CN103179991B - 癌症的体内成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可用于诊断和监测其中有异常PBR表达的癌症的方法。本发明方法特别可用于评估癌症的严重性，例如，PBR表达与细胞增殖速率、转移潜能、肿瘤侵略性、恶性肿瘤进展相关。因此，本发明的方法可应用于确定可能的疾病进展和做出相关的预后。此外，本发明的方法可应用于确定某些治疗方法的可能的成功或应用于评估某些提出的新疗法的功效。

Description

癌症的体内成像方法
发明技术领域
本发明涉及体内成像，具体来说是外周苯并二氮杂受体(PBR)的体内成像。具体而言，本发明提供可用于诊断和监测癌症的方法。
相关技术描述
外周苯并二氮杂受体(PBR，亦称作易位蛋白(TSPO))是涉及细胞增殖的线粒体蛋白。已知PBR主要位于周缘组织和神经胶质细胞，但其生理功能有待阐明清楚。已知PBR在亚细胞水平位于线粒体外膜上，这表明其在调节线粒体功能和在免疫系统中的潜在作用。已进一步假定，PBR涉及细胞增殖、类固醇生成、钙流和细胞呼吸。
已观察到PBR表达和癌症病理生理学之间的联系。在神经胶质瘤细胞系中，已表征PBR密度与增强的致瘤性和细胞增殖速率(Veenman等, Biochem Pharmacol 2004; 68:689-98)以及癌症的转移潜能两者(Rechichi等, Biochim Biophys Acta 2008; 1782:118-25)之间的高度相关性。在乳腺肿瘤的动物模型中，在非侵略性肿瘤中PBR的总表达([3H]Ro5-4864的Bmax)增加了56%，但在侵略性肿瘤中显著更多(128%) (Mukhopadhyay等，Glycoconj J 2006; 23: 199-207)。同样地，Hunakova等(Neoplasma 2007; 54: 541-8)将乳腺癌以及卵巢癌细胞系中的PBR表达与肿瘤侵略性关联。其显示出与线粒体浓度极少相关，但与恶性肿瘤进展有极强的相关性。高PBR密度还显示是顺铂-敏感性和非敏感性卵巢癌细胞系之间的显著差异标记。在神经胶质瘤细胞中显示了PBR和肿瘤侵略性之间的直接联系，所述神经胶质瘤细胞与野生型细胞相比，过量表达表现出增强增殖、运动性和迁移能力的受体(Rechichi等, Biochim Biophys Acta 2008; 1782: 118-25)。Zheng等(MolPharmaceutics 2011; 8: 823-2)使用免疫组化发现，相当大部分的肿瘤间质PBR表达与F4/80阳性巨噬细胞共定位。在高度侵略性MDA-MB-231乳腺癌细胞系中，通过siRNA敲除PBR的表达导致细胞增殖的减少(Li等, Biochem Pharmacol 2007; 73: 491-503)。这些研究提示肿瘤侵略性和PBR表达之间的联系是一种直接的而非继发性的或附带的病理生理联系。这进一步提示，可能通过PBR表达的减少来反映成功治疗，所述表达的减少是在乳腺、神经胶质瘤和肝癌细胞系中观察到的研究结果(Pretner等, Anticancer Res 2006; 26: 9-22)。
上述体外观察结果已在体内反映，证实了PBR、肿瘤侵略性和患者存活之间的联系。Maaser等(Clin Cancer Res. 2002; 8: 3205-9)在组织学上检查了切除的III期结肠直肠癌。将患者再分为‘高’和‘低’PBR表达组，作者显示了平均存活期差异30个月，推断出PBR过表达是这种癌症的独立预后因素。Miettnen等(Cancer Res 1995; 55: 2691-5)显示86例星形细胞脑肿瘤的严重性等级与PBR表达的强度之间紧密相关(P<0.0012)，由此在37例IV级肿瘤(最严重的)中，86%为PBR‘中等或更高’表达，64%为‘极高’表达。相比之下，在9例I级肿瘤中，66%‘几乎没有或没有’PBR表达，并且无一具有‘极高’表达。亦在PBR表达和增殖指数(通过Ki-67免疫组化来确定)之间观测到明确的相关性。分析‘低或无表达’组与‘中等至极高表达’组的患者存活，将PBR表达与较弱的结果显著关联。同样地，Vlodavsky和Soustiel (J Neurooncol 2007; 81: 1-7)将PBR表达与存活负相关，而与肿瘤恶性、增殖和凋亡指数正相关。
在乳腺癌中，Galiegue等(Clin Cancer Res 2004; 10: 2058-64)显示， PBR在肿瘤细胞中与在正常组织中相比增加，且与增殖标记Ki-67紧密相关。通过分析‘高’和‘低’表达组的存活，作者亦提示PBR作为淋巴结阴性患者的预后标记的有用性。
Nagler等(Biochim Biophys Acta 2010; 1802(5): 454-61)在患有口腔癌的患者的研究中证明，PBR表达增加和存活时间减少之间直接相关。五年存活概率从PBR阴性肿瘤患者中的65%降至高度表达PBR的患者中的7% (p < 0.001)。
Fafalios等(Clin Cancer Res 2009; 15(19): 6177-84)显示，与正常前列腺组织及良性前列腺增生症比较，在前列腺上皮内瘤、原发性前列腺癌和转移灶中PBR表达增加。亦见到恶性疾病进展与观察到的随Gleason分数增加而增加的PBR水平相关。此外，前列腺癌转移灶在所有检测的组织中显示出最高的PBR表达水平。
亦已报道PBR表达和纤维肉瘤肿瘤之间的联系(Yamasaki等, J Radiat Res2010; 51: 57-65和Nucl Med Biol 2009; 36(7): 801-9)。
本领域已知许多靶向PBR的体内成像剂。一直认为[11C]PK11195是针对PBR的金标准PET配体，并且已将其用于很多临床和临床前研究。然而，[11C]PK11195遭受高的和可变的血浆蛋白结合和高亲脂性，导致相对低的和可变的脑摄取和相对高水平的非特异性结合，这可导致不一致的成像结果(Lockhart等, Nucl Med Biol 2003; 30(2):199-206)。
最近在针对[11C]PK11195的临床前和临床情境中研究了DPA、DAA和其它系列的11C和18F衍生物，并已做出主张：这些化合物具有较高的特异性摄取。选择的这些成像剂图示如下：
Chaveau等(J Nuc Med 2009; 50(3): 468-476)报道，因为其增加的生物利用度，18F-DPA-714是11C-PK11195的有吸引力的备选。已在人中对通过NIMH显像的DAA1106的11C标记的类似物(命名为PBR28)进行了评估，用以对包括多发性硬化症(MS)和动脉粥样硬化症在内的炎性病况成像(Fujita等, Neuroimage 2008; 40(1): 43-52)。
在同时待审的专利申请WO 2010/109007中，阐述了一系列放射性标记的三环吲哚成像剂，其相对于所有上述体内成像剂具有改进性质。将这些三环吲哚体内成像剂阐述为可用于诊断其中PBR异常表达的炎性病况，并且特别是神经炎性病况。
需要可用于诊断和监测癌症的改进方法。
发明概述
本发明提供可用于诊断和监测其中有异常PBR表达的癌症的方法。本发明方法特别可用于评估癌症的严重性，例如，PBR表达与细胞增殖速率、转移潜能、肿瘤侵略性、恶性肿瘤进展相关。因此，本发明的方法可应用于确定可能的疾病进程和相关的预后。此外，本发明的方法可应用于确定某些治疗方法的可能的成功或可应用于评估某些提出的新疗法的功效。
附图简述
图1显示成像剂5 (按照实施例1制备)和非放射性成像剂5 (按照实施例2制备)的共洗脱。
图2显示成像剂6 (按照实施例3制备)和非放射性成像剂6 (按照实施例4制备)的共洗脱。
图3显示成像剂7 (按照实施例5制备)和非放射性成像剂7 (按照实施例6制备)的共洗脱。
图4显示成像剂8 (按照实施例7制备)和非放射性成像剂8 (按照实施例8制备)的共洗脱。
图5显示成像剂10 (上)和7-氟-9-(2-[18F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(中)和7-氟-9-(2-[19F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(下) (各自按照实施例9获得)。
图6显示成像剂11 (按照实施例11制备)和非放射性成像剂11 (按照实施例12制备)的共洗脱。
图7和8分别显示使用以上用于本发明的PET示踪物及其备选对映异构体的半制备方法获得的放射性(上)和UV (下) HPLC图谱(traces)。
图9和10分别显示使用以上用于本发明的PET示踪物及其备选对映异构体的分析型非手性方法获得的HPLC图谱。
图11和12分别显示使用以上用于本发明的PET示踪物及其备选对映异构体的手性HPLC方法获得的HPLC图谱。
图13-18分别图示了成像剂5-8、10和11在脑中的生物分布概况。
发明详述
在一个方面,本发明提供用于在受试者中鉴定和/或监测癌症的方法，其中所述癌症的特征为外周苯并二氮杂受体(PBR)的异常表达，其中所述方法包括以下步骤：
(a)将式I的体内成像剂给予所述受试者：
(I)
其中：
R1为C1-3烷基或C1-3氟烷基；
R2为氢、羟基、卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷基或C1-3氟烷氧基；
R3和R4独立为C1-3烷基、C7-10芳烷基，或R3和R4与其所连接的氮一起形成含氮的C4-6脂肪族环，该环任选包含1个选自氮、氧和硫的另外的杂原子；
Y1为O、S、SO、SO2或CH2；和
Y2为CH2、CH2-CH2、CH(CH3)-CH2或CH2-CH2-CH2；
并且其中所述式I的体内成像剂包含其为适于体内成像的放射性同位素的原子；
(b)让步骤(a)中所述给予的体内成像剂与所述受试者中表达的PBR结合；
(c)使用适宜的体内成像程序，检测由包含在步骤(b)的所述结合的体内成像剂中的放射性同位素发出的信号；
(d)产生代表步骤(c)中检测到的所述信号的分布和/或程度的图像；
(e)测定所述受试者中PBR表达的分布和/或程度，其中所述表达与如步骤(d)中产生的所述图像代表的所述信号的分布和/或程度直接相关；和
(f)在鉴定和/或监测所述癌症中使用如步骤(e)中测定的PBR表达的分布和程度。
术语“鉴定”用于包括临床和临床前两种情况。在其中受试者是患者的临床情况中，该术语指医学诊断，即基于在所选择的试验中收集到的信息确定患者是否患特定疾病或病况，和/或确定疾病或病况的性质。所述确定可用于选择最适当的治疗方法中或获得预后。所用的术语“预后”意为疾病的可能结果。
本文使用术语“监测”指随时间推移受试者中疾病或病况进程进行的评估，特别是在评估治疗方案的功效的情况下。
本发明中的“受试者”可为任何人或动物受试者。优选本发明的受试者为哺乳动物。最优选所述受试者为体内完整的哺乳动物身体，例如通常用于临床前试验的人或哺乳动物，包括天然动物和癌症的动物模型。在特别优选的实施方案中，本发明的受试者为人。亦优选本发明的受试者为已知或疑似患有癌症，其中将术语“癌症”定义为在其中一组细胞显示出不可控制的生长(分裂超过正常限度)、侵袭(侵入或破坏相邻组织)和有时转移(经由淋巴或血液扩散到身体的其它位置)的疾病类别。癌症的这三种恶性性质将其与自身受限且不侵袭或转移的良性肿瘤区分开来。特别是在本发明情况下所述癌症的病理生理学包含PBR的异常表达。这类癌症的非限制性实例为：神经胶质瘤、星形细胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、纤维肉瘤、口腔癌和结肠直肠癌。
“给予”体内成像剂的步骤优选胃肠外最优选静脉内实施。静脉内途径是递送体内成像剂至受试者全身以接触在所述受试者中表达的PBR的最有效方式。静脉内给予不会产生显著的身体干预或显著的健康风险。
本发明的体内成像剂优选作为“放射性药物组合物”给予，所述放射性药物组合物包含所述体内成像剂连同药理学上可接受的载体。
“药理学上可接受的载体”为体内成像剂悬浮或溶解于其中的流体，特别是液体，使得组合物是生理学上可忍受的，即可给予至哺乳动物身体而无毒性或过度不适。药理学上可接受的载体适宜为：可注射的载体液体，例如无菌、无热原的注射用水；水溶液，例如盐水(其可有利地平衡使得用于注射的最终产品为等渗或不低渗的)；一种或多种张度调节物质(例如等离子体阳离子与药理学上可接受的反荷离子的盐)的水溶液、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇或甘露糖醇)、二醇(例如甘油)或其它非离子多元醇物质(例如聚乙二醇、丙二醇等等)。药理学上可接受的载体亦可包含药理学上可接受的有机溶剂，例如乙醇。这类有机溶剂可用于溶解更多的亲脂化合物或制剂。优选药理学上可接受的载体为无热原的注射用水、等渗盐水或乙醇水溶液。用于静脉内注射的药理学上可接受的载体的pH适宜在4.0-10.5范围。
放射性药物组合物最优选为水溶液。所述组合物可任选含有更多的成分，例如缓冲剂；药理学上可接受的增溶剂(例如环糊精或表面活性剂，例如Pluronic、吐温或磷脂)；药理学上可接受的稳定剂或抗氧化剂(例如抗坏血酸、龙胆酸或对氨基苯甲酸)。
在本发明上下文中，术语“体内成像剂”指适于体内成像的放射性标记化合物。本文所用术语“体内成像”指非侵入地对受试者内部状况(aspect)的全部或部分产生图像的那些技术。适于本发明上下文的体内成像技术的实例为单光子发射断层摄影术(SPECT)和正电子发射断层摄影术(PET)，两者都是体内成像领域的熟知技术(读者可参考例如“发射断层摄影术：PET和SPECT的原理” (Emission Tomography: the Fundamentals of PETand SPECT); 2004 Academic Press: Wernick 和Aarsvold, 编辑)。
除非另有说明，单独或组合中的术语“烷基”意为直链或支链烷基，除非另有说明，其优选含有1-3个碳原子。所述基团的实例包括甲基、乙基和丙基。
术语“氟烷基”代表以下定义的卤素烷基，其中卤素为氟。
术语“羟基”指基团-OH。
术语"卤素”或“卤代”意为选自氟、氯、溴或碘的取代基。“卤代烷基”和“卤代烷氧 基”分别为用一个或多个卤素取代的如上定义的烷基和烷氧基。在卤代烷基和卤代烷氧基取代基的情况下，卤素适宜地置换所述基团末端的氢，即-亚烷基-卤素或-亚烷氧基-卤素。术语“亚烷基”指二价基团-(CH2)n-，其中n优选1-3，术语“亚烷氧基”指包含醚键的亚烷基基团，其中醚键如下所定义。
术语“氰基”指基团-CN。
除非另有说明，否则术语“烷氧基”意为包含醚键的如上定义的烷基，术语“醚键”指基团-C-O-C-。合适的烷基醚基的实例包括甲氧基、乙氧基和丙氧基。
术语“氟代烷氧基”代表如上定义的卤代烷氧基，其中卤素为氟。
术语“芳烷基”指-亚烷基-苯基，其中亚烷基如上定义。
“含氮的C 4-6 脂肪族环”为包含氮杂原子的饱和C4-6烷基环。实例包括吡咯烷基、哌啶基和吗啉基环。
在式I的情况下，术语“包含其为适于体内成像的放射性同位素的原子”，意为本文针对所述化学式定义的原子的一或多种(优选一种)的同位素形式是适于体内成像的放射性同位素。为了适于体内成像，将放射性同位素给予所述受试者之后，可在外部例如使用诸如SPECT或PET的体内成像技术对其检测。
“让”步骤(a)中所述给予的体内成像剂与在所述受试者中表达的PBR结合的步骤在给予步骤之后和在检测步骤之前。例如，当受试者为完好的哺乳动物时，体内成像剂将在哺乳动物身体内动态移动，接触其中的各种组织。体内成像剂一旦与PBR接触，便发生特异性的相互作用，使得体内成像剂从含PBR的组织中的清除时间比从不含或含少量PBR的组织中的清除时间花费更长。当作为结合含PBR的组织的体内成像剂与结合不含或含少量PBR的组织的体内成像剂之间的比率的结果，能够检测特异性结合PBR的体内成像剂时，将达到某个时间点。当观察到组织表达较高水平的PBR时，这可能是该组织是癌症组织的征兆。癌症组织由恶性肿瘤和非恶性肿瘤细胞(即内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞)组成，PBR表达可与任何这些细胞类型有关。如Zheng等(Mol Pharmaceutics 2011; 8: 823-2)所指出的，乳腺癌肿瘤中相当大部分肿瘤间质PBR表达与F4/80阳性巨噬细胞共定位。
