CN103191083A - 异丹叶大黄素在制备抗肿瘤活性药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异丹叶大黄素在制备抗肿瘤活性药物中的应用，所述应用通过下调X连锁凋亡抑制蛋白基因表达来抑制X连锁凋亡抑制蛋白活性；本发明利用蛋白免疫印迹、RT-PCR、ATP生物荧光检测法、CHIP等方法证实，ISO预处理多种肿瘤细胞均可显著抑制XIAP基因表达水平，并进而诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖；ISO并不能显著诱导肿瘤细胞增殖和凋亡，证实内源性XIAP基因是ISO治疗的有效靶标，特异性抑制XIAP的基因表达，并通过实验证实ISO可有效地提高化疗药物的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡，将在基础医学、临床治疗与新药研发等方面具有广阔的应用前景。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种中药单体异丹叶大黄素（ISO）在制备抗肿瘤活性药物中的应用即，异丹叶大黄素在肿瘤细胞中抑制X连锁凋亡抑制蛋白活性中的应用。
（二）背景技术
目前恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病，其中肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、膀胱癌的发病率和死亡率一直显著上升。具有早期易转移、晚期难治、预后差、易产生耐药等特点，而传统的手术、化、放疗的疗效不尽人意。传统的治疗方法的局限性决定了生物治疗必然要参与恶性肿瘤的综合治疗，并有可能在其中发挥至关重要的作用，而基因治疗是肿瘤生物治疗的重要方法之一。大量研究证明，X连锁凋亡抑制蛋白(X-linkedinhibitor of apoptosis protein,XIAP)作为一种多功能生物分子，参与多种受体介导的信号转导，在肿瘤的发生和发展中起着重要作用，既可作为一个较普遍的标志物用于肿瘤的早期诊断，又可作为判断肿瘤预后的重要标志物。高表达XIAP的肿瘤均具有早期易转移、晚期难治、预后差等特点，传统的手术、化疗、放疗的疗效均不尽人意。XIAP在肿瘤化疗敏感性中的作用及价值受到国内外学者广泛关注。现已明确，肿瘤细胞中XIAP水平的升高是肿瘤细胞逃避化疗药物杀伤作用的原因之一。在多种肿瘤中，如在胃癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌等细胞系中，均证实通过下调XIAP蛋白水平，可提高肿瘤对化疗药物的敏感性。
XIAP可通过多种途径抑制细胞凋亡，以其作为肿瘤治疗靶点的研究已经从实验室进入了临床研究阶段。目前临床治疗多用XIAP表达的干扰剂，如采用反义寡核苷酸为基础的基因治疗、XIAP小分子抑制剂等，但受到诸多因素的限制，包括药物稳定性差、需要多次重复给药、细胞膜通透性差、转染效率不稳定等。尽管采用了一些辅助如脂质体包裹、纳米粒的形式，但临床上使用仍然受到非常大的限制，尤其是患者安全性方面的限制。因此能否从中国的中药宝库中筛选出一种中药单体，可特异性抑制XIAP的基因表达，将在基础医学、临床治疗与新药研发等方面具有广阔的应用前景。
发明人通过筛选的方法，鉴定出从小叶买麻藤植物(Gnetumparvifolium)中分离得到多种中药单体中异丹叶大黄素（Isorhapontigenin，ISO），可有效抑制细胞内XIAP基因表达有效地抑制XIAP基因的表达，提高肿瘤治疗有效率、降低肿瘤耐药率。ISO单体（Huang KS,Zhou S,LinM,Wang YH.An isorhapontigenin tetramer and a novel stilbene dimer fromGnetum hainanense.Planta Med.2002，68(10):916-20.），化学结构式：3,5,4-三羟基-3′-甲氧基反式二苯乙烯，分子式：C15H14O4，化合物分子量258.2道尔顿。该单体与肿瘤的关系还鲜有报道。