CN103215836A - 一种表达糖苷酶的微生物菌种和其用于生物酶法造纸的技术 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用分泌嗜热糖苷酶的工程菌分解造纸浆的方法，包括以下步骤：1）以农作物秸秆为原料，粉碎，浸泡20-30小时形成原料浆；2）扩增分泌嗜热糖苷酶的工程菌种子并经一级和二级菌种培养，当第二菌种的OD值为0.4-0.8时，于25℃-37℃下用0.2-0.7mM的IPTG诱导嗜热糖苷酶的表达；3）将步骤2）所获得的二级菌种液按体积比1：20-40加入到步骤1）的原料浆中，于室温下处理浆液过夜；4）捞出浆料、煮沸、清洗、破碎，抄纸并烘烤成型。本发明的分泌糖苷酶微生物分解造纸原料浆的效果与常用的酶试剂相当，而且成本大大降低。

Description

一种表达糖苷酶的微生物菌种和其用于生物酶法造纸的技术

技术领域

本发明涉及生物酶法造纸技术领域，具体涉及一种表达糖苷酶的微生物菌种及其用于造纸的技术。

背景技术

由于生物科技的迅猛发展，其他行业受益于其发展成果的优势也越发明显，并正在迅速蔓延。造纸行业是众所周知的主要污染行业，尤其在制浆造纸的过程中会产生大量的化学物污染。根据2008年的统计数据表明：中国的制浆造纸产量达到7980万吨，成为全球产量第一的纸业大国，国家也花费了大量的资金用于造纸行业的污水、废气、固体废弃物的治理。将现代生物技术用于造纸行业的节能减排、污染治理是今后最有前景的解决方法。传统造纸是以碱法、亚铵法、亚钠法和半化学法等分解原料浆中的纤维素为生产工艺，该工艺在制浆技术在制浆蒸煮过程中有大量的黑色制浆废液产生、排出，是我国江河、湖泊的主要污染源之一，给人们的生活带来了极大的危害。而我们的酶解法是以可降解的生物酶降解纤维素作为主要生产工艺，以达到绿色环保。

原有的造纸原料主要为木材，小麦等，造成国家自然资源的极大消耗，已经有报道应用农作物如玉米秸秆作为造纸的原料[专利00812212.1由罗伯特·W·赫特;小梅德威克·V·伯德申报专利：采用玉米秸秆和其他非木本纤维材料的制浆工艺]，经查新国外也在近年出现利用香蕉叶进行造纸[PL2005038265020050915、99118241.3和JP2002212888(A)]，但是结果发现很难产业化和应用，因为单一农作物或者单一树叶无法达到纸张的强度、透气性和撕裂度等综合指标的要求。

过去，纤维素酶被分为内切型和外切型两类．内切型被认为是不规则地切断纤维素分子链；而外切型被认为是从分子链的非还原末端开始．以纤维二糖为单位将分子链依次分解。不过，如检查一下内切型纤维素酶(EG)和外切型纤维素酶(cBH)将纤维素分解产生的可溶性纤维低糖的分解结构，则上述的分解方式就未必合适。如果只对纤维素分子链，就会在纤维素酶分类为内切型和外切型上产生疑问。有文献[5]还报导了在大麦用CBH处理产生的B一1，3、1，4一葡聚糖、以及末葡聚糖水解方式上，也是切断纤维素分子链内部的0-1，4键。此外，在纤维低糖的类似基质上．也确认有同样的情况。因此，如仅检查纤维素分子链的水解方式．刚在所有纤维素酶中，很多都有内切型的性质，在实际意义上，很难说有外切型纤维素酶。

金炳铉使用的试剂级酶（SIGMA），纤维素酶调查有关的表面的纤维和纸张的物理性能的影响。他的调查为内切-β-1，4葡聚糖酶和外切-β-1，4葡聚糖酶。第一内切-β-1，4葡聚糖酶的表面上的原纤化的纤维出现剥离现象。外切-β-1，4葡聚糖酶的纤维，在结束分解纤维素前形成是细胞核开始耗尽，外切-β-1，4葡聚糖酶与破裂的浓度的增加，拉伸强度变大，表示该信息的度分别为78，34，17。然而，内切-β-1，4葡聚糖酶的出现从0.3到最大的效果，显示出两个以上的聚合酶，将在有不利影响时出现互补作用。但是韩国的专利[KR20010028982(A)]显示尽管他们也使用糖苷酶进行降解纸浆，但还是采用加入糖苷酶试剂的方法，成本较高，而且加入的酶的稳定性不强，保持时间有限，使目前无法真正转化到产业化中使用。

