CN103255053B - 一种可同步实现流动加载与荧光观测的细胞力学装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可同步实现流动加载与荧光观测的细胞力学装置，包括：平行流动腔模块，用于在剪切流动条件下模拟细胞在人体的流体动力环境；倒置荧光相差显微镜，用于对所述细胞进行荧光激发；信号采集模块，用于对微弱荧光信号的采集；控制模块，用于对平行流动腔模块、倒置荧光相差显微镜和信号采集模块的同步触发，并进行数据分析和处理。本发明在倒置荧光相差显微镜上，通过选取特殊的滤片组合对样品平面的细胞进行激发，通过平行流动腔装置对细胞施加力学刺激，通过控制模块使力学刺激和荧光激发、采集同步进行，采用EMCCD对数据进行采样，并对图像进行重建和数据分析，实现了对群体细胞的流体动力学加载和荧光观测的实时动态结合。

Description

一种可同步实现流动加载与荧光观测的细胞力学装置

技术领域

本发明涉及一种流体动力学加载和显微荧光观测相结合的细胞力学装置。

背景技术

人体始终处于力学环境之中，其生物学过程受到不同力学环境的调控，表现为多因素、非线性、交互作用等基本特征，需要在微观层次定量认识其耦合规律。细胞不仅处在复杂的生物化学环境中，也处在不同的生物力学环境中；细胞力学可阐明细胞如何感受、修饰、并对细胞环境的物理特性做出响应；细胞之间通过化学和物理信号实现信息交换，从而参与胚胎发生、伤口愈合、炎症反应、肿瘤转移等一系列的生物过程；细胞对力学刺激的响应在内环境稳态和许多疾病中至关重要。

细胞力学-生物学耦合研究不仅可定量认识细胞-细胞、细胞-表面相互作用的基本规律，同时还是组织工程、再生医学、介入治疗等的重要科学基础。因此，在生物大分子相互作用、亚细胞动力学过程、细胞整体生命活动及其调控规律等方面开展定量化和模型化研究，可为认识生命现象、保障人类健康提供新概念和新方法。

目前，分子-细胞生物力学领域的发展瓶颈在于有关力学信号在细胞内的传递和转导、细胞骨架和胞内信号分子的结构变化、以及蛋白质相互作用与组装过程的动力学行为等实验数据十分缺乏，因而难以对力学信号转导途径及细胞动态响应、生物大分子反应动力学及力学-化学耦合等规律进行统一描述。

目前分子-细胞层面力学-化学、力学-生物学耦合研究的实验技术主要分为两方大类：力学加载实验（力谱）技术和荧光检测（荧光谱）技术。力学加载实验技术：对细胞或分子施加力学作用是针对细胞或分子所处的生理力学环境进行模拟，无法实现力学刺激下活细胞动力学行为（迁移、增殖、分化等）和活细胞内细胞骨架、离子和分子活动和变化的实时动态检测，并且由于细胞培养、探针标记和力学加载不能原位进行，导致测试结果难以定量、时-空耦合难以实现。基于分子光学标记的荧光检测分析成像技术不能实现对分子或细胞的力学加载、也难以观测分子-细胞的力学-化学、力学生物学耦合过程。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种实现对细胞的流体动力学加载与荧光观测相结合的可同步实现流动加载与荧光观测的细胞力学装置，可以实现对群体细胞的动态力学加载以及荧光观测之间的同步化，从而了解力学加载条件下细胞骨架和胞内信号分子的实时动态变化。

