CN103217374A - 急性b淋巴细胞白血病启动细胞特性测定系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及急性B淋巴细胞白血病启动细胞特性测定系统及方法的设计。系统结构中包括流式细胞仪及数据分析软件。还包括主控计算机单元,存储有主控程序的系统管理模块,配缓存器的监、控显示器,存储经验数据的模块,暂存器模块,操控面板,通讯协议和数据模式的通讯模块,打印机及接口电路,流式细胞仪和激光扫描采样的测试窗口,专用标本试管以及专用试剂盒。为本系统设计的操作方法具体体现在管理模块的主控程序之中。
Description
技术领域
本发明属于细胞表型的检测设备和操作工艺,具体涉及确定急性B淋巴细胞白血病启动细胞特性的专用设备和方法。
背景技术
流式细胞仪分析法已成为评估的免疫表型特征的首选方法。重要的待染色剂的单克隆免疫抗原已经商品化、可选品种繁多。免疫表型技术已经为基础理论研究提供了有力的工具。
急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia 缩写ALL)是造血系统的恶性肿瘤,以未成熟淋巴系统的恶性增生及免疫紊乱为特征。在过去十多年,尽管对ALL的诊断和治疗有了显著的进展,较大比例的患者可以完全缓解(Complete Remission缩写CR),但大部分CR后的患者终将复发而死亡,导致ALL患者的长期无病生存率(Disease-Free Survival缩写DFS)仍相当低。因此,积极探索易于检测并且特异性表达的新标记用于ALL复发预测,将会使更多的ALL患者得到更加具有针对性的临床治疗,因此对于进一步提高DFS有着重大意义。
越来越多的实验证据表明白血病干细胞(leukemia stem cells缩写LSCs)是白血病启动、复发与耐药的根源。那些能够在免疫缺陷小鼠体内长期重建白血病并且具有自我更新能力的细胞称为白血病启动细胞(leukemia initiating cells缩写LICs),基本等同于LSCs。在前期工作中,利用新生期NOD/SCID/IL2rγnull小鼠异种移植模型首次鉴定出CD34+CD19+细胞为急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患者的LICs。但是,为了将B-ALL患者的LICs与正常B祖细胞鉴定开来,必须进行的LICs表面标记实验分析报告是目前检验医学的尖端课题。而且,在表型标记实验中对准备工作的精准程度,对操作技术工艺步骤的要求是极其苛刻的,对于专业研究人员来讲也是具有非常大的难度。目前,此类疾病的对于人类生命健康威胁已经是越来越严重。科学研究阶段的成果,必须竟快的转化为现代化的工程技术手段,包括使用定量定性的试剂、标准智能化的专用设备、严格的操作规范,以完善B-ALL患者在初诊阶段的病理检查,包括对B淋巴细胞白血病启动细胞特性的实验定性、定量分析的规范化、标准化。以有利于对患者能采取更加有效的临床治疗方案、尽可能的提高B-ALL患者的DFS。
发明内容
本发明的目的,在于为使B-ALL患者在就诊初期就快速、准确地确定出LICS的特异性,根据国家自然科学基金青年基金项目“白血病启动细胞在急性B淋巴细胞白血病复发预测”最新理论研究的成果,创新设计一种急性B淋巴细胞白血病启动细胞特性专用设备,其中包括规范化的操作方法和适用试剂。使具备设备基础和经过专门培训的医师能够方便地作出LICs表面标记实验分析报告,为广大的急性B淋巴细胞白血病患者作出贡献。具体的设计方案如下:
专用设备是“急性B淋巴细胞白血病启动细胞特性测定系统”,系统结构中包括流式细胞仪及其数据分析软件。关键设计在于系统中还包括主控计算机单元,以及连接在主控计算机单元配套接口上的存储有主控程序的系统管理模块、配置缓存器的监、控显示器、存储有标准数据和图形的经验数据模块、暂存器模块、设置在系统操控台上的的操控面板、存储有内、外数据通讯协议和数据规格转换模式的通讯模块、打印机及接口电路,流式细胞仪通过通讯接口电路和主控计算机的数据总线连接、流式细胞仪结构中配套有对标本进行激光扫描采样的测试窗口、专用标本试管以及专用试剂盒。
