CN103272404A

CN103272404A - 生物膜反应器的生物膜胞外聚合物的提取和分级分析方法

Info

Publication number: CN103272404A
Application number: CN2013101940715A
Authority: CN
Inventors: 王奇; 李军; 赵敏; 柯强; 马海虎; 于恒国; 李光明; 徐竟成
Original assignee: Wenzhou University
Current assignee: Wenzhou University
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-05-22
Also published as: CN103272404B

Abstract

本发明公开了一种生物膜反应器的生物膜胞外聚合物的提取和分级分析方法。该方法包括：生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的提取步骤；采用XAD-8吸附树脂、MSC阳离子交换树脂和Duolite A-7阴离子交换树脂分别将生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物进行色谱分级的分级步骤；生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的各分级组分的系统分析步骤。该方法可以解决通常生物膜剥落破坏原有的生物膜结构特征，也可以解决生物膜胞外聚合物亲水性、疏水性、酸碱性物质同步分离难和特征分析不系统的问题。

Description

生物膜反应器的生物膜胞外聚合物的提取和分级分析方法

技术领域

本发明涉及生物膜胞外聚合物的提取和分析领域，尤其涉及一种生物膜反应器的生物膜胞外聚合物的提取和分级分析方法。

背景技术

胞外聚合物（EPS）是微生物在一定环境条件下，在其代谢过程中产生的包围在细胞壁外，用于自我保护和相互粘附，并在饥饿环境下为微生物本身提供碳源和能量的一类有机高分子聚合物。在废水生物处理过程中EPS不仅包括由细胞分泌的粘液和荚膜，还包括微生物的排泄物、代谢和水解产物，以及吸附的废水中的一些无机物和有机物等多种物质。在生物膜反应器处理废水和修复污染水体过程中,EPS被认为在水处理过程中起到非常重要的作用，例如物质传输、吸附能力和微生物聚集体形成等，其组成的变化是评价处理效率的重要指标之一。

目前，从生物膜中提取EPS的方法可分为物理法、化学法和物理化学结合法。一般情况下物理方法比较温和，由于不引入药品，所以EPS的生物活性成分变性小。

生物膜胞外聚合物分子结构中同时含有疏水基团和亲水基团，这就决定了胞外聚合物是一个两性物质，同时具有亲水性和疏水性。传统的EPS测试项目如蛋白质、多糖等只能从总体上了解EPS的基本情况，不能掌握EPS的内在特性，对于水处理技术工艺的指导带有较大的模糊性和不确定性。目前，无法对生物膜反应器的生物膜胞外聚合物的组分进行有效的分离,并且生物膜胞外聚合物在生物膜水处理技术中的作用了解的甚少，从而影响了水处理技术人员对其作用和性质进行深入的研究和调控。分级组分可以对EPS的酸碱性、亲水疏水性等了解的更多，有利于掌握净水过程和机理。生物膜胞外聚合物提取和分级分析对于优化控制生物膜反应器的运行，提高处理的效果，具有重要的理论和实际应用价值。因此，需要提供一种有效的、更加细化的生物膜胞外聚合物的提取和分级分析方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种生物膜反应器的生物膜胞外聚合物的提取和分级分析方法。该方法用于解决通常生物膜剥落破坏原有的生物膜结构特征，解决常规生物膜剥落后影响生物膜胞外聚合物粘液（S）、松散型胞外聚合物（LB）和紧密型胞外聚合物（TB）提取的缺点，也可以解决生物膜胞外聚合物亲水性、疏水性、酸碱性物质同步分离难和特征分析不系统的问题。

为了解决现有技术的缺陷，本发明采用以下技术方案：

一种生物膜反应器的生物膜胞外聚合物的提取和分级分析方法，包括如下步骤：

生物膜胞外聚合物粘液（S）、松散型胞外聚合物（LB）和紧密型胞外聚合物（TB）的提取步骤；

采用XAD-8吸附树脂、MSC阳离子交换树脂和Duolite A-7阴离子交换树脂分别将生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物进行色谱分级，以分级出疏水性酸(HOA)、疏水性碱(HOB)、疏水中性(HON)、亲水酸(HIA)、亲水碱(HIB)和亲水中性(HIN)物质的分级步骤；