实际上糖苷酶(Glycosidase，EC3.2.1)即糖苷水解酶(glycosidehydrolases，GH)，又称为糖基水解酶，广泛存在于动物、植物及微生物中。它不仅来源广泛同时也是酶法合成糖苷类化合物的一类重要工具酶，常见的类型如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α—甘露糖苷酶等。到目前为止，已被报道的大多数糖苷酶属常温酶类，由于其热稳定性较差，对有机溶剂不稳定等缺点而不适合用于酶法合成糖苷类化合物，所以，寻找新型稳定的、耐高温的酶源逐渐成为人们关注的焦点。嗜热糖苷酶，因具有良好的热稳定性，较长的半衰期，水解速度快，可采用热处理方法，可以纯化，操作相对方便，污染危险较小等优点。本发明利用该酶的特点，将该酶通过基因工程方法在微生物中进行表达，以利用微生物在扩增和不断增长期，不断生长和分泌表达该酶，从而直接连续降解农作物和树叶中主要需要降解的纤维素，替代传统工艺的强碱降解方法，成本低，有长久性应用价值，即环保又降低了纸产品的有害性，真正将生物技术应用到造纸工艺中。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种直接利用分泌嗜热糖苷酶的工程菌分解造纸浆的方法，包括以下步骤：

1）以农作物秸秆为原料，粉碎，浸泡20-30小时形成原料浆；

2）构建并扩增分泌嗜热糖苷酶的工程菌种子并经一级和二级菌种培养，当第二菌种的OD值为0.4-0.8时，于25℃-37℃下用0.2-0.7mM的IPTG诱导嗜热糖苷酶的表达；

3）将步骤2）所获得的二级菌种液按体积比1：20-40加入到步骤1）的原料浆中，于室温下处理浆液过夜；

4）捞出浆料、煮沸、清洗、破碎，抄纸并烘烤成型。

进一步地，所述分泌嗜热糖苷酶的工程菌是转染了表达质粒pET-28b-0602的大肠杆菌，所述表达质粒pET-28b-0602具有如图2B所示的结构。

进一步地，所述农作物秸秆选自配比为1：1-10：1的玉米：小麦秸秆、4：1-9：1的香蕉叶：鱼骨树叶，1：1-5：1的香蕉叶：玉米秸秆、1：1-5：1的香蕉叶：小麦秸秆。

本发明的另一个目的是提供了所述分泌嗜热糖苷酶的工程菌在分解造纸浆中的应用。

本发明的又一个目的是提供一种分泌嗜热糖苷酶的工程菌，所述工程菌是转染了表达质粒pET-28b-0602的大肠杆菌，所述表达质粒pET-28b-0602具有如图2B所示的结构。

附图说明

图1是以超嗜热古细菌的基因组为模板扩增嗜热糖苷酶0602的PCR扩增图；

其中，箭头指明目的基因的位置。

图2是重组质粒pET-28b-0602的构建过程图；

其中，2A是重组质粒pET-28b-0602的构建过程图，2B是质粒pET-28b-0602的结构图。

图3是重组质粒pET-28b-0602PCR鉴定结果图；

其中，泳道1、2、3、4分别为1至4号克隆；M：DL 2K Plus。

图4是鉴定TN0602表达的SDS-PAGE分析图；

其中，泳道1-2是TN0602表达产物的上清液；泳道3是pET-28b表达产物的上清液；泳道4-5是TN0602表达产物的沉淀物；泳道6是pET-28b表达产物的沉淀物；泳道7-8是TN0602全表达产物；泳道9是pET-28b的全表达产物；箭头指明目的蛋白的位置。

图5是不同诱导温度下目的蛋白的SDS-PAGE分析结果；

其中，泳道1-3分别是诱导温度为25℃、30℃、37℃下的TN0602表达产物的上清液；泳道4-6分别是诱导温度为25℃、30℃、37℃下的TN0602表达产物的沉淀物；泳道7-9分别是诱导温度为25℃、30℃、37℃下的TN0602全表达产物；箭头指明目的蛋白的位置。

图6是不同浓度IPTG诱导的目的蛋白的SDS-PAGE分析图；

其中，泳道1-5分别是IPTG浓度为0mM、0.2mM、0.4mM、0.7mM、1.0mM诱导下的TN0602表达产物的上清液；泳道6-9分别是IPTG浓度为0mM、0.2mM、0.4mM、0.7mM、1.0mM诱导下的TN0602表达产物的沉淀物；泳道10-15分别是是IPTG浓度为0mM、0.2mM、0.4mM、0.7mM、1.0mM诱导下的TN0602全表达产物；箭头指明目的蛋白的位置。

