CN103251932A

CN103251932A - 铁调素在制备铁相关神经退行性疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN103251932A
Application number: CN2013101344257A
Authority: CN
Inventors: 柯亚; 钱忠明
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-04-17
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2013-08-21

Abstract

本发明涉及铁调素在制备预防或治疗铁相关神经退行性疾病药物中的应用。为泛酸激酶相关性神经变性、阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病提供一种新的治疗方法，以进一步控制泛酸激酶相关性神经变性、阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病患者的病情进展，提高生活质量。

Description

铁调素在制备铁相关神经退行性疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种治疗铁相关性神经退行性疾病的方法，特别是一种将铁调素应用于治疗铁相关性神经退行性疾病的新用途。

背景技术

铁相关性神经退行性疾病包括泛酸激酶相关性神经变性、阿尔茨海默病、帕金森病等，是一类与脑内进行性铁沉积相关的神经退行性疾病。泛酸激酶相关性神经变性，又称为Hallervorden-Spatz综合征或脑组织铁沉积性神经变性，目前发现其机制是由于泛酸激酶2基因（PANK2）缺失促进脑铁沉积并进而通过自由基途径导致神经元变性死亡。此外，年龄相关性铁沉积诱导氧化应激可以导致阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病，异常增高的脑铁触发危害性的级联放大反应并导致神经元死亡。目前这几种疾病尚无根本性治疗方法。

铁调素，又称为“肝脏抗菌多肽”，21世纪初经两个独立实验室分别从人类血清及尿液中提取而得。铁调素对于肠道内铁吸收的活性有着重要作用。铁调素用于治疗泛酸激酶相关性神经变性或预防铁相关的阿尔茨海默病、帕金森病，迄今未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供铁调素在制备铁相关神经退行性疾病药物中的应用，以克服上述现有治疗方法的不足，为泛酸激酶相关性神经变性、阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病提供一种新的治疗方法，以进一步控制泛酸激酶相关性神经变性、阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病患者的病情进展，提高生活质量。

本发明涉及铁调素在制备预防或治疗铁相关神经退行性疾病药物中的应用。上述应用特别涉及铁调素在制备预防或治疗泛酸激酶相关性神经变性或阿尔茨海默病或帕金森病药物中的应用。

具体地，上述应用涉及铁调素在制备预防或治疗脑铁沉积药物中的应用。

上述应用涉及铁调素在制备调节细胞转铁蛋白结合铁和非转铁蛋白结合铁的摄取和释放药物中的应用。

上述应用涉及铁调素在制备抑制细胞铁摄取蛋白或铁释放蛋白药物中的应用。

上述应用涉及铁调素在制备抑制转铁蛋白受体1（TfR1）、二价金属离子转运体1（DMT1）、铁排出因子膜铁转运蛋白1（Fpn1）表达药物中的应用。

上述细胞为神经元细胞和血管内皮细胞。

有益效果

本发明首次证实铁调素表达腺病毒（ad-hepcidin）转染诱导的铁调素表达增加，能够显著逆转帕金森病大鼠（6-羟多巴胺模型）和铁超载大鼠的脑铁过载；也证实铁调素表达增加和直接增加铁调素肽均能显著抑制细胞铁摄取蛋白（铁转运蛋白1、二价铁离子转运体1）和释放蛋白（膜铁转运蛋白1）的表达，从而减少神经元细胞和血管内皮细胞对转铁蛋白结合铁和非转铁蛋白结合铁的摄取及铁的释放。与此一致的是，retro-hepcidin（针对铁调素的siRNA）减少铁调素表达从而导致相反的结果。

本发明证实，铁调素肽及包括铁调素表达腺病毒在内的增加铁调素表达药物能通过抑制铁转运蛋白逆转帕金森病大鼠和铁过载大鼠的铁过量，因而对继发于老龄化和铁相关神经退行性疾病（泛酸激酶相关性神经变性、阿尔茨海默病和帕金森病）具有临床应用价值。本发明为泛酸激酶相关性神经变性、阿尔茨海默病和帕金森病等铁相关性神经退行性疾病的治疗提供新的方法。

铁调素能调控肠粘膜上皮细胞、巨噬细胞及骨髓细胞中铁转运蛋白的表达；还能调节血脑屏障内皮细胞铁转运蛋白，如转铁蛋白受体1、二价铁离子转运蛋白1和膜铁转运蛋白的表达；也能通过控制铁摄取蛋白和铁释放蛋白的表达维持神经元细胞和胶质细胞的铁平衡。

