CN103209737A - 探测活性氧的修饰的氢菁染料 - Google Patents

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Abstract

本发明描述的是通过常规荧光显微镜术、荧光分光术、流式细胞仪和/或高容量成像法探测活性氧(ROS)的化合物、组合物、方法和试剂盒。本发明公开的化合物是新的还原性染料，包括Cy-基氢菁染料和Cy-基氘菁染料，所述染料是体外和/或体内探测ROS和检测氧化应激的探针。本发明也描述制备用于公开的组合物、方法和试剂盒中的新的还原性染料，即ROS探针的方法。

Description

探测活性氧的修饰的氢菁染料
发明领域
本发明涉及用于探测活性氧(reactive oxygen species, ROS)的探针，特别是涉及还原的菁染料探针(cyanine dye probes)，以及这样的探针在体外或体内的应用。
发明背景
氧化应激源于活性氧(ROS)的产生和细胞清除这样的自由基的能力之间的不平衡。氧化应激可有许多不同的通路引起，内在或外在的，或者由线粒体呼吸或者由膜-结合的NADPH氧化酶介导。ROS在多种疾病，包括，但不限于炎症、动脉粥样硬化、衰老和年龄相关性退行性紊乱的进程中起重要作用。可探测血清样品、活组织外植体、细胞培养物中和体内的ROS的探针具有医学诊断和诊断以ROS产生增加为特征的疾病的研究工具的潜在用途(1-6)。
成像术使与在小细胞中的细胞毒性和细胞凋亡相关的不同参数的多重分析、定位和定量成为可能。因此，通过常规荧光显微镜术、荧光分光术、流式细胞仪和/或高容量成像法的ROS的探测相对于其他技术可能具有优势。超氧化物和羟基，诸如二氢乙啶(dihydroethydium) (DHE)的荧光传感器已经被用作ROS探针。然而，由于其自发性自动-氧化、快速光漂白、高度毒性和与ROS的多种反应产物，DHE已经限制应用(7-8)。更有甚者，DHE的较低的发射波长使得其在体内的应用成为问题。二氢罗丹明(Dihydrorhodamine) (DHR)，已经被研究用于ROS的探测的另一种还原性染料(9)，遭受高氧化率，由此限制其应用。迄今为止，所开发的作为基于Cy3/Cy5/Cy7 (10-11)的ROS的探针的菁染料，不同程度地遭受溶解度问题和/或自动-氧化作用。磺酸酯-基染料也已经被研究用作ROS探针(12-13)。这些探针，典型地需要费时并且昂贵的多步合成程序，经历快速水解，由此限制其应用。
因此，存在对探测ROS的探针的需求，使在体外或体内使用经得起检验，而不遭受在先技术ROS探针的局限，特别是，它们倾向经历由氧和/或光催化的自发性自动-氧化，同时伴随高水平的背景荧光的产生(14-15)。
发明简述
本文描述的是通过常规荧光显微镜术、荧光分光术、流式细胞仪和/或高容量成像法探测活性氧(ROS)的化合物、组合物、方法和试剂盒。本发明化合物是新的还原性染料，包括Cy-基氢菁染料(hydrocyanine dyes)和Cy-基氘菁染料(deuterocyanine dyes)，所述染料是在体外或体内探测细胞内ROS和检测氧化应激的探针。这些探针在与其他活细胞染料，诸如，例如绿色荧光蛋白(GFP)的多重应用中是有用的，使得它们用于检测细胞毒性和细胞凋亡的多种生物标记和可被用于评价由各自不同的试剂，包括，但不限于脂多糖、甲萘醌、血管紧张素II、奈法唑酮(nefazodone)、伊屋诺霉素(ionomycin)和谷氨酸盐在多种或细胞模型中所产生的ROS。
本文公开的还原性染料，一般具膜通透性并因此可在细胞中聚集，与相应的氧化性染料相比，表现出少量或无荧光性。当与本文公开的还原性染料细胞内反应，即ROS的探测时，还原性染料由此被氧化，得到在暴露足量波长的光下具实质性荧光强度的染料。本文公开的还原性染料与例如，线粒体膜电位、质膜渗透性和/或胱天蛋白酶(caspase)激活的探针组合时，也可被用于区分肝毒性化合物与无毒性化合物。本文也描述了制备用于本发明公开的组合物、方法和试剂盒中的新的还原性染料，即ROS探针的方法。
一个实施方案提供具有结构式(I)的、新的还原性染料化合物(即ROS探针)：
Figure 766934DEST_PATH_IMAGE001
其中
Y代表形成各环具有6个原子的、一至两个稠合芳环所需的原子，其中所述Y原子选自-CH、-C、-CR1和-N(R2)β，此处β是0或1，但Y中的所述原子中不超过一个是-N(R2)β和各R1独立地为氨基、磺基、三氟甲基、羟基、卤素、羧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基，其中的各烷基部分任选被选自羧基、磺基、氨基和羟基的取代基所取代；
α是1，且α + β = 1或2；
W代表形成各环具有6个原子的、一至两个稠合芳环所需的原子，其中所述W原子选自-CH、-C、-CR1’和-N(R12)β·，此处β'是0或1，但是W中的不超过一个所述原子是-N(R12)β·和各R1’独立地为氨基、磺基、三氟甲基、羟基、卤素、羧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基，其中的各烷基部分任选被选自羧基、磺基、氨基和羟基的取代基所取代；
δ是1，且δ + β' = 1或2；
R2和R12独立地为烷氧基羰基烷基、烷氧基硫代羰基烷基、硫代烷氧基羰基烷基、链烯氧基羰基烷基、链烯氧基硫代羰基烷基、硫代链烯氧基羰基烷基、烷氧基羰基链烯基、烷氧基羰基链烯基、硫代烷氧基羰基链烯基，其中的各烷基或链烯基部分是C1-C22烷基或链烯基，其任选地插入选自N、O和S的至多6个杂原子和其中的各烷基部分任选被以下基团取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基、C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；
X是O、S、Se、-CR3R4或-NR5，其中
R3和R4独立地为C1-C22烷基或C7-C22芳基烷基，其中的各烷基部分任选地插入选自N、O和S的至多6个杂原子和其中的各烷基部分任选被以下基团取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；或R3和R4组合在一起完成五-或六元饱和或不饱和环，其任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；和
R5是H或C22-C12烷基，其任选被以下基团取代一次或多次：羟基、羧基、磺基、氨基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基；
Z是O、S、Se、-CR13R14或-NR15，其中
R13和R14独立地为C1-C22烷基或C7-C22芳基烷基，其中的各烷基部分任选地插入选自N、O和S的至多6个杂原子和其中的各烷基部分任选被以下基团取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；或R13和R14组合在一起完成五-或六-元饱和或不饱和环，其任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；和
R15是H或C1-C22烷基，其任选被以下基团取代一次或多次：羟基、羧基、磺基、氨基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基；
R21、R22、R23各自独立地为H、F、Cl、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、芳基、芳基氧基、氮杂环、亚胺离子；或R21、R22、R23的任何两个相邻的取代基，当组合在一起时，形成任选被C1-C6烷基、卤素，或羰基氧取代一次或多次的芳基或4-、5-或6-元饱和或不饱和烃环；或R21与R3和R4之一组合在一起形成任选被C1-C6烷基取代的六-元环；或R23邻接至Z，与R13和R14之一组合在一起形成任选被C1-C6烷基取代的六-元环；
R24是H或处于或者R或者S构型的D；和
n是0、1、2或3。
另一个实施方案提供探测活性氧(ROS)的组合物，该组合物包括：
a) 一个或多个本文描述的还原性染料化合物；和
b) 载体，
其中还原性染料化合物以当与ROS反应时有效探测ROS的存在的量存在。
另一个实施方案提供探测样品中活性氧(ROS)的方法，该方法包括以下步骤：
a) 使样品与有效量的本文描述的一个或多个的还原性染料化合物或本文描述的组合物接触；和
b) 测定还原性染料化合物是否已经被氧化。
另一个实施方案提供探测样品中活性氧(ROS)的试剂盒，该试剂盒包括：
a) 本文描述的一个或多个的还原性染料化合物或本文描述的组合物；和
b) 一个或多个容器。
另一个实施方案提供制备结构式(I)还原性染料化合物(即，ROS探针)的方法：
该方法包括：
a) 使结构式(II)菁染料化合物
Figure 900029DEST_PATH_IMAGE003
(II)
与NaBH4或NaBD4反应，其中:
W、X、Y、Z、R2、R12、R21、R22、R23、R24、n、α和δ如本文定义。
本发明的其他实施方案和阐述性方面、特征和优点将从下面的详述中变得显而易见。然而，应该理解，以下的详述和具体的实施例，在指示本发明优选的实施方案时，仅以阐述的方式给出。期望的是纳入本发明的精神和范畴内的多种变化和修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
图的简述
图1显示用5 μΜ Red ROS探针探测牛肺动脉内皮(BPAE)细胞中的甲萘醌-诱导的ROS形成。
图2显示用5 μΜ Red ROS探针探测RAW巨噬细胞中的脂多糖(1PS)-诱导的ROS形成。
图3显示采用5 μΜ Red ROS探针探测HepG2细胞中的奈法唑酮-诱导的ROS形成。
图4显示用500 nM PMA、100 μΜ甲萘醌或对照品处理和用5 μΜ Red ROS探针染色的活Jurkat细胞的流式细胞仪结果。
图5显示采用Far Red ROS传感器检测细胞氧化应激的结果。
图6a和图6b显示采用Far Red ROS传感器的基于荧光显微镜-探测细胞中的氧化应激。
图7显示U-2 OS细胞中Far Red ROS传感器信号的固定性(fixability)。
图8显示采用Far Red ROS传感器的细胞氧化应激的高容量成像。
图9显示用Far Red ROS传感器的HepG2细胞中氧化应激的高容量成像-基定量。
图10a和图10b显示细胞中细胞毒性和氧化应激(图10a)和细胞凋亡和氧化应激(图10b)的多重检测值(multiplexed measurements)。
图11显示用荧光板读出仪的Far Red ROS传感器信号的定量。
图12显示用Orange ROS探针探测U2-OS细胞的TBHP-诱导的ROS。
图13显示室温下2 h后Orange ROS探针的信号强度。
发明详述
本发明包括通过常规荧光显微镜术、荧光分光术、流式细胞仪和/或高容量成像探测活性氧(ROS)的化合物、组合物、方法和试剂盒。本文公开的化合物是新的还原性染料，包括Cy-基氢菁染料和Cy-基氘菁染料，所述染料是在体外或体内探测细胞中ROS和检测细胞中氧化应激的探针。本发明也提供制备用于本文描述的组合物、方法和试剂盒的本文公开的还原性染料，即ROS探针的方法。
应该理解的是，本发明并不限于具体的组合物或方法步骤，因为这样的组合物或方法是可以变化的。也应该指出，如用于本说明书和附属的权利要求书中的那样，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数称谓，除非上下文中另有明确指明。
除非另有定义，本文使用的所有技术或科学术语具有如通常本发明相关领域普通技术人员所理解的相同含义。
如在本文使用的，“还原性染料”指的是这样的染料分子，其中的一个或多个π-键已经被还原，破坏扩展的π共轭，导致表现为可忽略或无荧光性的分子。