生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的各分级组分的系统分析步骤。

在上述方法中，作为一种优选实施方式，所述分级步骤包括如下步骤：步骤一，将生物膜胞外聚合物粘液过滤膜，得到的滤液过XAD-8吸附树脂柱，滤出液保留备用；步骤二，采用0.1M HCl洗脱步骤一的XAD-8吸附树脂柱，得到的洗脱液为疏水性碱生物膜胞外聚合物粘液（S-HOB）；步骤三，调节步骤一中过XAD-8吸附树脂柱的滤出液的pH为2，然后依次过XAD-8吸附树脂柱、MSC阳离子交换树脂柱和Duolite A-7阴离子交换树脂柱，最终得到的滤出液为亲水中性生物膜胞外聚合物粘液（S-HIN）；步骤四，再用0.1M NaOH洗脱经步骤三的XAD-8吸附树脂柱，得到的洗脱液为疏水性酸生物膜胞外聚合物粘液（S-HOA）；步骤五，用0.1M NaOH洗脱经步骤三的MSC阳离子交换树脂柱，得到的洗脱液为亲水碱生物膜胞外聚合物粘液（S-HIB）；步骤六，用0.1M NaOH洗脱经步骤三的Duolite A-7阴离子交换树脂柱，得到的洗脱液为亲水酸生物膜胞外聚合物粘液（S-HIA）；步骤七，将经步骤四的XAD-8吸附树脂干燥，然后利用甲醇进行索氏提取以得到疏水中性生物膜胞外聚合物粘液（S-HON）；采用与步骤一至步骤七相同的方法将松散型胞外聚合物分级为疏水性碱松散型胞外聚合物（LB-HOB）、亲水中性松散型胞外聚合物（LB–HIN）、疏水性酸松散型胞外聚合物（LB-HOA）、亲水碱松散型胞外聚合物（LB–HIB）、亲水酸松散型胞外聚合物（LB–HIA）、疏水中性松散型胞外聚合物（LB–HON）；采用与步骤一至步骤七相同的方法将紧密型胞外聚合物分级为疏水性碱紧密型胞外聚合物（TB-HOB）、亲水中性紧密型胞外聚合物（TB–HIN）、疏水性酸紧密型胞外聚合物（TB-HOA）、亲水碱紧密型胞外聚合物（TB–HIB）、亲水酸紧密型胞外聚合物（TB–HIA）、疏水中性紧密型胞外聚合物（TB–HON）。更优选地，在进行所述色谱分级前，所述生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的DOC大于20mg/L，最优选DOC为20-40mg/L，示例性的可以为20mg/L、22mg/L、26mg/L、30mg/L、34mg/L、38mg/L。更优选地，所述步骤一中滤液过XAD-8吸附树脂柱的流速为0.8-1mL/min，示例性的可以为0.85mL/min、0.9mL/min、0.95mL/min；在所述步骤三中，滤出液依次过XAD-8吸附树脂柱、MSC阳离子交换树脂柱和Duolite A-7阴离子交换树脂柱的流速均为0.8-1mL/min，示例性的可以为0.85mL/min、0.9mL/min、0.95mL/min。更优选地，所述步骤七中的所述索氏提取的时间为20-30h，示例性的可以为22h、24h、26h、28h。