图7是目的粗菌液不同热处理时间的SDS-PAGE分析图；

其中，泳道1、3、5、7、9分别是热处理时间为2min、5min、10min、20min的TN0602表达产物的上清液；泳道2、4、6、8、10分别是热处理时间为2min、5min、10min、20min的TN0602粗菌液沉淀物；箭头指明目的蛋白的位置。

图8是纯化的TN0602的SDS-PAGE分析图；

其中，泳道1是含有目的蛋白的粗溶菌液；泳道2是热处理的粗溶菌液的上清液；泳道3是穿透液；泳道4、5、6、7、8、9、10是咪唑浓度分别为0、20mM、50mM、75mM、100mM、150mM、200mM的目的蛋白洗脱液；箭头指明目的蛋白的位置。

图9是最适反应温度测定图。

图10是最适PH测定图；

其中，图10A是对oNPG最适反应PH的测定结果；图10B是对乳糖最适反应PH的测定结果。

图11是TN0602在不同温度下的热稳定性分析图。

图12是TN0602的PH稳定性分析图。

图13是TN0602的Lineweaker-Burk图。

图14是以玉米秆为原料使用生物酶试剂法制造纸浆的工艺流程图。

图15是以玉米秆为原料使用微生物发酵产生的生物本酶试剂制造纸浆的工艺流程图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步详细说明本发明的优点和特点，不应理解为是对本发明的限制，所使用的实验设备和材料如无特殊说明，均为普通市售。

【实施例1】以农作物和树叶作为造纸原料浆的配比筛选

本实施例采用生物碱乙醇钠，原料为玉米秸秆、小麦秸秆、香蕉树叶，并进行不同原料的配比实验。原料浆配比筛选的目的是为后续的酶法造纸进行探索，减少造纸污染。

具体配比方案分别如下表1至表4所示。玉米秸秆：小麦的配比从1：1到10：1；香蕉叶：鱼骨树叶从4：1到9：1；香蕉叶：玉米秸秆从1：1到5：1，香蕉叶：小麦从1：1到5：1。

表1：两种农作物配比进行生物酶法造纸实验

表3农作物和树叶配比进行生物酶法造纸实验（玉米秸秆与香蕉树叶）

上述两种农作物配比进行生物酶法造纸实验的结果可见，玉米秸杆：小麦为4：1时的纸张各种性能较好；两种树叶配比进行生物酶法造纸实验的结果可见，香蕉树叶：鱼骨树叶为4：1比较好；农作物和树叶配比进行生物酶法造纸实验结果可见，香蕉树叶：玉米秸秆为4：1和香蕉树叶：小麦为2：1比较好。

【实施例2】酶法结合有机碱造纸法的工艺条件筛选

本实施例使用的纤维素酶：型号为140万U/g，批号为20120280008YX，厂家为夏盛实业集团有限公司。

β-葡聚糖酶：型号为3000万U/g，批号为20120280008YX，厂家为夏盛实业集团有限公司。

酶法+有机碱的环保工艺条件研究结果见表5：

表5：酶法造纸条件探索情况

通过表5可见酶的浓度不同时需要的作用时间也明显不同，根据成本优选酶量较小且作用时间较短的组别。因为加酶的量和生产成本直接相关，但作用时间也就是生产周期也是生产成本的次影响因素，需要综合考虑多种因素。并且造纸过程中，在纸浆铺平后烘干之前先压平，有助于提高纸张的光滑度和耐折度。

【实施例3】构建表达生物酶基因的载体

用常规PCR的方法从超嗜热古细菌（Thermotoga naphthophila，JapanCollection of Microorganisms，RIKEN BioResource Center）的基因组中调取基因嗜热糖苷酶0602，本文也称TN0602。发酵超嗜热古细菌，离心收集菌体，用试剂盒提取基因，用PCR的方法从基因组中调取嗜热糖苷酶0602基因，然后转入大肠杆菌（E.coli BL21（DE3））中进表达，并进行了纯化及基本酶学性质的表征。