附图说明

图1 A和B所示：Ad-hepcidin增加铁过载大鼠铁调素表达并降低其脑铁水平；C和D所示：Ad-hepcidin增加帕金森病大鼠铁调素表达并降低黑质铁水平。

图2 Ad-hepcidin抑制转铁蛋白结合铁转运入脑。

图3 Ad-hepcidin增加微血管内皮细胞铁调素的表达，抑制细胞铁转运蛋白的表达以及铁的摄取和释放。

图4 铁调素肽减少血管内皮细胞转铁蛋白结合铁和非转铁蛋白结合铁的摄取以及铁的释放，同时减少细胞铁转运蛋白的表达。

图5 Ad-hepcidin增加神经元细胞铁调素的表达和释放，同时抑制细胞铁转运蛋白的表达以及铁的摄取和释放。

图6 铁调素肽抑制神经元细胞铁转运蛋白的表达，减少转铁蛋白结合铁和非转铁蛋白结合铁的摄取以及铁释放。

图7 Retro-hepcidin增加神经元细胞和微血管内皮细胞铁转运蛋白的表达，从而导致铁摄取和释放的显著增加。

图8 铁调素通过降低铁的水平保护6-羟基多巴胺对黑质多巴胺神经元的神经毒性。

图9 高铁饮食加剧APP/PS1转基因小鼠的淀粉斑沉积和记忆缺失。

图10铁调素降低6-羟多巴胺（6-OHDA）对大鼠的毒害作用。

图11铁调素表达腺病毒（ad-hepcidin）的结构。

图12重组的铁调素表达腺病毒的骨架质粒。

具体实施方法

有关本发明的详细说明和技术内容，现结合附图说明如下：

实施例1

剂量为0.9×10⁸ pfu的ad-hepcidin脑室内注射预处理，能增加帕金森病大鼠（6-羟多巴胺模型）铁调素表达并降低其黑质铁水平，增加铁超载大鼠铁调素表达并降低其脑铁水平。其作用效果请参见图1。A和C纵轴为铁调素表达水平，单位为μg/g；B和D纵轴为总铁水平，单位为nmol/g；横轴为各分组不同脑区。(A和C)：与对照组比较，*p<0.05；与Iron+Ad-H 组比较，#p<0.05。(B和D)：与对照组比较，*p<0.05；与Iron组比较，#p<0.05；与Iron+Ad-H 组比较，p<0.05。

实施例2

为证实铁调素通过调节铁向脑内的转运来抑制脑铁积聚，在注射Tf-Fe⁵⁵后，分别测定不同时间点对照组和实验组大鼠四个大脑区域放射性标记铁的剂量，发现剂量为0.9×10⁸ pfu的ad-hepcidin能抑制转铁蛋白结合铁转运入脑。如图2所示，从注射后0.5小时到5小时，ad-hepcidin干预组大鼠四个大脑区域铁积聚与对照组比较明显减少。此外，注射后12小时和24小时放射性标记铁的浓度逐渐降低，ad-hepcidin干预组和对照组之间具有显著性差异。实验结果暗示铁调素可能具有加快铁向脑外转运的作用。与对照组比较，*P < 0.05, **P <0.01, ***P <0.001。

实施例3

为了解ad-hepcidin的上述作用是否与其增加铁调素表达的能力有关，将ad-hepcidin感染血管内皮细胞，16小时后用RT-PCR和ELISA方法测定铁调素的表达和释放。如图3A所示，我们发现ad-hepcidin转染能诱导铁调素mRNA和多肽水平的明显增加，在培养液中铁调素浓度也是增高的。表明ad-hepcidin不仅增加铁调素的表达，而且还能增加铁调素向细胞外的释放。

实施例4

为明确脑内铁调素降铁机制，我们研究了ad-hepcidin对血管内皮细胞摄取转铁蛋白结合铁与非转铁蛋白结合铁以及细胞铁释放的影响。我们发现ad-hepcidin感染不仅显著减少转铁蛋白结合铁与非转铁蛋白结合铁的摄取，还能明显减少铁释放(见图3B)。