在上述方法中，所述提取步骤可以是本领域常用的物理提取方法，比如高速离心法、热提取法或超声法，作为一种优选实施方式，所述提取步骤是离心超声波整体提取法。更优选地，所述离心超声波整体提取法具体为：用超纯水清洗生物膜反应器中挂有生物膜的载体2-3次；将清洗后的含有生物膜的超纯水在4℃、1800-2200g条件下离心10-20min，得到的第一上清液为胞外聚合物粘液；然后再向离心管中加入与用于清洗所述挂有生物膜载体的超纯水具有相同体积的超纯水，在4℃、4500-5500g条件下离心10-20min，得到的第二上清液为松散型胞外聚合物；之后再向离心管中加入与用于清洗所述挂有生物膜载体的超纯水具有相同体积的超纯水，在55-65W的超声功率、26-30kHz的超声波频率下超声8-15min，再在4℃、18000-22000g条件下离心15-25min，得到的第三上清液为紧密型胞外聚合物。该优选方法不破坏原有生物膜结构，可以准确表征胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的特征。

在上述方法中，作为一种优选实施方式，所述系统分析步骤包括分级组分DOC（溶解有机碳）分析、三维荧光分析、紫外分析和分子量分布分析以综合表征生物膜胞外聚合物的分级组分。

上述分级组分是指生物膜S、LB、TB胞外聚合物分别经XAD-8吸附树脂柱、MSC阳离子交换树脂柱和Duolite A-7阴离子交换树脂柱分离后得到的S-HOA、S-HOB、S-HON、S-HIA、S-HIB、S-HIN、LB-HOA、LB-HOB、LB-HON、LB-HIA、LB-HIB、LB-HIN、TB-HOA、TB-HOB、TB-HON、TB-HIA、TB-HIB、TB-HIN。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明优选的生物膜反应器的生物膜胞外聚合物提取方法可以不破坏原有的生物膜结构特征，对生物膜胞外聚合物不会造成污染或造成破坏，因此可以准确表征胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的特征。

（2）可实现生物膜反应器的生物膜胞外聚合物亲水性、疏水性、酸碱性物质同步分离，解决了生物膜胞外聚合物亲水性、疏水性、酸碱性物质同步分离难的问题。另外，为研究不同性质的胞外聚合物对污染物的吸附作用和机理提供技术支持，也可将分离出不同性质的胞外聚合物进行纯化后，制备选择性的新型吸附剂。

（3）采用DOC分析、三维荧光分析、紫外分析和分子量分布分析可系统分析表征所提取的生物膜胞外聚合物分级组分，解决了生物膜胞外聚合物特征分析不系统的问题，有效分析胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的性质，可为优化生物膜反应器处理废水提供科学依据。

附图说明

图1是生物膜胞外聚合物分级流程图；

图2是生物膜胞外聚合物分级组分比例图；

图3是生物膜胞外聚合物粘液分级组分三维荧光谱图；

图4是生物膜松散型胞外聚合物分级组分三维荧光谱图；

图5是生物膜紧密型胞外聚合物分级组分三维荧光谱图；

图6是生物膜胞外聚合物分级组分UV254吸光度图；

图7是生物膜胞外聚合物粘液分级组分子量分布图；

图8是生物膜松散型胞外聚合物分级组分分子量分布图；

图9是生物膜紧密型胞外聚合物分级组分分子量分布图；

图10是生物膜胞外聚合物粘液分级组分的凝胶色谱图；

图11是生物膜松散型胞外聚合物分级组分的凝胶色谱图；

图12是生物膜紧密型胞外聚合物分级组分的凝胶色谱图。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明的方法进行详细说明。

实施例生物膜反应器的生物膜胞外聚合物的提取和分级分析方法

曝气生物滤池（BAF）是典型的生物膜反应器，在水处理中应用广泛。本实施例中选用曝气生物滤池作为生物膜反应器，将同济大学三好坞景观水体和生活污水混合的实验废水（其中进水水质：DOC为6～8mg/L，UV₂₅₄为8-10m^-1，总磷为0.4～0.8mg/L，氨氮1～3mg/L，NO₃-N为0.2～0.5mg/L）引入曝气生物滤池中，进水量为30m³/h，待稳定运行一周后，放空水，进行第一次取料即从上到下分别取出挂有生物膜的填料载体，湿重共约50g。取料后，继续运行2周后再采用与第一取料相同的方法进行第二次取料即从上到下分别取出挂有生物膜的填料载体，湿重共约50g。