如在本文使用的，“菁染料”指的是闭合链菁染料，即具有为环部分的末端基团的菁染料，其中的环部分可为芳族的或非-芳族和在一个或多个位置被取代或未被取代。
如在本文使用的，“还原性染料”、“还原的菁染料”、“氢菁”和“氘菁”可交换地和一般指其中亚胺阳离子已经被还原的菁染料。如在本文使用的，“氘菁”指的是已经被含氘的还原剂还原，因此将氘插入还原的分子的菁染料。以下显示还原的亚胺阳离子的实例：
Figure 108288DEST_PATH_IMAGE004
其中W、Z、R12和δ如本文定义。
如在本文使用的，“活性氧”和“ROS”可交换地指的是含氧离子、自由基、过氧化物或其组合的分子或离子。活性氧可为有机的或无机的。活性氧的实例包括，但不限于超氧化物；自由基，诸如羟基自由基和过氧化基；过氧化物、单态氧(singlet oxygen)、臭氧、一氧化氮；阴离子，诸如羟基阴离子和超氧化物阴离子；次氯酸(hypochlorus acid)；和过氧亚硝酸根阴离子(peroxynitrites)以及任何这样的活性氧的组合。
如在本文使用的，“膜通透性”指的是可通过被动扩散进入细胞的分子。
如在本文使用的，“烷基芳基”指的是被芳基(如芳族基团或杂芳族基团)取代的烷基。
如在本文使用的，“烷基”指的是任选为直链或支链和饱和的烃。类似地，过氟代烷基、烷氧基、烷基硫基、单烷基氨基、二烷基氨基或烷基酰胺基的烷基部分任选为直链或支链和饱和的。
如在本文使用的，“芳基”指的是具有单环或多重稠合环的芳族部分，其中的各环任选和独立地被以下基团取代：H、卤素、氰基、叠氮基、磺酸、磺酸的碱金属或铵盐、羧酸、羧酸的生物可相容的盐、硝基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烷基硫基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基或烷基酰胺基。
如在本文使用的，“杂芳基”指的是任选稠合至一个额外的六-元芳环或稠合至一个5-或6-元杂芳环的5-或6-元芳族杂环，所述杂芳环含1-3个选自O、N和S (以任何组合)的杂原子。任何杂芳基取代基以单键连接并任选和独立地被H、卤素、具有1-6个碳的烷基或具有1-6个碳的烷氧基取代一次或多次。杂芳基取代基的选择性实例为吡咯、噻吩或呋喃(单个环、单个杂原子)、噁唑、异噁唑、噁二唑或咪唑(单个环、多个杂原子)。多环杂芳基的实例包括苯并噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑(多个环、多个杂原子)、苯并呋喃或吲哚(多个环、单个杂原子)。
如在本文使用的，“药学上可接受的盐”或“生物学可相容的盐”是不如使用的那样具毒性和对生物分子不具有实质有害作用的相反离子。这样的盐的实例，除了别的以外，包括K+、Na+、Cs+、Li+、Ca++、Mg++、Cl-、AcO-和烷基铵或烷氧基铵盐。
如在本文使用的，“烷氧基”指的是基团-O-烷基，其中烷基按本文定义。烷氧基包括，例如甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、异丙氧基、正-丁氧基、叔-丁氧基、仲-丁氧基和正-戊氧基。
如在本文使用的，“链烯基”指的是具有从2至22个碳原子，优选2至4个碳原子和具有至少1个且优选从1至2个链烯基不饱和部位的链烯基。这样的基团以，例如乙烯基、烯丙基和丁-3-烯-1-基为示例。
如在本文使用的，“链烯氧基”指的是基团-O-链烯基，其中链烯基按本文定义。链烯氧基包括，例如乙烯氧基、烯丙氧基、1-丁烯氧基、2-丁烯氧基、2-戊烯氧基、3-戊烯氧基、4-戊烯氧基。
如在本文使用的，“杂环”或“杂环的”或“杂环烷基”或“杂环基”指的是具有单个环或多个稠合环的饱和的或不饱和的基团，包括稠合的桥接的和螺接环系统，所述环中有从1至10个碳原子和选自氮、硫或氧的从1至4个杂原子，其中，在稠合的环系统中，一个或多个环可为环烷基、芳基或杂芳基，条件是连接点穿过非-芳环。在一个实施方案中，杂环基的氮和/或硫原子(s)任选被氧化以提供为N-氧化物、亚磺酰基、磺酰基部分。
如在本文使用的，“磺基”指的是磺酸或磺酸酯。
如在本文使用的，“卤素”指的是氟、氯、溴或碘。
如在本文使用的，“Red ROS探针”、“Red ROS染料”、“Red ROS传感器(sensor)”和“Far Red ROS传感器”可交换地指新的本文公开的还原性染料化合物，该化合物分别在640 nm和665 nm具有峰值激发和发射，且是在体外或体内探测细胞中活性氧(ROS)和检测氧化应激的探针。
如在本文使用的，“Orange ROS探针”、“Orange ROS染料”和“Orange ROS传感器”可交换地指新的本文公开的还原性染料化合物，该化合物分别在540nm和565nm具有峰值激发和发射，且是在体外或体内探测细胞中活性氧(ROS)和检测氧化应激的探针。
如在本文使用的，术语“染料”指的是发射光以产生可观察到的可探测的信号的化合物。
本文公开的化合物可以非溶剂化形式(unsolvated forms)以及溶剂化形式包括水合形式存在。这些化合物可以多种结晶形式或无定形形式存在。一般地，对于本文描述的应用而言，所有的物理形式是等价的，并且意欲纳入本发明的范畴内。本文公开的化合物可拥有不对称碳原子(即手性中心)或双键；本文描述的化合物的外消旋物、非对映体、几何异构体和单个的异构体纳入本发明的范畴内。可将本文描述的化合物制备为单个异构体或作为异构体的混合物。
一个实施方案提供具有结构式(I)的、新的还原性染料化合物(即ROS探针)：
Figure 922660DEST_PATH_IMAGE005
其中
Y代表形成各环具有6个原子的、一至两个稠合芳环所需的原子，其中所述Y原子选自-CH、-C、-CR1和-N(R2)β，此处β是0或1，但Y中的所述原子中不超过一个是-N(R2)β且每个R1独立地为氨基、磺基、三氟甲基、羟基、卤素、羧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基，其中的各烷基部分任选被选自羧基、磺基、氨基和羟基的取代基所取代；
α是1，且α + β = 1或2；
W代表形成各环具有6个原子的、一至两个稠合芳环所需的原子，其中所述W原子选自-CH、-C、-CR1’和-N(R12)β'，此处β'是0或1，但是W中不超过一个所述原子是-N(R12)β'且每个R1’独立地为氨基、磺基、三氟甲基、羟基、卤素、羧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基，其中的各烷基部分任选被选自羧基、磺基、氨基和羟基的取代基所取代；
δ是1，且δ + β' = 1或2；
R2和R12独立地为烷氧基羰基烷基、烷氧基硫代羰基烷基、硫代烷氧基羰基烷基、链烯氧基羰基烷基、链烯氧基硫代羰基烷基、硫代链烯氧基羰基烷基、烷氧基羰基链烯基、烷氧基羰基链烯基、硫代烷氧基羰基链烯基，其中的各烷基或链烯基部分是C1-C22烷基或链烯基，其任选地插入选自N、O和S的最多至6个杂原子，且其中的每个烷基部分任选被以下基团取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基、C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；
X是O、S、Se、-CR3R4或-NR5，其中
R3和R4独立地为C1-C22烷基或C7-C22芳基烷基，其中的各烷基部分任选地插入选自N、O和S的最多至6个杂原子，且其中的每个烷基部分任选被以下基团取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；或R3和R4组合在一起完成五-或六元饱和或不饱和环，其任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；和
R5是H或C1-C22烷基，其任选被以下基团取代一次或多次：羟基、羧基、磺基、氨基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基；
Z是O、S、Se、-CR13R14或-NR15，其中
R13和R14独立地为C1-C22烷基或C7-C22芳基烷基，其中的各烷基部分任选地插入选自N、O和S的最多至6个杂原子，且其中的每个烷基部分任选被以下基团取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；或R13和R14组合在一起完成五-或六元饱和或不饱和环，其任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；和
R15是H或C1-C22烷基，其任选被以下基团取代一次或多次：羟基、羧基、磺基、氨基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基；
R21、R22、R23各自独立地为H、F、Cl、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、芳基、芳基氧基、氮杂环、亚胺离子；或R21、R22、R23的任何两个相邻的取代基，当组合在一起时，形成任选被C1-C6烷基、卤素，或羰基氧取代一次或多次的芳基或4-、5-或6-元饱和或不饱和烃环；或R21与R3和R4之一组合在一起形成任选被C1-C6烷基取代的六-元环；或R23邻接至Z，与R13和R14之一组合在一起形成任选被C1-C6烷基取代的六-元环；
R24是H或处于或者R或者S构型的D；和
n是0、1、2或3。
本文公开的还原性染料，一般为膜通透性并因此可聚集于细胞中，相比于相应的氧化的染料，表现较少甚或无荧光性。当在细胞内反应，即，ROS的探测时，本文公开的还原性染料被氧化，由此获得在暴露于足量波长的光时具有足够荧光性强度的染料。本文公开的还原性染料，在与例如，线粒体膜电位、胞浆膜渗透性和/或胱天蛋白酶激活的探针组合时，可被用于区分肝毒性化合物与无毒性化合物。
在一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并吡咯的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的吲哚的第二个杂环系统。在另一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的吲哚的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的氮杂吲哚(azabenzazole) (该环插入两个或更多个氮原子)的第二个杂环系统。在又一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噁唑的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的吲哚的第二个杂环系统。在还一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噁唑的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噁唑的第二个杂环系统。
在一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的氮杂吲哚的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环形成为取代的氮杂吲哚的第二个杂环系统。在另一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噻唑的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的氮杂吲哚的第二个杂环系统。在又一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噻唑的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的吲哚的第二个杂环系统。在还一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噻唑的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噻唑的第二个杂环系统。