《中华本草》记载，买麻藤归肺经、膀胱经。中国传统医学将买麻藤用来祛风去湿、活血散瘀，可以用来治疗关节炎、支气管炎、胰腺炎、膀胱炎、心血管系统疾病等。最新的研究文献证实，ISO可以抑制包括PKC、MAPK以及PI3K-Akt-p70S6K/GSK3b信号途径，通过这些信号途径进而直接或间接地阻断NF-B和AP-1的活性。这些信号途径在肿瘤细胞的发生、发展中也起着极为重要的作用。ISO预处理包括膀胱癌、结肠癌等肿瘤细胞后，应用Western-Blotting和RT-PCR法，分析检测证实XIAP蛋白和mRNA水平均在治疗后显著下降。ISO可抑制膀胱癌细胞增殖，并可通过下调XIAP基因表达,显著增强多西他赛诱导的膀胱癌细胞凋亡，并增强细胞毒性。相关内容尚未见有关报道。
（三）发明内容
本发明目的是提供异丹叶大黄素可选择性下调肿瘤药物治疗靶标-XIAP蛋白的应用，即提供异丹叶大黄素在制备抑制X连锁凋亡抑制蛋白活性药物中的应用，将在基础医学、临床治疗与新药研发等方面具有广阔的应用前景。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种异丹叶大黄素（ISO）在制备抗肿瘤活性药物中的应用，所述应用通过下调X连锁凋亡抑制蛋白基因表达来抑制X连锁凋亡抑制蛋白活性，即所述异丹叶大黄素通过抑制肿瘤细胞内X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）表达来抑制肿瘤细胞增殖。
进一步，所述X连锁凋亡抑制蛋白为肿瘤细胞内的内源性蛋白，具体为异丹叶大黄素通过下调肿瘤细胞内的内源性XIAP基因表达来诱导肿瘤细胞凋亡。
所述肿瘤细胞为膀胱癌T24T细胞、膀胱癌RT112细胞、膀胱癌UMUC3细胞或大肠癌HCT116细胞。
进一步，所述异丹叶大黄素（ISO）在制备抗肿瘤活性药物中的浓度为20～60μmol/L。
本发明所述ISO下调肿瘤细胞内XIAP基因表达来诱导肿瘤细胞凋亡的鉴定方法为：首先通过Western-Blotting和RT-PCR法，分析检测证实肿瘤细胞内的XIAP mRNA和蛋白水平均在治疗后显著下降。通过转录XIAP-启动子荧光素酶报告基因，发现ISO可显著地下调启动子荧光素酶报告基因的活性。接着利用染色质免疫沉淀（CHIP）的方法，证实ISO可以通过抑制转染因子SP1与XIAP启动子的结合从而抑制XIAP基因的转录。因此，ISO通过下调XIAP基因水平显著抑制肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡。
本发明所述利用ISO抑制XIAP活性水平来进行肿瘤基因治疗的方法可应用于多种肿瘤细胞内，比如膀胱癌、结肠癌。
进一步证实，ISO可抑制膀胱癌细胞增殖，并可通过下调XIAP基因表达,显著增强多西他赛诱导的膀胱癌细胞凋亡，并增强细胞毒性。
本发明所述利用ISO抑制XIAP活性水平来治疗恶性肿瘤的药物作用机制为：XIAP是一种多功能生物分子，参与多种受体介导的信号转导，在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。高表达XIAP的肿瘤具有早期易转移、晚期难治、预后差等特点，易耐药等特点。通过下调XIAP蛋白水平，可明显提高消化道肿瘤对化疗药物的敏感性，成为重要的生物治疗靶点之一。
本发明的有益效果主要体现在：本发明利用蛋白免疫印迹、RT-PCR、ATP生物荧光检测法、CHIP等方法证实：ISO预处理多种肿瘤细胞均可显著抑制XIAP基因表达水平，并进而诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖；以肠癌HCT116细胞为模型，外源性XIAP基因转染到XIAP基因敲除型肠癌HCT116细胞，ISO并不能显著诱导肿瘤细胞增殖和凋亡，证实内源性XIAP基因是ISO治疗的有效靶标，特异性抑制XIAP的基因表达，并通过实验证实ISO可有效地提高化疗药物的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡，将在基础医学、临床治疗与新药研发等方面具有广阔的应用前景。