本发明的一种可同步实现流动加载与荧光观测的细胞力学装置包括：

平行流动腔模块，用于在可控的剪切流动条件下模拟细胞在人体的流体动力环境；

倒置荧光相差显微镜，用于对所述细胞进行荧光激发；

信号采集模块，用于对微弱荧光信号的采集；

控制模块，用于对平行流动腔模块、倒置荧光相差显微镜和信号采集模块的同步触发，并进行数据分析和处理。

优选地，所述倒置荧光相差显微镜包括：倒置相差显微镜体、显微镜聚光器支柱、激发光源和滤镜光学组件。

优选地，所述平行流动腔模块包括：

平行平板流动腔，形成有流体区域的宽度远大于流体区域的高度至少二十倍的腔体；

直线注射泵，用于向所述腔体注入细胞悬液。

优选地，所述信息采集模块为EMCCD。

优选地，所述控制模块包括：

控制计算机，用于安装用户编写的控制软件，通过触发器对直线注射泵、EMCCD、滤镜光学组件的运动和开关进行控制；

触发器，用于接受控制计算机发出的数字控制信号，将其转为模拟电平信号，用于直线注射泵、EMCCD、滤镜光学组件的运动和开关的同步触发；

图像重建和数据分析单元，用于对EMCCD获得的图像行数据分析和处理，获得图像各部分的量化信息和图像的时间序列重建和三维重建信息。

本发明具有如下优点：

1）本发明突破现有细胞-分子生物力学研究中力学加载与光学检测方法之时间-空间分离的局限，建立力谱-荧光谱耦合的分子-细胞动力学实时原位观测系统，完善活细胞与分子力学行为的研究平台，为深入理解分子-细胞层面力学-化学、力学-生物学耦合规律服务；

2）本发明在倒置荧光相差显微镜上，通过选取特殊的滤片组合对样品平面的细胞进行激发，通过平行流动腔装置对细胞施加力学刺激，通过控制模块使力学刺激和荧光激发、采集同步进行，采用EMCCD对数据进行采样，并对图像进行重建和数据分析，实现了对群体细胞的流体动力学加载和荧光观测的实时动态结合。

附图说明

图1为本发明的原理框图;

图2为本发明的结构示意图；

图3a为本发明的平行流动腔的分拆立体结构示意图；

图3b为平行流动腔腔的安装结构示意图；

图4为平行流动腔腔体内细胞剪切的示意图；

图5为触发器运控示意图。

具体实施方式

如图1、2所示，本发明一种可实现流动与荧光观测的细胞力学装置由倒置荧光相差显微镜100、平行流动腔模块101、信号采集模块102和控制模块103组成。

倒置荧光相差显微镜100包括显微镜体1、激发滤镜2、激发光源3、发射滤镜4、物镜5和载物台6。本实施例中显微镜体1采用Olympus IX71倒置显微镜，工作镜头为100倍的油镜（NA1.30）。本实施例中样品细胞采用CFP（Cyan Fluorescence Protein，青色荧光蛋白）（433/475nm激发/发射）进行标记；激发光源3采用汞灯（100W），在汞灯前方放置带通的激发滤镜4（420/20nm），允许波长在410-430nm范围的光对样品进行激发，激发光经过显微镜的外荧光通路耦合进显微镜，通过物镜5照射到载物台上的平行平板流动腔7（图1，图2、图3a、图3b）。实验中细胞所标记的CFP被激发，发射的荧光通过物镜收集，经过显微镜光路传输，经发射滤镜5（475/40nm）滤波，被信号采集模块9EMCCD接收。本实施例中采用EMCCD前方放置带通滤光片4（475/40nm），只允许波长在455-495nm的激发光进入EMCCD，提高了系统的性噪比。

平行流动腔模块由平行流动腔体7、精密直线注射泵8和管路组成。本实施例中平行流动腔（图3a、图3b）由带有入口和出口的聚碳酸酯底板71、密封垫圈72、包被目标细胞的玻片73、100μm厚且不可压缩变形塑料垫圈74和聚碳酸酯盖板75构成平板流动腔的主要部分。塑料垫圈74中间25μm×76μm的方型区域，即为流体施加的区域。螺丝通过聚碳酸酯盖板75上的螺孔与底板71的铝制底板拧紧固定。底板71和显微镜载物台6固定。在玻片73和聚碳酸酯底板71间夹着100μm厚的可变形的密封垫圈72，可以均匀螺丝拧紧后的压力，从而达到较好的密封流室、在流体流过流室时不渗漏的目的。本实施例中平板流动腔流体区域高度即为垫圈的高度h=100μm，流体区域的宽度为W=20mm、长度为L=65mm。上述流体区域的宽度远大于流体区域的高度至少二十倍，使得流体流动为层流，流体的速度分布在空间上只依赖其距离底面的距离。