本发明方法的“检测”步骤涉及借助对所述信号敏感的检测器来检测由所述体内成像剂的放射性同位素发出的信号。亦可将该检测步骤理解为获取信号数据。单光子发射断层摄影术(SPECT)和正电子发射断层摄影术(PET)是最适宜用于本发明方法的体内成像程序。
本发明方法的“产生”步骤由计算机来实施，其对获取的信号数据应用重构算法以产生数据集。然后处理该数据集以产生显示由所述放射性同位素发出的信号的位置和/或量的图像。因此，发出的信号与PBR的表达直接相关，使得然后可通过评估产生的图像来实施“测定”步骤。
可将在鉴定和/或监测所述癌症中“使用”步骤(e)中测定的信息的步骤理解为包括鉴定所述受试者中癌症的存在情况，优选作为在选择适宜的疗法或测定患者的预后中进行诊断的辅助。在鉴定癌症存在情况的情况中，将步骤(e)中获得的信息与在正常受试者(即，已知未患癌症的受试者)组群中用相同的体内成像方法获得的数据比较。以这种方式可测定PBR表达中与正常值的任何显著偏差，并且可将该偏差归因于特定的临床情景。为监测所述癌症，将步骤(e)中获得的信息与较早时间点使用对同一受试者中实施的相同体内成像方法获得的数据比较。各个时间点获得的信息之间的差异可指示癌症的进展或消退。使用步骤亦包括监测，其作为评估疗法成功的手段，或在作为新疗法的受试化合物的潜在功效的测定中。设想将本发明的方法亦可用于正在开发的疗法的测试和优化的临床前情境中。
优选的式I的体内成像剂适于用单光子发射计算断层摄影术(SPECT)或正电子发射断层摄影术(PET)成像。对于SPECT，所述体内成像剂适宜地包含发射γ-的放射性卤素。适用于本发明的发射γ的放射性卤素实例为123I、131I和77Br。优选的发射γ的放射性卤素为123I。当体内成像剂的放射性同位素为123I时，优选R2为123I。对于PET，所述体内成像剂适宜地包含发射正电子的放射性非金属。适用于本发明的发射正电子的放射性非金属的实例为11C、18F和124I。优选发射正电子的放射性非金属为11C和18F。在11C的情况下，优选R1为11C甲基。当放射性同位素为18F时，优选R1为C2-3 [18F]氟烷基，最优选-乙烯-18F。
因其优良的灵敏度和分辨率，在本发明方法中特别优选PET，使得即使是相对小的损害变化也可随时间推移观察到，这在监测疾病随时间进展例如对治疗的应答中尤为有用。PET扫描仪常规测量在皮摩尔范围内的放射性浓度。现在微-PET扫描仪接近约1mm的空间分辨率，临床扫描仪为约4-5mm。
当本发明的体内成像剂中存在手性中心或异构中心的另一形式时，所述异构体的所有形式，包括对映异构体和非对映异构体，都涵盖在本发明之内。含有手性中心的本发明的体内成像剂可作为外消旋混合物或作为富含对映异构体的混合物使用，或可用熟知的技术分离外消旋混合物，并且可单独使用单个的对映异构体。
在本发明的方法中：
式I的R1优选甲基或C2-3氟烷基；
式I的R2优选氢、卤素、C1-3烷氧基或C1-3氟烷氧基；
式I的R3和R4独立优选甲基、乙基或苄基；或与其所连接的氮一起形成含氮的C5-6脂肪族环；
式I的Y1优选CH2；
式I的Y2优选CH2-CH2。
在优选实施方案中，本发明方法中使用的所述式I的体内成像剂为式Ia：
　(Ia)
其中：
R2a为氢、卤素或C1-3烷氧基；
R3a和R4a独立为甲基、乙基或苄基；或与其所连接的氮一起形成吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基或吗啉基环；
Y2a为如上对式I的Y 2所定义；和
n为1、2或3。
对于式Ia，优选：
R3a和R4a二者均为乙基；或R3a为甲基，R4a为苄基；或与其所连接的氮一起形成氮杂环庚烷基；
R2a为氢、甲氧基或氟；
Y2a为CH2-CH2或CH(CH3)-CH2；和
n为2。
适用于本发明方法的式Ia的体内成像剂的一些非限制性实例如下：
特别优选用于本发明方法的体内成像剂为上表中所阐明的体内成像剂5。最特别优选该成像剂的对映异构体，其中手性中心具有(S)构型(上表中阐明为成像剂12)。
通过让前体化合物与适宜的放射性同位素源反应来制备上述体内成像剂。适宜的所述前体化合物为式II：
　(II)
其中R11和R12之一包含与如上所定义的适宜的放射性同位素源反应的化学基团，以便在所述前体化合物与所述放射性同位素的所述合适源反应时形成体内成像剂，并且R11和R12中的另一个分别如本文对R1和R2所定义，任选包含保护基团；和
R13-14和Y11-12分别如本文对R3-4和Y1-2所定义，任选各进一步包含保护基团。
“前体化合物”包含放射性标记化合物的非放射性衍生物，将其设计使得：与可检测标记的方便的化学形式的化学反应位点特异性地发生；可以最少数量的步骤实施(理想上为单个步骤)；和不需要显著纯化(理想上为无需进一步纯化)，以产生所期需的式I的体内成像剂。所述前体化合物是合成的，且可方便地以良好化学纯度获得。
术语“保护基团”意为抑制或遏抑不需要的化学反应的基团，但其经设计为具有足够活性，可在不改变分子其他部分的足够温和的条件下将其从目的官能团上切割，以获得期望的产物。保护基团为本领域技术人员所熟知，并阐述于Theorodora W. Greene和PeterG. M. Wuts的‘有机合成中的保护性基团’ (Protective Groups in OrganicSynthesis)，(第三版, John Wiley & Sons，1999)中。
术语“适宜的放射性同位素源”意为呈这样的化学形式的放射性同位素，所述化学形式与前体化合物的取代基具有反应活性以便放射性同位素与前体化合物共价连接。对在以下部分中出现的每一种具体的放射性同位素，论述了一种或多种适宜的放射性同位素源。体内成像剂领域内的技术人员应熟悉这些放射性同位素源和适用于本发明应用的其它放射性同位素源。
以下流程1是显示如何获得可自身用作适宜前体化合物或可用少量另外的步骤转变成前体化合物的化合物的通用反应流程。流程1的R11-14和Y11-12如以上对于式II所定义。
或者，当前体化合物的R12在环的顶部位置时，可使用以下流程1a所阐明的通用合成路线：
在以上流程1a中，-R11a-PG代表受保护的R11基团，其中R11如本文中所合适和优选定义的。当R11为羟基时，-R11a-PG可例如是-O-苄基。R12-14和Y11-12如对于以上式II所合适和优选提供，条件是R12不是氯。在该合成路线中，环中底部位置的氯仅以一种方式促使环化发生，使得仅产生一种异构体。WO 2003/014082中公开了类似的方法，但其中环化步骤中使用的溶剂系统是乙醚而不是甲苯。环化步骤的产物溶解于乙醚中，而未环化的初始化合物则不溶解。因此，未环化的初始化合物与ZnCl2一起保留在反应容器的底部，环化的产物则进入反应容器上部的乙醚中。
当体内成像剂的放射性同位素为18F时，可通过亲核置换前体化合物中的离去基团来实现18F标记。适宜的离去基团包括Cl、Br、I、甲苯磺酸根(OTs)、甲磺酸根(mesylate,OMs)和三氟甲磺酸根(triflate, OTf)。另一策略可为存在于前体化合物上的烷基酰胺基的适当位置上具有适宜的离去基团。在这两种情况下，可通过与适宜的[18F]-氟离子(18Fֿ)源反应来一步标记前体化合物，其通常作为来自核反应18O(p,n)18F的水溶液获得，并通过加入阳离子型反荷离子并随后去除水来使其具有反应性。亦可通过前体化合物中的羟基与18F(CH2)3-LG的O-烷化作用来引入18F，其中LG代表如上所定义的离去基团。或者，放射性氟原子可经由直接共价键与诸如苯环等芳环连接。对于芳基系统，从芳基重氮盐、芳基硝基化合物或芳基季铵盐的18F-氟化物亲核置换是得到芳基-18F衍生物的适宜路线。
可继续上述的流程1或流程1a来获得适于获得用于本发明方法的18F体内成像剂的前体化合物，例如其如以下流程2所阐明：
起始化合物和中间体可市购，或从发表的科学论文知悉，例如Napper等, J MedChem 2005; 48: 8045-54；Davies等, J Med Chem 1998; 41: 451-467。
可通过让前体化合物与11C碘代甲烷反应来合成11C-标记的PET示踪化合物。因为11C的半衰期仅为20.4分钟，中间体11C碘代甲烷具有高比放射性就很重要，因此，其使用尽可能快的反应过程来产生。所述11C-标记技术的全面综述可参见M.J. Welch和C.S.Redvanly编辑的放射性药物手册(Handbook of Radiopharmaceuticals)中Antoni等的“11C-标记化合物的合成的各方面”(Aspects on the Synthesis of 11C-LabelledCompounds) (2003, John Wiley和Sons)。
可通过继续流程1来获得用于本发明方法的11C-标记的体内成像剂，其如以下流程3所阐明：
当成像部分是放射性碘时，前体化合物可包含任一种经历亲电碘化的衍生物。其实例为有机金属衍生物，例如三烷基锡烷(例如三甲基锡烷或三丁基锡烷)或三烷基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基)或有机硼化合物(例如硼酸酯类或有机三氟硼酸盐)。
对于亲电放射性碘化，前体化合物包含：有活性的有机金属前体化合物(例如三烷基锡、三烷基甲硅烷基或有机硼化合物)。Bolton (J. Lab. Comp. Radiopharm. 2002;45: 485-528)阐述了前体化合物和将放射性碘引入到有机分子中的方法。Kabalaka等(Nucl. Med. Biol., 2002; 29: 841-843 and 2003; 30: 369-373)阐述了适宜的硼酸酯类有机硼酸化合物及其制备。Kabalaka等 (Nucl. Med. Biol., 2004; 31: 935-938)阐述了适宜的有机三氟硼酸盐及其制备。
可通过继续流程1来获得用于本发明方法的放射性碘标记的体内成像剂，其如以下流程4所阐明：
可通过与上述放射性碘化类似的方法来实现放射性溴化。Kabalka和Varma综述了用于合成包括放射性溴化化合物在内的放射性卤化化合物的各种方法(Tetrahedron1989; 45(21): 6601-21)。
用于制备体内成像剂的前体化合物理想上以无菌、无热原的形式来提供，以便用于制备适于哺乳动物给予的包含体内成像剂连同药理学上可接受的载体的放射性药物组合物。前体化合物亦适于作为用于制备所述放射性药物组合物的试剂盒或盒(cassette)的组分包含在内。
前体化合物可结合在固相上，并且可共价连接到固体支持基质上来提供。以这种方式，所期需的产物在溶液中形成，而起始材料和杂质保留与固相结合。作为这类系统的实例，WO 03/002489阐述了与18F-氟化物进行固相亲电子氟化的前体化合物，而WO 03/002157阐述了与18F-氟化物进行固相亲核氟化的前体化合物。或者，可在适用于自动合成设备的试剂盒或盒中的溶液中提供前体化合物。
在试剂盒中，前体化合物可存在于允许保持无菌完整性和/或放射安全性的密封容器中，可任选加上惰性顶空气体(例如氮和氩)，同时允许用注射器加入溶液或取出溶液。密封容器的实例为隔膜密封的小瓶，其中用顶封(通常为铝)压紧气密封盖。所述密封容器具有优势：需要时封盖可承受真空例如以改变顶空气体或使溶液脱气。可在无菌生产条件下使用用于试剂盒的前体化合物来提供无菌、无热原的材料。或者可在非无菌条件下使用前体化合物，接着使用例如γ-辐照、高压灭菌、干热或化学处理(例如用环氧乙烷)进行终端灭菌。通常试剂盒中的所有组分都是一次性的，以使多次运行之间污染的可能性最小化并确保无菌度和质量保证。
现在通常在自动放射合成设备上方便地制备某些体内成像剂，特别是用18F标记的成像剂。有若干种市售可得到的这类设备的实例，包括TracerlabTM和FastlabTM (GEHealthcare Ltd)。所述设备通常包含“盒”，通常为一次性的，在其中进行放射性化学反应，为了进行放射合成，该盒与设备配合。盒通常包括流体通路、反应容器和接收试剂小瓶的端口以及用于放射合成后清理步骤的任何固相萃取柱(cartridge)。典型的这种盒包括：
(i)含有本文所述的前体化合物的容器；和
(ii)装置(means)，其用于用本文所述的适于体内成像的适宜的所述放射性同位素源洗脱容器。
该盒可另外包括：
(iii)用于去除多余的放射性同位素的离子交换柱；和任选
(iv)当前体化合物包含一个或多个保护基团时，用于对所得到的放射性标记产物进行脱保护以形成所期需的体内成像剂的柱。
当作为如上所述的放射性药物组合物给予体内成像剂时，制备所述体内成像剂的方法可进一步包括为获得放射性药物组合物所需的步骤，例如去除有机溶剂、加入药理学上可接受的载体和任何任选的另外成分。对于胃肠外给予，亦需要采取确保放射性药物组合物为无菌和无热原的步骤。
PBR表达可与癌症严重性的各种指数相关，其如例如以下体外和体内研究所报道，体外研究：Rechichi等(Biochim Biophys Acta 2008; 1782: 118-25)、Veenman等(Biochem Pharmacol 2004; 68: 689-98)、Mukhopadhyay等(Glycoconj J 2006; 23:199-207)和Li等(Biochem Pharmacol 2007; 73: 491-503)；和体内研究：Maaser等(ClinCancer Res. 2002; 8: 3205-9)、Vlodavsky和Soustiel (J Neurooncol 2007; 81: 1-7)、Galiegue等(Clin Cancer Res 2004; 10: 2058-64)和Miettnen等(Cancer Res 1995;55: 2691-5)。因此，本发明的方法可用于评估致肿瘤性、细胞增殖速度、癌症转移潜能、肿瘤侵略性、恶性肿瘤进程、患者结果和存活。本发明的方法亦可应用于选择最合适的疗法。此外，本发明的方法可用于测定治疗是否成功，因为治疗的成功与PBR表达的减少相关。在一些情况下，[18F]-氟代脱氧葡萄糖(FDG)用于评价差异(differentiation)不理想。因此，与[18F]-FDG成像相比，本发明的方法提出了对某些癌症体内成像的改进方法。
在备选方面，在用于所述受试者的治疗方案的进程期间可重复实施本发明的体内成像方法，所述方案包括给予药物来对抗癌症，其中所述癌症如本文所定义。例如，可在所述治疗之前、期间和之后实施本发明的体内成像方法，以便监测其随时间变化的有效性。本文所述的本发明方法的适宜和优选实施方案亦适用于本发明的该方面。本发明的该方面亦可应用于评估有潜能的新疗法的功效，例如在临床前或临床研究中。
在另一方面，本发明提供用于所述方法的体内成像剂，其如本文中关于本发明方法所合适及优选定义。
在又一方面，本发明提供体内成像剂在制备放射性药物组合物中的用途，所述体内成像剂如本文中关于本发明方法所合适及优选定义，所述放射性药物组合物如本文中用于本发明方法所合适及优选定义。
现在通过一系列非限制性实施例来阐明本发明。
实施例简述
实施例1阐述成像剂5的合成。
实施例2阐述成像剂5的非放射性类似物的合成。
实施例3阐述成像剂6的合成。
实施例4阐述成像剂6的非放射性类似物的合成。
实施例5阐述成像剂7的合成。
实施例6阐述成像剂7的非放射性类似物的合成。
实施例7阐述成像剂8的合成。
实施例8阐述成像剂8的非放射性类似物的合成。
实施例9阐述成像剂10的合成。
实施例10阐述成像剂10的非放射性类似物的合成。
实施例11阐述成像剂11的合成。
实施例12阐述成像剂11的非放射性类似物的合成。
实施例13阐述前体化合物5的对映异构体分离。
实施例14阐述非放射性成像剂5的对映异构体分离。
实施例15阐述用于测试对于PBR的亲和力的体外效能测定。
实施例16阐述用于体内检查本发明成像剂性能的生物分布方法。
实施例中所用的缩写列表
aq　　　　 水性
DCM　 　　二氯甲烷
DMAP　 　4-二甲基氨基吡啶
DMF　　 　二甲基甲酰胺
EDC　 　　1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐
EOS　 　　合成结束
EtOAc 　　乙酸乙酯
IPA　 　　异丙醇
LC-MS 　　液相色谱-质谱
NMR　 　 核磁共振
OBn　 　　苄氧基
OMs　　　 甲磺酸盐
OTs　　 　甲苯磺酸盐
RT　　 　 室温
TLC　　 　薄层色谱法
Tol　　 　 甲苯。
实施例