具体提取和分级分析方法如下：

（1）提取步骤：

待第一次取料完成后，用总计40mL超纯水清洗挂有生物膜的填料载体2次；将清洗后的含有生物膜的超纯水在超速冷冻离心机（天美科学仪器公司，CT15RT）中以4℃、2000g的条件离心15分钟，上清液为胞外聚合物粘液（S）；然后向试管中加入40mL的超纯水，在4℃、5000g条件下离心15分钟，提取上清液为松散型胞外聚合物（LB）；之后再加入40mL的超纯水，在超声功率60W、超声波频率28kHz下超声10min，不能加热，维持水温为室温，然后在4℃、20000g条件下离心20分钟，提取上清液为紧密型胞外聚合物（TB）；将得到的胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物、紧密型胞外聚合物置于4℃条件下备用。

待第二次取料完成后，按照上述方法再次提取胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物、紧密型胞外聚合物，然后将第二次得到的胞外聚合物粘液与第一次得到的胞外聚合物粘液混合作为分级步骤的原料胞外聚合物粘液，其DOC为22mg/L；将第二次得到的松散型胞外聚合物与第一次得到的松散型胞外聚合物混合作为分级步骤的原料松散型胞外聚合物，其DOC为10mg/L，将其真空浓缩以使DOC为20mg/L；将第二次得到的紧密型胞外聚合物与第一次得到的紧密型胞外聚合物混合作为分级步骤的原料紧密型胞外聚合物，其DOC为25mg/L。所述DOC值的测定方法参见下面系统分析步骤。

（2）色谱分级步骤

操作条件：

XAD-8吸附树脂柱：填料粒径40-60目，柱直径10mm，柱床高50mm；

MSC阳离子交换树脂柱：填料粒径20-50目，柱直径10nm，柱直径20mm，柱床高50mm；

Duolite A-7阴离子交换树脂柱：填料粒径16-50目，柱直径10mm，柱床高50mm；

检测器：检测器为RID-10A

结合图1，具体步骤如下：

步骤一，将提取步骤中得到的40mL生物膜胞外聚合物粘液过0.45μm滤膜，得到的滤液以0.9mL/min左右的流速过XAD-8吸附树脂柱，滤出液保留备用；步骤二，采用0.1M HCl以0.9mL/min的流速洗脱步骤一的XAD-8吸附树脂柱，得到的洗脱液（40mL）为S-HOB；步骤三，用6M的HCl调节步骤一中过XAD-8吸附树脂柱的滤出液的pH为2，然后将其过XAD-8吸附树脂柱、得到的滤出液再过MSC阳离子交换树脂柱，再次得到的滤出液过Duolite A-7阴离子交换树脂柱，过这三个柱子的速度均为0.9mL/min左右，最终得到的滤出液（40mL）为S-HIN；步骤四，再用0.1M NaOH以0.9mL/min的流速洗脱经步骤三的XAD-8吸附树脂柱，得到的洗脱液（40mL）为S-HOA；步骤五，用0.1M NaOH以0.9mL/min的流速洗脱经步骤三的MSC阳离子交换树脂柱，得到的洗脱液（40mL）为S-HIB；步骤六，用0.1M NaOH以0.9mL/min的流速洗脱经步骤三的Duolite A-7阴离子交换树脂柱，得到的洗脱液（40mL）为S-HIA；步骤七，将经步骤四的XAD-8吸附树脂干燥12h，然后在索氏提取器中加入甲醇和干燥后的XAD-8树脂（其中甲醇与XAD-8树脂的质量比为40:1），进行索氏提取24h，提取后的甲醇溶液40摄氏度下用旋转蒸发仪去除多余的甲醇，提取液浓缩至干，残渣加超纯水15mL，微热使溶解，转移至100mL容量瓶中，加超纯水定容至100mL，得到S-HON（100mL）；采用与步骤一至步骤七相同的方法将松散型胞外聚合物分级为LB-HOB、LB–HIN、LB-HOA、LB–HIB、LB–HIA、LB–HON；采用与步骤一至步骤七相同的方法将紧密型胞外聚合物分级为TB-HOB、TB–HIN、TB-HOA、TB–HIB、TB–HIA、TB–HON。