在一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并咪唑的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的吲哚的第二个杂环系统。在另一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并咪唑的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的氮杂吲哚(该环插入两个或更多个氮原子)的第二个杂环系统。在又一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噁唑的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并咪唑的第二个杂环系统。
在一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的氮杂吲哚的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的吲哚的第二个杂环系统。在另一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的吲哚的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噁唑的第二个杂环系统。在又一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的氮杂吲哚的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噻唑的第二个杂环系统。在还一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的吲哚的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噻唑的第二个杂环系统。在另一个实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噁唑的第一个杂环系统，而W和与之相连接的杂环5-元环可形成为取代的苯并噻唑的第二个杂环系统。
第一个和第二个杂环系统以及整合R21、R22、R23的聚次甲基连接基(polymethine linker)，任选被多种取代基进一步所取代，或与任选被进一步取代的额外的环稠合，该取代微调(fine tunes)得到的还原性染料化合物的吸收和发射光谱，并且，间接地微调相应的氧化的(通过ROS)染料化合物。适当的聚次甲基连接基的实例之前已在专利文献中描述，包括插入非氢取代基、环结构和硬化元素(rigidizing elements)的聚次甲基连接基部分(参见美国专利号，Ollmann, Jr (1998)的5,831,098；Patonay等.(2000)的6,086,737；Waggoner (2000)的6,048,982；和Lee等.(1995)的5,453,505；Middendorf等.(1997)的5,639,874；Lincoln等(1975)的3,864,644；Simson (1977)的4,011,086；所有这些均通过参考结合于本文)。
在一个示例性实施方案中，本发明的还原性染料化合物具有结构式(III)：
Figure 745123DEST_PATH_IMAGE006
(III)
其中W、Y、R2、R12、R21、R22、R23、R24、n、α和δ如本文定义。
在另一个示例性实施方案中，本发明的还原性染料化合物具有结构式(IV)：
Figure 74473DEST_PATH_IMAGE007
(IV)
其中W、Y、R2、R5、R12、R15、R21、R22、R23、R24、n、α和δ如本文定义。
在另一个示例性实施方案中，本发明的还原性染料化合物具有结构式(V)：
Figure 273373DEST_PATH_IMAGE008
(V)
其中W、Y、R2、R12、R21、R22、R23、R24、n、α和δ如本文定义。
在另一个示例性实施方案中，本发明的还原性染料化合物具有结构式(VI)：
Figure 253836DEST_PATH_IMAGE009
其中W、Y、R2、R3、R4、R12、R13、R14、R21、R22、R23、R24、n、α和δ如本文定义。
结构式(I)中W、X、Y和Z部分，以及诸杂环系统之间的聚次甲基桥接的长度的选择，具有对本文公开的还原性染料化合物的吸收和荧光发射特性的作用。W和Y可相同或不同，X和Z可相同或不同，而得到的还原性染料化合物的光谱特性可通过仔细选择W、X、Y和Z而相应地调整。在一个示例性实施方案中，X是-CR3R4和Z是O、S、Se、-CR13R14或-NR15之一，此处R3、R4、R13、R14和R15如本文定义。在另一个示例性实施方案中，X是O、S、Se、-CR3R4或-NR5之一和Z是-CR13R14，此处R3、R4、R5、R13、R14如本文定义。典型地，X和Z分别是-CR3R4和-CR13R14。
例证性还原性染料化合物，分别阐述结构式(I)的第一个和第二个杂环系统中的Y和W多种组合，其各个组合预期纳入本发明范畴，以结构式VII-XXII (其中X、Z、R2、R12、R21-R24和n如本文定义)显示；为简单起见，所有芳环取代基显示为氢：
(X)
(XIII)
(XIV)
Figure 137293DEST_PATH_IMAGE013
(XV)
Figure 567137DEST_PATH_IMAGE014
(XVI)
Figure 871080DEST_PATH_IMAGE015
(XVII)
Figure 146203DEST_PATH_IMAGE016
(XVIII)
Figure 101258DEST_PATH_IMAGE017
(XIX)
Figure 498742DEST_PATH_IMAGE018
(XX)
Figure 227663DEST_PATH_IMAGE019
(XXI)
Figure 181844DEST_PATH_IMAGE020
(XXII)
在优选的实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环形成取代的吲哚环，W和与之相连接的杂环5-元环形成取代的吲哚环，且X和Z分别是-CR3R4和-CR13R14，如在结构式(XXIII)中显示的那样：
Figure 14843DEST_PATH_IMAGE021
(XXIII)
其中R2-R4、R12-R14、R21-R24和n如本文定义和R6-R9和R16-R19独立地为H、氨基、磺基、三氟甲基、羟基、卤素、羧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基，其中的各烷基部分任选被选自羧基、磺基、氨基和羟基的取代基取代。在特别优选的实施方案中，R3、R4、R13和R14独立地为C1-C22烷基，R2和R12独立地为甲氧基羰基烷基、乙氧基羰基烷基或丙氧基羰基烷基和n是1或2。
在另一个优选的实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环形成取代的吲哚环、W和与之相连接的杂环5-元环形成取代的氮杂吲哚环，且X和Z分别是-CR3R4和-CR13R14，如在结构式(XXIV)中显示的那样：
Figure 786490DEST_PATH_IMAGE022
(XXIV)
其中R2-R4、R12-R14、R21-R24和n如本文定义，及R6-R9和R16-R18独立地为H、氨基、磺基、三氟甲基、羟基、卤素、羧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基，其中的各烷基部分任选被选自羧基、磺基、氨基和羟基的取代基所取代。在特别优选的实施方案中，R3、R4、R13和R14独立地为C1-C22烷基，R2和R12独立地为甲氧基羰基烷基、乙氧基羰基烷基或丙氧基羰基烷基和n是1或2。
在还一个优选的实施方案中，Y和与之相连接的杂环5-元环形成取代的氮杂吲哚环、W和与之相连接的杂环5-元环形成取代的氮杂吲哚环，且X和Z分别是-CR3R4和-CR13R14，如在结构式(XXV)中显示的那样：
Figure 799446DEST_PATH_IMAGE023
(XXV)
其中R2-R4、R12-R14、R21-R24和n如本文定义，及R6-R8和R16-R18独立地为H、氨基、磺基、三氟甲基、羟基、卤素、羧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基，其中的各烷基部分任选被选自羧基、磺基、氨基和羟基的取代基所取代。在特别优选的实施方案中，R3、R4、R13和R14独立地为C1-C22烷基，R2和R12独立地为甲氧基羰基烷基、乙氧基羰基烷基或丙氧基羰基烷基和n是1或2。
本文公开的还原性染料化合物或者是氢菁或者是氘菁，两个类型都适于本文描述的组合物、应用方法和试剂盒。这些还原性染料展示对自动-氧化的增强的稳定性，具有可调的发射波长和对ROS的纳摩尔至毫摩尔敏感性。此外，给定的氘菁的氧化产生如其氢菁类似物一样完全同样的菁，由此使得这些探针将会与现成的ROS传感器的方案被交互应用。虽然与在先技术的ROS探针，诸如DHE相比，本文公开的氢菁染料表现出在水性溶液中对自动氧化的改善的稳定性，它们在细胞培养物中的背景氧化超过相应的氘菁染料的背景氧化，氘菁染料可展示出对自动氧化的更大的稳定性，并由此表现出更低水平的背景荧光性。不愿受理论的束缚，该作用的科学基础是当在反应的速率决定步骤中C-H键断裂时，氘对氢的取代可导致氘相对于氢的大约2-10倍速率的减速；此已知为主要的动力学同位素效应(16)。因此，在氢菁分子中的适当位置的氘取代将会使得分子变得对自发性氧化(空气，在储存时等)更稳定，原因是该相对减慢的反应速率减速，而同时仍然允许在实际的ROS感应事件中有适当的反应性，在该ROS感应事件中H和D之间的速率差异相对于氧化事件速率而言将是微小的(miniscule)。
另一个实施方案提供探测活性氧(ROS)的组合物，该组合物包括：
a) 一个或多个本文描述的还原性染料化合物；和
b) 载体，
其中还原性染料化合物以当与ROS反应时有效探测ROS的存在的量存在。
本文公开的还原性染料化合物典型地在室温下是固体。因此，该化合物一般将溶解或悬浮于载体中作为组合物使用或给药。将要使用的还原性染料的确切浓度取决于试验条件和想要的结果，而试验条件的最优化典型地需要测定在给定应用中将要使用的还原性染料的最佳浓度。还原性染料的浓度典型地在纳摩尔至毫摩尔范围，优选纳摩尔至微摩尔范围内。由本领域已知的、在可比较的条件下用于类似化合物的方法，易于确定想要的光学响应的还原性染料浓度。
典型地，对于体内使用，还原性染料的浓度为在合理的时间内得到可探测样品中信号以及最小背景荧光所需要的最小量。将要使用的还原性染料的确切浓度取决于试验条件和想要的结果。在一个实施方案中，染料的量从约50 μg/kg至约50 g/kg，优选从约50 μg/kg至约10 g/kg，更优选从约50 μg/kg至约1 g/kg，最优选从约50 μg/kg至约0.1 g/kg。