（四）附图说明
图1为ISO可抑制膀胱癌T24T细胞增殖诱导细胞凋亡：不同浓度（0、20、40、60、80μmol/L）的ISO溶液诱导膀胱癌T24T细胞24h后的相差显微镜图。
图2为ISO可诱导膀胱癌T24T细胞凋亡：不同浓度（0、20、40、60、80μmol/L）的ISO溶液诱导膀胱癌T24T细胞24h后的流式细胞仪检测图谱。
图3为ISO诱导膀胱癌T24T细胞PARP蛋白和Caspase-3蛋白裂解的Western-Blot图，以20～60μmol/L ISO溶液与膀胱癌T24T细胞作用24h后，Western-blotting证实ISO可显著地抑制膀胱癌细胞PARP蛋白和Caspase-3蛋白裂解，诱导肿瘤细胞凋亡。
图4为ISO可诱导膀胱癌RT112细胞PARP蛋白裂解的Western-Blot图,以20～60μmol/L ISO溶液与膀胱癌RT112细胞作用24h后，Western-blotting证实ISO可显著地抑制膀胱癌细胞PARP蛋白裂解，诱导肿瘤细胞凋亡。
图5为ISO可诱导膀胱癌UMUC3细胞PARP蛋白裂解的Western-Blot图，以20～60μmol/L ISO溶液与膀胱癌UMUC3细胞作用24h后，Western-blotting证实ISO可显著地抑制膀胱癌细胞PARP蛋白裂解，诱导肿瘤细胞凋亡。
图6为ISO可诱导大肠癌HCT116细胞PARP蛋白裂解的Western-Blot图，以20～60μmol/L ISO溶液与大肠癌HCT116细胞作用24h后，Western-blotting证实ISO可显著地抑制大肠癌HCT116细胞PARP蛋白裂解，诱导肿瘤细胞凋亡。
图7为ISO可降低膀胱癌细胞XIAP蛋白表达水平的Western-Blot图，以20～60μmol/L ISO溶液与膀胱癌T24T细胞作用24h后，Western-blotting证实20、40和60μmol/L ISO可明显下调肿瘤细胞XIAP蛋白表达。
图8为ISO可降低膀胱癌细胞XIAP mRNA表达水平的RT-PCR结果图，以20～60μmol/L ISO溶液与膀胱癌T24T细胞作用24h后，RT-PCR法证实ISO预处理后可显著性下调肿瘤细胞xiap的mRNA表达水平。
图9为ISO可降低膀胱癌细胞核转录因子SP1蛋白表达水平的Western-Blot图，0和60μmol/L ISO溶液作用于T24T细胞12h后，分别收集胞浆和核蛋白，Western-blotting法证实ISO可抑制核转录因子SP1的表达。
图10为ISO可抑制核转录因子SP1结合XIAP启动子区域的能力的CHIP结果图，以60μmol/L ISO溶液预处理膀胱癌T24T细胞12h后，通过染色质免疫沉淀（CHIP）技术，证实ISO可显著抑制SP1直接结合到XIAP启动子区-214至+60之间区域。
图11为ISO不能有效地诱导外源性HA-XIAP转染后的肿瘤细胞PARP和CASPASE-3蛋白的裂解的Western-Blot图，以外源性N-末端的HA尾及HA尾-XIAP质粒分别转染到HCT116细胞和XIAP基因敲除型肠癌HCT116细胞(HCT116 XIAP-/-)，证实ISO不能有效地诱导转染HA-XIAP的HCT116 XIAP-/-细胞出现与凋亡相关的PARP和CASPASE-3蛋白的裂解。
图12为ISO不能有效地诱导外源性HA-XIAP转染后的肿瘤细胞凋亡流式细胞仪检测图谱，以外源性N-末端的HA尾及HA尾-XIAP质粒分别转染到HCT116细胞和XIAP基因敲除型肠癌HCT116细胞(HCT116XIAP-/-)；通过流式细胞仪技术检测细胞周期亚二倍体峰，证实ISO不能有效地诱导转染HA-XIAP的HCT116 XIAP-/-细胞出现与凋亡相关的亚二倍体峰出现。
图13为ISO可增强多西他赛药物的细胞毒性作用剂量药效图；通过ATPase法证实，单用多西他赛组IC50明显低与联用多西他赛、ISO组的IC50(P<0.01)。
