CN103191145A - 腺苷及其衍生物在防治药物性肝损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了腺苷及其衍生物在防治药物性肝损伤中的应用。本发明涉及腺苷及其衍生物如单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷在保护对乙酰氨基酚所致的肝损伤中的用途，本发明所采用的小鼠模型为对乙酰氨基酚所诱导的小鼠急性肝衰竭模型，腺苷或其衍生物的给药量为0.1mmol/kg～5mmol/kg，腺苷及其衍生物能降低药物性肝损伤中AST、ALT酶活性，减少肝实质细胞坏死面积，提高谷胱甘肽水平，从而防治由肝毒性药物对乙酰氨基酚所致的肝损伤。本发明经动物实验证明腺苷及其衍生物具有显著的防治药物性肝损伤的作用，故腺苷及其衍生物可用于药物性肝损伤的预防与救治过程，为临床上治疗药物性肝损伤提供新的方法和手段。

Description

腺苷及其衍生物在防治药物性肝损伤中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别是腺苷及其衍生物在防治药物性肝损伤中的应用。
背景技术
肝脏是哺乳动物体内重要器官之一，因其具有合成、解毒、代谢、分泌、生物转化以及免疫防御等功能，故又被称为“加工厂”。当受到多种因素（如病毒、酒精、药物等）引起严重损害时，造成肝细胞大量坏死，导致上述功能发生严重障碍或失代偿，进而出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群，称之为肝衰竭。
近年来，随着大量新药的开发和临床推广，药物肝损伤尤其是急性药物肝损伤的发病率呈现明显上升趋势，使药物肝损伤成为急性肝损伤发生的首要病因，有研究报道急性药物性肝损伤发病率可达14/10万人年。例如，长期服用对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）、利福平、吡嗪酰胺、异烟肼等抗生素，以及更年期长期服用雌激素等也会造成严重的肝细胞坏死，导致急性或慢性肝炎、黄疸和肝纤维化等肝损伤。
APAP是常用的解热镇痛药，在临床上，特别是儿科中被广泛应用。同时，APAP又是一种肝毒性物质，药物过量容易引起肝损伤。APAP是经过生物转化后形成亲电子代谢物致肝损伤，常用于造急性肝功能衰竭模型。APAP过量使用造成严重肝中毒从而导致肝衰竭。APAP在体内，90%-95%在肝脏代谢，约60%在鸟苷二磷酸-醛酸转移酶作用下与葡萄糖酸结合，约30%在磺酸基转移酶作用下与磺酸结合，二者均成为无毒物质随尿排出。4%-5%的APAP经肝脏的cyp450氧化酶系统代谢为毒性较大的自由基代谢产物N-乙酰苯亚胺醌（NAPQI）（Gunawan BK,Liu ZX,Han D,Hanawa N,Gaarde WA,Kaplowitz N.c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophenhepatotoxicity.Gastroenterology.2006;131:165-178），还原性谷胱甘肽（GSH）等保护因子含量重组的情况下，NAPQI与GSH结合而解毒，一旦GSH消耗殆尽，NAPQI将与细胞内其他重要的生物大分子如蛋白结合形成APAP-蛋白复合物，此复合物可导致氧化应激、线粒体功能障碍和DNA损伤（Saito C,Zwingmann C,Jaeschke H.Novelmechanisms of protection against acetaminophen hepatotoxicity in mice by glutathione andN-acetylcysteine.Hepatology.2010;51:246-254.）。从而导致肝细胞损伤、坏死，严重者可致肝肾衰竭、肝性脑病、脑水肿、低血糖、低血压，甚至死亡。