采用该分级步骤将S、LB和TB分级的效果好，可参见图10-12，从图10-12中可以看出，各谱峰较好、各组分分离效果好。

（3）系统分析步骤：

包括分级组分DOC分析、三维荧光分析、紫外分析和分子量分布分析以综合表征生物膜胞外聚合物的分级组分。

（A）DOC分析

将色谱分级步骤中得到的各分级组分分别通过0.45μm醋酸纤维素膜，然后采用德国ELEMENTAR TOC分析仪测定各分级组分的DOC（过膜后测定的TOC即为DOC），并计算S、LB和TB的各分级组分分别占相应的S、LB和TB总量的比例。生物膜胞外聚合物分级组分比例见图2所示。

由图2可知：生物膜胞外聚合物粘液（S）中以亲水碱性物质(HIB)为主，占29.85%，总的亲水性物质占68.51%。因此，S主要为亲水性物质。这种结构可以使生物膜在一定条件下易于更新和脱落，保持生物膜的活性。生物膜松散型胞外聚合物（LB）中以疏水碱性物质(HOA)为主，占39.97%，总的疏水性物质占72.4%。因此，生物膜松散型胞外聚合物主要为疏水性物质，在生物膜胞外聚合物吸附污染物中最为重要，影响生物膜疏水性的根本原因。疏水性是生物膜微生物聚集的重要推动力，疏水性大可以增强细胞间的亲和力。生物膜紧密型胞外聚合物（TB）中以亲水碱性物质(HIN)为主，占43.25%，总的亲水性物质占56.86%。因此，生物膜紧密型胞外聚合物虽然主要为亲水性物质，但亲水物质和疏水物质的比例基本差不多。因为生物膜紧密型胞外聚合物，离微生物胞内最近，因此，微生物降解环境决定了只有保持中性条件和疏水亲水比例基本一致，才能更好的降解污染物质。生物膜中EPS的亲/疏水性的差异将影响微生物聚集体的疏水性，从而影响曝气生物滤池的运行效率。

曝气生物膜滤池生物膜胞外聚合物S主要为亲水性物质，LB松散型胞外聚合物主要为疏水性物质，TB紧密型胞外聚合物亲水性物质多于疏水性物质，但亲水物质和疏水物质的比例差异不大，生物膜的胞外聚合物结构是胞外聚合物粘液EPS-松散型EPS-紧密型EPS亲水-疏水-亲水为主的三层结构状态即以亲水-疏水-亲水的为主的结构状态。采取优化的运行条件保证胞外聚合物的组成，有利于维持生物膜的活性，提高净化的效果。

（B）三维荧光分析

应用Hitachi F-4600荧光光谱仪测定S、LB和TB的各分级组分的三维荧光光谱，用Matlab7.0绘图，光谱图的X轴为250nm～550nm，Y轴为200nm～500nm。参数设置为：激发通带选择为5nm，发射通带选择为5nm，扫描速度为12000nm/min，激发波长扫描范围为200nm～500nm，发射波长扫描范围为250nm～550nm。样品在装入1cm石英荧光样品池。S、LB和TB的分级组分三维荧光谱图见图3-图5所示。

由图3-图5可知：生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物中均含有色氨酸、酪氨酸、紫外类富里酸、可见类富里酸和类腐殖酸五类物质，相同荧光峰所对应的荧光强度是不同的。