实验材料和方法

基因组的提取：离心收集转化有嗜热糖苷酶0602基因的大肠杆菌菌体，用试剂盒（杭州维特杰公司）提取其基因组，参照试剂盒的说明书进行。

引物设计：以超嗜热古细菌基因组DNA为模板,设计带有不同限制性内切酶位点的上下游引物对目的基因TN0602进行PCR，以获得目的基因，引物设计如下：Primer sense：5′CTGACACATATGAACGTGAAAAAGTTCCCT3′，Primerantisense：5′CTGCACGAATTCTTAATCTTCCAGACTG3′。

目的基因的扩增及纯化：PCR反应体系及反应为:

PCR反应结束后，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR产物，再用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，之后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行目的基因纯化产物的检测，并根据Marker估算其浓度。

PCR纯化产物的限制性酶切及其纯化：

⑴将PCR纯化产物用NdeI和EcorRI进行双酶切，酶切反应体系如下：

反应体系  反应条件

Buffer K        50 ul 37℃进行酶切6h

纯化片段        25 ul

Nde I           2.5 ul

EcoR I          2.5 ul

Sterile H₂O 15  ul

总计            50 ul

用0.8％的琼脂糖凝胶电泳对酶切效果进行检测。

⑵对酶切后的PCR产物进行纯化回收：用凝胶回收试剂盒对酶切后的目的片段进行回收，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测回收结果，并根据Marker估算其浓度。

载体DNA的限制性酶切及纯化：pET-28b的限制性酶切与纯化与PCR纯化产物的处理方法相同。

结果

将培养好的古细菌Thermotoga naphthophila离心收集体，按照试剂盒说明书进行操作提取其基因组。

目的基因的扩增：以Thermotoga naphthophila的基因组为模板于不同的退火温度（50℃-60℃）进行PCR扩增（图1），从图1中可以看出在1350bp处有一条很亮的带，PCR扩增成功，将扩增产物用凝胶试剂盒进行PCR产物的纯化回收。

目的基因的纯化回收：将目的基因用Nde I和EcoRI进行双酶切后,参照凝胶试剂盒的方法进行纯化回收在1350bp的位置有一条亮带,说明纯化成功。

【实施例4】重组质粒的转化及鉴定

1、载体DNA的限制性酶切及纯化

pET-28b的限制性酶切与PCR纯化产物的处理方法相同。目的基因与载体的连接用T4 DNA连接酶对纯化的目的基因和载体进行连接，于16℃过夜进行。10ul反应体系如下：

纯化的目的基因：5.0 ul

纯化的载体28b：1.0 ul

T4 DNA Buffer：1.0 ul

T4 DNA ligase：0.5 ul

Sterile H2O：2.5 ul。

2、重组质粒pET28b-0602的构建

将双酶切后的载体pET-28b（购于美国Novgen公司）与目的片段TN 0602用连接酶进行连接，形成重组质粒pET-28b-0602，具体构建过程如图2A所示。

3、重组质粒的转化及鉴定

将重组的质粒转入经CaCl₂处理的E.coli JM109细胞中，进行重组质粒的扩增。由于重组质粒上带有卡那霉素抗性基因，因此可以根据其抗生基因对阳性克隆进行筛选。选取生长状态较好的单克隆菌落进行培养，用终浓度12.5％的甘油保存菌种后提取质粒并对质粒进行PCR鉴定，并且用保存的菌液进行DNA测序。

4、重组质粒pET-28b-0602的鉴定

挑取四个平板上生长状态良好的阳性克隆进行培养，提取质粒，用实施例3所述的TN0602的引物对进行PCR鉴定，从电泳图（图3）中可以看到1号阳性克隆在1350bp处有一条亮带，说明重组质粒构建成功。

5、目的基因TN0602的测序

将阳性克隆的质粒进行测序，测序结果显示没有突变。

【实施例5】目的基因诱导表达及优化表达条件

目的基因的诱导表达

将重组质粒pET-28b-0602转入经CaCl₂处理的E.coli BL21(DE3)中（购于美国Novgen公司），构建工程菌，并将pET-28b转入E.coli BL21(DE3)中，作为对照，同时用5ml的LB培养基分别培养，待工程菌长至OD600值为0.6时保存菌种并加入终浓度为0.1M的IPTG37℃诱导以让目的基因表达,诱导12h后离心收集菌体并超声破碎后用SDS-PAGE进行检测。