腺苷又名腺嘌呤核苷，化学名为：6-氨基-9-β-D-呋喃核糖嘌呤（Adenosine）。腺苷是一种自然的代谢物，在生理生化过程中起着非常重要的调控作用，具有广泛的药用价值。研究表明，它具有抗癫痫和强效扩张冠脉的作用，可用于治疗心绞痛、心肌梗赛、冠状功能不全、动脉硬化、原发性高血压、脑血管障碍、中风后遗症、以及进行性心肌萎缩症等。腺苷在组织损伤时是一种信号核苷，当细胞受到损伤时释放出腺苷或腺苷酸使得胞外腺苷的水平升高，腺苷通过腺苷受体将信号传导进去，因此腺苷对机体的急性损伤和慢性损伤都起着保护作用（Karmouty-Quintana H,Xia Y,Blackburn MR.Adenosinesignaling during acute and chronic disease states.J Mol Med.2013;91:173-181）。研究报道，腺苷预处理后对肾脏缺血再灌注造成的损伤有保护作用（Lee HT,Emala CW.Protectiveeffects of renal ischemic preconditioning and adenosine pretreatment:role of A1and A3receptors.Am J Physiol Renal Physiol.2000;278:F380-F387.）。另外还有研究表明，腺苷对缺血再灌注心肌有保护作用（Ke JJ,Yu FX,Rao Y,Wang YL.Adenosine postconditioningprotects against myocardial ischemia-reperfusion injury through modulate production ofTNF-αand prevents activation of transcription factor NF-kappaB.Mol Biol Rep.2011;38:531-538）。然而，腺苷及其衍生物是否能保护药物性肝损伤仍未有报道。
目前尚没有能有效完全阻断肝损伤发生的药物，因此无法有效防止因大面积肝细胞坏死所造成的急性肝衰竭，急性肝衰竭死亡率一直难以降低。临床上迫切需要具有特异性快速阻止肝损伤的药物以治疗肝功能衰竭。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供腺苷及其衍生物在防治药物性肝损伤中的应用，为腺苷及其衍生物提供了一种新的用途，也为防治药物性肝损伤提供了一种新的、疗效好的药物来源。
实现本发明目的的技术解决方案为：腺苷及其衍生物在防治药物性肝损伤中的应用。
所述的药物性肝损伤是对乙酰氨基酚所导致的。
所述的腺苷衍生物为单磷酸腺苷、二磷酸腺苷或三磷酸腺苷。
所述防治药物性肝损伤中腺苷或其衍生物的给药量为0.1mmol/kg～5mmol/kg。
所述腺苷及其衍生物在防治药物性肝损伤中的应用，用于包括人在内的哺乳动物。
本发明腺苷及其衍生物防治药物性肝损伤的反应机理为：对乙酰氨基酚（APAP）过量使用使肝细胞中还原性谷胱甘肽（GSH）消耗殆尽，N-乙酰苯亚胺醌（NAPQI）将与细胞内其他重要的生物大分子如蛋白结合形成APAP-蛋白复合物，此复合物可导致氧化应激、线粒体功能障碍和DNA损伤。腺苷及其衍生物通过抑制肝细胞中还原性谷胱甘肽的消耗，保护因子还原性谷胱甘肽与N-乙酰苯亚胺醌结合而解毒，从而减轻APAP-复合物导致的氧化应激、线粒体功能障碍和DNA损伤，最终减轻对乙酰氨基酚所致肝损伤。
本发明与现有技术相比，其显著优点为：腺苷及其衍生物能够快速阻止肝损伤以治疗肝功能衰竭，且腺苷及其衍生物是生物体核苷酸代谢的自然产物，使用腺苷及其衍生物来防治肝损伤对机体没有任何副作用。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1是腺苷（Adenosine,1.5mmol/kg）对对乙酰氨基酚所诱导的小鼠急性肝衰竭模型血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）的酶活性的影响。
图2是腺苷（Adenosine,1.5mmol/kg）防治对乙酰氨基酚所诱导的小鼠急性肝衰竭模型的肝细胞坏死的效果对照图。
图3是腺苷（Adenosine,1.5mmol/kg）对对乙酰氨基酚所诱导的小鼠急性肝衰竭模型的肝脏谷胱甘肽的影响。
图4是单磷酸腺苷（AMP,3mmol/kg）对对乙酰氨基酚所诱导的小鼠急性肝衰竭模型血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）的酶活性的影响。
图5是单磷酸腺苷（AMP,3mmol/kg）防治对乙酰氨基酚所诱导的小鼠急性肝衰竭模型的肝细胞坏死的效果对照图。
