定管理员负责。数据管理员采用EPI5软件编制数据录入程序，进行数据的录入与管理。为保证数据录入的准确性，应由两个数据管理员独立进行双份录入并校对。对CRF中存在的疑问，数据管理员将产生疑问解答表（DRQ），并通过临床检查员向研究者发出询问，研究者应尽快解答并返回，数据管理员根据研究者的回答进行数据修改，确认与录入。必要时可再次发出DRQ

数据锁定

在审核并确认建立的数据库正确后，由主要研究者，申报者，统计分析人员和药品监督管理人员对数据进行锁定。锁定后的文件不再做改动。数据锁定后发现的问题，经确认后在统计分析程序中进行修改

数据处理

在研究数据全部录入并锁定后，将数据库交统计分析人员进行统计分析。完成统计分析后，写出研究报告。

任命监查员：保证临床试验中受试者的权益受到保障，试验记录与报告数据准确，保证试验遵循已批准的方案、药品管理规范和有关法规。

统计分析

统计分析将采用SPSS10.0统计分析软件进行分析：所有的统计检验都采用双侧检验，P值小于0.05将被认为所检验的差别有统计意义。各组每次就诊的计量资料采用均数±标准差进行统计描述。与筛选期基础值进行比较，采用配对t检验比较组内前后差异。两组治疗前后的变化采用方差分析（ANOVA）。不同治疗组各次就诊的计数资料采用频数（构成比）进行统计描述。两组治疗前后的变化采用χ²检验或非参数检验。

脱落分析：两组总脱落率和不良事件脱落率的比较将采用χ²检验。

基础值的均衡性分析：采用方差分析或χ²检验来比较人口学资料和其它基础值指标，以衡量两组均衡性如何。

有效性分析：采用非参数方法评估有效性指标。

安全性分析：两组不良事件发生率的比较采用χ²检验，并列表描述本次试验所发生的不良事件；实验室检验结果在试验前后正常/异常的变化情况以及发生异常改变时与试验药物的关系。

【实施例10】仁青芒觉胶囊治疗腹泻型IBS病的临床疗效及安全性、前瞻性、探索性临床研究结果

一、实际入选病例数：

42例病人符合入选标准进入本研究，其中试验组21例，对照组21例。研究中无患者脱落，病例无剔除，共有42例病人按方案完成研究。本试验全部病人均签署了知情同意书。受试者用药依从性良好。

二、入选病人基本情况：

两组治疗前性别、年龄、心率、收缩压、舒张压、既往治疗、药物过敏史、合并疾病等方面均无显著差异（P）。两组具有可比性。见表21。

表21.入组时一般情况及体格检查项目的比较

入组时症状体征的可比性分析：

入组时两组受试者的症状体征各项评价指标的统计分析，结果显示两组间各项指标差异均无统计学意义(P值均大于0.05)，具有均衡可比性，详见以下各项分析。

入组时消化道症状积分可比性分析：

入组时消化道各症状积分统计结果显示，组间差异无统计学意义(P＞0.05)，具有均衡可比性(见表22)

表22.入组时消化道症状积分的比较

入组时SAS积分可比性分析：

入组时SAS积分统计结果显示，组间差异无统计学意义(P＞0.05)，具有均衡可比性(见表23)

表23.入组时SAS积分的比较

入组时SDS积分可比性分析：

入组时SDS积分统计结果显示，组间差异无统计学意义(P＞0.05)，具有均衡可比性(见表24)

表24.入组时SDS积分的比较

三、疗效指标结果及分析

两组病人临床疗效比较：用药后腹痛改善方面，试验组有效率为100%，对照组有效率为81%，两组间比较有显著性差异（P=0.034）；用药后腹泻改善方面，试验组有效率为100%，对照组有效率为95.3%，两组间比较有显著性差异（P=0.008）；用药后腹痛改善方面，试验组有效率为100%，对照组有效率为81%，两组间比较有显著性差异（P=0.016）。见表25。

表25.两组病人临床疗效的情况及比较

用药后两组病人消化道总积分情况比较：用药后试验组、对照组的消化道症状总积分均呈逐渐下降。试验组的症状总积分中位数由用药前的17分下降为4分，下降值为13.29±1.793。对照组的症状总积分中位数由用药前的17分下降为5分，下降值为10.38±3.122。治疗前后比较有显著差异（P<0.001）。两组间比较无显著性差异（P>0.05）。用药后仁青芒觉在改善症状方面起效迅速，与对照组的疗效不相上下。详见表26-27。