表达条件的优化

1、诱导温度对目的基因表达的影响

取一支试管加入5ml LB培养基,将工程菌接入并培养至对数期后，分别取20ul接种于三支装有5ml LB培养基的试管中37℃培养至OD600值为0.6时，加入终浓度为0.1M的IPTG分别于25℃、30℃和37℃培养12h，然后收集菌体，用SDS-PAGE检测结果。在25℃、30℃、37℃诱导12h，从电泳检测结果(图5)可以看出，随着温度的升高，目的蛋白的表达量有所提高，但从细胞破碎后的沉淀中可以看出该蛋白在表达时由于表达速度过快，所以容易形成大量包涵体量，因此在诱导目的蛋白表达时用25℃低温诱导，以尽量降低包涵体的形成。

2、IPTG浓度对目的基因表达的影响

取一支试管加入5mlLB培养基，将工程菌接入并培养至对数期后，分别取20ul培养物接种于五支装有5mlLB培养基的试管中37℃培养至OD600值为0.6时，分别加入终浓度为0mM、0.2mM、0.4mM、0.7mM和1mM的IPTG，25℃培养12h，收集菌体，用SDS-PAGE检测结果。用不同浓度的IPTG对目的基因进行诱导，从电泳检测结果从图6中可以看出即使不加入IPTG，目的蛋白也可以表达，且各梯度的上清表达量相差不多，不易形成包涵体。粗测酶活显示，终浓度为0.4mM的IPTG诱导所得到的粗酶液酶活相对较高，因此在以后的实验中可用终浓度0.4mM的IPTG进行诱导。

用pET-28b作为pET-28b-0602的对照，在相同条件下进行诱导表达，通过SDS-PAGE检测结果，如图4，从图中可以看出，在50KDa左右的位置上pET-28b-0602的上清液、沉淀与全菌体与pET-28b的相比有一条明显的差别带，说明目的基因已表达。

【实施例6】目的蛋白的纯化及纯化条件的优化

将接入工程菌400ml LB培养基在后37℃培养，待长至OD600=0.6时，于25℃诱导12h后离心收菌，大约得到1.5g菌体，匀浆加压破碎菌体后进行热处理条件摸索，80℃分别热处理2min、5min、10min和20min，从电泳结果检测(图7)中可以看出，目的蛋白的热稳定性较好，随着热处理时间的延长，上清液中的目的蛋白的含量变性并不大，但以10min和20min所除去的杂蛋白的量较多，因此80℃热处理的时间最终选为10min。

将匀浆加压破碎后的上清在80℃热处理10min后的上清加入终浓度为0.4M的NaCl,以终体积15ml上柱,从电泳结果从图8中可以看出，除0mM和20mM的咪唑洗脱液无目的蛋白的洗出外，从终浓度50mM-200mM的咪唑洗脱液中都有目的蛋白的洗出，其中以75mM、100mM和150mM洗脱液中目的蛋白的量最大，且纯度在90%以上。

【实施例7】目的蛋白基本性质的测定

1、酶活力的测定

配制0.1M的底物o-NPG(邻硝基β-D-半乳糖)，1ml反应体系(50mM磷酸或Tris-HCl缓冲液)中加入5ul，20或30ul不同浓度的酶液，于80℃下用紫外UV2550(SHIMADZU)在λ=420nm条件下测定酶促反应在1min内的动力学变化。

A、以乳糖为底物的酶活力的测定

990ul反应体系(50mM缓冲液)中含5%乳糖，20ul0.2mg/ml的酶液，于85℃下反应30min后加入10ul醋酸以终止反。反应过程中产生的葡萄糖含量用葡萄糖氧化酶试剂盒（长春汇力）进行测定（用紫外分光光度计测定样品在λ=510nm下的吸光度）。

酶活力定义：在反应条件下，每分钟释放1umol的葡萄糖定义为1个酶活力单位。

B、以乳糖为底的最适反应温度的测定

设定的反应温度范围为50℃-95℃，每5℃为一个梯度。反应体系为1ml，975ul的Na3PO4缓冲液（pH7.0），5ul的底物，20ul0.2㎎/ml酶液。结果如图9所示。

TN0602对oNPG最适反应pH测定结果如图10A所示，可以看出目的蛋白的最适反应pH为7.0。

以乳糖为底物的最适pH的测定：设定的pH范围为pH4.0-pH10.0，每隔0.5为一个梯度。990ul反应体系(50mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)中含5%乳糖，20ul0.2mg/ml的酶液，于85℃下反应30min后加入10ul醋酸以终止反。其中所用的citrate–Na2HPO4缓冲体系取范围pH4.0-8.0，所用的H3BO3-KCl-NaOH缓冲体系取范围pH7.8-10.0。