图6是单磷酸腺苷（AMP,3mmol/kg）对对乙酰氨基酚所诱导的小鼠急性肝衰竭模型的肝脏谷胱甘肽的影响。
具体实施方式
本发明腺苷及其衍生物在防治药物性肝损伤中的应用，用于哺乳动物，包括人，治疗经历肝损伤事件或者肝损伤时间即将来临的情况。“肝损伤”是在病理学上可辨别的肝实质细胞的坏死或凋亡，肝损伤产生的并发症有感染性并发症、肝创面胆漏、继发性出血、急性肝肺功能障碍；“肝衰竭”指多种因素引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。
本发明所述的腺苷(Adenosine)化学式为：
本发明所述的腺苷衍生物包括单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)和三磷酸腺苷(ATP)，化学式分别为：
（1）单磷酸腺苷：
Figure BDA00002972969900042
（2）二磷酸腺苷：
（3）三磷酸腺苷：
Figure BDA00002972969900051
所述防治药物性肝损伤中腺苷或其衍生物的给药量为0.1mmol/kg～5mmol/kg。
所述腺苷及其衍生物在防治药物性肝损伤中的应用，用于包括人在内的哺乳动物。
本发明腺苷及其衍生物防治药物性肝损伤的反应机理为：对乙酰氨基酚（APAP）过量使用使肝细胞中还原性谷胱甘肽（GSH）消耗殆尽，N-乙酰苯亚胺醌（NAPQI）将与细胞内其他重要的生物大分子如蛋白结合形成APAP-蛋白复合物，此复合物可导致氧化应激、线粒体功能障碍和DNA损伤。腺苷及其衍生物通过抑制肝细胞中还原性谷胱甘肽的消耗，保护因子还原性谷胱甘肽与N-乙酰苯亚胺醌结合而解毒，从而减轻APAP-复合物导致的氧化应激、线粒体功能障碍和DNA损伤，最终减轻对乙酰氨基酚所致肝损伤。
以下实施例结合腺苷(Adenosine)或其衍生物对对乙酰氨基酚（APAP）所致药物性肝损伤小鼠的血清谷草转氨酶（AST）、血清谷丙转氨酶（ALT）、肝脏谷胱甘肽、肝细胞坏死等各项指标的影响，对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
（1）动物模型
实验动物为八周龄的雄性C57BL/6（WT）小鼠。在标准实验条件下饲养：12小时光照-12小时黑暗循环，自由摄取水和食物。APAP用以建立小鼠急性肝衰竭模型，通过灌胃给药APAP（300mg/kg）。WT小鼠随机分成三组，第一组为对照组（Saline），在实验过程中给予对应药物介质（生理盐水）处理；第二组为APAP组（APAP），灌胃给药APAP；第三组为腺苷治疗组（Ado+APAP），将Adenosine（1.5mmol/kg）与APAP混为混合溶液灌胃给药。APAP灌胃24小时后，取血、肝脏用于评价肝损伤情况。
（2）血清酶活性测定
收集到全血后，待其常温自然凝血，3000r/min离心15min后，取血清测定AST和ALT酶活性。AST和ALT的酶活性用酶显色定量分析方法测定，按照试剂盒说明书中的操作步骤进行，最后在340nm波长下进行比色测定其浓度。
结合图1，腺苷（Adenosine,1.5mmol/kg）对血清谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）的酶活性的影响。C57BL/6WT小鼠通过灌胃对乙酰氨基酚（APAP，300mg/kg）建立急性肝衰竭模型。APAP建模24小时后，相比于对照组，APAP组小鼠血清AST，ALT酶活性显著升高；相比于APAP组，腺苷治疗组（Ado+APAP）小鼠血清AST，ALT酶活性的显著下降。
（3）肝脏组织学分析
肝组织用10%福尔马林固定，然后石蜡包埋切片，再用苏木精-伊红HE染色。通过显微镜观察肝细胞的坏死情况。
结合图2，腺苷（Adenosine,1.5mmol/kg）对肝细胞坏死的影响。C57BL/6WT小鼠通过灌胃对乙酰氨基酚（APAP，300mg/kg）建立急性肝衰竭模型。APAP建模24小时后，检测肝组织病变。肝组织病理切片H&E染色（100×）显示，APAP建模24小时后，相比于对照组，APAP组小鼠肝细胞呈现严重坏死；相比于APAP组，腺苷治疗组（Ado+APAP）小鼠肝细胞坏死程度明显减轻。
（4）肝脏中谷胱甘肽的测定
肝组织在10%PBS中匀浆，离心取上清液用于检测GSH含量，按照试剂盒说明书中的操作步骤进行，420nm处测定光密度。