表26.两组病人治疗前后消化道症状总积分的情况

表27.两组病人治疗后消化道症状总积分下降值的比较

两组病人用药后各消化道症状变化比较：用药第7天，试验组及对照组的消化道各症状前后比较均有显著性差异（试验组P<0.001，对照组P<0.05），两组间比较无显著性差异（P>0.05）。用药第14天，试验组及对照组的消化道各症状前后比较均有显著性差异（P<0.001），两组间比较无显著性差异（P>0.05）。用药第21天，试验组及对照组的消化道各症状前后比较均有显著性差异（P<0.001），两组间比较无显著性差异（P>0.05）。用药第28天，试验组及对照组的消化道各症状前后比较均有显著性差异（P<0.001），两组间比较无显著性差异（P>0.05）。详见表28-31。

表28.用药7天后消化道积分变化情况与比较

表29.用药14天后消化道积分变化情况与比较

表30.用药21天后消化道积分变化情况与比较

表31.用药28天后消化道积分变化情况与比较

两组病人用药后SAS积分情况：用药后试验组、对照组的SAS积分有下降趋势。试验组的总积分中位数由用药前的45分下降为34分，下降值为10.619±6.184。对照组的总积分中位数由用药前的43分下降为40分，下降值为2.714±4.349。治疗前后比较有显著差异（P<0.05）。两组间比较无显著性差异（P>0.05）。详见表32-33。

表32.两组病人治疗前后SAS总积分的情况

表33.两组病人治疗后SAS总积分下降值的比较

两组病人用药后SDS积分情况：用药后试验组、对照组的SDS积分有下降趋势。试验组的总积分中位数由用药前的46分下降为34分，下降值为10.190±6.306。对照组的总积分中位数由用药前的48分下降为41分，下降值为3.952±5.287。治疗前后比较有显著差异（P<0.001）。两组间比较无显著性差异（P>0.05）。详见表34-35。

表34.两组病人治疗前后SDS总积分的情况

表35.两组病人治疗后SDS总积分下降值的比较

四、安全性情况

（一）不良事件和不良反应：本研究中未出现不良反应和不良事件。两组的不良事件及不良反应发生率均为0.00%。

（二）严重不良事件:本研究中未出现严重不良事件。

（三）实验室检查异常情况:治疗前实验室检查正常而治疗后异常的病例，表现为心电图变化、尿白细胞。根据患者的实际情况，临床医生判断这些实验室指标治疗前正常治疗后异常情况无临床意义，并与试验药物无关。

五、合并用药

研究中，试验组有1例、对照组有1例合并用药，合并用药比例两组比较无显著差异(P=0.76)。合并用药为施慧达、亚莫利。无违背方案的合并用药。合并用药详情见表36。

表36.两组病人合并用药详情

结论

本研究是随机、平行、阳性对照的单中心再评价的临床研究，目的在于论证仁青芒觉胶囊治疗腹泻型IBS的有效性和安全性，希望能在腹泻型IBS治疗方面开拓新的有效药物。研究过程严格按照GCP要求执行。研究结果显示：疗效方面，仁青芒觉胶囊（4粒/次，1次/天）与对照药肠胃康胶囊（2粒/次,3次/天）均能够有效的缓解腹泻型IBS引起的腹痛、腹泻、腹胀等症状，用药前后比较有显著统计学差异（P<0.001）,组间比较无统计学差异（P>0.05）。在腹痛、腹泻、腹胀临床症状改善有效率方面，两组均有明显疗效，且治疗组疗效优于对照组（P<0.05）。

在安全性方面，本次试验未出现一例不良反应与不良事件，说明本品的安全性是可以得到肯定的。

因此藏药仁青芒觉胶囊在腹泻型IBS患者中的疗效和安全性与对照药肠胃康胶囊相当，可以安全、有效的治疗腹泻型IBS。

参考文献

（1）《药物临床试验质量管理规范》（GCP）

(2)SFDA《药品注册管理办法》

（3）《中药新药临床研究指导原则》

（4）《新药审批办法及有关法规》

（5）仁青芒觉胶囊研究者手册

Claims (3)

1.藏药仁青芒觉在制备治疗腹泻型肠易激综合征药物中的应用,其中所述药物用于调节由细胞因子介导的肠道粘膜免疫反应失衡；或者所述药物用于抑制胃肠激素p物质异常分泌；或者所述药物用于调节5‐羟色胺表达。

2.藏药仁青芒觉在制备治疗肠易激综合征药物中的应用，其中所述药物刺激或抑制肠蠕动。

3.如权利要求1～2任一项所述的应用，其中所述藏药仁青芒觉为选自丸剂、胶囊剂、片剂、散剂和颗粒剂的药学制剂中的一种口服制剂。