对乳糖最适反应pH测定结果如图10B所示，由图可以看出目的蛋白的最适反应pH为5.5。

2、酶的热稳定性的研究

酶浓度为0.2mg/ml，在50mM的磷酸缓冲液（pH7.0）中于75℃、80℃、85℃、90℃中保温不同时间，以ONPG为底物（终浓度5uM）测定残余活力。在不同温度保温一定时间后，（50mM磷酸（pH7.0）缓冲体系），取样测定TN0602的残余活性，结果如图11（酶浓度为0.2mg/ml）。0602在75℃、80℃、85℃、90℃中的半衰期分别为84、33、14和2.9h。在75℃和80℃下，该酶具有较好的稳定性，这是在实际应用中可能考虑的一个优势。

3、酶的pH稳定性的研究

将0.2mg/ml的酶液分别在pH4.0-10.0的50mM磷酸与硼酸缓冲液于25℃保温1h和24h，在50mM磷酸缓冲液（pH7.0）80℃条件下测定残余活力。

结果如图12所示，从图中可以看出，经过24个小时的孵育后，只有在pH4和4.5的缓冲液中下降了20%左右的活力，在pH5-10的范围内，0602保持了约90%的活力。

4、动力学常数的测定

以不同浓度的o-NPG(0.08-0.5mM)做为底物来测定TN-0602的基本动力学常数。1ml反应体系(50mM磷酸缓冲液pH7.0)中加入20ul0.2mg/ml的酶和不同浓度的底物,于80℃下反应5min，然后根据Lineweaker-Burk双倒数曲线来测定Km(mM)和Vmax(U/ml)值。根据在不同底物浓度下及其反应初速度所做的双倒数曲线（图13）可算出，TN0602的Km值为0.605mM，Vmax值为1295.337U/ml，kcat值为5560.16s-1，其中，

Y=0.4674x+0.772

R²=0.9962

【实施例8】菌种扩增后接种到原料浆中发酵条件的建立

菌种经过三级种子库建设和稳定性测定，证明构建的微生物菌种稳定，可以用于生产中。菌种复活后经过一级和二级种子培养，培养初始温度为37℃，转接到造纸浆中继续发酵，诱导温度为25℃，用终浓度0.4mM的IPTG进行诱导。加压匀浆后在70℃下处理20分钟浆液，室温放置过夜，过滤，抄纸，压平干燥。

工程菌（含表达质粒pET-28b-0602）菌种鉴定如下：

（1）形态学观察及革兰氏染色

取一只甘油保存的原始菌种，接种到100ml含100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB培养基中，37℃，225rpm培养16hr，次日用接种环划含100μg/ml氨苄青霉素的LB的固体培养基平板，37℃培养过夜。次日可观察到圆形，边缘较不整齐，透亮的菌落，菌落易被接种环刮取，为典型的大肠杆菌菌落形态。

将LB液体培养基扩增的工程菌涂于载玻片，用革兰氏染色法进行染色，结果表明，工程菌呈典型的革兰氏阴性大肠杆菌形态。

（2）抗生素抗性测定

将BL21(DE3)宿主菌和含重组表达质粒工程菌分别接种于含100μg/ml Amp的LB固体培养基平板和不含Amp的LB固体培养基平板，37℃培养过夜，结果表明，在含Amp的LB固体培养基平板中不带质粒的BL21(DE3)宿主菌不能形成菌落，其余均有细菌菌落的形成。证明Amp抗性是由于携带pTRX-Tα1重组质粒所致，并可作为发酵培养基的选择条件。

（3）生化反应

工程菌发酵乳糖并产气，即发酵乳糖为（＋）；

乙酰甲基甲醇反应呈（－）；

甲基红反应呈（－）；

上述3个反应均为大肠杆菌特性。

（4）电镜检查

FEI QUANTA400热场发射扫描电镜检查由中山大学分析测试中心完成，为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

（5）种子批的建立

为保证生产的持续稳定，根据“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定（《中国药典》三部（2010年版）“通则”），建立了原始种子批、主种子批、工作种子批。

原始种子批的建立

原始工程菌菌种为带有Tα1基因的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得能表达糖苷酶的工程菌原始种子。