结合图3，腺苷（Adenosine,1.5mmol/kg）对肝脏谷胱甘肽的影响。C57BL/6WT小鼠通过灌胃对乙酰氨基酚（APAP，300mg/kg）建立急性肝衰竭模型。APAP建模24小时后，相比于对照组，APAP组小鼠肝脏中谷胱甘肽（GSH）含量下降；相比于APAP组，腺苷治疗组（Ado+APAP）小鼠肝脏中谷胱甘肽显著恢复上升。
（5）数据分析
多组之间的比较用ANOVA统计学方法进行统计分析。P＜0.05被认为有显著性区别。
（6）急性肝衰竭时肝受损情况
APAP灌胃24h后可产生急性肝衰竭症状，并伴随血清AST和ALT酶活性的强烈升高，以及肝脏组织结构的变化，经HE染色显微可见明显的肝实质细胞坏死提示，APAP能产生明显的肝损伤，并使肝细胞的GSH大量消耗。
（7）急性肝衰竭时腺苷改善肝损伤的效力
用腺苷同APAP混合后进行处理WT小鼠，可缓解APAP所致肝损伤。观察到血清AST、ALT酶活性的显著降低、肝实质细胞坏死面积的减小及肝细胞的GSH的恢复。
实施例2
（1）动物模型
实验动物为八周龄的雄性C57BL/6（WT）小鼠。在标准实验条件下饲养：12小时光照-12小时黑暗循环，自由摄取水和食物。APAP用以建立小鼠急性肝衰竭模型，通过灌胃给药APAP（300mg/kg）。WT小鼠随机分成三组，第一组为对照组（Saline），在实验过程中给予对应药物介质（生理盐水）处理；第二组为APAP组（APAP），灌胃给药APAP；第三组为单磷酸腺苷治疗组（AMP+APAP），将AMP（3mmol/kg）与APAP混为混合溶液灌胃给药。APAP灌胃24小时后，取血、肝脏用于评价肝损伤情况。
（2）血清酶活性测定
收集到全血后，待其常温自然凝血，3000r/min离心15min后，取血清测定AST和ALT的酶活性。AST和ALT酶活性用酶显色定量分析方法测定，按照试剂盒说明书中的操作步骤进行。最后在340nm波长下进行比色测定其浓度。
结合图4，单磷酸腺苷（AMP,3mmol/kg）对血清谷草转氨酶（AST）及谷丙转氨酶（ALT）的酶活性的影响。C57BL/6WT小鼠通过灌胃对乙酰氨基酚（APAP，300mg/kg）建立急性肝衰竭模型。APAP建模24小时后，相比于对照组，APAP组小鼠血清AST，ALT酶活性显著升高；相比于APAP组，单磷酸腺苷治疗组（AMP+APAP）小鼠血清AST，ALT酶活性的显著下降。
（3）肝脏组织学分析
肝组织用10%福尔马林固定，然后石蜡包埋切片，再用苏木精-伊红HE染色。通过显微镜观察肝细胞的坏死情况。
结合图5，单磷酸腺苷（AMP,3mmol/kg）对肝细胞坏死的影响。C57BL/6WT小鼠通过灌胃对乙酰氨基酚（APAP，300mg/kg）建立急性肝衰竭模型。APAP建模24小时后，检测肝组织病变。肝组织病理切片H&E染色（100×）显示，APAP建模24小时后，相比于对照组，APAP组小鼠肝细胞呈现严重坏死；相比于APAP组，单磷酸腺苷治疗组（AMP+APAP）小鼠肝细胞坏死程度明显减轻。
（4）肝脏中谷胱甘肽的测定
肝组织在10%PBS中匀浆，离心取上清液用于检测GSH含量，按照试剂盒说明书中的操作步骤进行，420nm处测定光密度。
结合图6，单磷酸腺苷（AMP,3mmol/kg）对肝脏谷胱甘肽的影响。C57BL/6WT小鼠通过灌胃对乙酰氨基酚（APAP，300mg/kg）建立急性肝衰竭模型。APAP建模24小时后，相比于对照组，APAP组小鼠肝脏中谷胱甘肽（GSH）含量下降；相比于APAP组，单磷酸腺苷治疗组（AMP+APAP）小鼠肝脏中谷胱甘肽显著恢复上升。
（5）数据分析
多组之间的比较用ANOVA统计学方法进行统计分析。P＜0.05被认为有显著性区别。
（6）急性肝衰竭时肝受损情况
APAP灌胃24h后可产生急性肝衰竭症状，并伴随血清AST和ALT酶活性的强烈升高，以及肝脏组织结构的变化，经HE染色显微可见明显的肝实质细胞坏死提示，APAP能产生明显的肝损伤，并使肝细胞的GSH大量消耗。
（7）急性肝衰竭时单磷酸腺苷改善肝损伤的效力
用单磷酸腺苷同APAP混合后进行处理WT小鼠，可缓解APAP所致肝损伤。观察到血清AST，ALT酶活性的显著降低、肝实质细胞坏死面积的减小及肝细胞的GSH的恢复。
实施例3
（1）动物模型