进一步研究发现，其影响是通过抑制转铁蛋白受体1（TfR1）、二价金属离子转运体1（DMT1）等铁摄取因子以及铁排出因子膜铁转运蛋白1(Fpn1)表达实现的。结果显示ad-hepcidin显著减少TfR1 (图3C)、DMT1+IRE (图3D)、DMT1-IRE (图3E)、and Fpn1 (图3F)的表达。

实施例5

通过针对铁调素肽直接影响血管内皮细胞的研究发现，添加铁调素肽(700 nM)后，Tf-Fe和NTBI的摄取以及铁释放显著减少(图4A)，同时TfR1(图4B)、DMT1+IRE(图4C)、DMT1-IRE (图4D)和Fpn1 (图4E)的表达也明显减少。这些发现与ad-hepcidin实验获得的结果一致，从另一方面证明ad-hepcicin通过增加血管内皮细胞铁调素表达起作用。

实施例6

通过针对ad-hepcidin影响体外培养神经元细胞（脑的主要细胞）铁调素的表达和释放、Tf-Fe和NTBI的摄取、铁释放以及铁转运因子表达的研究发现，ad-hepcidin感染不仅显著增加铁调素的表达和释放(图5A)，还能显著减少Tf-Fe和NTBI的摄取以及铁释放(图5B)。同时，ad-hepcidin干预神经元细胞能显著减少TfR1 (图5C)、DMT1+IRE (Fig.5D)、DMT1-IRE (图5E)和Fpn1的表达。

实施例7

针对铁调素肽直接影响神经元细胞铁摄取和释放以及铁转运蛋白表达的研究发现，直接添加铁调素肽能显著减少Tf-Fe和NTBI的摄取以及铁释放(图6A)。干预后0.5小时这个影响即已明显（除铁释放外），并且持续至少9小时。与此类似，TfR1 (图6B)、DMT1+IRE (图6C)、DMT1-IRE (图6D) 和Fpn1(图6E)的表达都减少。除Fpn1外，对表达的影响从干预后0.5小时即已明显且持续至少9小时。

实施例8

我们研究了retro-hepcidin (针对铁调素的siRNA)对体外培养的神经元细胞铁转运以及铁摄取和释放蛋白表达的影响。RT-PCR分析和放射性标记铁测定显示retro-hepcidin使这些细胞铁调素mRNA水平显著降低，使Tf-Fe和NTBI的摄取以及铁释放明显增加(图7A)。Western blot检测显示retro-hepcidin使TfR1、DMT1+IRE、DMT1-IRE和Fpn1的表达显著增加(图7B)。Retro-hepcidin对体外培养的血管内皮细胞也有着极为相似的影响(图7C、图7D)。

实施例9

铁调素通过降低铁的水平保护6-羟基多巴胺对黑质多巴胺神经元的神经毒性。黑质内注射6-羟基多巴胺引起黑质内铁调素表达增加，Ad-hepcidin处理后铁调素表达在此基础又进一步升高，如免疫染色（图8a左图）和酶联免疫吸附测定（图8a右图）所示。另一方面，6-羟基多巴胺引起损伤侧显著的铁聚集（图8b，左图-Perl’s染色，右图-GFAAS）和多巴胺神经元的损失（图8c,图8d，TH染色），而在黑质内注射Ad-hepcidin引起的铁调素表达增加则可逆转这些变化。通过测定阿朴吗啡诱导的转动行为，铁调素的作用伴随有运动障碍的改善（图8e）。P<0.05; ** P<0.01 (每组n=5-9)。

实施例10

高铁饮食加剧APP/PS1转基因小鼠的淀粉斑沉积和记忆缺失。（图9a）转基因小鼠的皮层和海马中，淀粉斑的免疫反应性（白色箭头所示）在7月龄出现（图9a左图）。高铁饮食增加了这些区域斑的密度（图9a右图）。（图9b）在Morris水迷宫测试中，通过比较逃到平台的潜伏期（图9b上图）和目标象限的时间（图9b下图）可以看出转基因小鼠表现显著差于野生型小鼠。高铁饮食进一步损伤转基因小鼠的空间记忆。（图9c）高铁饮食清楚地增加了6月龄APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ寡聚化。我们对野生型和转基因型，转基因型和高铁-转基因型做了统计学比较 * P<0.05; ** P<0.01。