对于体内使用，典型地将本化合物与一个或多个载体合并。如在本文使用的，“载体”指的是存在于组合物中的除了还原性染料之外的所有组分。术语“载体”包括，但不限于溶剂、助悬剂、分散剂、缓冲剂、pH调节剂、等渗性调节剂、防腐剂、抗微生物剂、添加剂、赋形剂及其组合。添加剂包括那些用于加工或制备组合物的物质、那些可帮助组合物的掺和或稳定的物质或那些可用于修饰组合物的性能的物质。赋形剂包括任意多个其他的医学上或药学上可接受的试剂，诸如防腐剂、脂质、脂肪酸、蜡、表面活性剂、塑化剂、致孔剂(porosigen)、抗氧化剂、填充剂、缓冲剂、螯合剂、共溶剂、水溶性试剂、不溶性试剂、金属阳离子、阴离子、盐、渗透剂、合成聚合物、生物聚合物、亲水聚合物、多醣、醣、疏水聚合物、亲水聚合物，及其组合。
对于体内应用，可通过多种途径给予该制剂。典型地，将本化合物配制成经胃肠外给药的，包括，但不限于静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、真皮内、输注、结膜下和导管内(如，aurologic传递)以及经由外置镜像(external scopic)技术，诸如，例如关节镜或内窥镜技术给药。
可将本文公开的组合物给予具体的位置(如，局部传递)，包括，但不限于鞘内、心脏内、骨内(如，骨髓)、立体定向引导传递、输注传递、CNS传递、趋触性(stereo-tactically)给药传递、整形外科的传递(如，传递至关节或进入骨)、心血管传递、眼内、眼中和眼侧部(inter-, intra- and para-ocular)传递(包括玻璃体内和巩膜、眼球后和sub-tenous传递)以及传递至任何多个其他位置、局部、器官等。
对于体内应用，典型地，与细胞接触的还原性染料的浓度从约1 μΜ至约100 μΜ。然而，可基于将要进行的分析易于调节具体浓度。一般地，将本文公开的还原性染料化合物溶解或悬浮于适于意欲的应用的适当的溶剂中。适宜的溶剂包括，但不限于水性溶剂，诸如水、PBS、盐水、有机溶剂，诸如DMSO和醇，及其组合。本文公开的还原性染料也可或备选地被包囊在多种纳米结构中以改善细胞传递。适宜纳米结构包括，但不限于脂质体、微粒，诸如聚合物微粒和胶束，诸如由嵌段共聚物形成的聚合物胶束。
另一个实施方案提供探测样品中活性氧(ROS)的方法，该方法包括以下步骤：
a) 使样品与有效量的一个或多个本文描述的还原性染料化合物或本文描述的组合物接触；和
b) 测定还原性染料化合物是否已经被氧化。
本文公开的还原性染料化合物可被用作诊断工具，以评价或探测以在体内产生或过度产生ROS为特征的多种疾病和紊乱或疾病或紊乱的标记物，或在体外探测或定量样品中的ROS。依据应用的不同，可采用荧光分光术或荧光显微镜检测由氧化性染料发射的荧光，所述染料是在本文公开的还原性染料与ROS反应时产生的。荧光显微镜法的例证性方法包括，但不限于共焦激光扫描显微法、全内反射荧光显微镜术、经由荧光的组织学分析、流式细胞仪、采用读出仪，诸如荧光性微滴定板读出仪的分析、标准或小型荧光计或表面荧光显微镜。
在一个实施方案中，本文公开的还原性染料化合物和含那些染料的组合物，可被用作体内诊断工具，以评价或探测以产生或过度产生ROS为特征的多种疾病和紊乱。例证性疾病和紊乱包括，但不限于颈动脉损伤、动脉粥样硬化、高血压、癌症、以炎症为特征的疾病和紊乱、辐射诱发的晚期正常组织的损伤、由于化疗引起的组织损伤、缺血或移植后再灌注、糖尿病，诸如I型糖尿病(TID)、神经退行性疾病，诸如阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)和亨廷顿氏舞蹈病(Huntington's disease)；脑血管疾病、囊性纤维化、慢性肾病、心血管疾病、先兆子痫、眼科疾病(即眼部的疾病) (17-20)。除此之外，本文公开的还原性染料化合物还可被用于正电子发射断层扫描术(PET)作为造影剂、生物分子的成像和光声学成像，它们各自在WO 2009/121055 A1中描述，该项公开通过参考结合于本文。
在另一个实施方案中，本文公开的还原性染料化合物和含那些染料的组合物，可被用于多种活体外或离体分析。例如，还原性染料可被用于单个细胞成像术或分析细胞悬浮液，在此期间通过与细胞一起孵育足够的时间段将染料(s)加至细胞中。具体的分析包括，但不限于那些用活体器官培养物的分析以及细胞培养分析。
使用本文公开的还原性染料的一般程序如下：在体内或体外给予一个或多个还原性染料以使与生物样品，即，细胞、细胞培养物、组织、器官、血清、体液、生物流体等接触。依据分析的不同，可将本文公开的一个或多个还原性染料与一种或多种载体配制。将还原性染料(s)与样品一起孵育足以使还原性染料与存在于样品中的活性氧(ROS)反应的时期。在该段时间之后，分析样品的荧光强度。将孵育后的荧光强度与还原性染料的荧光强度作比较。生物样品中染料的荧光强度的增加指示染料的氧化并因此存在活性氧(ROS)。可采用以上列出的技术检测或探测增加的荧光性。
另一个实施方案提供探测样品中活性氧(ROS)的试剂盒，该试剂盒包括：
a) 一个或多个本文描述的的还原性染料化合物或本文描述的组合物；和
b) 一个或多个容器。
如在本文使用的，术语“试剂盒”指的是相关组分，典型地一个或多个化合物或组合物的包装组件。本文公开的试剂盒包括本文描述的一个或多个的还原性染料化合物、一个或多个适宜体外或体内应用的载体和一个或多个存储一个或多个还原性染料和/或一个或多个载体，诸如溶剂、缓冲剂、稳定剂、pH调节剂等的容器。试剂盒任选含使用说明书，教导如何制备一个或多个还原性染料或如何制备含一个或多个还原性染料的组合物、如何给予染料或含染料的组合物和如何探测染料的氧化(如，激发波长和发射波长)。在优选的实施方案中，试剂盒包含实施探测一个或多个活性氧(ROS)的存在的测定的说明书。试剂盒还可含一个或多个器材以给予染料或含染料的组合物，所述器材包括，但不限于注射器、吸管、吸球(pipette bulbs)、刮刀(spatulas)、小瓶、注射针，及其多种不同的组合。
一般通过用还原剂使相应的菁染料还原，制备适宜于本文描述的组合物、使用方法和试剂盒的本文公开的还原性染料。例如，可从它们相应的菁染料经由一步还原法，采用还原剂，诸如硼氢化钠(NaBH4)或硼氘化钠(NaBD4)，合成本文公开的氢菁和氘菁染料。相比于它们相应的菁染料而言，本文公开的还原性染料表现出很少的荧光性或者无荧光性(由于破坏的π-共轭)。然而，当与ROS反应时，还原性染料被氧化(重新产生具有延伸的π-共轭的菁染料)，由此获得当暴露于足量波长的光时荧光强度足够增强。生产多种菁染料的方法在美国专利号6,977,305、7,566,790、7,671,2147和790,893中描述，所述专利通过参考结合于本文。
另一个实施方案提供制备结构式(I)还原性染料化合物(即，ROS探针)的方法：
Figure 681951DEST_PATH_IMAGE024
(I)
该方法包括：
a) 使结构式(II)的菁染料化合物
(II)
与NaBH4或NaBD4反应，其中：
W、X、Y、Z、R2、R12、R21、R22、R23、R24、n、α和δ如本文定义。
在一个这样的方法的示例性实施方案中，如在流程I中显示的那样制备结构式(I)化合物：
流程I
Figure 790033DEST_PATH_IMAGE026
其中R21、R22、R23各自为H，n是2和W、X、Y、Z、R2、R12和R24如本文定义。
在一个实施方案中，当X =-CR3R4，Z =-CR13R14、R3、R4、R13和R14各自独立地为C1-C22烷基和Y = W =苯基时，用4-溴丁酸乙酯(R2-Br = R12-Br)使2,3,3-三烷基-3H-吲哚(a和b)烷基化，产生相应的吲哚盐(c和d)。后续的与1,1,3,3-四甲氧基丙烷在吡啶中的反应获得结构式(II)化合物，于是用硼氢化钠或硼氘化钠(sodium borodeuteride)还原得到结构式(I)化合物。
在这样的方法的另一个示例性实施方案中，如在流程II中显示的那样制备结构式(I)化合物：
流程II
Figure 710901DEST_PATH_IMAGE028
其中R21、R22、R23各自为H，n是1和W、X、Y、Z、R2、R12和R24如本文定义。
在一个实施方案中，当X =-CR3R4、Z =-CR13R14、R3、R4、R13和R14各自独立地为C1-C22烷基和Y = W =苯基时，用4-溴丁酸乙酯(R2-Br = R12-Br)使2,3,3-三烷基-3H-吲哚(a和b)烷基化，产生相应的吲哚盐(c和d)。后续的与原甲酸三甲酯在吡啶中的反应得到结构式(II)化合物，于是用硼氢化钠或硼氘化钠还原得到结构式(I)化合物。
以上已经对本发明提供详细描述，为了阐述本发明的目的，给出以下的实施例，其不应该被解释为限制本发明或权利要求书的范畴。
实施例
还原性染料化合物(ROS探针)的化学合成
本文公开的还原性染料(ROS探针)的制备：
化合物( 4a )和( 4b )
流程III
4a，X= H
4b，X= D
1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚
Figure 533735DEST_PATH_IMAGE027
溴化物(2)的合成
Figure 820360DEST_PATH_IMAGE030
2
将2,3,3-三甲基伪吲哚(trimethylindolenine) (2.6 g, 16.3 mmol)和4-溴丁酸乙酯(18.8 g, 96.3 mmol)的混合物于120℃加热17 h。使得到的溶液冷却至室温。然后在边剧烈搅动下用5分钟将其缓慢加至大约100 mL的乙酸乙酯中。过滤、用乙酸乙酯洗涤和真空下干燥，得到想要的白色固体样化合物( 2 ) (4.1 g, 73 %得率)。TLC: Rf = 0.60 (硅胶，5 %甲醇在氯仿中)。1H NMR (DMSO-d6): δ 8.10 (d, 1H), 7,98 (d, 1H), 7.65 (dd, 2H), 4.47 (t, 2H), 4.04 (q, 2H), 2.83 (s, 3H), 2.59 (t, 2H), 2.10-2.05 (m, 2H), 1.54 (s, 6H), 1.16 (t, 3H)。
1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-((1E,3E,4E)-5-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯基-3,3-二甲基-3H-吲哚
Figure 694906DEST_PATH_IMAGE027
溴化物(3)的合成
Figure 979257DEST_PATH_IMAGE031
3
将1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚溴化物( 2 , 4.0 g, 11.3 mmol)和1,1,3,3-四甲氧基丙烷(3.71 g, 22.6 mmol)于吡啶(50 mL)中的混合物于90℃搅拌2.5 h。使其冷却至室温和减压下去除绝大部分吡啶。得到的残余物经硅胶柱色谱法纯化，先用在氯仿中的30 %乙酸乙酯，然后用在氯仿中的10 %甲醇洗脱，得到蓝色固体样想要的产物( 3 ) (1.72 g, 23 %得率)。TLC: Rf = 0.20 (硅胶，10 %甲醇在氯仿中)。
Figure 793684DEST_PATH_IMAGE032
吸收峰值在：643 nm在乙醇中，发射峰值在：664 nm。
1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯基)吲哚啉(4a)的合成
Figure 975267DEST_PATH_IMAGE033
4a
向1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-((1E,3E,4E)-5-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯基-3,3-二甲基-3H-吲哚
Figure 164940DEST_PATH_IMAGE027