实验动物为八周龄的雄性C57BL/6（WT）小鼠。在标准实验条件下饲养：12小时光照-12小时黑暗循环，自由摄取水和食物。APAP用以建立小鼠急性肝衰竭模型，通过灌胃给药APAP（300mg/kg）。WT小鼠随机分成四组，第一组为对照组（Saline），在实验过程中给予对应药物介质（生理盐水）处理；第二组为APAP组（APAP），灌胃给药APAP；第三组为腺苷治疗组（Ado+APAP），并分为Ⅲa组和Ⅲb组，Ⅲa组将Adenosine（0.1mmol/kg）与APAP混为混合溶液灌胃给药，Ⅲb组将Adenosine（5mmol/kg）与APAP混为混合溶液灌胃给药；第四组为单磷酸腺苷治疗组（AMP+APAP），并分为Ⅳa组和Ⅳb组，Ⅳa组将AMP（0.1mmol/kg）与APAP混为混合溶液灌胃给药，Ⅳb组将AMP（5mmol/kg）与APAP混为混合溶液灌胃给药；第五组为二磷酸腺苷治疗组（ADP+APAP），并分为Ⅴa组、Ⅴb组和Ⅴc组，Ⅴa组将ADP（0.1mmol/kg）与APAP混为混合溶液灌胃给药，Ⅴb组将ADP（3mmol/kg）与APAP混为混合溶液灌胃给药，Ⅴc组将ADP（5mmol/kg）与APAP混为混合溶液灌胃给药；第六组为三磷酸腺苷治疗组（ATP+APAP），并分为Ⅵa组、Ⅵb组、Ⅵc组，Ⅵa组将ATP（0.1mmol/kg）与APAP混为混合溶液灌胃给药，Ⅵb组将ATP（3mmol/kg）与APAP混为混合溶液灌胃给药，Ⅵc组将ATP（5mmol/kg）与APAP混为混合溶液灌胃给药。APAP灌胃24小时后，取血、肝脏用于评价肝损伤情况。
（2）血清酶活性测定
收集到全血后，待其常温自然凝血，3000r/min离心15min后，取血清测定AST和ALT酶活性。AST和ALT酶活性用酶显色定量分析方法测定，按照试剂盒说明书中的操作步骤进行。最后在340nm波长下进行比色测定其浓度。
（3）肝脏中谷胱甘肽的测定
肝组织在10%PBS中匀浆，离心取上清液用于检测GSH含量，按照试剂盒说明书中的操作步骤进行，420nm处测定光密度。
（4）数据分析
多组之间的比较用ANOVA统计学方法进行统计分析。P＜0.05被认为有显著性区别。
（5）急性肝衰竭时肝受损情况
APAP灌胃24h后可产生急性肝衰竭症状，并伴随血清AST和ALT酶活性的强烈升高，APAP能产生明显的肝损伤，并使肝细胞的GSH大量消耗。
（6）急性肝衰竭时腺苷衍生物改善肝损伤的效力
用腺苷及其衍生物同APAP混合后进行处理WT小鼠，可缓解APAP所致肝损伤。观察到血清AST，ALT酶活性的显著降低及肝细胞的GSH的恢复。
表1描述了腺苷及其衍生物对APAP肝中毒的影响。C57BL/6WT小鼠通过灌胃对乙酰氨基酚（APAP，300mg/kg）建立急性肝衰竭模型。APAP建模24小时后，相比于对照组，APAP组小鼠血清AST，ALT酶活性显著升高，肝脏中谷胱甘肽（GSH）含量下降。相比于APAP组，腺苷治疗组（Ado+APAP）、单磷酸腺苷治疗组（AMP+APAP）、二磷酸腺苷治疗组（ADP+APAP）和三磷酸腺苷治疗组（ATP+APAP）小鼠血清AST，ALT酶活性的显著下降，谷胱甘肽显著恢复上升。综上，腺苷及其衍生物能够快速阻止肝损伤以治疗肝功能衰竭，且腺苷及其衍生物是生物体核苷酸代谢的自然产物，使用腺苷及其衍生物来防治肝损伤对机体没有任何副作用。
表1
Figure BDA00002972969900101

Claims (5)

1.腺苷及其衍生物在防治药物性肝损伤中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物性肝损伤是对乙酰氨基酚所导致的。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的腺苷衍生物为单磷酸腺苷、二磷酸腺苷或三磷酸腺苷。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防治药物性肝损伤中腺苷或其衍生物的给药量为0.1mmol/kg～5mmol/kg。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于包括人在内的哺乳动物。
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