实施例1：9-(2-[ 18 F]氟-乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰 胺(成像剂5)的合成
实施例1(a)：苄氧乙酰氯(1)
向含苄氧乙酸(10.0 g, 60.0毫摩尔, 8.6 mL)的二氯甲烷(50 mL)中加入草酰氯(9.1 g, 72.0毫摩尔, 6.0 mL)和DMF (30.0 mg, 0.4毫摩尔, 32.0 µL)，并于RT下搅拌3小时。开始时随着反应的进行有气体快速逸出，但随着反应的完成，气体逸出停止。在真空中浓缩二氯甲烷溶液得到胶状物(gum)。用更多的草酰氯(4.5 g, 35.7毫摩尔, 3.0 mL)、二氯甲烷(50 mL)和一滴DMF处理该胶状物。有气体快速逸出，再搅拌该反应物2小时。然后在真空中浓缩该反应物，得到11.0 g (定量的)胶状苄氧乙酰氯(1)。通过13C NMR (75 MHz,CDCl3) δC 73.6、74.8、128.1、128.4、128.6、130.0和171.9确认其结构。
实施例1(b)：2-苄氧基-N-(2-氯-5-甲氧基-苯基)乙酰胺(2)
在0℃下搅拌含苄氧乙酰氯(1) (11.0 g, 60.0毫摩尔)和2-氯-5-甲氧基苯胺盐酸盐(11.7 g, 60.2毫摩尔)的二氯甲烷(100 mL)，经15分钟缓慢加入三乙胺(13.0 g,126.0毫摩尔, 18.0 mL)。让搅拌的反应物经18小时升到室温。有三乙胺盐酸盐的大量沉淀。用10%的碳酸钾水溶液(50 mL)洗涤二氯甲烷溶液，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到18.9 g (定量的)胶状2-苄氧基-N-(2-氯-5-甲氧基-苯基)乙酰胺(2)。通过13C NMR (75MHz, CDCl3) δC 55.6、69.6、73.6、106.2、111.1、114.1、127.7、128.3、128.6、129.2、134.6、136.5、158.9和167.7确认其结构。
实施例1(c)：(2-苄氧基-乙基)-(2-氯-5-甲氧基苯基)胺(3)
搅拌含2-苄氧基-N-(2-氯-5-甲氧基-苯基)乙酰胺(2) (18.9 g, 62.0毫摩尔)的THF (100 mL)，经15分钟缓慢加入氢化锂铝(4.9 g, 130.0毫摩尔)。在起初加入氢化锂铝时，有氢气快速逸出。然后加热反应物至回流4小时，并使其整个周末维持在RT。然后通过向搅拌的溶液中逐滴加入水(50 mL)来猝灭反应。有氢气猛烈逸出，导致反应混合物回流。然后在真空中将反应物浓缩成为浆液。加入水(200 mL)和乙酸乙酯(200 mL)，将混合物剧烈振摇。然后通过硅藻土过滤反应物，以去除沉淀的氢氧化铝，分离乙酸乙酯溶液，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到18.4 g (定量的)胶状(2-苄氧基-乙基)-(2-氯-5-甲氧基苯基)胺(3)。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 43.3、55.3、68.2、73.0、98.1、101.8、111.6、127.6、127.7、128.4、129.3、137.9、144.8和159.5确认其结构。
实施例1(d)：3-溴-2-羟基-环己-1烯-甲酸乙酯(4)
将2-氧代环己基甲酸乙酯(30 g, 176毫摩尔, 28 mL)溶解于乙醚(30 mL)中，在氮气中冷却至0℃。在15分钟内逐滴加入溴(28 g, 176毫摩尔, 9.0 mL)，经90分钟让反应混合物温热至RT。将混合物缓慢倒入冰冷的饱和碳酸钾水溶液(250 mL)中，用乙酸乙酯(3x 200 mL)萃取。合并的有机层经硫酸镁干燥，过滤，真空中浓缩并在真空管线中干燥18小时，得到41.4 g (94%)黄色油状3-溴-2-羟基-1-烯甲酸乙酯(4)。通过13C NMR (75 MHz,CDCl3)：δC 14.1、17.7、21.8、32.0、60.0、60.8、99.7、166.3和172.8确认其结构。
实施例1(e)：3[(2-苄氧基-乙基)-(2-氯-5-甲氧基-苯基)-氨基]-2-羟基-环己- 1-烯甲酸乙酯(5)
在氮气下于-40℃在无水THF (100 mL)中搅拌(2-苄氧基-乙基)-(2-氯-5-甲氧基苯基)胺(3) (10.0 g, 34.2毫摩尔)，经30分钟加入双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾(143.0 mL0.5 M在甲苯中的溶液，72.0毫摩尔)。然后加入含3-溴-2-羟基环己-1-烯甲酸乙酯(4)(8.5 g, 34.2毫摩尔)的无水THF (10 mL)，经1.5小时让其温热至RT。加入乙酸(10.0 g,166毫摩尔, 10.0 mL)，在真空中浓缩以去除THF。加入乙酸乙酯(200 mL)和10%碳酸钾水溶液(100 mL)，剧烈振摇混合物。分离乙酸乙酯溶液，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到16.5g (定量的)胶状3[(2-苄氧基-乙基)-(2-氯-5-甲氧基-苯基)-氨基]-2-羟基-环己-1-烯甲酸乙酯(5)，在下一步中将其用作粗品。粗反应混合物的HPLC (Gemini 150 x 4.6 mm，经20分钟50-95%甲醇/水)，18.9分钟 (38%)、19.2分钟 (25%)、23.1分钟 (28%)。
分离反应物的一种组分，13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 14.3、20.6、21.8、26.4、38.6、43.0、55.8、60.5、68.7、73.3、93,4、106.3、108.2、119.3、121.5、127.5、127.6、128.3、135.7、137.0、137.9、155.7和175.0。
实施例1(f)：9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9,-四氢-1H-咔唑-4-甲 酸乙酯(6)
在氮气下将氯化锌(7.1 g, 52.0毫摩尔)加入到含3[(2-苄氧基-乙基)-(2-氯-5-甲氧基-苯基)-氨基]-2-羟基-环己-1-烯甲酸乙酯(5) (8.0 g, 17.0毫摩尔)的无水乙醚(150 mL)中，回流加热5.5小时。随着反应物的回流，在反应物中形成深褐色稠密油状物。然后冷却反应物，轻轻倒出上清液乙醚，加入乙酸乙酯(100 mL)，用2 N HCl (50 mL)和10%碳酸钾水溶液(50 mL)洗涤。分离乙醚层，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到油状物(2.0 g)。通过硅胶色谱法用石油(A)：乙酸乙酯(B) (10-40% (B), 340 g, 22 CV, 150 mL/min)洗脱来纯化粗材料，得到1.8 g 9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9,-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(6)。用乙酸乙酯(100 mL)和2 N HCl (50 mL)处理稠密褐色层。分离乙酸乙酯溶液，用10%的碳酸钾水溶液(50 mL)洗涤，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到油状物(5.2 g)。加入乙醚(100 mL)和无水氯化锌(7.0 g)。再将混合物回流加热5天。从深色胶状物中轻轻倒出乙醚层，用2 N HCl (50 mL)洗涤该乙醚层，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到胶状物(2.8 g)。通过硅胶色谱法用石油(A)：乙酸乙酯(B) (5-35% (B), 340 g, 150mL/分钟)洗脱来纯化该胶状物，得到2.1 g 9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9,-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(6)。获得的总原料为4.1 g (50%)的9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9,-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(6)。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3)：δC14.4、20.5、22.3、27.5、40.2、43.9、55.0、60.2、70.7、73.3、100.2、107.5、108.4、120.1、122.8、127.4、127.5、128.2、132.0、137.4、138.1、152.6和175.8确认其结构。
实施例1(g)：9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9,-四氢-1H-咔唑-4-甲 酸(7)
向含9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9,-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(6)(2.0 g, 4.1毫摩尔)的乙醇(50 mL)中加入氢氧化钠(1.1 g, 27.1毫摩尔)和水(5mL)，在80℃下加热18小时。然后通过在真空中蒸发除去乙醇，残留物在乙醚(50 mL)和水(50 mL)之间分配。分离乙醚层，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到胶状物(71.0 mg)。用2NHCl (20 mL)将水层酸化至pH 1，用二氯甲烷(2 x 100 mL)萃取。二氯甲烷层经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到1.6 g (87%)泡沫状9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9,-四氢-1H-咔唑-4-甲酸(7)。通过13C NMR (75 MHz; CDCl3)：δC 20.2、22.2、27.1、39.7、44.0、55.1、70.7、73.3、100.6、106.3、108.9、123.0、127.4、127.5、128.3、132.0、138.0和152.0确认其结构。
实施例1(h)：9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9,-四氢-1H-咔唑-4-碳 酰氯(8)
将9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9,-四氢-1H-咔唑-4-甲酸(7)(1.5 g, 3.7毫摩尔)溶解于二氯甲烷(50 mL)中，加入草酰氯(700 mg, 5.5毫摩尔, 470 µL)和DMF (1滴)，在20℃下搅拌反应物2小时。随着反应的进行，有气体温和逸出约30分钟。然后在真空中浓缩反应物，得到胶状9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9,-四氢-1H-咔唑-4-碳酰氯(8)，不经纯化将其用于下一步骤。通过13C NMR (75 MHz; CDCl3)：δC20.8、22.1、26.4、44.2、51.8、55.1、70.7、73.3、100.7、106.0、108.6、119.5、123.4、127.3、127.7、128.3、131.9、138.0、138.2、152.0和176.3确认其结构。
实施例1(i)：9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲 酸二乙酰胺(9)
然后将9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9,-四氢-1H-咔唑-4-碳酰氯(8) (1.6 g, 3.7毫摩尔)溶解于二氯甲烷(50 mL)中，冷却至0℃，搅拌并逐滴加入二乙基胺(810 mg, 11.0毫摩尔, 1.1 mL)。在18小时的时间内让反应物温热至室温。反应混合物然后用10%的碳酸钾水溶液(50 mL)洗涤，分离，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩成胶状。粗材料从乙醚中结晶，得到1.2 g (71%)白色晶状固体形式的9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(9)。通过13C NMR (75 MHz; CDCl3)：δC 13.0、14.5、19.8、22.2、27.9、36.4、40.4、41.9、43.8、55.0、70.8、73.3、100.2、108.5、108.6、119.9、122.5、127.4、127.5、128.3、131.5、137.8、138.2、152.4和174.5确认其结构。
实施例1(j)：9-(2-苄氧基-乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙 胺(10)
含9-(2-苄氧基-乙基)-8-氯-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(9) (1.0 g, 2.1毫摩尔)的甲醇(100 ml)与10%披钯木炭(1.0 g)、三乙胺(2.9 mg, 2.9毫摩尔, 4 µL)一起，在55℃于氢气气氛下振摇18小时。然后通过硅藻土垫过滤反应物，在真空中浓缩滤液，得到胶状物(908 mg)。然后胶状物被二氯甲烷(100 ml)吸收，用5%的碳酸钾水溶液(50 ml)洗涤。然后分离二氯甲烷溶液，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到胶状物。然后让胶状物从乙醚(50ml)中结晶，通过过滤收集晶体，得到523 mg (57%) 9-(2-苄氧基-乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙胺(10)。通过13C NMR (75 MHz;CDCl3)：δC 13.1、14.6、20.1、22.0、28.1、36.4、40.5、42.0、43.0、54.7、68.8、73.3、99.4、102.4、107.8、116.4、121.2、127.6、127.6、128.3、135.6、137.8、138.0、153.6和175.0确认其结构。
实施例1(k)：9-(2-羟基乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙胺 (11)
含9-(2-苄氧基-乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙胺(10)(1.0 g, 2.1毫摩尔)的甲醇(50 ml)与10%披钯木炭(300 mg)和氢气(过量)一起，在55℃振摇18小时。然后通过硅藻土垫过滤反应物，在真空中浓缩滤液，得到578 mg泡沫状(100%)9-(2-羟基乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙胺(11)。通过13C NMR (75MHz; CDCl3)：δC 13.0、14.4、20.0、22.0、28.0、36.4、40.6、42.0、54.7、60.6、99.2、102.6、107.0、116.7、121.1、136.1、137.5、138.0、153.5和175.7确认其结构。
实施例1(l)：甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-5-甲氧基-1,2,3,4-四氢-
咔唑-9-基)乙酯