从上述原始种子的平板上挑取单菌落接种于LB培养基中，37℃振荡培养16小时，培养液分装到无菌小管中，冻干保存。此即为原始种子批。

主种子批的建立

从原始种子批传出，扩大培养后冻干保存作为主种子批；或由上一代主种子批传出，扩大培养后冻干保存作为主种子批，但每次只限传3代。

工作种子批的建立

从主种子批传出供生产用的菌种称为工作种子。取一支主种子批的冻干菌种，启开后接种于LB培养基中，37℃振荡培养16小时，分装于无菌小管中,加入30%灭菌甘油混合，使甘油终浓度为15%，-20℃以下保存作为生产种子批，液体甘油保存的菌种保存期不超过半年，有限传代的代数为3-4代。

(6)工程菌质粒遗传稳定性和产物表达稳定性

工程菌质粒遗传稳定性

从原始菌种库取出的工程菌为原代，划平板，挑取单克隆接种入LB平板培养基中，37℃培养12小时，此时为第1代种子，挑取单菌落，在无选择压力的LB平板上划平板，37℃培养12小时，作为第2代，依次类推，不断传代，直到80代。选取原代、第20代、第40代、80代进行以下检测。

稳定性检测项目

摇床表达，SDS-PAGE电泳检测表达水平。

提取质粒，分别用进行酶切涂片做革兰氏染色、氨苄青霉素抗性、形态学检测。

菌种稳定性试验结果如表6所示。

表6菌种稳定性试验结果

【实施例9】生物酶试剂和微生物表达的生物酶分解造纸浆的工艺

以实施例1筛选获得的其中一个优选原料配比为例进行以下实验。

1、以玉米秸杆：小麦=4：1为原料酶法制造纸浆的工艺流程为例说明用生物酶试剂法造纸工艺，包括以下步骤：

a、将玉米秸秆和小麦放在阴凉处进行完全干燥，切成3-4cm长，然后去掉粘附在外皮上的落叶及其它杂物，劈开玉米秆后将秆芯去掉；

b、将玉米秸秆和小麦分别用破碎机和粉碎机将制成具有一定大小的原料；

c、按照玉米秸杆：小麦为4：1分别称取粉碎的原料，将原料在水中浸泡24h制成浆。加入0.2到5%(纤维素酶/β-葡聚糖酶)，在4或25（℃）、96±24（小时）的条件下进行作用；

d、用100目的筛子捞出经过作用的原料，取下筛网上留下的捞出物；

e、将捞出物进行煮沸1.5h(需要的话再加入乙醇钠一起煮沸，乙醇钠与水的加入量为5g/100ml)；

f、将煮沸后的玉米秸杆和小麦置于水中清洗，洗至水的颜色为透明澄清即可；

g、取出清洗后的玉米秸杆和小麦，于破碎机中破碎，约破碎30s～60s；

h、制纸，将模具置于水中后，取破碎物倒于模具内，使破碎物均匀分散在模具内；

i、烘箱70°C～85°C，烘烤2.5h～4h（根据纸张大小，薄厚程度控制烘烤时间）。

其工艺流程如图14所示。

其中，纤维素酶的型号为140万U/g，批号为20120280008YX，厂家为夏盛实业集团有限公司；β-葡聚糖酶的型号为3000万U/g，批号为20120280008YX，厂家为夏盛实业集团有限公司。

2、以玉米秸杆：小麦=4：1为原料酶法制造纸浆的工艺流程为例说明用微生物发酵产生的生物酶试剂法造纸工艺，包括以下步骤：

a、将玉米秆和小麦放在阴凉处进行完全干燥，切成3一4cm长，然后去掉粘附在外皮上的落叶及其它杂物，劈开后将秆芯去掉；

b、将玉米秸秆和小麦分别用破碎机和粉碎机制成具有一定大小的原料；

c、按照玉米秸杆：小麦为4：1分别称取粉碎的原料，将原料在水中浸泡24h制成浆；

d、从菌种库取出工程菌工作种子，划平板，挑取单克隆接种入LB平板培养基中，菌种复活后经过一级和二级种子培养，培养初始温度为37℃，到OD值为0.4-0.8时，诱导温度为25℃，用终浓度0.4mM的IPTG进行诱导；