图14为ISO可增强多西他赛药物诱导细胞凋亡作用的流式细胞仪检测图谱；经流式细胞仪检测亚二倍体峰，T24T细胞接受多西他赛组凋亡率显著低于联用ISO预处理的凋亡百分率。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请对照《分子克隆实验指南》第三版相应部分（J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社）或参阅所用试剂盒的说明书。ISO由中国协和医科大学药物研究所候琦教授提供，以二甲基亚砜（DMSO）溶解并配置溶液，贮存，终浓度为60m mol/L。
（1）ISO通过抑制膀胱癌T24T细胞增殖进而诱导细胞凋亡
膀胱癌T24T细胞（纽约大学医学院Huang CS实验室）长满70%后，0.1%血清饥饿细胞24小时后，并与不同浓度的ISO溶液（终浓度0、20、40、60、80μmol/L）预处理24h后，显微镜下观察细胞形态学变化，结果见图1所示，结果显示：随着ISO浓度的增加，凋亡细胞明显增多，表现为染色质凝集，细胞核碎裂等典型细胞凋亡特征性变化。
（2）ISO诱导膀胱癌T24T细胞凋亡
膀胱癌T24T细胞长满70%后，0.1%血清饥饿细胞24小时，并与不同浓度的ISO(0、20、40、60、80μmol/L)预处理24h后，0.25%胰酶消化5min，收集细胞，体积浓度70%乙醇水溶液固定后4℃保存24h以上。600×g离心5min，并用PBS液(含有体积浓度0.5%BSA和体积浓度0.1%Triton X-100)洗2次。加入PI染色液避光保存30min后，用流式细胞仪（Beckman Coulter,Miami,FL，USA）检测细胞周期DNA含量和凋亡细胞百分数，结果如图2所示，40μmol/L浓度以上的ISO可不同程度地诱导肿瘤细胞凋亡，呈现明显的剂量依赖性。
（3）ISO可诱导膀胱癌T24T细胞PARP蛋白和Caspase-3蛋白裂解
膀胱癌T24T细胞长满70%后，0.1%血清饥饿细胞24小时，分别以0、20、40、60μmol/L ISO溶液与饥饿处理后的膀胱癌T24T细胞在37℃、5%CO2细胞培养箱内作用24h后，加入细胞裂解液(10mmol/LTris-HCl(pH7.4)，1%SDS，1mmol/L Na3VO4)常规收集细胞蛋白。将收集的膀胱癌T24T细胞蛋白采用Bio-Rad凯氏定氮法定量。采用WesternBlotting法检测膀胱癌T24T细胞株中PARP蛋白和Caspase-3蛋白表达情况。转膜后先后与10g/l脱脂奶粉、鼠抗人PARP、Caspase-3和GADPH一抗4℃孵育过夜，过氧化物酶偶联的二抗孵育，运用ECLWestern-blotting kit显色并扫描实验结果。结果见图3所示，表明ISO可显著地抑制膀胱癌细胞PARP蛋白和Caspase-3蛋白裂解，诱导肿瘤细胞凋亡。
（4）ISO可诱导膀胱癌RT112细胞PARP蛋白裂解
膀胱癌RT112细胞（购自ATCC）长满70%后，0.1%血清饥饿细胞24小时，以0、20、40、60μmol/L ISO溶液与膀胱癌RT112细胞在37℃、5%CO2细胞培养箱内作用24h后，细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl(pH7.4),1%SDS,and 1mmol/L Na3VO4)收集细胞蛋白。Bio-Rad凯氏定氮法定量。采用Western Blotting法检测膀胱癌RT112细胞株中PARP蛋白。转膜后先后与10g/l脱脂奶粉、鼠抗人PARP和GADPH一抗4℃孵育过夜，过氧化物酶偶联的二抗孵育，运用ECL Westernblot kit显色并扫描实验结果。结果见图4所示，表明ISO可显著地抑制膀胱癌RT112细胞PARP蛋白裂解，诱导肿瘤细胞凋亡。
（5）ISO可诱导膀胱癌UMUC3细胞PARP蛋白裂解
膀胱癌UMUC3（购自ATCC公司）细胞长满70%后，0.1%血清饥饿细胞在37℃、5%CO2细胞培养箱内培养24小时，以20～60μmol/L（0、20、40、60μmol/L）ISO溶液与膀胱癌UMUC3细胞作用24h后，细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl(pH7.4),1%SDS,and 1mmol/L Na3VO4)收集细胞蛋白。Bio-Rad凯氏定氮法定量。采用Western Blotting法检测肿瘤细胞株中PARP蛋白。转膜后先后与10g/l脱脂奶粉、鼠抗人PARP和GADPH一抗4℃孵育过夜，过氧化物酶偶联的二抗孵育，运用ECLWesternblot kit显色并扫描实验结果。结果见图5所示，表明ISO可显著地抑制膀胱癌UMUC3细胞PARP蛋白裂解，诱导肿瘤细胞凋亡。