将含9-(2-羟基乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙胺(11)(478 mg, 1.4毫摩尔)的二氯甲烷(30 ml)冷却至0℃，加入甲磺酰氯(477 mg, 4.2毫摩尔,324 µL)和三乙胺(420 mg, 4.2毫摩尔, 578 µL)，使其温热至RT过夜。用5%的碳酸钾水溶液洗涤反应物。分离各层。合并的有机物经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到胶状物(696mg)。通过硅胶色谱法用石油(A)：乙酸乙酯(B) (75-100% B, 22 CV、120 g, 85 mL/分钟)洗脱来纯化该粗材料，得到胶状甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-5-甲氧基-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)乙酯，该胶状物从乙醚中结晶得到346 mg (59%)无色固体。通过13C NMR (75 MHz;CDCl3)：δC 13.1、14.5、20.0、21.9、28.0、36.3、36.7、40.3、41.8、41.9、54.7、68.1、100.0、102.0、109.0、116.4、122.0、135.1、137.3、153.8和174.6确认其结构。
实施例1(m)：9-(2-[ 18 F]氟-乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙 酰胺(成像剂5)
由GE Healthcare提供在GE PETrace回旋加速器上的[18F]氟化物。将Kryptofix2.2.2 (2 mg, 5微摩尔)、碳酸氢钾(0.1摩尔dm-3, 0.1ml, 5 mg, 5微摩尔)和乙腈(0.5ml)加入到COC反应容器中的[18F]F- /H2O (约400 MBq, 0.1-0.3 ml)中。在氮气流下于100℃通过加热来干燥混合物20-25分钟。干燥后不冷却，将含甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-5-甲氧基-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)乙酯(0.5-1mg, 1.2-2.4微摩尔)的乙腈(1 ml)加到COC反应容器中，100℃下加热10分钟。冷却后，移出反应混合物，用水(1.5 ml)漂洗COC反应容器，并加到主要粗反应物中。
之后，将粗产品施用到半制备型HPLC上：HICHROM ACE 5 C18柱(100 x 10 mm内径)，粒径5 μm；流动相A：水，流动相B：甲醇；流动梯度：3ml/分钟；0-1分钟40 %B；1-20分钟40-95 %B；波长254 nm；tR成像剂5 16分钟。用水将成像剂5的HPLC纯化峰稀释至10 ml的体积，让其吸附到tC18 Sep-Pak (lite)柱上。用水(2 ml)洗涤柱，先用无水乙醇(0.5 ml)接着用Dulbecco磷酸缓冲盐水(4.5 ml)洗脱。放射化学产率30±7% (n=4)非衰变校正，时间90-120分钟，放射化学纯度≥ 99%。
分析型HPLC：Phenomenex Luna C18柱(150 x 4.6 mm内径)，粒径5 μm；流动相A：水，流动相B：甲醇；流动梯度：1ml/分钟；0-1分钟40 %B；1-20分钟40-95 %B；波长230 nm；tR成像剂5 16分钟。图1显示成像剂5和非放射性成像剂5 (实施例2阐述其合成)的共洗脱。
实施例2：9-(2-氟-乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(非 放射性成像剂5)的合成
实施例2(a)：甲苯磺酸氟乙酯(12)
在氮气下将2-氟乙醇(640 mg, 10毫摩尔, 0.6 mL)溶解于吡啶(10 mL)中。于0℃下搅拌溶液，经30分钟的时间将甲苯磺酰氯(4.2 g, 21.8毫摩尔)分批添加到溶液中，保持温度低于5℃。在0℃下搅拌反应物3小时。缓慢加入冰，接着加入水(20 mL)。将反应混合物萃取到乙酸乙酯中，用水洗涤。通过用1 N HCl溶液洗涤至水层变成酸性来去除过量的吡啶。通过用1 M碳酸钠水溶液洗涤来去除过量的甲苯磺酰氯。用卤水洗涤有机层，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到2.1 g (98%)无色油状甲苯磺酸氟乙酯(12)。通过13C NMR (75MHz, CDCl3)：δC 21.6 (CCH3)、68.5 (d, JCF = 173 Hz, OCH2CH2F)、80.6 (d, JCF = 173Hz, OCH2 CH2F)、128.0、129.9、132.6和145.1确认其结构。
实施例2(b)：(2-氯-5-甲氧基-苯基) (2-氟乙基)胺(13)
将2-氯-5-甲氧基苯胺盐酸盐(5.0 g, 26.0毫摩尔)溶解于DMF (50 mL)中，加入氢化钠(2.3 g, 油中60%, 57.0毫摩尔)。在氮气下于RT搅拌反应物30分钟。逐滴加入含甲苯磺酸氟乙酯(12) (6.7 g, 31.0毫摩尔)的DMF (5 mL)，在RT下搅拌反应物2小时。然后在100℃加热反应物18小时。让反应物冷却，减压下去除溶剂。将残留物溶解于乙酸乙酯(100mL)，用水(2 x 100 mL)洗涤。收集有机物，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到褐色油状物，通过硅胶色谱法用石油(A)：乙酸乙酯(B) (5 - 30% (B), 330 g, 18.1 CV, 120 mL/分钟)洗脱来纯化该油状物，得到1.3 g (25%)黄色油状2-氯-5-甲氧基-苯基) (2-氟乙基)胺(13)。通过13C NMR (75 MHz; CDCl3)：δC 43.8 (d, JCF = 23 Hz)、55.3、82.0 (d, JCF =165 Hz)、98.1、102.2、111.6、129.5、144.1和159.5确认其结构。
实施例2(c)：3-[(2-氯-5-甲氧基-苯基)-(2-氟乙基)氨基]-2-羟基-环己基-1-烯 甲酸乙酯(14)
将含2-氯-5-甲氧基-苯基) (2-氟乙基)胺(13) (6.1 g, 30.0毫摩尔)的THF(170 mL)溶液冷却至-40℃。逐滴加入双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾(126.0 mL 0.5 M的甲苯溶液，63.0毫摩尔)，在-40℃下搅拌反应物30分钟。在-40℃下逐滴加入含3-溴-2-羟基-环己基-1-烯甲酸乙酯(4；按照实施例1(d)制备) (7.4 g, 30.0毫摩尔)的THF (30 mL)。去除冷却浴，在RT下搅拌反应物4小时。用卤水(300 mL)猝灭反应，将其萃取到乙酸乙酯(2 x400 mL)中，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到12.0 g (定量的)褐色油状3-[(2-氯-5-甲氧基-苯基)-(2-氟乙基)氨基]-2-羟基-环己基-1-烯甲酸乙酯(14)，其不经加工用于下一步骤。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3)：δH 1.08 (0.8H, t, J = 9 Hz, CO2CH2CH 3)、1.22-1.33 (2.2小时, m, CO2CH2CH 3)、1.40-2.60 (7H, m, 4-, 5-,和6-CH2, CHN)、3.20-4.50(10H, m, NCH 2CH2F, NCH2CH 2F, OCH 3, CHCO2CH 2CH3)、6.50-6.70 (1H, m, CHC(OCH3)CHCH)、6.95 (0.5H, dd, J = 3和6 Hz, CHC(OCH3)CHCH)、7.08 (0.5H, d, J = 3 Hz,CHC(OCH3)CHCH)和7.20-7.30 (1H, m, CHC(OCH3)CHCH)确认作为异构体混合物的结构。
实施例2(d)：8-氯-9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯 (15)
最初尝试使用WO 2003/014082中所述的条件来合成8-氯-9-(2-氟-乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(15)。在冰浴中冷却2-氯-5-甲氧基-苯基) (2-氟乙基)胺(13；按照实施例2(b)制备) (600 mg, 3.8毫摩尔)的无水THF (20 mL)溶液，用双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾(16 mL 0.5 M的甲苯溶液，8.0毫摩尔)处理。30分钟后，加入含3-溴-2-羟基-环己基-1-烯甲酸乙酯(4；按照实施例1(d)制备) (1.04 g, 4.2毫摩尔)的THF(4 mL)，经2小时让反应物温热至RT。用饱和氯化铵溶液猝灭反应，用乙醚萃取两次。用水、卤水洗涤萃取物，在真空干燥和浓缩。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (2.5-50 %B, 50 g, 25 CV, 40 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料。主要的斑点是三种化合物的混合物。用无水氯化锌(1.7 g, 12.6毫摩尔)使混合物在甲苯中回流(20 mL)过夜。在真空中浓缩反应物，让残留物在1N HCl (25 mL)和乙酸乙酯(25 mL)之间分配，然后用乙酸乙酯再次萃取。用水和卤水洗涤有机层，在真空中干燥和浓缩，得到褐色油状物。1H NMR表明其是多种化合物的混合物。二氧化硅TLC在一系列溶剂中不能将该混合物分离成单独的斑点。将混合物与真实样品的1H NMR比较，表明混合物含有估计25%的8-氯-9-(2-氟-乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(15)。
然后实施改良方法。将3-[(2-氯-5-甲氧基-苯基)-(2-氟乙基)氨基]-2-羟基-环己基-1-烯甲酸乙酯(14) (12.2 g, 30.0毫摩尔)溶解于乙醚(250 mL)中，加入氯化锌(16.4 g, 120.0毫摩尔)。让反应物在回流下加热16小时。加入乙酸乙酯(500 mL)以溶解所有物质，用2N HCl (200 mL)、水(200 mL)、10%碳酸钾水溶液(200 mL)洗涤，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩。通过硅胶色谱用石油(A)：乙酸乙酯(B) (5-20% B, 12 CV, 10 g, 100 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到5.3 g (经两步达到50%)黄色固体的8-氯-9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(15)。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3)：δC14.4、20.4、22.2、27.4、40.1、44.2 (d, JCF = 23 Hz)、55.1、60.2、83.9 (d, JCF = 173Hz)、100.6、107.9、108.2、119.8、123.1、131.9、137.2、152.7和175.7确认其结构。
实施例2(e)：9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(16)
将8-氯-9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(15) (5.3g, 15.0毫摩尔)溶解于甲醇(180 mL)中，加入三乙胺(1.8 g, 18.0毫摩尔, 2.5 mL)和10%Pd/C (2 g，在甲醇(20 mL)中)。将混合物置于Parr氢化器上，在氢气气氛下振摇18小时。通过硅藻土垫过滤反应物，用甲醇洗涤，在真空中去除溶剂。将残留物溶解于乙酸乙酯(300mL)中，用10%的碳酸钾水溶液(200 mL)洗涤，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到4.2 g(88%)浅褐色固体的9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(16)。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3)：δC 14.3、20.6、21.8、27.6、40.3、43.3 (d,JCF = 23 Hz)、54.9、60.1、82.0 (d, JCF= 165 Hz)、99.8、102.1、107.3、117.2、121.8、134.9、137.6、153.8和176.0来确认其结构。
HPLC (Gemini 150 x 4.6 mm，经20分钟50-95%甲醇/水) 13.6分钟(94%)。
实施例2(f)：9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸(17)
将8-氯-9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(16) (380mg, 1.2毫摩尔)溶解于乙醇(4 mL)中。加入溶解于6 mL水中的氢氧化钠(580 mg, 14.5毫摩尔)溶液。让反应混合物加热到回流过夜。在真空中去除溶剂，用水稀释粗混合物，用2 NHCl酸化至酸性，用二氯甲烷洗涤。合并有机物，经硫酸镁干燥，在真空中浓缩，得到347 mg(定量的)米白色固体的9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸(17)，其不经加工用于下一步骤。通过13C NMR (75 MHz; CDCl3)：δC 20.4、21.9、27.2、39.9、 43.3(d,JCF = 23 Hz)、55.1、81.9 (d,JCF = 173 Hz)、100.3、102.8、106.2、117.1、122.2、135.6、137.8、153.3和180.8确认其结构。
实施例2(g)：9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-碳酰氯(18)
在氮气下搅拌含9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸(17)(347 mg, 1.2毫摩尔)的无水二氯甲烷(2 mL)溶液。加入草酰氯(453 mg, 3.6毫摩尔, 300µL)，接着加入一滴DMF。在氮气下于RT搅拌反应混合物2小时，然后在真空中蒸发，得到371mg (定量的)胶状9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-碳酰氯，不经纯化将其用于下一步骤。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3)：δC20.2、21.7、26.4、43.3 (d, JCF = 23Hz)、54.9、80.5、83.1、100.2、102.2、105.8、116.7、122.4、135.5、137.4、153.5和176.6确认其结构。
实施例2(h)：9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙基酰 胺(非放射性成像剂5)