生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的亲水酸性物质（HIA）中都无色氨酸，酪氨酸等类蛋白质荧光峰，主要是紫外类富里酸、可见类富里酸和类腐殖酸荧光峰组成，类富里酸都存在与亲水性物质中。

（C）紫外分析

对生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的分级组分采用紫外可见分光光度UV-2802测定UV₂₅₄值，结果见图6所示。由图6可知：生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的分级组分UV₂₅₄的亲水酸性（HIA）所占比例都最高，所占比例最小的却不同，分别为疏水中性（S-HON）、疏水碱性（LB-HOB）、疏水酸性（TB-HOA）。

（D）分子量分布分析

对生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的分级组分分子量分布的测定采用日本岛津公司的凝胶过滤色谱仪（GPC），型号为LC-10ADVP。样品进样前需经过0.45μm醋酸纤维素膜过滤，进样量为100μL。流动相为Milli-Q纯水，标准样品为聚乙二醇（PEG）/聚氧乙烯（PEO）。凝胶色谱结果分别见图7-9、图10-12所示。

由图7-9可知：在松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的分级组分中，疏水碱性、疏水中性、亲水酸性和亲水中性物质分子量分布特征基本一致，疏水酸性和亲水碱性物质分子量分布差异大，这导致了两者的化学结构不同。胞外聚合物主要是由大分子量物质组成，松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物在曝气生物滤池处理污染水体过程中起到主导作用，从分子量角度，大分子量的EPS是影响净化效果的主导因素，其分级组分主要是曝气生物膜滤池生物膜松散型胞外聚合物的疏水酸性（HOA）、亲水碱性（HIB）、亲水中性物质（HIN）及紧密型胞外聚合物的疏水酸性（HOA）、亲水中性物质（HIN）。

由图10可知：S-HIN最先出峰，根据出峰时间可以看出该组分分子量比较大，而S-HON最后出峰，分子量比较小。GPC（凝胶过滤色谱）的分析结果反映了生物膜中微生物降解城市景观水体有机物过程中EPS组成和分子量分布的转化规律。S-HOA、S-HOB、S-HON、S-HIA、S-HIB和S-HIN主要保留时间分别为21.111min、21.102min、20.983min、20.947min、17.053min和16.085min，对应的分子量大小分别为553Da、557Da、734Da、624Da、10795Da和21933Da。这说明S-HIN和S-HIB分子量大些，Slime（S）胞外聚合物的疏水性物质大部分都是小分子量。另外，可见图中各谱峰好，可以说明各分级组分分离效果好。

由图11可知：LB-HOA最先出峰，分子量比较大，而LB-HON最后出峰，分子量比较小。LB-HOA、LB-HOB、LB-HON、LB-HIA、LB-HIB和LB-HIN主要保留时间分别为9.742min、20.964min、23.201min、17.138min、10.945min和10.317min，对应的分子量大小分别为2280153Da、616Da、120Da、10143Da、944850Da和1496725Da。这说明LB-HOA和LB-HIN分子量相对大。另外，可见图中各谱峰好，可以说明各分级组分分离效果好。由图12可知：TB-HOA最先出峰，分子量比较大，而TB-HON和TB-HIB最后出峰，分子量比较小。TB-HOA、TB-HOB、TB-HON、TB-HIA、TB-HIB和TB-HIN主要保留时间分别为9.705min、20.847min、23.181min、16.832min、10.941min和11.709min，对应的分子量大小分别为2341619Da、672Da、122Da、12694Da、947389Da和539936Da。这说明TB-HOA和TB-HIN分子量大些另外，可见图中各谱峰好，可以说明各分级组分分离效果好。

因此，Slime、LB-EPS和TB-EPS分级组分分子量分布不同，三种EPS化学结构存在较大的差异，导致了分子量差异较大，其中LB-EPS和TB-EPS结构有些类似，但TB-EPS比LB-EPS更复杂，它们的共同点是疏水中性都是分子量最小的组分。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.一种生物膜反应器的生物膜胞外聚合物的提取和分级分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的提取步骤；