本实施例中由精密的直线注射泵8（Harvard apparatus,Pump11Pico Plus,MA170-2213）驱动的装有缓冲液的注射器（20ml，内径19mm），通过管路连接到组装好的平板流动腔装置的入口，流动腔装置的出口通过管路连接到细胞悬液。注射泵驱动的注射器、另外一个装有缓冲液的注射器和连接流动腔的管路通过三通连接，另外的这个装有缓冲液的注射器用来排出管路内的气泡。实验时细胞悬液在注射泵驱动的下通过流动腔装置，在倒置显微镜相差显微镜（Olympus,IX71）下观察玻片中间包有目标细胞（图3下）的区域。

如图4所示，本实施例中，将用青色荧光蛋白CFP标记的细胞（HL60细胞）悬液（本实施例中为含Ca2+、Mg2+的HBSS）通过注射器和三通连接管路注入平行流动腔，保证整个流动腔的管路和流室内不能有任何气泡，以免影响层流的稳定。流动腔底板预先包被可与HL-60细胞发生特异性反应的贴壁细胞，本实施例中为HUVEC细胞。注射泵分别设置为0.6ml/h、1.5ml/h、3ml/h，计算机控制信号触发器，启动精密注射泵8、显微镜的激发光源3、滤镜组（2、4）和信号采集模块9在不同或相同的时序工作，实现流动剪切动力学加载与荧光观测同步进行，有利于观测到细胞在特定流体剪切作用下（胞所受壁面剪切应力分别为0.2dyne/cm2、0.5dyne/cm2、1dyne/cm2）的特定时间位点的同步荧光信号的变化。

本实施例中触发波形如图5，精密直线注射泵8工作后，滤镜转轮同时转换到目的滤镜（2，4），数据采集模块EMCCD9在一个脉冲后触发采集，曝光时间为1个脉冲长度，然后滤镜组回转，EMCCD停止工作，两个脉冲后重复同样采集过程。可控时序采集不仅能得到长时间的力学加载下荧光实时信息，而且避免了连续采集数据量过大的缺点。在实验图像由信号采集模块9采集，存储于计算机内，采用图像重建和数据分析模块进行在线和离线的数据分析。

Claims (1)

1.一种可同步实现流动加载与荧光观测的细胞力学装置，其特征在于，包括：

平行流动腔模块，用于在可控的剪切流动条件下模拟细胞在人体的流体动力环境；所述平行流动腔模块包括：平行平板流动腔，形成有流体区域的宽度大于流体区域的高度至少二十倍的腔体；直线注射泵，用于向所述腔体注入细胞悬液；

倒置荧光相差显微镜，用于对所述细胞进行荧光激发，所述倒置荧光相差显微镜包括：倒置相差显微镜体、显微镜聚光器支柱、激发光源和滤镜光学组件；

信号采集模块，用于对微弱荧光信号的采集；所述信息采集模块为EMCCD；

控制模块，用于对平行流动腔模块、倒置荧光相差显微镜和信号采集模块的同步触发，并进行数据分析和处理；所述控制模块进一步包括：

控制计算机，用于安装用户编写的控制软件，通过触发器对直线注射泵、EMCCD、滤镜光学组件的运动和开关进行控制；

触发器，用于接受控制计算机发出的数字控制信号，将其转为模拟电平信号，用于直线注射泵、EMCCD、滤镜光学组件的运动和开关的同步触发；

图像重建和数据分析单元，用于对EMCCD获得的图像进行数据分析和处理，获得图像各部分的量化信息和图像的时间序列重建和三维重建信息；

所述计算机控制信号触发器，启动精密注射泵、显微镜的激发光源、滤镜组和信号采集模块在不同或相同的时序工作，实现流动剪切动力学加载与荧光观测同步进行，以观测到细胞在特定流体剪切作用下的特定时间位点的同步荧光信号的变化。