实施例11

铁调素降低6-羟多巴胺（6-OHDA）对大鼠的毒害作用。30日的6-OHDA连续注射使得大鼠体重明显降低，于侧脑室注射表达铁调素的病毒显著抑制了体重下降的趋势（图10a）。在网格实验中，6-OHDA连续注射显著提高了大鼠迈出第一步的潜伏期，而于侧脑室注射表达铁调素的病毒改善了由6-OHDA毒害导致的潜伏期延长，** P<0.01（图10b）。在旷场实验中，6-OHDA连续注射显著降低了大鼠访问的格子数目，而于侧脑室注射表达铁调素的病毒使得大鼠的运动能力明显改善，* P<0.05（图10c）。在旷场实验中，6-OHDA连续注射显著降低了大鼠的总运动距离，而于侧脑室注射表达铁调素的病毒使得大鼠的运动能力恢复到与正常组相当的水平，* P<0.05（图10d）。

以上实施例结果表明，针对铁调素及包括铁调素表达腺病毒在内的增加铁调素表达药物可通过抑制铁转运蛋白逆转帕金森病大鼠和铁过载大鼠的铁过量，从而对泛酸激酶相关性神经变性、阿尔茨海默病和帕金森病等铁相关性神经退行性疾病有治疗作用。

继发于老龄化或特定基因缺失的脑铁沉积是铁相关神经退行性疾病发生、发展的重要因素，限制脑铁增高对于治疗泛酸激酶相关性神经变性或预防铁相关的阿尔茨海默病、帕金森病具有的益处。发明人研究发现，铁调素表达腺病毒（ad-hepcidin）转染诱导的铁调素表达增加，能够显著逆转帕金森病大鼠（6-羟多巴胺模型）和铁超载大鼠的脑铁过载；铁调素表达增加和直接增加铁调素肽均能显著抑制细胞铁摄取蛋白（铁转运蛋白1、二价铁离子转运体1）和释放蛋白（膜铁转运蛋白1）的表达，并进而减少神经元细胞和血管内皮细胞对转铁蛋白结合铁和非转铁蛋白结合铁的摄取及铁的释放。

以上结果表明，铁调素肽及包括铁调素表达腺病毒在内的增加铁调素表达药物对继发于老龄化或特定基因缺失的铁相关性神经退行性疾病具有临床应用价值，可作为一种新的方法用于泛酸激酶相关性神经变性的治疗和铁相关的阿尔茨海默病、帕金森病的预防和治疗。本发明为铁调素应用于泛酸激酶相关性神经变性、阿尔茨海默病和帕金森病等铁相关性神经退行性疾病的治疗，提供了直接的依据。

本发明所使用的铁调素表达腺病毒（ad-hepcidin）的结构如图11。构建步骤是先构建重组的铁调素腺病毒骨架质粒（图11右侧），但这个质粒无E1基因，必须由HEK293细胞表达腺病毒E1蛋白，所以在HEK293细胞中包装成腺病毒（图11左侧）。

重组的铁调素腺病毒骨架质粒，也可表示为图12。

本发明所使用的铁调素肽的结构如下：

1 malssqiwaa clllllllas ltsgsvfpqq tgqlaelqpq dragaraswm

51 pmfqrrrrrd thfpicifcc gcchrskcgm cckt

以上所介绍的，仅仅是本发明的较佳实施例而已，不能以此来限定本发明实施的范围，即本技术领域内的一般技术人员根据本发明所作的等同的变化，以及本领域内技术人员熟知的改进、变化，都应仍属于本发明专利涵盖的范围。

Claims

1.铁调素在制备预防或治疗铁相关神经退行性疾病药物中的应用。

2.铁调素在制备预防或治疗泛酸激酶相关性神经变性、阿尔茨海默病、帕金森病药物中的应用。

3.铁调素在制备预防或治疗脑铁沉积药物中的应用。

4.铁调素在制备调节细胞转铁蛋白结合铁或非转铁蛋白结合铁的摄取和释放药物中的应用。

5.铁调素在制备抑制细胞铁摄取蛋白和/或铁释放蛋白药物中的应用。

6.铁调素在制备抑制细胞转铁蛋白受体1（TfR1）、二价金属离子转运体1（DMT1）、铁排出因子膜铁转运蛋白1（Fpn1）表达药物中的应用。

7.如权利要求4～6任一所述的应用，所述细胞为神经元细胞或血管内皮细胞。