溴化物( 3 , 100 mg, 0.15 mmol)于甲醇(2 mL)的溶液中，缓慢加入硼氢化钠(20 mg, 0.53 mmol)并将反应混合物于冰水浴温度搅动15 min。用乙酸乙酯(40 mL)稀释和用水(20 mL)洗涤反应混合物。分离的有机层经Na2SO4干燥和过滤。溶剂蒸发后，粗产物经硅胶柱色谱法纯化，用在己烷中的10 %乙酸乙酯洗脱，得到想要的产物( 4a , 71 mg, 81 %得率)。TLC: Rf = 0.21 (硅胶，10 %乙酸乙酯在己烷中)。
Figure 127080DEST_PATH_IMAGE034
(s, t, 9H，重叠在一起的甲基峰的一个单峰和两个三重峰), 1.04 (s, 3H)。吸收峰值在：361 nm于甲醇中。
1-(4-乙氧基-4-氧代丁基-2-氘-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯基)吲哚啉(4b)的合成
Figure 568556DEST_PATH_IMAGE035
4b
向1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-((1E,3E,4E)-5-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯基-3,3-二甲基-3H-吲哚
Figure 870225DEST_PATH_IMAGE027
溴化物( 3 , 42 mg, 0.06 mmol)于甲醇(2 mL)的溶液中，缓慢加入硼氘化钠(13 mg, 0.30 mmol)，并将反应混合物于冰水浴温度搅动15 min。用乙酸乙酯(30 mL)稀释和用水(20 mL)洗涤反应混合物。分离的有机层经Na2SO4干燥和过滤。溶剂蒸发后，粗产物经硅胶柱色谱法纯化，用在己烷中的10 %乙酸乙酯洗脱，得到想要的产物( 4b , 30 mg, 71 %得率)。TLC: Rf = 0.20 (硅胶，10 %乙酸乙酯在己烷中)。1H NMR (CD3OD)；δ 7.18-6.40 (m, 9Η), 6.18-6.05 (m 2Η), 5.52 (d, 1Η), 5.43 (d, 1Η), 4.17-4.08 (m, 4Η), 3.72-3.69 (m, 2Η), 3.18-3.03 (m, 3Η), 2.44-2.37 (m, 4Η), 1.98-1.84 (m, 4Η), 1.32 (s, 6Η), 1.33-1.22 (s, t, 9Η，重叠在一起的甲基峰的一个单峰和两个三重峰), 1.04 (s, 3Η)。
还原性染料化合物(ROS探针)的化学合成
本文公开的还原性染料(ROS探针)的制备：
化合物( 6a )和( 6b )
流程IV
Figure 542383DEST_PATH_IMAGE036
6a，X = H
6b，X = D
1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-2-((1E,3E)-3-(1-4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯基)-3,3-二甲基-3H-吲哚
Figure 929502DEST_PATH_IMAGE027
溴化物(5)的合成
Figure 361621DEST_PATH_IMAGE037
5
将1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚
Figure 252216DEST_PATH_IMAGE027
溴化物( 2 , 0.72 g, 2.0 mmol)和原甲酸三甲酯(2.0 g, 20 mmol)于吡啶(20 mL)中的混合物于90℃搅动2 h。使其冷却至室温并在减压下去除绝大部分吡啶。残余物经硅胶柱色谱法纯化，先用在氯仿中的30 %乙酸乙酯，然后用在氯仿中的10 %甲醇洗脱，得到想要的红色固体样产物( 5 ) (0.26 g, 21 %得率)。TLC: Rf = 0.18 (硅胶，10 %甲醇在氯仿中)。1H NMR 
。
1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E)-3-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯基)吲哚啉(6a)的合成
Figure 471156DEST_PATH_IMAGE039
6a
向1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-((1E,3E,4E)-5-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯基-3,3-二甲基-3H-吲哚
Figure 644649DEST_PATH_IMAGE027
溴化物( 5 , 21 mg, 0.03mmol)于甲醇(1 mL)的溶液中，缓慢加入硼氢化钠(7 mg, 0.50 mmol)并将反应混合物于冰水浴温度搅动15 min。用氯仿(10 mL)稀释和用水(10 mL)洗涤反应混合物。分离的有机层经Na2SO4干燥和过滤。溶剂蒸发后，粗产物经硅胶柱色谱法纯化，用在己烷中的10 %乙酸乙酯洗脱，得到想要的产物( 6a , 16 mg, 80 %得率)。TLC: Rf = 0.20 (硅胶，10 %乙酸乙酯在己烷中)。
1-(3-羧基丙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-
Figure 655330DEST_PATH_IMAGE027
溴化物(7)的合成
Figure 685603DEST_PATH_IMAGE040
将2,3,3-三甲基伪吲哚(3.0 g, 18.8 mmol)和4-溴丁酸(18.0 g, 107.8 mmol)的混合物于120℃加热18 h。使反应混合物冷却至室温。然后在边剧烈搅动下，经5分钟将其缓慢加至大约100 mL的乙酸乙酯中。过滤得到的固体，用乙酸乙酯洗涤和真空下干燥，得到想要的化合物( 7 )。
1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-
Figure 781735DEST_PATH_IMAGE027
溴化物(8)的合成
Figure 804923DEST_PATH_IMAGE041
向1-(3-羧基丙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物( 7 , 3.5 g, 10.7 mmol)于无水DMF (20 mL)的溶液中，加入无水K2CO3 (1.6 g, 11.6 mmol)和四丁基溴化铵(0.7 g, 2.2 mmol)，随后逐滴添加烯丙基溴(3.7 mL, 42.8 mmol)。于室温搅动混合物1小时，然后真空下浓缩。用水(20 mL)稀释和用氯仿(3 x 20 mL)提取得到的残余物。连续用10 % HBr、5 % NaHCO3和饱和的NaBr溶液洗涤合并的有机层。然后经Na2SO4干燥、过滤和真空下浓缩，得到化合物( 8 )。
1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-2-((1E,3E)-3-(1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-
Figure 808968DEST_PATH_IMAGE027
溴化物(9)的合成
Figure 267763DEST_PATH_IMAGE042
将1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-
Figure 517478DEST_PATH_IMAGE027
溴化物( 8 , 3.0 g, 8.2 mmol)和原甲酸三甲酯(8.7 g, 81.9 mmol)于吡啶(20 mL)中的混合物于90℃搅动2 h。使其冷却至室温和减压下去除绝大部分吡啶。到的残余物经硅胶柱色谱法纯化，先用在氯仿中的30 %乙酸乙酯，然后用在氯仿中的5 %甲醇洗脱，得到想要的产物( 9 )。
4-((E)-2-((E)-3-(1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-基)烯丙叉)-3,3-二甲基吲哚啉-1-基)丁酸烯丙酯(10)的合成
Figure 565069DEST_PATH_IMAGE043
向1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-2-((1E,3E)-3-(1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-
Figure 874828DEST_PATH_IMAGE027
溴化物( 9 , 50 mg, 0.08 mmol)于甲醇(1 mL)的溶液中，缓慢加入硼氢化钠(20 mg, 0.53 mmol)并于冰水浴温度下搅动反应混合物15 min。用氯仿(20 mL)稀释和用水(10 mL)洗涤反应混合物。分离的有机层经Na2SO4干燥和过滤。真空下溶剂蒸发后，粗产物经硅胶柱色谱法纯化，用在己烷中的10 %乙酸乙酯洗脱，得到想要的产物( 10 )。
(E)-1-(4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-
Figure 945552DEST_PATH_IMAGE027
溴化物(11)的合成
Figure 310543DEST_PATH_IMAGE044
将2,3,3-三甲基伪吲哚(2.0 g, 12.5 mmol)和4-溴巴豆酸乙酯(13.5 g, 69.9 mmol)的混合物于120℃加热18 h。使反应混合物冷却至室温。然后在边剧烈搅动下，经5分钟将其缓慢加至大约100 mL的乙酸乙酯中。过滤得到的固体，用乙酸乙酯洗涤和真空下干燥，得到想要的化合物( 11 )。
1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-2-((1E,3E)-3-(1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-
Figure 150323DEST_PATH_IMAGE027
溴化物( 12 )的合成
将(E)-1-(4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-
Figure 985741DEST_PATH_IMAGE027
溴化物( 11 , 1.2 g, 3.4 mmol)和原甲酸三甲酯(3.6 g, 33.9 mmol)于吡啶(20 mL)中的混合物于90℃搅动2 h。使其冷却至室温和减压下去除绝大部分吡啶。得到的残余物经硅胶柱色谱法纯化，先用在氯仿中的30 %乙酸乙酯，然后用在氯仿中的5 %甲醇洗脱，得到想要的产物( 12 )。
(E)-4-((E)-2-((E)-3-(1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-基)烯丙叉)-3,3-二甲基吲哚啉-1-基)丁-2-烯酸乙酯(13)的合成
向1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-2-((1E,3E)-3-(1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-
Figure 350174DEST_PATH_IMAGE027
溴化物( 12 , 50 mg, 0.08 mmol)于甲醇(1 mL)的溶液中，缓慢加入硼氢化钠(20 mg, 0.5 mmol)和于冰水浴温度搅动反应混合物15 min。用氯仿(20 mL)稀释和用水(10 mL)洗涤反应混合物。分离的有机层经Na2SO4干燥和过滤。真空下溶剂蒸发后，粗产物经硅胶柱色谱法纯化，用在己烷中的10 %乙酸乙酯洗脱，得到想要的产物( 13 )。