将9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-碳酰氯(18) (371 mg,1.2毫摩尔)溶解于二氯甲烷(2 mL)中，冷却至0℃。然后加入二乙胺(177 mg, 2.4毫摩尔,250 µL)，在RT下搅拌反应物过夜。用10%的碳酸钾水溶液(2 mL)猝灭反应。通过分相器收集二氯甲烷层，然后在真空中浓缩。通过硅胶色谱用石油(A)：乙酸乙酯(B) (50-100% (B),50 g, 35.2 CV, 40 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到淡黄色固体。接着用最少量的乙醚捣碎固体，得到240 mg (58%) 9-(2-氟乙基)-5-甲氧基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙基酰胺(非放射性成像剂5)。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3)：δC 13.0、14.6、19.9、21.9、28.0、36.3、40.5、41.9、43.1 (d, JCF = 23 Hz)、54.7、82.0 (d,JCF = 173 Hz)、99.7、102.1、108.3、117.0、121.5、135.3、137.4、153.3和174.8确认其结构。
实施例3：[9-(2-[ 18 F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-基]-哌啶-1-基-甲酮 (成像剂6)的合成
实施例3(a)：2-(哌啶-1-羰基)-环己酮(19)
将含2-氧代环己烷-甲酸乙酯(5.3 g, 31毫摩尔, 5.0 mL)、DMAP (1.05 g, 9.4毫摩尔)和哌啶(5.3 g, 63毫摩尔, 6.2 mL)的甲苯(100 mL)回流加热4天。让反应物冷却，在真空中浓缩反应物。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (20 - 80% (B), 100 g, 8CV, 85 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到6.26 g (96%)白色固体的2-(哌啶-1-羰基)-环己酮(19)。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 23.5、24.5、25.5、26.2、27.1、30.4、41.9、42.9、46.8、54.2、167.6、207.6确认其结构。
实施例3(b)：2-溴-6-(哌啶-1-羰基)-环己酮(20)
将2-(哌啶-1-羰基)-环己酮(19) (4.0 g, 19毫摩尔)溶解于乙醚(5 mL)中，在N2下冷却至0℃。在15分钟内逐滴加入溴(5.9 g, 19毫摩尔, 1.0 mL)，让反应混合物经90分钟温热至室温。通过过滤收集固体，得到5.86 g (定量的)白色固体的2-溴-6-(哌啶-1-羰基)-环己酮(20)，不经纯化将其用于下一步骤。通过13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δC 17.3、24.2、25.3、25.8、32.5、44.0、51.6、108.3、145.5、167.8确认其结构。
实施例3(c)：(2-苄氧基-乙基)-苯基-胺(21)
在圆底烧瓶中，将苯胺(2.0 g, 21.5毫摩尔, 2.0 mL)、2,6-二甲基吡啶(2.30 g,21.5毫摩尔)和苄基2-溴乙基醚(4.6 g, 21.5毫摩尔, 3.4 mL)在DMF (10 mL)中混合，100℃下搅拌过夜。让反应物冷却，然后用乙酸乙酯(50 mL)稀释。用水(3 x 20 mL)洗涤，在真空中干燥并浓缩有机物。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (0-50% B、100 g, 19.5CV, 85 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到2.22 g (37%)黄色油状(2-苄氧基-乙基)-苯基-胺(21)。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 43.6、68.6、73.2、113.1、117.5、127.5、127.7、128.4、129.1、138.2、148.1确认其结构。
实施例3(d)：[9-(2-苄氧基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-基]-哌啶-1-基-甲 酮(22)
在N2下于50℃将2-溴-6-(哌啶-1-羰基)-环己酮(20) (1.5 g, 5.2毫摩尔)和(2-苄氧基-乙基)-苯基-胺(21) (3.2 g, 10.4毫摩尔)的混合物搅拌3小时，反应物变成褐色。将所得混合物溶解于丙-2-醇(5 mL)中，加入无水氯化锌(2.13 g, 15.6毫摩尔)。在N2下将混合物加热到回流达16小时，然后在真空中浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯(100 mL)中，用2 N HCl (30 mL)、水(2 x 30 mL)和碳酸钾水溶液(2 x 30 mL)洗涤，然后在真空中干燥和浓缩。通过SCX柱并然后通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (30-100% B、12 g, 41CV, 30 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到600 mg (27%)油状[9-(2-苄氧基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-基]-哌啶-1-基-甲酮(22)。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 21.5,21.7, 24.5, 25..7, 26.3, 273, 37.7, 42.8, 43.1, 46.7, 60.2, 68.7, 73.1,108.2, 108.7, 117.8, 118.9, 120.5, 126.4, 127.3, 127.4, 128.1, 136.2, 137.8,172.9确认其结构。
实施例3(e)：[9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-基]-哌啶-1-基-甲酮 (23)
向[9-(2-苄氧基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-基]-哌啶-1-基-甲酮(22)(600 mg, 1.4毫摩尔)的甲醇(15 mL)溶液中加入Pd/C (200 mg)的甲醇(10 mL)浆液。将混合物置于Parr氢化器上，在氢气气氛下振摇24小时。通过硅藻土垫过滤反应物，用甲醇洗涤，在真空中浓缩。捣碎粗材料得到332 mg (71%)白色固体的[9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-基]-哌啶-1-基-甲酮(23)。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3)：δC 21.2、21.9、24.7、27.4、36.4、43.4、45.0、47.0、60.9、107.8、109.0、117.7、119.0、120.7、126.6、136.2、137.2、173.5确认其结构。
实施例3(f)：甲磺酸2-[4-(哌啶-1-羰基)-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基]-乙酯(前体 化合物6)
向[9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-基]-哌啶-1-基-甲酮(23) (260mg, 0.8毫摩尔)的二氯甲烷(15 mL)溶液中加入吡啶(633 mg, 8.0毫摩尔, 0.65 mL)。让反应物冷却至0℃，加入甲磺酰氯(458 mg, 4.0毫摩尔, 0.31 mL)。让反应温热至室温过夜。用2 N HCl (2 x 50 mL)和水(2 x 50 mL)洗涤混合物，在真空中干燥并浓缩。用乙醚将粗材料捣碎，得到263 mg (82%)白色固体的甲磺酸2-[4-(哌啶-1-羰基)-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基]-乙酯。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 21.4、21.8、24.7、25.9、26.9、27.4、36.6、36.8、41.7、43.3、47.0、67.9、108.5、109.5、118.4、119.7、121.3、126.9、136.2、172.7确认其结构。
实施例3(g)：[9-(2-[ 18 F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-基]-哌啶-1-基-甲 酮(成像剂6)
如实施例1(f)中所述来实施用18F标记甲磺酸2-[4-(哌啶-1-羰基)-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基]-乙酯。
半制备型HPLC：HICHROM ACE 5 C18柱(100 x 10 mm内径)，粒径5 μm；流动相A：水，流动相B：甲醇；流动梯度：3ml/分钟；0-1分钟50 % B；1-20分钟50-95 %B；波长254 nm；tR成像剂6，17分钟。
分析型HPLC：Phenomenex Luna C18柱(150 x 4.6 mm内径)，粒径5 μm；流动相A：水，流动相B：甲醇；流动梯度：1ml/分钟；0-1分钟50 %B；1-20分钟50-95 %B；波长230 nm；tR成像剂6 16分钟。放射化学产率23±2% (n=3)非衰变校正，时间90-120分钟，放射化学纯度≥ 99%。图2显示成像剂6和非放射性成像剂6 (按照实施例4制备)的共洗脱。
实施例4：[9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-基]-哌啶-1-基-甲酮(成像 剂6的非放射性类似物)的合成
实施例4(a)：(2-氟-乙基)-苯基-胺(24)
在圆底烧瓶中，让苯胺(0.5 g, 5.4毫摩尔)、2,6-二甲基吡啶(0.58 g, 5.4毫摩尔)和甲苯磺酸2-氟乙酯(12；按照实施例2(a)制备) (1.17 g, 5.4毫摩尔)在DMF (2.5mL)中混合，在100℃下搅拌过夜。让反应物冷却，然后用乙酸乙酯(50 mL)稀释。用水(3 x20 mL)洗涤，在真空中干燥并浓缩有机物。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (100g, 0-100% B、18 CV, 85 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到435 mg (60%)黄色油状(2-氟-乙基)-苯基-胺(24)。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 3.41 (1H, t, J = 3 Hz,NCH 2CH2F)、3.50 (1H, t, J = 3 Hz, NCH 2CH2F)、3.93 (1H, s, br)、4.54 (1H, t, J = 3Hz, NCH2CH 2F)、4.71 (1H, t, J = 3 Hz, NCH2CH 2F)、6.65-6.82 (3H, m, 2 x NCCH,NCCHCHCH)、7.14-7.28 (2H, m, 2 x NCCHCHCH)确认其结构。
实施例4(b)：[9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-基]-哌啶-1-基-甲酮 (非放射性成像剂6)
在N2下于50℃将2-溴-6-(哌啶-1-羰基)-环己酮(20；按照实施例3(b)制备) (500mg, 1.7毫摩尔)和(2-氟-乙基)-苯基-胺(24) (890 mg, 3.5毫摩尔)混合物搅拌3小时，反应物变成褐色。将所得混合物溶解于丙-2-醇(2 mL)中，加入无水氯化锌(682 mg, 5毫摩尔)。在N2下将混合物加热到回流达16小时，然后在真空中浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯(50 mL)，用2 N HCl (20 mL)、水(2 x 20 mL)和碳酸钾水溶液(2 x 20 mL)洗涤，然后在真空中干燥和浓缩。用乙醚捣碎粗材料，得到151 mg (27%)白色固体的[9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-基]-哌啶-1-基-甲酮(非放射性成像剂6)。通过13C NMR (75 MHz,CDCl3) δC 21.6、21.8、24.7、26.5、26.9、27.4、37.3、43.1 (d, JCF = 45 Hz)、47.0、82.1(d, JCF = 173 Hz)、108.5、108.9、118.6、119.4、121.0、126.8、136.2、172.7确认其结构。
实施例5：9-(2-[ 18 F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸苄基-甲基-酰胺 (成像剂7)的合成
实施例5(a)：9-(2-苄氧基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(25)
在N2下于50℃将(2-苄氧基-乙基)-苯基-胺(21；按照实施例3(c)制备) (8.0 g,26毫摩尔)和3-溴-2-羟基-环己-1-烯甲酸乙酯(4；按照实施例1(d)制备) (3.2 g, 13毫摩尔)混合物搅拌3小时，反应物变成褐色。将所得混合物溶解于丙-2-醇(30 mL)中，加入无水氯化锌(10.6 g, 78毫摩尔)。在N2下将混合物加热至回流达16小时，在真空中浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯(300 mL)中，用2 N HCl (20 mL)、水(2 x 20 mL)和碳酸钾水溶液(2 x20 mL)洗涤，然后在真空中干燥和浓缩。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (2.5-40%B、17 CV, 330 g, 100 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到3.49 g (72%)油状9-(2-苄氧基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(25)。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 14.2、20.5、21.8、26.5、38.6、42.9、60.4、68.7、73.2、106.4、108.8、118.7、120.7、127.4、127.5、128.3、136.2、136.9、137.8、175.0确认其结构。
实施例5(b)：9-(2-苄氧基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸(26)
将9-(2-苄氧基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(25) (35 g, 9.3毫摩尔)溶解于乙醇(9 mL)中，然后加入含NaOH (1.56 g)的水(15 mL)。将反应物在回流下加热2小时。在真空中浓缩反应物，残留物用水稀释并用二氯甲烷(2 x 150 mL)洗涤。将水层逐滴加入到2 N HCl (150 mL)中，然后萃取到二氯甲烷(3 x 150 mL)中。在真空中干燥和浓缩有机物，得到2.48 g (92%)黄色固体的9-(2-苄氧基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸(26)，不经纯化将其用于下一步骤。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 20.4、21.8、26.4、38.3、42.9、68.7、73.3、105.7、108.8、118.7、119.3、102.9、127.4、127.6、128.3、136.2、137.1、137.8、108.9确认其结构。