（6）ISO可诱导大肠癌HCT116细胞PARP蛋白裂解
大肠癌HCT116（购自ATCC公司）细胞长满70%后，0.1%血清饥饿细胞24小时，以0、20、40、60μmol/L ISO溶液与大肠癌HCT116细胞在37℃、5%CO2细胞培养箱内培养24h后，细胞裂解液(10mmol/LTris-HCl(pH7.4),1%SDS,and1mmol/L Na3VO4)收集细胞蛋白。Bio-Rad凯氏定氮法定量。采用Western Blotting法检测肿瘤细胞株中PARP蛋白。转膜后先后与10g/l脱脂奶粉、鼠抗人PARP和GADPH一抗4℃孵育过夜，过氧化物酶偶联的二抗孵育，运用ECL Westernblot kit显色并扫描实验结果。结果见图6所示，表明ISO可显著地抑制大肠癌HCT116细胞PARP蛋白裂解，诱导肿瘤细胞凋亡。
（7）ISO可降低膀胱癌细胞XIAP蛋白表达水平
以膀胱癌T24T细胞为研究对象。以0、20、40、60μmol/L ISO与膀胱癌T24T细胞在37℃、5%CO2细胞培养箱内作用24h后，以细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl(pH7.4),1%SDS,and 1mmol/L Na3VO4)收集细胞蛋白。Bio-Rad凯氏定氮法定量。采用Western Blotting法检测肿瘤细胞株中XIAP蛋白水平。转膜后先后与10g/l脱脂奶粉、鼠抗人XIAP和GADPH一抗4℃孵育过夜，过氧化物酶偶联的二抗孵育，运用ECL Westernblot kit显色并扫描实验结果。结果如图7所示，以膀胱癌T24T细胞为实验对象，20、40和60μmol/L ISO溶液可明显下调肿瘤细胞XIAP蛋白表达。
（8）ISO可降低膀胱癌细胞XIAP mRNA表达水平
膀胱癌T24T细胞长满70%后，0.1%血清饥饿细胞24小时，0、20、40和60μmol/L ISO溶液在37℃、5%CO2细胞培养箱内作用于T24T细胞24h后，收集细胞并用TRIzol试剂（Invitrogen公司，加利福尼亚州，美国）中提取总RNA，并合成cDNA的逆转录PCR系统。RT-PCR检测XIAP mRNA时，XIAP cDNA扩增的正义引物序列：5’-TTTCCAGATTGGGGCTCGGG-3’；反义引物序列：5’-CCCTGCTCGTGCCAGTGTTGAT-3’。扩增对照GAPDH cDNA的的正义引物序列：5’-GATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3’；反义引物序列：5’-CAGGGCTGCTTTTAACT CTG-3’。结果如图8所示，ISO预处理后可显著性下调xiap的mRNA表达水平。
（9）ISO可降低膀胱癌细胞核转录因子SP1蛋白表达水平
TFANSFAC
转录因子结合位点软件（生物数据库，沃芬布特尔，德国）用于XIAP启动子区的生物信息学分析。膀胱癌T24T细胞长满70%后，0.1%血清饥饿细胞24小时，0和60μmol/L ISO溶液作用于膀胱癌T24T细胞12h后，分别收集胞浆和核蛋白。Bio-Rad蛋白定量法定量后，取40μg胞浆和核蛋白，进行Western-Blotting印迹。如图9所示，证实ISO可抑制核转录因子SP1的表达。
（10）ISO可抑制核转录因子SP1结合XIAP启动子区域的能力