1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-2-((1E,3E,5E)-5-(1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-
Figure 1735DEST_PATH_IMAGE027
溴化物(14)的合成
Figure 109369DEST_PATH_IMAGE047
将(E)-4-((E)-2-((E)-3-(1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-基)烯丙叉)-3,3-二甲基吲哚啉-1-基)丁-2-烯酸乙酯( 13  1.0 g, 1.8 mmol)和1,1,3,3-四甲氧基丙烷(0.6 g, 3.7 mmol)于吡啶(20 mL)中的混合物于90℃搅动2 h。使其冷却至室温和减压下去除绝大部分吡啶。得到的残余物经硅胶柱色谱法纯化，先用在氯仿中的30 %乙酸乙酯，然后用在氯仿中的10 %甲醇洗脱，得到想要的产物( 14 )。
(E)-4-((E)-2-((2E.4E)-5-(1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-基)戊-2,4-二烯-1-亚基)-3,3-二甲基吲哚啉-1-基)丁-2-烯酸乙酯(15)的合成
向1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-2-((1E,3E,5E)-5-(1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-
Figure 53371DEST_PATH_IMAGE027
溴化物( 14 , 50 mg, 0.08 mmol)于甲醇(1 mL)的溶液中，缓慢加入硼氢化钠(20 mg, 0.5 mmol)并将反应混合物于冰水浴温度搅动15 min。用氯仿(20 mL)稀释和用水(10 mL)洗涤反应混合物。分离的有机层经Na2SO4干燥和过滤。真空下溶剂蒸发后，粗产物经硅胶柱色谱法纯化，用在己烷中的10 %乙酸乙酯洗脱，得到想要的产物( 15 )。
1-(11-乙氧基-11-氧代十一烷基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1- 溴化物(16)的合成
Figure 720030DEST_PATH_IMAGE049
将2,3,3-三甲基伪吲哚(2.0 g, 12.5 mmol)和10-溴代十一酸乙酯(18.0 g, 61.4 mmol)的混合物于120℃加热18 h。使反应混合物冷却至室温。然后在边剧烈搅动下，用5 min将其缓慢加至大约100 mL的乙酸乙酯中。过滤得到的固体，用乙酸乙酯洗涤和真空下干燥，得到想要的化合物( 16 )。
1-(11-乙氧基-11-氧代十一基)-2-((1 E,3E)-3-(1-(11-乙氧基-11-氧代十一烷基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-
Figure 981247DEST_PATH_IMAGE027
 (17 )的合成
Figure 384547DEST_PATH_IMAGE050
将1-(11-乙氧基-11-氧代十一烷基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-
Figure 456539DEST_PATH_IMAGE027
溴化物( 16 , 1.0 g, 2.2 mmol)和原甲酸三甲酯(2.3 g, 22.1 mmol)于吡啶(20 mL)的混合物于90℃搅动2 h。使其冷却至室温和减压下去除绝大部分吡啶。得到的残余物经硅胶柱色谱法纯化，先用在氯仿中的30 %乙酸乙酯，然后用在氯仿中的10 %甲醇洗脱，得到想要的产物( 17 )。
11-(2-((1E,3E)-3-(3,3-二甲基-1-(11-氧代十三烷基)吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-1-基)十一酸乙酯(18)的合成
向1-(11-乙氧基-11-氧代十一烷基)-2-((1E,3E)-3-(1-(10-乙氧基-11-氧代十一烷基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-
Figure 947881DEST_PATH_IMAGE027
溴化物( 17 , 50 mg, 0.06 mmol)于甲醇(1 mL)的溶液中，缓慢加入硼氢化钠(15 mg, 0.40 mmol)并将反应混合物于冰水浴温度搅动15 min。用氯仿(20 mL)稀释和用水(10 mL)洗涤反应混合物。分离的有机层经Na2SO4干燥和过滤。真空下溶剂蒸发后，粗产物经硅胶柱色谱法纯化，用在己烷中的10 %乙酸乙酯洗脱，得到想要的产物( 18 )。
还原性染料化合物(ROS探针)的生物学应用的实施例
实施例1
将牛肺动脉内皮(BPAE)细胞按7500个细胞/孔的密度生长过夜，用或不用100 μΜ甲萘醌处理1 h，然后用5 μΜ Red ROS探针染色30 min。然后用1X PBS洗涤细胞3次，并在用Hoechst核染料染色后，采用Thermo Scientific Cellomics ArrayScan? VTI HCS Reader (读出仪) (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)成像。甲萘醌-处理过的细胞显示阳性反应，原因是红色ROS (Red ROS)探针对细胞中产生的活性氧的反应性(参见图1)。
实施例2
将RAW巨噬细胞按10,000个细胞/孔的密度铺陈于96孔板中，用500 ng/ml的脂多糖(LPS)处理18 h，然后用5 μΜ 红色ROS (Red ROS)探针染色30分钟。用1X PBS洗涤细胞3次，用Hoechst核染料染色后，再采用Thermo Scientific Cellomics ArrayScan? VTI HCS Reader (读出仪)成像。LPS-处理过的细胞显示增强的荧光性，作为红色ROS (Red ROS)探针对在LPS-处理过的细胞中产生的活性氧的反应性的结果；在对照细胞群中未见到信号(参见图2)。
实施例3
将人肝细胞性肝癌(HepG2)细胞按7500个细胞/孔的密度铺陈在胶原蛋白I-包被的96孔板中。然后用50 μΜ奈法唑酮处理细胞24 h和用5 μΜ的红色ROS (Red ROS)探针染色30 min。用1X PBS洗涤细胞3次，用Hoechst核染料染色后，再采用Thermo Scientific Cellomics ArrayScan? VTI HCS Reader (读出仪)成像。在奈法唑酮处理后有增强的荧光强度，指示红色ROS (Red ROS)探针正与细胞中奈法唑酮-诱导的活性氧反应(参见图3)。
实施例4
用或不用或者100 μΜ甲萘醌或者500 nM肉豆蔻酸乙酸佛波醇酯(PMA)处理活的Jurkat细胞1 hr。用5 μΜ远红外ROS (Far Red ROS)传感器和Hoechst 33342使细胞染色30 mins。用PBS洗涤细胞3次，然后在于每秒约400次的BD? LSR II流式细胞仪(Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)上分析，用635 nm激光激发和在650-670 nm收集荧光发射。在用甲萘醌和PMA二者处理后ROS形成均增加(参见图4)。
实施例5
按7500个细胞/孔的密度，将牛肺主动脉内皮(BPAE)细胞铺陈在96孔板中，然后在完全培养基中用100 μΜ甲萘醌处理1 hr并用20 nM Mitotracker? Green (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)、5 μΜ远红外ROS (Far Red ROS)传感器和Hoechst 33342使之染色30 min。然后用PBS洗涤细胞3次和在Thermo Scientific Cellomics ArrayScan? VTI HCS Reader (读出仪)上成像。对照样品没有信号，而在甲萘醌-处理过的细胞有强烈增加的信号，此作为由甲萘醌引起的氧化应激的结果。Mitotracker? Green和远红外ROS (Far Red ROS)传感器染色的孔均显示它们在多重测定中一道起作用(参见图5)。
实施例6
将人主动脉平滑肌细胞(HASM)、U-2 OS细胞、HepG2细胞、RAW细胞或绿色荧光蛋白(GFP)-表达A375细胞铺陈在35 mm Mattek玻璃底的盘上，并用在HASMs中的500 nM血管紧张素II处理(4 h)或在U-2 OS和A375细胞中用100 μΜ甲萘醌处理(1 h)或在HepG2细胞中用50 μΜ奈法唑酮处理(24 h)或在RAW细胞中用500 ng/ml的LPS处理(24 h)。然后在完全培养基中用5 μΜ远红外ROS (Far Red ROS)传感器于37℃使细胞染色30 min。然后用PBS洗涤细胞3次和在Zeiss倒置显微镜上用40x倍目镜成像。所有使用的化合物产生显著的氧化应激，如信号增强所示的。GFP-表达A375细胞的数据显示，远红外ROS (Far Red ROS)传感器在检测GFP-表达细胞系中的ROS形成中是有用的(参见图6)。
实施例7
将U-2 OS细胞铺陈在96孔板中，用100 μΜ甲萘醌处理1 hr，然后用20 μΜ的远红外ROS (Far Red ROS)传感器处理30 min。然后洗涤细胞3X和在Thermo Scientific Cellomics ArrayScan? VTI HCS Reader (读出仪)上分析。然后用4 %甲醛固定细胞10 min并再次读板。从远红外ROS (Far Red ROS)传感器的平均信号强度计算倍数变化。结果显示，甲醛固定后信号强度保留良好(参见图7)。
实施例8
将BPAE细胞或RAW巨噬细胞铺陈在96孔板中。用或不用100 μΜ甲萘醌处理BPAE细胞1 h。在孵育的最后30 min，将100 μΜ的超氧化物清除剂，MnTBAP加至一些对照孔和甲萘醌-处理过的孔中。用或不用带有或不带有NADPH氧化抑制剂二亚苯撑碘 (DiphenyleneIodinium，DPI)的500 ng/mL的脂多糖(LPS)处理RAW细胞。然后用远红外ROS (Far Red ROS)传感器使细胞染色30 min，用PBS洗涤并在Thermo Scientific Cellomics ArrayScan? VTI HCS Reader (读出仪)上分析。MnTBAP或DPI处理抑制分别由甲萘醌或LPS产生的ROS，确认ROS信号的特异性(参见图8)。
实施例9
将HepG2细胞铺陈在96孔板中，然后用或者50 μΜ罗格列酮或者50 μΜ奈法唑酮处理24 h。然后用5 μΜ远红外ROS (Far Red ROS)传感器使细胞染色30 min。然后用PBS洗涤细胞3次并在Thermo Scientific Cellomics ArrayScan? VTI HCS Reader (读出仪)上分析。奈法唑酮处理产生显著的ROS形成，而罗格列酮处理不引起任何ROS响应(参见图9)。
实施例10
将HepG2细胞铺陈在96孔板中，然后用50 μΜ奈法唑酮处理24 h。在奈法唑酮处理的最后30 min，或者用5 μΜ远红外ROS (Far Red ROS)传感器和20 nM Image-IT? DEAD Green?耐久性染液(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)，图10a)或者用5 μΜ远红外ROS (Far Red ROS)传感器和5 μΜ荧光性CaspaGreen胱天蛋白酶底物(图10b)使细胞染色。用PBS洗涤细胞3次并在Thermo Scientific Cellomics ArrayScan? VTI HCS Reader (读出仪)上分析。Image-iT? DEAD Green?检测作为细胞毒性的标记的质膜渗透性。荧光性CaspaGreen胱天蛋白酶底物在细胞中检测细胞凋亡，如在奈法唑酮-处理过的细胞中增强的核染色所示的。奈法唑酮在细胞中引起氧化应激、细胞毒性和细胞凋亡(参见图10)。