实施例5(c)：9-(2-苄氧基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸苄基-甲基-酰 胺(27)
在氮气下将9-(2-苄氧基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸(26) (600 mg,1.7毫摩尔)溶解于无水DCM (8 mL)中，加入草酰氯(393 mg, 3.1毫摩尔, 0.26 mL)。在室温下搅拌反应物3小时，有气体剧烈逸出。在真空中浓缩反应物，然后重新溶解于二氯甲烷(8 mL)中，冷却至0℃，加入N-苄基甲基胺(412 mg, 3.4毫摩尔, 0.44 mL)。让反应物温热至室温过夜。用5%的碳酸钾水溶液溶液洗涤反应物，在真空中干燥和浓缩，得到褐色油状物。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (30% B, 10g)洗脱来纯化粗材料，得到246 mg(64%)黄色油状9-(2-苄氧基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸苄基-甲基-酰胺(27)。通过1H NMR (CDCl3) δH 1.60-2.30 (4H, m, CHCH 2CH 2CH2)、2.70-2.90 (2H, m,CHCH2CH2CH 2)、3.10 (1.5H, s, N(CH 3)CH2Ph)、3.13 (1.5H, s, N(CH 3)CH2Ph)、3.73 (2H,t, J = 6 Hz, NCH 2CH2O)、4.10-4.30 (3H, m, NCH2CH 2O, CHCH2CH2CH2)、4.42 (1H, s,OCH 2Ph)、4.44 (1H, s, OCH 2Ph)、4.80 (1H, s, N(CH3)CH 2Ph)、4.81 (1H, s, N(CH3)CH 2Ph)、6.90-7.50 (14H, m)确认其结构。
实施例5(d)：9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸苄基-甲基-酰胺 (28)
向9-(2-苄氧基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸苄基-甲基-酰胺(27)(246 mg, 0.5毫摩尔)的甲醇(15 mL)溶液中加入Pd/C (200 mg)的甲醇(10 mL)浆液。将混合物置于Parr氢化器上，在氢气气氛下振摇24小时。通过硅藻土垫过滤反应物，用甲醇洗涤，在真空中浓缩，得到36 mg (20%)绿色油状9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸苄基-甲基-酰胺(28)，不经纯化将其用于下一步骤。通过1H NMR (CDCl3) δH 1.80-2.20 (4H, m)、2.70-3.00 (2H, m)、3.20-4.30 (10H, m)、6.90-7.50 (9H, m)确认其结构。
实施例5(e)：甲磺酸2-[4-(苄基-甲基-氨甲酰基)-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基]-乙 酯
向9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸苄基-甲基-酰胺(28) (36mg, 0.1毫摩尔)的二氯甲烷(2 mL)溶液中加入吡啶(7.91 g, 1.0毫摩尔, 8.1 mL)。让反应物冷却至0℃，加入甲磺酰氯(57 mg, 0.5毫摩尔, 0.04 mL)。让反应物温热至室温过夜。用2 N HCl (2 x 10 mL)和水(2 x 10 mL)洗涤混合物，在真空中干燥和浓缩。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (20-80% B, 4 g, 45 CV、18 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到14 mg (32%)黄色油状甲磺酸2-[4-(苄基-甲基-氨甲酰基)-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基]-乙酯。通过1H NMR (CDCl3) δH 1.10-2.40 (5H, m)、2.51 (1.5H, s, OSO2CH 3)、2.54(1.5H, s, OSO2CH 3)、2.70-2.90 (2H, m)、3.08 (1.5H, s, NCH 3)、3.15 (1.5H, s,NCH 3)、3.40-3.70 (1H, m)、4.10-4.80 (4H, m)、7.00-7.50 (9H, m)确认其结构。
实施例5(f)：9-(2-[ 18 F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸苄基-甲基-酰 胺(成像剂7)
如实施例1(f)中所述来实施用18F标记甲磺酸2-[4-(苄基-甲基-氨甲酰基)-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基]-乙酯。半制备型HPLC：HICHROM ACE 5 C18柱(100 x 10 mm内径)，粒径5μm；流动相A：水，流动相B：甲醇；流动梯度：3ml/分钟；0-1分钟50 % B；1-20分钟50-95 %B；波长254 nm；tR成像剂7，17分钟。
分析型HPLC：Phenomenex Luna C18柱(150 x 4.6 mm内径)，粒径5 μm；流动相A：水，流动相B：甲醇；流动梯度：1ml/分钟；0-1分钟50 % B；1-20分钟50-95 %B；波长 230 nm；tR成像剂7 16分钟。放射化学产率23±2% (n=3)非衰变校正，时间90-120分钟，放射化学纯度≥ 99%。图3显示成像剂7和非放射性成像剂7 (按照实施例6制备)的共洗脱。
实施例6：9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸苄基-甲基-酰胺(非放 射性成像剂7)
实施例6(a)：3-溴-2-羟基-环己-1-烯甲酸乙酯(29)
将2-氧代环己烷甲酸乙酯(5.0 g, 29毫摩尔, 4.7 mL)溶解于乙醚(5 mL)中，在N2下冷却至0℃。在15分钟内逐滴加入溴(4.6 g, 29毫摩尔, 4.2 mL)，让反应混合物经90分钟温热至室温。将混合物缓慢倒入冰冷的饱和碳酸钠水溶液(40 mL)中，用乙酸乙酯(3 x40 mL)萃取。在真空中干燥和浓缩合并的有机层，得到5.96 g (81%)淡黄色油状3-溴-2-羟基-环己-1-烯甲酸乙酯(29)，不经纯化将其用于下一步骤。通过13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δC 14.14、17.65、21.77、32.02、59.95、60.83、99.70、166.33、172.81确认其结构。
实施例6(b)：9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(30)
在N2下于50℃将(2-氟-乙基)-苯基-胺(24；按照实施例4(a)制备)(560 mg, 4.0毫摩尔)和3-溴-2-羟基-环己-1-烯甲酸乙酯(29) (500 mg, 2.0毫摩尔)混合物搅拌3小时，反应物变成褐色。将所得混合物溶解于丙-2-醇(4 mL)中，加入无水氯化锌(820 mg, 6毫摩尔)。在N2下将混合物加热至回流达16小时，在真空中浓缩。将产物溶解于乙酸乙酯/乙醚(30 mL/150 mL)，用2 N HCl (40 mL)、水(2 x 100 mL)和碳酸钾水溶液(2 x 100 mL)洗涤，然后干燥和浓缩，得到447 mg (91%)黄色油状9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(30)，不经纯化将其用于下一步骤。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 14.3、20.4、21.7、26.4、38.5、43.1 (d, JCF = 15 Hz)、60.6、76.6、77.0、77.4、82.1 (d, JCF =173 Hz)、106.9、108.5、118.9、119.4、121.1、127.1、136.2、136.7、174.9确认其结构。
实施例6(c)：9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸(31)
将9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸乙酯(30) (380 mg, 1.3毫摩尔)溶解于乙醇(3 mL)，然后加入含NaOH (520 mg)的水(5 mL)。让反应物在回流下加热2小时。在真空中浓缩反应物，残留物用水稀释并用二氯甲烷(2 x 50 mL)洗涤。将水层逐滴加入到2 N HCl (50 mL)中，然后萃取到二氯甲烷(3 x 50 mL)中。在真空中干燥和浓缩有机物，得到130 mg (37%)黄色固体的9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸(31)，不经纯化将其用于下一步骤。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.90-2.42 (4H, m, 2-和3-CH 2)、2.60-2.91 (2H, m, 1-CH 2), 3.94 (1H, t, J = 6 Hz, 4-CH)、4.30 (1H, t, J = 6Hz, NCH 2CH2F)、4.37 (1H, t, J = 6 Hz, NCH 2CH2F)、4.59 (1H, t, J = 6 Hz,NCH2CH 2F)、4.74 (1H, t, J = 6 Hz, NCH2CH 2F)、7.05-7.26 (3H, m, ArH)、7.59 (1H, d,J = 9 Hz, ArH)确认其结构。
实施例6(d)：9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-碳酰氯(32)
在氮气气氛下于室温将含9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸(31)(0.5 g, 1.91毫摩尔)的无水二氯甲烷(6 mL)与草酰氯(490 mg, 3.8毫摩尔, 0.34 mL)和一滴DMF一起搅拌。在真空中浓缩反应物，得到545 mg (定量的) 9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-碳酰氯(32)，不经纯化将其用于下一步骤。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3)δC 20.2、21.6、26.7、43.1、43.4、50.6、80.9、83.1、105.3、108.8、118.3、120.0、121.6、126.5、136.2、137.5、176.1确认其结构。
实施例6(e)：9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸苄基-甲基-酰胺(非 放射性成像剂7)
将9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-碳酰氯(32) (110 mg, 0.4毫摩尔)溶解于二氯甲烷(1 mL)中，冷却至0℃。然后加入N-苄基甲基胺(92 mg, 0.8毫摩尔, 98 µL)，让反应物在RT下搅拌过夜。用10%的碳酸钾水溶液(2 mL)猝灭反应。通过分相器收集二氯甲烷层，然后在真空中浓缩。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (20-100% B, 12g, 30 CV, 30 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到39 mg (28%) 9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸苄基-甲基-酰胺(非放射性成像剂7)。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3)δH 1.75-2.32 (4H, m, 2-和3-CH 2)、2.68-2.86 (2H, m, 1-CH 2)、3.10 (1H, s, NCH 3)、3.14 (2H, s, NCH 3)、4.17-4.39 (3H, m, NCH 2CH2F和4-CH 2)、4.52-4.87 (4H, m, NCH 2Ph和NCH2CH 2F)、6.96-7.42 (9H, m, ArH)确认其结构。
实施例7：6-氟-9-(2-[ 18 F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(成 像剂8)的合成
实施例7(a)：2-苄氧基-N-(4-氟-苯基)-乙酰胺(33)
向苄氧乙酸(4.6 g, 28.0毫摩尔, 4.0 mL)的DCM (52 mL)溶液中加入草酰氯(7.7 g, 61毫摩尔, 5.3 mL)和一滴DMF。在室温下搅拌反应混合物4小时。在真空中去除过量的草酰氯，得到苄氧基-乙酰氯。将该粗酰氯稀释入DCM (100 mL)中，加入三乙胺(5.3mL, 41.6毫摩尔, 4.2 g)，接着加入4-氟代苯胺(3.5 g, 32毫摩尔, 3.0 mL)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。然后用1 M水性HCl (100 mL)猝灭反应，在真空中干燥和浓缩，得到7.1g (95%)黄色油状2-苄氧基-N-(4-氟-苯基)-乙酰胺(33)，不经纯化将其用于下一步骤。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 69.2、73.5、115.4 (d, JCF = 22 Hz)、121.4 (d, JCF = 7Hz)、127.9、128.2、128.5、132.5 (d, JCF = 3 Hz)、136.3、157.6、160.8和167.5确认其结构。
实施例7(b)：(2-苄氧基-乙基)-(4-氟-苯基)-胺(34)
向LAH (1.25 g, 27毫摩尔)的无水乙醚(100 mL)混悬液中逐滴加入2-苄氧基-N-(4-氟-苯基)-乙酰胺(33) (6.9 g, 27毫摩尔)的无水乙醚(100 mL)溶液。如此添加是为了维持回流。一旦添加完成，将反应混合物加热至回流达4小时，然后倒入冰水中，加入DCM。为了分解铝盐，加入2M氢氧化钠水溶液，直到获得强碱性pH。分离各层，用DCM洗涤水层，在真空中干燥和浓缩。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (5-50% B、100 g, 12 CV, 60mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到5.5 g (84%)黄色油状(2-苄氧基-乙基)-(4-氟-苯基)-胺(34)。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 44.0、68.3、72.8、113.7 (d, JCF = 7 Hz)、115.3 (d, JCF = 22 Hz)、127.5、127.6 (d, JCF = 3 Hz)、128.3、137.8、144.5、154.1和157.2确认其结构。
实施例7(c)：3-溴-2-氧代-环己烷甲酸二乙酰胺(35)
让2-环己酮-甲酸乙酯(7.50 mL, 47.0毫摩尔)、DMAP (1.72 g, 14.1毫摩尔)和二乙胺(9.77 mL, 94.0毫摩尔)在甲苯 (100 mL)中在回流下加热72小时。让反应物冷却，减压下去除甲苯。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (1:1, 100 g, SiO2)洗脱来纯化粗油状物，得到6.8 g (73%)橙色油状2-氧代-环己烷甲酸二乙胺。通过13C NMR (CDCl3)δ11.1、12.7、21.3、24.9、28.5、39.4、39.6、51.7、166.5、205.9确认其结构。