以60μmol/L ISO溶液预处理膀胱癌T24T细胞12h后，用体积浓度1％的甲醛交联基因组DNA和蛋白质；重悬于裂解缓冲液(1%SDS,10mmol/L EDTA,50mmol/L Tris-HCl pH8.0，以及蛋白酶抑制剂如1mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）,1μg/ml抑肽酶以及1μg/ml胃蛋白酶抑制剂A)；超声处理以产生200-500bp的染色质的DNA片段。离心后，将上清液稀释10倍，然后与抗SP1抗体或控制兔IgG在4℃下过夜温育。免疫复合物被Protein G琼脂糖饱和的鲑鱼精子DNA洗脱。DNA-蛋白质65℃下过夜加热解交联，纯化富集的DNA片断，PCR扩增XIAP启动子序列的正义引物：5’-TTTTACTTTATGACTTGAATGATGTGG-3’(从-214到-187)；反交引物序列：5’-TTCCTTATTGATGTCTGCAGGT-3’(从+39到+60)。并进行PCR分析。如图10所示，通过染色质免疫沉淀（CHIP）技术，证实ISO可显著抑制SP1直接结合到XIAP启动子区-214至+60之间区域。
（11）ISO不能有效地诱导外源性HA-XIAP转染后的肿瘤细胞PARP和CASPASE-3蛋白的裂解
以外源性N-末端的HA尾及HA尾-XIAP质粒分别转染到HCT116细胞和XIAP基因敲除型肠癌HCT116细胞(HCT116 XIAP-/-)。如图11所示，以60μmol/L ISO溶液分别预处理HCT116（Vector）和HCT116XIAP-/-（HA-XIAP）细胞24h后，证实ISO不能有效地诱导细胞出现与凋亡相关的PARP和CASPASE-3蛋白的裂解。证实ISO下调XIAP表达是与其参与诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。
（12）ISO不能有效地诱导外源性HA-XIAP转染后的肿瘤细胞凋亡
以外源性N-末端的HA尾及HA尾-XIAP质粒分别转染到HCT116细胞和XIAP基因敲除型肠癌HCT116细胞(HCT116 XIAP-/-)。如图12所示，以60μmol/L ISO分别预处理HCT116（Vector）和HCT116（HA-XIAP）细胞24h后，证实ISO不能有效地诱导肿瘤细胞出现与凋亡相关的亚二倍体峰峰的出现。证实ISO下调XIAP表达是与其参与诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。
（13）ISO可增强多西他赛药物的细胞毒性作用
膀胱癌T24T细胞分别与0、1、2、5、10nmol/L的多西他赛，联合或不联合20μmol/L ISO溶液在37℃、5%CO2细胞培养箱内预处理48h后，检测细胞的ATPase活力。如图13所示，单用多西他赛组IC501.02±0.38nmol/L明显低于联用多西他赛和ISO组的IC508.78±1.32nmol/L(P<0.01)。
（14）ISO可增强多西他赛药物诱导细胞凋亡作用
膀胱癌T24T细胞分别与2.5nmol/L多西他赛、2.5nmol/L多西他赛联合20μmol/L ISO溶液预处理48h后，如图14所示，经流式细胞仪检测，T24T细胞接受多西他赛组凋亡率显著低于联用ISO预处理的凋亡百分率（n=3，P<0.01）。
Claims (4)
1.异丹叶大黄素在制备抗肿瘤活性药物中的应用，其特征在于所述应用通过下调X连锁凋亡抑制蛋白基因表达来抑制X连锁凋亡抑制蛋白活性。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述X连锁凋亡抑制蛋白为肿瘤细胞内的内源性蛋白。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞为膀胱癌T24T细胞、膀胱癌RT112细胞、膀胱癌UMUC3细胞或大肠癌HCT116细胞。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述异丹叶大黄素在制备抗肿瘤活性药物中的浓度为20～60μmol/L。
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|---|---|---|---|---|
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130710 |