本发明的关键技术在于借助主控计算机系统的完善配备和针对性任务明确的控制方法与配套软、硬件的配套,将关键的采样设备-流式细胞仪改造成为LICs表面标记实验分析报告专用的系统装备。流式细胞仪的用途是先把细胞用各种荧光的方法标记,抗体标记表面抗原。然后把标记好的细胞用流式细胞仪检测,以激光扫描采集采集样本反馈信号的强弱,记录下所需要的数据。但是,最终要还是由医务人员来判断是不是肿瘤细胞,什么样的肿瘤细胞;流式细胞仪检测中仅仅能完成的是基础数据的收集。比较先进的厂家在流式细胞仪中还附带了数据分析软件,可以对基础数据进行分类以及整理出按照设定条件下的色标二维点图,为分类、定性分析打下基础。但是,被测定细胞特异性内涵的定性和进一步定量分析,流式细胞仪和分析软件是无能为力的。特定任务的的实现,取决于染色标记的选配是否合理,定标界限选取值实验是否的具有普遍性和操作方法是否能为临床的结果所验证。
本发明所设计的系统中,集中了本课题组三年来的实验成果。其中包括对B-ALL患者的LICs的特异性定性分析色标单克隆抗原的选择,流式二维点图的类型选择,健康志愿者标准图库模块的制作,LICs表面标记实验分析报告标准化流程的设计,从而实现了在本系统中,仅仅凭借标准化的操作规范,即可以准确地确定B-ALL患者的LICs的特征和亚型分类。为临床医学带来一个新装备,为B-ALL患者带来新的希望。
本发明的发明关键还在于设计了基于本发明所说的系统,确认急性B淋巴细胞白血病启动细胞特异性的方法,该方法包括以下步骤:
、调入流式细胞仪配套图形分析软件,定义、并建立二维图谱,将以上图谱传输并分类标记存入暂存器模块,
、根据以上确定分界线,表达CD58的LICs≥分界线值定义为CD58阳性、即CD34+CD19+CD58+表型为CD58+ LICs ;表达CD58的LICs<分界线值的定义为CD58阴性,即CD34+CD19+CD58-表型为CD58-LICs,
借助以上的方法,可以指导编制本系统中的主控程序中的管理软件,形成全自动式的设备,以快速完成初诊时B-ALL患者在LICs特性测定.
附图说明
图1是本系统的结构示意图;
图2基于系统的基础上,完成B-ALL患者LICs特性测试报告的步骤框图;
图3属成年人组的某健康人骨髓荧光着色标本的二维图谱;
图4患者的启动细胞为阳性,即当CD34+CD19+CD58+表型为CD58+LICs时,与以上图谱对照的二维图谱;
图5患者的启动细胞为阴性,即当CD34+CD19+CD58-表型为CD58+LICs时,与以上图谱对照的二维图谱;
图6 B-ALL亚型分类需要的参考图谱;
图7 测试报告图样;
以上图中,1代表主控计算机单元,2代表存储有主控程序的系统管理模块,LCD代表配置缓存器模块13的监、控显示器,3代表存储有标准数据和图形的经验数据模块,4代表暂存器模块,5代表设置在系统操控台上的操控面板,6代表存储有内、外数据通讯协议和数据规格转换模式的通讯模块,7代表打印机及接口电路,8代表流式细胞仪,该仪器通过通讯接口电路12和主控计算机1的数据总线连接,流式细胞仪8结构中配套有对标本进行激光扫描采样的测试窗口9,10是专用标本试管,11代表专用试剂盒。
具体实施方式
下面参照附图进一步的说明,本发明的目的是如何实现的:
本发明中的急性B淋巴细胞白血病启动细胞特性测定系统,系统结构中包括流式细胞仪及其数据分析软件。关键在于系统结构中还包括主控计算机单元1,以及连接在主控计算机单元1配套接口上的存储有主控程序的系统管理模块2。配置缓存器13的监、控显示器LCD,存储有标准数据和图形的经验数据模块3,暂存器模块4,设置在系统操控台上的的操控面板5,存储有内、外数据通讯协议和数据规格转换模式的通讯模块6,打印机及接口电路7,流式细胞仪8通过通讯接口电路12和主控计算机1的数据总线连接,流式细胞仪8结构中配套有对标本进行激光扫描采样的测试窗口9,专用标本试管10以及专用试剂盒11。
以上的硬件设置保证了系统的专用性、方便了操作过程的完整性和快速、准确率。特别是经验数据库模块的设立和配套管理程序模块的设置,包容了课题组的全部经验和成果,将复杂而繁琐的试验和分析过程转化为,简单的、自动化的数据与图形比对。使得染色、定性、定量实验室课题转化为普通医院的常规化验项目。
经验数据模块3结构中包括按照年龄段、性别分别标示的健康人的骨髓样本流光数据库;每个数据库中存储着所标示的健康人骨髓为标本、按照流式细胞仪8的采样规范为原则、针对用专用试剂盒11中的染色单克隆抗原为试剂制成的激光采样标本进行激光束照射采样、所采集到的全部基础数据和借助基础数据制成的两维色标图谱。