e、转接到造纸浆中继续发酵（转接菌液的比例为二级菌种液：造纸浆生产+培养液为1：20到1：40）；

f、在室温（25℃）下处理浆液过夜；

g、用100目的筛子捞出经过作用的原料，取下筛网上留下的捞出物；

h、将捞出物进行煮沸1.5h

i、将煮沸后玉米秸杆和小麦置于水中清洗，洗至水的颜色为透明澄清即可；

m、取出清洗后的玉米秸杆和小麦，于破碎机中破碎，约破碎30s～60s；

n、制纸，将模具置于水中后，取破碎物倒于模具内，使破碎物均匀分散在模具内。

o、烘箱70°C～85°C，烘烤2.5h～4h（根据纸张大小，薄厚程度控制烘烤时间）。

其工艺流程如图15所示。

【实施例10】纸张产品的外观和物理性能测定

1.将NAOH、乙醇钠工艺、纤维素酶和β-葡聚糖酶法造纸的纸张进行了的物理性能测定，耐折度、压缩强度和撕裂度等具体数据见附录的表7-表8，9。

表7NAOH、乙醇钠工艺造纸纸张的照片和物理参数测定

表8加酶试剂(纤维素酶)法工艺造纸纸张的物理参数测定

表9加酶试剂(糖苷酶)法工艺造纸纸张的物理参数测定表

经过表7和表8的数据比较，可见纤维素酶法造纸物理特性与NAOH法和乙醇钠法造纸比较在光滑度和耐折度方面较弱。但是在压缩强度方面强于NAOH法，低于乙醇钠法；撕裂度大于NAOH法，和乙醇钠法相当；在透气度方面接近100%，为三者最强。

从表8和表9中，我们将纤维素酶和β-葡聚糖酶的各项指标进行对比，从纸张表面我们可以看出，β-葡聚糖酶法纸张的纤维比纤维素酶纸张的纤维粗。但是从纸张的其他性能，我们可以发现β-葡聚糖酶纸张的耐折度，压缩强度，透气度及撕裂强度都比纤维素酶纸张好。例如：5%β-葡聚糖酶的压缩强度是70N，0.46kn/m，而纤维素酶的压缩强度是25.25N，0.17kn/m，可以看出β-葡聚糖酶的压缩强度约是纤维素酶的压缩强度的3倍。

2.将用本发明明构建的微生物菌直接发酵法造出的纸张进行了物理性能测定，耐折度、压缩强度和撕裂度等具体数据见附录的表10。

表10微生物直接发酵法造纸的物理参数测定表

结果表明用本发明构建的微生物发酵分泌的糖苷酶分解原料浆基本达到加入酶试剂的效果，而且成本大大降低。

另外将用本发明的微生物发酵法制备的纸张与市售B级牛皮纸以及市售包装纸袋物理性能进行了比较实验，结果见表11。

表11微生物酶法纸张与牛皮纸及市面包装纸袋物理性能比较结果

牛皮纸，是印刷包装的主要原料之一。国产牛皮纸分为优等品、一等品、合格品三个等级。牛皮纸的质地必须坚韧，耐破度和撕裂度要高，此外还要具有较高的抗水性。因此此次选择它及市售包装纸袋与微生物发酵分泌酶法制备的纸张作一个比较。

从上表11可以看出，与两者比较生物酶法配比材料制备的纸张的压缩强度及透气度远高于牛皮纸及包装纸袋，撕裂度与包装纸袋相当，但是耐折度有待加强，因此此法制备的纸张有作为包装纸袋的潜质。

Claims (5)

1.一种直接利用分泌嗜热糖苷酶的工程菌分解造纸浆的方法，包括以下步骤：

1）以农作物秸秆为原料，粉碎，浸泡20-30小时形成原料浆；

2）构建并扩增分泌嗜热糖苷酶的工程菌种子并经一级和二级菌种培养，当二级菌种液的OD值为0.4-0.8时，于25℃-37℃下用0.2-0.7mM的IPTG诱导嗜热糖苷酶的表达；

3）将步骤2）所获得的二级菌种液按体积比1：20-40加入到步骤1）的原料浆中，于室温下处理浆液过夜；

4）捞出浆料、煮沸、清洗、破碎，抄纸并烘烤成型。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述分泌嗜热糖苷酶的工程菌是转染了表达质粒pET-28b-0602的大肠杆菌，所述表达质粒pET-28b-0602具有如图2B所示的结构。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述农作物秸秆选自配比为1：1-10：1的玉米：小麦秸秆、4：1-9：1的香蕉叶：鱼骨树叶，1：1-5：1的香蕉叶：玉米秸秆、1：1-5：1的香蕉叶：小麦秸秆。

4.如权利要2所述的方法，其中所述分泌嗜热糖苷酶的工程菌在分解造纸浆中的应用。

5.一种分泌嗜热糖苷酶的工程菌，所述工程菌是转染了表达质粒pET-28b-0602的大肠杆菌，所述表达质粒pET-28b-0602具有如图2B所示的结构。

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