将2-氧代-环己烷甲酸二乙胺(3.56 mL, 19.3毫摩尔)溶解于乙醚(5 mL)中，在N2下搅拌冷却至0℃。在15分钟内逐滴加入溴(0.99 mL, 19.3毫摩尔)，让反应混合物经3小时温热至室温。从反应物中沉淀出固体。通过过滤收集固体，用乙醚洗涤，得到5.85 g (109%)淡黄色固体的3-溴-2-氧代-环己烷甲酸二乙酰胺(35)。通过13C NMR (CDCl3) δ11.2、12.8、22.7、28.8、37.6、37.9、39.4、51.0、55.7、165.5、197.2确认其结构。
实施例7(d)：9-(2-苄氧基-乙基)-6-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺 (36)
在N2下于50℃将2-苄氧基-N-(4-氟-苯基)-乙酰胺(33) (5.3 g, 22毫摩尔)和3-溴-2-氧代-环己烷甲酸二乙酰胺(35) (3.0 g, 13毫摩尔))的混合物搅拌3小时，反应物变成褐色。将所得混合物溶解于丙-2-醇(30 mL)中，加入无水氯化锌(9.0 g, 66毫摩尔)。在N2下将混合物加热至回流达16小时，然后在真空中浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯(300mL)中，用2 N HCl (20 mL)、水(2 x 20 mL)和碳酸钾水溶液(2 x 20 mL)洗涤，然后在真空中干燥和浓缩。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (10-50% B, 100 g)洗脱来纯化粗材料，得到196 mg (11%)白色固体的9-(2-苄氧基-乙基)-6-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(36)。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 1.14 (3H, t, J = 7 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.30 (3H, t, J = 7 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.60-2.60 (4H, m, 2-和3-CH 2)、2.70-2.85 (2H, m, 1-CH 2), 3.10-3.65 (4H, m, N(CH 2CH3)2和NCH 2CH2OBn), 3.66-3.75(1H, m, 4-CH)、4.00-4.25 (2H, m, NCH2CH 2OBn)、4.41 (2H, s, OCH 2Ph)、6.75-6.95(2H, m, NCCHCHCFCH)、7.05-7.15 (1H, m, NCCHCHCFCH)和7.16-7.25 (5H, m, Ph)确认其结构。
实施例7(d)：6-氟-9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺 (37)
向9-(2-苄氧基-乙基)-6-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(36) (600mg, 1.4毫摩尔)的甲醇(40 mL)溶液中加入Pd/C (100 mg)的甲醇 (5 mL)浆液。将混合物置于Parr氢化器上，在氢气气氛下振摇24小时。通过硅藻土垫过滤反应物，用甲醇洗涤，在真空中浓缩，得到460 mg (80%)黄色油状6-氟-9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(37)，不经纯化将其用于下一步骤。通过1H NMR (300 MHz, MeOD-d3) δH1.18 (3H, t, J = 9 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.35 (3H, t, J = 9 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.80-2.20(4H, m, 2-和3-CH 2)、2.69-3.88 (2H, m, 1-CH 2)、3.40-3.86 (6H, m, N(CH 2CH3)2和NCH 2CH2OH)、4.03-4.22 (3H, m, NCH2CH 2OH和4-CH)、6.75-6.95 (2H, m, NCCHCHCFCH)和7.05-7.15 (1H, m, NCCHCHCFCH确认其结构。
实施例7(e)：甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-6-氟-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙 酯
向6-氟-9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(37) (460mg, 1.4毫摩尔)的二氯甲烷(20 mL)溶液中加入吡啶(1.11 g, 14.0毫摩尔, 1.1 mL)。让反应物冷却至0℃，加入甲磺酰氯(722 mg, 6.3毫摩尔, 0.5 mL)。让反应物温热至室温过夜。用2 N HCl (2 x 30 mL)和水(2 x 30mL)洗涤混合物，在真空中干燥和浓缩。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (0-100% (B), 10 g, 45 CV, 30 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，然后用乙醚捣碎，得到166 mg (30%)白色固体的甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-6-氟-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙酯。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 12.9、15.0、21.1、27.7、36.1、36.7、40.6、41.7、67.8、103.3 (d, JCF = 23 Hz)、108.7、109.0、109.1、109.4(d, JCF = 5 Hz)、126.9 (d, JCF = 10 Hz)、132.4、138.4、156.1、159.2和173.3确认其结构。
实施例7(f)：6-氟-9-(2-[ 18 F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺 (成像剂8)
如实施例1(f)中所述来实施用18F标记甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-6-氟-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙酯。
半制备型HPLC：HICHROM ACE 5 C18柱(100 x 10 mm内径)，粒径5μm；流动相A：水，流动相B：甲醇；流动梯度：3ml/分钟；0-1分钟40 % B；1-20分钟40-95 %B；波长 254 nm；tR成像剂8，15分钟。
分析型HPLC：Phenomenex Luna C18柱(150 x 4.6 mm内径)，粒径5 μm；流动相A：水，流动相B：甲醇；流动梯度：1ml/分钟；0-1分钟50 % B；1-20分钟50-95 %B；波长 230 nm；tR成像剂8 14分钟。放射化学产率26±8% (n=4)非衰变校正，时间90-120分钟，放射化学纯度≥ 99%。图4显示成像剂8和非放射性成像剂8 (按照实施例8制备)的共洗脱。
实施例8：6-氟-9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(非放射 性成像剂8)的合成
实施例8(a)：(2-氟-乙基)-(4-氟-苯基)-胺(38)
在圆底烧瓶中，让4-氟代苯胺(1.3 g, 11.6毫摩尔、1.6 mL)、2,6-二甲基吡啶(1.24 g, 11.6毫摩尔)和甲苯磺酸2-氟乙酯(12；按照实施例2(a)制备) (2.5 g, 11.6毫摩尔)在DMF (5 mL)中混合，在100℃下搅拌过夜。使反应物冷却，然后用乙酸乙酯(100 mL)稀释。用水(3 x 40 mL)洗涤，在真空中干燥和浓缩有机物。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (10% B, 100 g, 12 CV, 60 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到383 mg (20%)黄色油状(2-氟-乙基)-(4-氟-苯基)-胺(38)。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 3.30-3.35(1H, m, NCH 2CH2F)、3.40-3.45 (1H, m, NCH 2CH2F)、3.90 (1H, s, br, NH)、4.53 (1H,t, J = 3 Hz, NCH2CH 2F)、4.69 (1H, t, J = 3 Hz, NCH2CH 2F)、6.51-6.72 (2H, m, 2 xNCCH)、6.85-7.05 (2H, m, 2 x NCCHCH)确认其结构。
实施例8(b)：6-氟-9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(非 放射性成像剂8)
在N2下于50℃将3-溴-2-氧代-环己烷甲酸二乙酰胺(35；按照实施例7(c)制备)(336 mg, 1.2毫摩尔)和(2-氟-乙基)-(4-氟-苯基)-胺(38) (383 mg, 2.4毫摩尔)的混合物搅拌3小时，反应物变成褐色。将所得混合物溶解于丙-2-醇(2 mL)中，加入无水氯化锌(491 mg, 3.6毫摩尔)。在N2下将混合物加热到回流达16小时，在真空中浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯(20 mL)中，用2 N HCl (10 mL)、水(2 x 10 mL)和碳酸钾水溶液(2 x 5 mL)洗涤，然后在真空中干燥和浓缩。用乙醚捣碎粗材料，得到40 mg (10%)白色固体的6-氟-9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(非放射性成像剂8)。通过1H NMR(300 MHz, CDCl3) δH 1.13 (3H, t, J = 9 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.30 (3H, t, J = 9 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.55-2.14 (4H, m, 2-和3-CH 2)、2.78-2.86 (2H, m, 1-CH 2)、3.36-3.67 (4H,m, N(CH 2CH3)2)、4.00-4.10 (1H, m, 4-CH)、4.30 (2H, dm, J = 21 Hz, NCH 2CH2F)、4.60(2H, dm, J = 41 Hz, NCH2CH 2F)、6.75-6.95 (2H, m, NCCHCHCFCH)和7.05-7.15 (1H, m,NCCHCHCFCH确认其结构。
实施例9：5-氟-9-(2-[ 18 F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(成 像剂10)的合成
实施例9(a)：2-苄氧基-N-(3-氟-苯基)-乙酰胺(39)
向苄氧乙酸(4.65 g, 28毫摩尔, 4.0 mL)的DCM(52 mL)溶液中加入草酰氯(7.7g, 61毫摩尔, 5.3 mL)和一滴DMF。在室温下搅拌反应混合物4小时。在真空中去除过量的草酰氯，将该粗酰氯稀释入DCM (100 mL)中，加入三乙胺(5.3 mL, 41.6毫摩尔, 4.2 g)，接着加入3-氟代苯胺(3.5 g, 32毫摩尔, 3.0 mL)。让反应混合物在RT下搅拌过夜。然后用1 M水性HCl (100 mL)猝灭反应，在真空中干燥和浓缩，得到7.10 g (95%)黄色油状2-苄氧基-N-(3-氟-苯基)-乙酰胺(39)，不经纯化将其用于下一步骤。通过13C NMR (75 MHz,CDCl3) δC 69.2、73.5、106.9、107.2、111.0 (d, JCF = 24 Hz)、114.9 (d, JCF = 3 Hz)、127.8、128.2、128.5、129.7 (d, JCF = 9 Hz)、136.2和167.6确认其结构。
实施例9(b)：(2-苄氧基-乙基)-(3-氟-苯基)-胺(40)
向LAH (1.25 g, 27毫摩尔)的无水乙醚(100 mL)混悬液中逐滴加入2-苄氧基-N-(3-氟-苯基)-乙酰胺(39) (7.0 g, 27毫摩尔)的无水乙醚 (100 mL)溶液。如此添加是为了维持回流。一旦添加完成，将反应混合物加热至回流4小时，然后倒入冰水中，加入DCM。为了分解铝盐，加入2M氢氧化钠水溶液，直到获得强碱性pH。分离各层，用DCM洗涤水层，在真空中干燥和浓缩。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (5-50% B, 100 g, 12 CV, 60mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到4.1 g (84%)黄色油状(2-苄氧基-乙基)-(3-氟-苯基)-胺(40)。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3)：δC 43.3、68.2、73.0、99.4 (d, JCF = 24 Hz)、103.5、103.8、108.8、127.4 (d, JCF = 3 Hz)、127.6、128.4、130.0 (d, JCF = 9 Hz)和138.8确认其结构。
实施例9(c)：9-(2-苄氧基-乙基)-5-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺 (41)
在N2下于50℃将3-溴-2-氧代-环己烷甲酸二乙酰胺(35；按照实施例7(c)制备)(2.3 g, 10毫摩尔)和(2-苄氧基-乙基)-(3-氟-苯基)-胺(40) (4.1 g, 17毫摩尔)的混合物搅拌3小时，反应物变成褐色。将所得混合物溶解于丙-2-醇(10 mL)中，加入无水氯化锌(4.09 g, 30毫摩尔)。在N2下将混合物加热至回流达16小时，在真空中浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯(200 mL)中，用2 N HCl (50 mL)、水(2 x 50 mL)和碳酸钾水溶液(2 x 50 mL)洗涤，然后在真空中干燥和浓缩。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (5-100% B, 100g, 28 CV, 60 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到1.3 g (30%)含9-(2-苄氧基-乙基)-5-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(41)和异构体9-(2-苄氧基-乙基)-7-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺的混合物，不经纯化将其用于下一步骤。通过1H NMR(300 MHz, CDCl3) δH 1.10-1.40 (6H, m, N(CH2CH 3)2)、1.60-2.60 (4H, m, 2-和3-CH 2)、2.70-2.85 (2H, m, 1-CH 2)、3.10-3.65 (4H, m, N(CH 2CH3)2和CH 2CH2OBn)、4.00-4.30(3H, m, CH2CH 2Obn和4-CH)、4.43 (2H, s, OCH 2Ph)、6.55-6.65 (1H, m, NCCHCHCHCF)、6.90-7.05 (1H, m, NCCHCHCHCF)、7.05-7.15 (1H, m, NCCHCHCHCF)和7.16-7.25 (5H,m, Ph)确认9-(2-苄氧基-乙基)-5-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(41)的结构。