实施例11
按7500个细胞/孔的密度将U-2 OS细胞铺陈在96孔板中，并用100 μΜ甲萘醌处理或不用甲萘醌处理(对照)，然后用20 μΜ远红外ROS (Far Red ROS)传感器染色30 min。然后用PBS洗涤细胞3次和在Flexstation II荧光读出仪(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)上(于640 + 5 nm激发和于665 + 5 nm发射)读板。分别得到对照和甲萘醌-处理过的细胞的-400 AU和-1400 AU的信号强度，这具有P < 0.001的显著性(参见图11)。
实施例12
按10,000个细胞/孔的密度将U2-OS细胞铺陈在96孔板中，并用200 μΜ TBHP处理1 h，随后在完全生长培养基中用5 μΜ橙色ROS (Orange ROS)探针和Hoechst 33324染色。然后用1X PBS洗涤细胞3次并在Thermo Scientific Cellomics ArrayScan? VTI HCS Reader (读出仪)上分析。与溶媒对照相比，TBHP-处理过的细胞中信号强度增加10倍(参见图12)。
实施例13
按10,000个细胞/孔的密度将U2-OS细胞铺陈在96孔板中，并用200 μΜ TBHP处理1 h，随后在完全生长培养基中用5 μΜ的或者Cy3 ROS探针或者橙色ROS (Orange ROS)探针染色。然后用1X PBS洗涤细胞3次，然后在Thermo Scientific Cellomics ArrayScan? VTI HCS Reader (读出仪)上分析。将板于室温暗中放置2 h后再次扫描样品。ROS信号的平均信号强度被用于计算信号强度丢失百分率。用Cy3 ROS探针处理的有34 %的信号丢失，而用橙色ROS (Orange ROS)探针处理的无显著的信号丢失(参见图13)。
还原性染料化合物(ROS探针)的生物学应用的实施例
除了以上描述的荧光显微镜术、高容量成像法、荧光板读出仪和体外流式细胞仪应用之外，本文公开的还原性染料化合物(ROS探针)，包括红色ROS (Red ROS)探针、橙色ROS (Orange ROS)探针和含那些染料的组合物可被用作体外诊断工具，以探测或量化多种样品中的ROS。再有，本文公开的还原性染料化合物(ROS探针)，包括红色ROS (Red ROS)探针、橙色ROS (Orange ROS)探针和含那些染料的组合物可被用于体内以探测多种疾病和紊乱或以产生或过度产生ROS为特征的疾病和紊乱的标记，以及在正电子发射断层扫描术(PET)中作为造影剂、生物分子的成像和光声学成像。
实施例14
计算本文公开的还原性染料化合物(ROS探针)的使体内ROS产生成像的能力，所述ROS由在急性炎症的LPS模型中活化的巨噬细胞和嗜中性粒细胞产生。简要地，将小鼠分为三组：第I组腹腔注射(i.p.)给予LPS (1 mg在400 μL盐水中)；第II组i.p.注射给予盐水(400 μL)和第III组不经处理。6 h后，麻醉小鼠，剃除其腹部毛发，并i.p.注射给予LPS-和盐水-处理过的小鼠以ROS探针(~5 nM在50 μL甲醇中)。采用体内成像系统，诸如柯达体内成像系统FX (Kodak In-Vivo Imaging System FX) (柯达分子成像系统(Kodak Molecular Imaging Systems), New Haven, CT)，使小鼠按三份成像，一份来自各组。
以上提到的、列于如下的参考文献从1至20的各份参考文献，以及WO 2009/121055 A1和美国专利和所有公开的信息，通过引用结合于本文。
参考文献
Figure 963427DEST_PATH_IMAGE052
Figure 939473DEST_PATH_IMAGE053
Figure 791760DEST_PATH_IMAGE054
Figure 832715DEST_PATH_IMAGE056
Figure 457545DEST_PATH_IMAGE060
Figure 618585DEST_PATH_IMAGE062
Figure 971069DEST_PATH_IMAGE063
Figure 225202DEST_PATH_IMAGE064
14) R. P. Haugland, 教科书：荧光探针和标记技术的指导(The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies), Chapters 12.2和18, 11th ed., Life Technologies/Invitrogen/Molecular Probes, Carlsbad, CA, 2010.
Figure 663136DEST_PATH_IMAGE065
Figure 146070DEST_PATH_IMAGE066
Figure 618640DEST_PATH_IMAGE067
Figure 466510DEST_PATH_IMAGE068
Figure 204790DEST_PATH_IMAGE069
Figure 429098DEST_PATH_IMAGE070

Claims (33)

1.一种结构式(I)的还原性染料化合物：
Figure 752377DEST_PATH_IMAGE001
其中
Y代表形成各环具有6个原子的、一至两个稠合芳环所需的原子，其中所述Y原子选自-CH、-C、-CR1和-N(R2)β，此处β是0或1，但Y中的所述原子中不超过一个是-N(R2)β且各个R1独立地为氨基、磺基、三氟甲基、羟基、卤素、羧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基，其中的各烷基部分任选被选自羧基、磺基、氨基和羟基的取代基所取代；
α是1，且α + β = 1或2；
W代表形成各环具有6个原子的、一至两个稠合芳环所需的原子，其中所述W原子选自-CH、-C、-CR1’和-N(R12)β'，此处β'是0或1，但W中的所述原子中不超过一个是-N(R12)β'，和各R1’独立地为氨基、磺基、三氟甲基、羟基、卤素、羧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基，其中的各烷基部分任选被选自羧基、磺基、氨基和羟基的取代基所取代；
δ是1，且δ + β' = 1或2；
R2和R12独立地为烷氧基羰基烷基、烷氧基硫代羰基烷基、硫代烷氧基羰基烷基、链烯氧基羰基烷基、链烯氧基硫代羰基烷基、硫代链烯氧基羰基烷基、烷氧基羰基链烯基、烷氧基羰基链烯基、硫代烷氧基羰基链烯基，其中的各烷基或链烯基部分是C1-C22烷基或链烯基，其任选地插入选自N、O和S的至多6个杂原子和其中的各烷基部分任选被以下基团取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基、C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；
X是O、S、Se、-CR3R4或-NR5，其中
R3和R4独立地为C1-C22烷基或C7-C22芳基烷基，其中的各烷基部分任选地插入选自N、O和S的至多6个杂原子，且其中的各烷基部分任选被以下基团取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；或R3和R4组合在一起完成五-或六元饱和或不饱和环，其任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；和
R5是H或C1-C22烷基，后者任选被以下基团取代一次或多次：羟基、羧基、磺基、氨基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基；
Z是O、S、Se、-CR13R14或-NR15，其中
R13和R14独立地为C1-C22烷基或C7-C22芳基烷基，其中的各烷基部分任选地插入选自N、O和S的至多6个杂原子，且其中的各烷基部分任选被以下基团取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基，或C3-C18三烷基铵；或R13和R14组合在一起完成五-或六元饱和或不饱和环，其任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；和
R15是H或C1-C22烷基，后者任选被以下基团取代一次或多次：羟基、羧基、磺基、氨基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基；
R21、R22、R23各自独立地为H、F、Cl、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、芳基、芳基氧基、氮杂环、亚胺离子；或R21、R22、R23的任何两个相邻的取代基，当组合在一起时，形成任选被C1-C6烷基、卤素，或羰基氧取代一次或多次的芳基或4-、5-或6-元饱和或不饱和烃环；或R21与R3和R4之一组合在一起形成任选被C1-C6烷基取代的六-元环；或R23邻接至Z，与R13和R14之一组合在一起形成任选被C1-C6烷基取代的六-元环；
R24是H或处于或者R或者S构型的D；和
n是0、1、2或3。
2.依据权利要求1的化合物，其中的化合物具有结构式(III)：
Figure 997413DEST_PATH_IMAGE002
(III)
其中R24是H且n是1或2。
3.依据权利要求1的化合物，其中的化合物具有结构式(IV)：
Figure 777150DEST_PATH_IMAGE003
(IV)
其中R24是H且n是1或2。
4.依据权利要求1的化合物，其中的化合物具有结构式(V)：
Figure 969097DEST_PATH_IMAGE004
(V)
其中R24是H且n是1或2。
5.依据权利要求1的化合物，其中的化合物具有结构式(VI)：
Figure 783470DEST_PATH_IMAGE005
(VI)
其中R24是H且n是1或2。
6.依据权利要求5的化合物，其中R3、R4、R13和R14独立地为C1-C22烷基。
7.依据权利要求6的化合物，其中R2和R12独立地为甲氧基羰基烷基、乙氧基羰基烷基、丙氧基羰基烷基、乙烯氧基羰基烷基、烯丙氧基羰基烷基、甲氧基羰基链烯基、乙氧基羰基链烯基或丙氧基羰基链烯基。
8.一种选自以下的还原性染料化合物：
1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚溴化物；
1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-((1E,3E,4E)-5-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯基-3,3-二甲基-3H-吲哚
Figure 935282DEST_PATH_IMAGE006
溴化物；
1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯基)吲哚啉；
1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-2-氘-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯基)吲哚啉；