采用XAD-8吸附树脂、MSC阳离子交换树脂和Duolite A-7阴离子交换树脂分别将生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物进行色谱分级，以分级出疏水性酸、疏水性碱、疏水中性、亲水酸、亲水碱和亲水中性物质的分级步骤；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分级步骤包括如下步骤：步骤一，将生物膜胞外聚合物粘液过滤膜，得到的滤液过XAD-8吸附树脂柱，滤出液保留备用；步骤二，采用0.1M HCl洗脱步骤一的XAD-8吸附树脂柱，得到的洗脱液为疏水性碱生物膜胞外聚合物粘液；步骤三，调节步骤一中过XAD-8吸附树脂柱的滤出液的pH为2，然后依次过XAD-8吸附树脂柱、MSC阳离子交换树脂柱和Duolite A-7阴离子交换树脂柱，最终得到的滤出液为亲水中性生物膜胞外聚合物粘液；步骤四，再用0.1M NaOH洗脱经步骤三的XAD-8吸附树脂柱，得到的洗脱液为疏水性酸生物膜胞外聚合物粘液；步骤五，用0.1M NaOH洗脱经步骤三的MSC阳离子交换树脂柱，得到的洗脱液为亲水碱生物膜胞外聚合物粘液；步骤六，用0.1M NaOH洗脱经步骤三的Duolite A-7阴离子交换树脂柱，得到的洗脱液为亲水酸生物膜胞外聚合物粘液；步骤七，将经步骤四的XAD-8吸附树脂干燥，然后利用甲醇进行索氏提取以得到疏水中性生物膜胞外聚合物粘液；采用与步骤一至步骤七相同的方法将松散型胞外聚合物分级为疏水性碱松散型胞外聚合物、亲水中性松散型胞外聚合物、疏水性酸松散型胞外聚合物、亲水碱松散型胞外聚合物亲水酸松散型胞外聚合物、疏水中性松散型胞外聚合物；采用与步骤一至步骤七相同的方法将紧密型胞外聚合物分级为疏水性碱紧密型胞外聚合物、亲水中性紧密型胞外聚合物、疏水性酸紧密型胞外聚合物、亲水碱紧密型胞外聚合物、亲水酸紧密型胞外聚合物、疏水中性紧密型胞外聚合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤一中滤液过XAD-8吸附树脂柱的流速为0.8-1mL/min。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤三中滤出液依次过XAD-8吸附树脂柱、MSC阳离子交换树脂柱和Duolite A-7阴离子交换树脂柱的流速均为0.8-1mL/min。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤七中的所述索氏提取的时间为20-30h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述色谱分级前，所述生物膜胞外聚合物粘液、松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的DOC均大于20mg/L。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DOC均为20-40mg/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取步骤采用离心超声波整体提取法。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述离心超声波整体提取法具体为：用超纯水清洗生物膜反应器中挂有生物膜的载体2-3次；将清洗后的含有生物膜的超纯水在4℃、1800-2200g条件下离心10-20min，得到的第一上清液为提取出的胞外聚合物粘液；然后再向离心管中加入与用于清洗所述挂有生物膜载体的超纯水具有相同体积的超纯水，在4℃、4500-5500g条件下离心10-20min，得到的第二上清液为松散型胞外聚合物；之后再向离心管中加入与用于清洗所述挂有生物膜载体的超纯水具有相同体积的超纯水，在55-65W的超声功率、26-30kHz的超声波频率下超声8-15min，再在4℃、18000-22000g条件下离心15-25min，得到的第三上清液为紧密型胞外聚合物。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述系统分析步骤包括分级组分DOC分析、三维荧光分析、紫外分析和分子量分布分析以综合表征生物膜胞外聚合物的分级组分。