急性B淋巴细胞白血病启动细胞特性测定系统中配置的专用试剂盒11中设置有带荧光标记的单克隆抗原CD58、CD10、CD34、CD19、CD45和CD38,依次对应的荧光标记分别为FITC、PE、PerCP、APC-Cy7、Pacific Blue和APC。
以上试剂的种类和荧光标记的选择,是本试剂盒的关键也是本专用仪器设备成功的关键。它关系到所形成图谱的光色反差的大小和图形的完整性、图形数据离散型、最终关系到图谱的质量。决定着医师用肉眼比对的结果误差率和定性分析的标准选、划。关系到急性B淋巴细胞白血病启动细胞特性测定理论研究成果的实用价值。
系统中所配套的是高清晰度的监、控显示器LCD,该显示器借助暂存器13与主控计算机单元1的数据总线相连、配套设置触摸式电子鼠标。
因为大量的图形数据处理和分析,要求该显示器配套中庸的暂存器模块13和配套设置触摸式电子鼠标以实现图形的快速拖动、进行比较分析。
本系统中所采用的流式细胞仪是德国美天旎生物技术有限公司生产的MACSQuant-TM七色流式细胞仪, 配备有三激光管和专用流式细胞分析软件FCS 或 FlowJo。
本系统的硬件结构和含有经验数据模块的配备,是实现本发明目的的基础条件。控制和引导具体操作的管理软件的汇编方法是实现发明目的又一个关键。
该方法包括以下步骤:
使用高清晰度显示屏是为了提高图像的分辨率,列入同屏、双列是为了对比直观,引入光标是为了定量分析。从而给医师更多的、更精细的分析工具。
、根据以上确定分界线,表达CD58的LICs≥分界线值定义为CD58阳性、即CD34+CD19+CD58+表型为CD58+LICs ;表达CD58的LICs<分界线值的定义为CD58阴性,即CD34+CD19+CD58-表型为CD58-LICs),
、取洁净的试管,从专用试剂盒11中依次取出3μL的 CD58FITC、10μL的 CD10PE、1μL的 CD34 PerCP/Cy5.5、 2μL的 CD38APC、5μL的 CD19APC-Cy7、1.3μL的 CD45Vioblue加进试管、再加入100μL患者骨髓标本,轻摇混匀,环境温度保持在22℃左右、避光放置15分钟孵育,
、从专用试剂盒11中再取出稀释10倍的溶血素2ml,混匀后避光,室温放置 8分钟,溶解红细胞,
急性B淋巴细胞白血病启动细胞特异性中所述PBS缓冲液的配制方法:
Na2HPO4.12H2O 26.3g
NaH2PO4.2H2O 3.0g
NaCl 85.0g
加蒸溜水至1000mL,常温保存。
、CD58/ CD34+CD19+的CD58+表型强度二维点图,分析白血病启动细胞上CD58抗原的表达比例分析用,
所谓FSC/SSC二维点图是建立前向角散射(Forward Scatter简称FSC)/侧向角散射(Side Scatter简称SSC)点图,散射光FSC和SSC可以代表被测细胞的物理性质,不依赖于标本的制备程序,例如染色过程。FSC与被测细胞的大小有关,SSC与提供被测标本细胞内的颗粒性质有关。
在附图3-附图5中出现的P1是表明该二维点图中所划定的是骨髓单个核细胞区域,以排除死细胞和细胞碎片。而P2则表示CD45/SSC二维点图,根据各群细胞CD45和SSC强度,勾画出异常幼稚B细胞的P2区。对P2区中的CD34+CD19+细胞进行设门分析,在分析B-ALL患者标本前,首先需要从经验数据模块3中调取对应年龄、性别段的形似分类组的健康者骨髓中正常B祖细胞CD34+CD19+表型?,以确定CD58抗原在白血病启动细胞上的阴性和阳性分界线的定义值;
以此为基础,主管检验师来分析B-ALL患者被检样本的白血病启动细胞,CD34+CD19+表型,简称LICs,上CD58抗原的表达比例,表达CD58的LICs≥定义值的为CD58阳性LICs,即CD34+CD19+CD58+表型,CD58+LICs;表达CD58的LICs<定义值的为CD58阴性LICs,即CD34+CD19+CD58-表型,CD58-LICs)。
CD38是B-ALL常见的白血病相关免疫表型之一,在治疗过程中常常出现免疫表型转换,表现为CD38弱表达或不表达,是B-ALL白血病细胞监测的常用指标之一,因此在初诊时需要进行CD38检测已确定,被测对象的分类是属于以下哪一种亚型分类。
I 型:Pro-B-ALL,早B前体-ALL,CD34+CD10-;
II 型:Com-B-ALL,普通B-ALL:CD34+CD10+;