1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-2-((1E,3E)-3-(1-4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯基)-3,3-二甲基-3H-吲哚
Figure 960614DEST_PATH_IMAGE006
溴化物；
1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E)-3-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯基)吲哚啉；
1-(3-羧基丙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-
Figure 629492DEST_PATH_IMAGE006
溴化物；
1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-
Figure 622856DEST_PATH_IMAGE006
溴化物；
1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-2-((1E,3E)-3-(1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-
Figure 173923DEST_PATH_IMAGE006
溴化物；
4-((E)-2-((E)-3-(1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-基)烯丙叉)-3,3-二甲基吲哚啉-1-基)丁酸烯丙酯；
(E)-1-(4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物；
1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-2-((1E,3E)-3-(1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-溴化物；
(E)-4-((E)-2-((E)-3-(1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-基)烯丙叉)-3,3-二甲基吲哚啉-1-基)丁-2-烯酸乙酯；
1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-2-((1E,3E,5E)-5-(1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-
Figure 926482DEST_PATH_IMAGE006
溴化物；
(E)-4-((E)-2-((2E,4E)-5-(1-((E)-4-乙氧基-4-氧代丁-2-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-基)戊-2,4-二烯-1-亚基)-3,3-二甲基吲哚啉-1-基)丁-2-烯酸乙酯；
1-(11-乙氧基-11-氧代十一烷基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-
Figure 168107DEST_PATH_IMAGE006
溴化物；
1-(11-乙氧基-11-氧代十一烷基)-2-((1E,3E)-3-(1-(11-乙氧基-11-氧代十一烷基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-
Figure 69329DEST_PATH_IMAGE006
；和
11-(2-((1E,3E)-3-(3,3-二甲基-1-(11-氧代十三烷基)吲哚啉-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基吲哚啉-1-基)十一酸乙酯。
9.一种探测氧自由基(ROS)的组合物，该组合物包括：
a) 一个或多个还原性染料；和
b) 载体，
其中所述还原性染料是依据权利要求1的化合物并且以当与ROS反应时有效探测ROS的存在的量存在。
10.依据权利要求9的组合物，其中的组合物适于体外应用。
11.依据权利要求9的组合物，其中的组合物适于体内应用。
12.一种探测样品中的活性氧(ROS)的方法，该方法包括以下步骤：
a) 使样品与有效量的一个或多个依据权利要求1的还原性染料化合物接触；和
b) 测定还原性染料化合物是否已经被氧化。
13.一种探测样品中活性氧(ROS)的方法，该方法包括以下步骤：
a) 使样品与有效量的依据权利要求9的组合物接触；和
b) 测定还原性染料化合物是否已经被氧化。
14.依据权利要求12的方法，其中的样品包括细胞、组织、生物液或其组合。
15.依据权利要求12的方法，其中通过荧光分光术探测还原性染料化合物的氧化。
16.依据权利要求12的方法，其中通过荧光显微镜探测还原性染料化合物的氧化。
17.依据权利要求16的方法，其中通过共焦激光扫描荧光显微镜探测还原性染料化合物的氧化。
18.依据权利要求16的方法，其中通过全内反射荧光显微镜探测还原性染料化合物的氧化。
19.依据权利要求12的方法，其中活性氧(ROS)的探测被用于诊断选自以下的疾病或紊乱：颈动脉损伤、动脉粥样硬化、高血压、癌症、以炎症为特征的疾病和紊乱、辐射诱发的晚期正常组织的损伤；由于化疗引起的组织损伤、缺血或移植后再灌注；糖尿病，诸如1型糖尿病(TID)、神经退行性疾病，诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)和亨廷顿氏舞蹈病；脑血管疾病、囊性纤维化、慢性肾病、心血管疾病、先兆子痫、眼科疾病，及其组合。
20.一种探测样品中活性氧(ROS)的试剂盒，该试剂盒包括：
a) 一个或多个依据权利要求1的还原性染料化合物；和
b) 一个或多个容器。
21.一种探测样品中活性氧(ROS)的试剂盒，该试剂盒包括：
a) 依据权利要求9的组合物；和
b) 一个或多个容器。
22.依据权利要求20的试剂盒，其中的试剂盒还包括进行探测一个或多个活性氧(ROS)的测定的说明书。
23.依据权利要求22的试剂盒，其中的测定在体内或体外进行。
24.一项制备结构式(I)还原性染料化合物的方法，
Figure 712800DEST_PATH_IMAGE007
(I)
该方法包括：
a) 使结构式(II)的菁染料化合物
Figure 47967DEST_PATH_IMAGE008
(II)
与NaBH4或NaBD4反应，其中：
W、X、Y、Z、R2、R12、R21、R22、R23、R24、n、α和δ如在权利要求1中定义。
25.依据权利要求24的方法，其中X是CR3R4，Z是CR13R14，R24是H和n是1或2。
26.依据权利要求25的方法，其中R3、R4、R13和R14独立地为C1-C22烷基。
27.依据权利要求26的方法，其中R2和R12独立地为甲氧基羰基烷基、乙氧基羰基烷基或丙氧基羰基烷基。
28.依据权利要求27的方法，其中R2和R12各自为乙氧基羰基烷基。
29.一种结构式(I)的还原性染料化合物：
Figure 104784DEST_PATH_IMAGE009
其中
Y代表形成各环具有6个原子的、一至两个稠合芳环所需的原子，其中所述Y原子选自-CH、-C、-CR1和-N(R2)β，此处β是0或1，但Y中的所述原子中不超过一个是-N(R2)β和各R1独立地为氨基、磺基、三氟甲基、羟基、卤素、羧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基，其中的各烷基部分任选被选自羧基、磺基、氨基和羟基的取代基所取代；
α是1，且α + β = 1或2；
W代表形成各环具有6个原子的、一至两个稠合芳环所需的原子，其中所述W原子选自-CH、-C、-CR1’和-N(R12)β'，此处β'是0或1，但W中的所述原子中不超过一个是-N(R12)β'和各R1’独立地为氨基、磺基、三氟甲基、羟基、卤素、羧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基，其中的各烷基部分任选被选自羧基、磺基、氨基和羟基的取代基所取代；
δ是1，且δ + β' = 1或2；
R2和R12独立地为C1-C22烷基或链烯基，其任选地插入选自N、O和S的至多6个杂原子，且其中的各烷基部分任选被以下基团取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基、C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；
X是O、S、Se、-CR3R4或-NR5，其中
R3和R4独立地为C1-C22烷基或C7-C22芳基烷基，其中的各烷基部分任选地插入选自N、O和S的至多6个杂原子，且其中的各烷基部分任选被以下基团取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；或R3和R4组合在一起完成五-或六元饱和或不饱和环，其任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；和
R5是H或C1-C22烷基，后者任选被以下基团取代一次或多次：羟基、羧基、磺基、氨基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基；
Z是O、S、Se、-CR13R14或-NR15，其中
R13和R14独立地为C1-C22烷基或C7-C22芳基烷基，其中的各烷基部分任选地插入选自N、O和S的至多6个杂原子，且其中的各烷基部分任选被以下基团取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；或R13和R14组合在一起完成五-或六元饱和或不饱和环，其任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵；和
R15是H或C1-C22烷基，后者任选被以下基团取代一次或多次：羟基、羧基、磺基、氨基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基；
各个R21、R22、R23独立地为H、F、Cl、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、芳基、芳基氧基、任选被烷基芳基取代一次或多次氮杂环，所述烷基芳基任选被H、卤素或卤代甲基取代一次或多次、亚胺离子；或R21、R22、R23的任何两个相邻的取代基，当组合在一起时，形成任选被C1-C6烷基、卤素，或羰基氧取代一次或多次的芳基或4-、5-或6-元饱和或不饱和烃环；或R21与R3和R4之一组合在一起形成任选被C1-C6烷基取代的六-元环；或R23邻接至Z，与R13和R14之一组合在一起形成任选被C1-C6烷基取代的六-元环；
R24是H或处于或者R或者S构型的D；和
n是0、1、2或3。
30.依据权利要求29的化合物，其中该化合物具有结构式(VI)：
Figure 980336DEST_PATH_IMAGE010
其中R24是H且n是1或2。
31.依据权利要求30的化合物，其中R3、R4、R13和R14独立地为C1-C22烷基。
32.依据权利要求31的化合物，其中R2和R12独立地为C1-C22烷基。
33.依据权利要求32的化合物，其中的还原性染料化合物是1-(4-(氯代甲基)苄基)-4-((1E,3Z,5E)-1-(1,3,3-三甲基吲哚啉-2-基)-5-(1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-3-基)吡啶-1-
Figure 540631DEST_PATH_IMAGE006
氯化物。
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