III型:Pre-B-ALL,前体B-ALL:CD34-CD10+;
IV型:成熟型B-ALL:CD34-CD10- ,
参看图6。
步骤众所说的被检测骨髓样品用单克隆荧光染色剂制成的标本为一式2-3个:将步骤到按照标本个数重覆循环进行,将每次得到的数据分别计入暂存器模块(4)形成中间数组,同类别数据按照算术平均求值、形成检测数据。
最后的、精确的结论性意见往往取决于几米的实验设备和科学的检测方法。本系统的积极意义在于将影响实验报告结论的总多因素均化为标准模板。尽可能的消除了人为的干扰。结论报出的关键因素决定于经验数据模块4中的数据正确程度。正常骨髓的表型数据、及治疗后微小残留病阴性B-ALL患者骨髓CD34+CD19+正常B祖细胞表型和所确定的CD58抗原在白血病启动细胞上的阴性和阳性分界线是关键。
Claims (10)
1.急性B淋巴细胞白血病启动细胞特性测定系统,系统结构中包括流式细胞仪及其数据分析软件,其特征在于系统中还包括主控计算机单元(1)、以及连接在主控计算机单元(1)配套接口上的存储有主控程序的系统管理模块(2)、配置缓存器模块(13)的监控显示器(LCD)、存储有标准数据和图形的经验数据模块(3)、暂存器模块(4)、设置在系统操控台上的操控面板(5)、存储有内、外数据通讯协议和数据规格转换模式的通讯模块(6)、打印机及接口电路(7),流式细胞仪(8)通过通讯接口电路(12)和主控计算机(1)的数据总线连接、流式细胞仪(8)结构中配套有对标本进行激光扫描采样的测试窗口(9)、专用标本试管(10)以及专用试剂盒(11)。
2.根据权利要求1所说的急性B淋巴细胞白血病启动细胞特性测定系统,其特征在于经验数据模块(3)结构中包括按照年龄段、性别分别标示的健康人的骨髓样本流式数据库;每个数据库中存储着以所标示的健康人骨髓为标本、按照流式细胞仪(8)的采样规范为原则、针对用专用试剂盒(11)中的染色单克隆抗原为试剂制成的激光采样标本进行激光束照射采样、所采集到的全部基础数据和借助基础数据制成的两维色标图谱。
3.根据权利要求1所说的急性B淋巴细胞白血病启动细胞特性测定系统,其特征在于专用试剂盒(11)中设置有带荧光标记的单克隆抗原CD58、CD10、CD34、CD19、CD45和CD38,依次对应的荧光标记分别为FITC、PE、PerCP、APC-Cy7、Pacific Blue和APC。
4.根据权利要求1所说的急性B淋巴细胞白血病启动细胞特性测定系统,其特征在于高清晰度的监控显示器(LCD)借助暂存器模块(13)与主控计算机单元(1)的数据总线相连、配套设置触摸式电子鼠标。
5.根据权利要求1所说的急性B淋巴细胞白血病启动细胞特性测定系统,其特征在于本系统中所采用的流式细胞仪是MACSQuant-TM七色流式细胞仪,配备有三色激光管和专用流式细胞分析软件FCS模块 或 FlowJo模块。
6.一种借助于权利要求1所述的系统确认急性B淋巴细胞白血病启动细胞特异性的方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
、将所检测骨髓样品用单克隆荧光染色剂制成标本,
、根据以上确定分界线,表达CD58的LICs≥分界线值定义为CD58阳性、即CD34+CD19+CD58+表型为CD58+LICs;表达CD58的LICs<分界线值的定义为CD58阴性,即CD34+CD19+CD58-表型为CD58-LICs,
7.根据权利要求6所说的确认急性B淋巴细胞白血病启动细胞特异性的方法,其特征在于步骤将所检测骨髓样品用单克隆荧光染色剂制成标本的分步步骤为:
、取洁净的试管,从专用试剂盒(11)中依次取出3μL的 CD58FITC、10μL的 CD10PE、1μL的 CD34 PerCP/Cy5.5、 2μL的 CD38APC、5μL的 CD19APC-Cy7、1.3μL的 CD45Vioblue加进试管、再加入100μL患者骨髓标本,轻摇混匀,环境温度保持在22℃左右、避光放置15分钟孵育,
8.根据权利要求7所说的确认急性B淋巴细胞白血病启动细胞特异性的方法,其特征在于
所述PBS缓冲液的配制方法:
Na2HPO4.12H2O 26.3g
NaH2PO4.2H2O 3.0g
NaCl 85.0g
加蒸溜水至1000mL,常温保存。
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