通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 1.10-1.40 (6H, m, N(CH2CH 3)2)、1.60-2.60(4H, m, 2-和3-CH 2), 2.70-2.85 (2H, m, 1-CH 2), 3.10-3.65 (4H, m, N(CH 2CH3)2和NCH 2CH2OBn)、4.00-4.30 (3H, m, NCH2CH 2Obn和4-CH)、4.55 (2H, s, OCH 2Ph)、6.70-6.80(1H, m, NCCHCFCHCH)和7.00-7.40 (7H, m, NCCHCFCHCH和Ph)确认9-(2-苄氧基-乙基)-7-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺的结构。
实施例9(d)：5-氟-9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺 (42)
向9-(2-苄氧基-乙基)-5-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(41)和9-(2-苄氧基-乙基)-7-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺混合物(1.3 g, 3.0毫摩尔)的甲醇(75 mL)溶液中加入Pd/C (200 mg)的甲醇(10 mL)浆液。将混合物置于Parr氢化器上，在氢气气氛下振摇24小时。通过硅藻土垫过滤反应物，用甲醇洗涤，在真空中浓缩，得到743 mg (80%)黄色油状的5-氟-9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(42)和7-氟-9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺的混合物，不经纯化将其用于下一步骤。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 1.10-1.40 (6H, m, N(CH2CH 3)2)、1.60-2.60 (4H, m, 2-和3-CH 2)、2.70-2.85 (2H, m, 1-CH 2)、3.10-3.65 (4H,m, N(CH 2CH3)2和CH 2CH2OH)、4.00-4.30 (3H, m, CH2CH 2OH, 4-CH)、6.55-6.65 (1H, m,NCCHCHCHCF)、6.90-7.05 (1H, m, NCCHCHCHCF)和7.05-7.15 (1H, m, NCCHCHCHCF)确认5-氟-9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(42)的结构。
通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 1.10-1.40 (6H, m, N(CH2CH 3)2)、1.60-2.60(4H, m, 2-和3-CH 2), 2.70-2.85 (2H, m, 1-CH 2), 3.10-3.65 (4H, m, N(CH 2CH3)2和CH 2CH2OH)、4.00-4.30 (3H, m, NCH2CH 2OH, 4-CH)、6.70-6.80 (1H, m, NCCHCFCHCH)和7.00-7.40 (2H, m, NCCHCFCHCH)确认7-氟-9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺的结构。
实施例9(e)：甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-5-氟-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙 酯
向5-氟-9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(42)和7-氟-9-(2-羟基-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺的混合物(743 mg, 2.2毫摩尔)的二氯甲烷(30 mL)溶液中加入吡啶(1.74 g, 22.0毫摩尔, 1.8 mL)。让反应物冷却至0℃，加入甲磺酰氯(1.01 g, 8.8毫摩尔, 0.7 mL)。将反应物温热至室温过夜。用2 N HCl(2 x 50 mL)和水(2 x 50 mL)洗涤混合物，在真空中干燥和浓缩。通过半制备型HPLC用水(A)和甲醇(B) (Gemini 5u, C18, 110A, 150 x 21mm, 50-95% B在20分钟内, 21 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到10 mg (1 %)白色固体的甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-7-氟-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙酯和30 mg (9 %)白色固体的甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-7-氟-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙酯与甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-5-氟-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙酯的混合物。使用这些纯化条件，不能将甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-5-氟-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙酯分离成为单一组分。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3)δH 1.18 (3H, t, J = 7 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.39 (3H, t, J = 7 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.70-2.30 (4H, m, 2-和3-CH 2)、2.58 (3H, s, OSO2CH 3)、2.60-2.80 (2H, m, 1-CH 2)、3.40-3.65 (4H, m, N(CH 2CH3)2)、4.02 (1H, t, J = 6 Hz, 4-CH)、4.20 (2H, t, J = 7 Hz,NCH 2CH2OMs)、4.35 (2H, t, J = 7 Hz, NCH2CH 2OMs)、6.70-6.85 (1H, m, NCCHCFCHCH)、6.90-7.00 (1H, m, NCCHCFCHCH)和7.05-7.15 (2H, m, NCCHCFCHCH)确认甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-7-氟-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙酯的结构。
通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 1.18 (3H, t, J = 7 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.39(3H, t, J = 7 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.70-2.30 (4H, m, 2-和3-CH 2)、2.58 (3H, s,OSO2CH 3)、2.60-2.80 (2H, m, 1-CH 2)、3.40-3.65 (4H, m, N(CH 2CH3)2)、4.15 (1H, m, 4-CH)、4.20 (2H, t, J = 7 Hz, NCH 2CH2OMs)、4.35 (2H, t, J = 7 Hz, NCH2CH 2OMs)、6.55-6.65 (1H, m, NCCHCHCHCF)、6.90-7.05 (1H, m, NCCHCHCHCF)和7.05-7.15 (1H,m, NCCHCHCHCF)确认甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-5-氟-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙酯的结构。
实施例9(f)：5-氟-9-(2-[ 18 F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺 (成像剂10)
在放射标记反应中使用甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-5-氟-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙酯和甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-7-氟-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙酯的混合物。如实施例1(f)中所述来实施用18F的标记。获得7-氟-9-(2-[18F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(成像剂10)。
半制备型HPLC：HICHROM ACE 5 C18柱(100 x 10 mm内径)，粒径5 μm；流动相A：水，流动相B：甲醇；流动梯度：3ml/分钟；0-1分钟50 % B；1-20分钟50-95 %B；波长 254 nm；tR成像剂10 15分钟；tR 7-氟-9-(2-[18F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺 14分钟。
分析型HPLC：Phenomenex Luna C18柱(150 x 4.6 mm内径)，粒径5 μm；流动相A：水，流动相B：甲醇；流动梯度：1ml/分钟；0-1分钟50 % B；1-20分钟50-95 %B；波长 230 nm；tR成像剂10 16分钟；tR 7-氟-9-(2-[18F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺 14分钟。成像剂10的放射化学产率8.7±1% (n=3)非衰变校正，时间90-120分钟，放射化学纯度≥ 99%。图5显示成像剂10 (上)、7-氟-9-(2-[18F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(中)和7-氟-9-(2-[19F]氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(下)。
实施例10：5-氟-9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(非放 射性成像剂10)的合成
实施例10(a)：(2-氟-乙基)-(3-氟-苯基)-胺(43)
将3-氟代苯胺(1.4 g, 11.6毫摩尔,1.2 mL)、甲苯磺酸2-氟乙酯(12；按照实施例2(a)制备) (2.5 g, 11.6毫摩尔)和二甲基吡啶(1.24g, 11.6mmol))于100℃下在DMF (5mL)中搅拌和加热过夜。使反应物冷却，然后用乙酸乙酯(100 mL)稀释。用水(3 x 40 mL)洗涤，在真空中干燥和浓缩有机物。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (10% B, 100 g,12 CV, 60 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到184 mg (10%)黄色油状(2-氟-乙基)-(3-氟-苯基)-胺(43)。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 3.37 (1H, q, J = 6 Hz, NCH 2CH2F)、3.46 (1H, q, J = 6 Hz, NCH 2CH2F)、4.12 (1H, s, br, NH)、4.54 (1H, t, J = 3 Hz,NCH2CH 2F)、4.69 (1H, t, J = 3 Hz, NCH2CH 2F)、6.31-6.50 (3H, m, NCCHCHCH)、7.10-7.25 (1H, m, NCCHCF)确认其结构。
实施例10(b)：5-氟-9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(非 放射性成像剂10)
在N2下于50℃将3-溴-2-氧代-环己烷甲酸二乙酰胺(35；按照实施例7(c)制备)(161 mg, 0.6毫摩尔)和(2-氟-乙基)-(3-氟-苯基)-胺(43) (184 mg, 1.2毫摩尔)的混合物搅拌3小时，反应物变成褐色。将所得混合物溶解于丙-2-醇(1 mL)中，加入无水氯化锌(245 mg, 1.8毫摩尔)。在N2下将混合物加热至回流达16小时，在真空中浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯(10 mL)中，用2 N HCl (5 mL)、水(2 x 5 mL)和碳酸钾水溶液(2 x 5 mL)洗涤，然后在真空中干燥和浓缩。通过半制备型HPLC用水(A)和甲醇(B) (Gemini 5u, C18,110A, 150 x 21mm, 50-95% B在20分钟内, 21 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，得到20 mg(6 %)白色固体的7-氟-9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺和10 mg(3 %) 白色固体的5-氟-9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(非放射性成像剂10)。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 1.14 (3H, t, J = 7 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.33 (3H, t, J = 7 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.80-2.15 (4H, m, 2-和3-CH 2), 2.70-2.80(2H, m, 1-CH 2)、3.50-3.80 (4H, m, N(CH 2CH3)2)、4.20-4.35 (1H, m, 4-CH)、4.40 (2H,dm, J = 21 Hz, NCH 2CH2F)、4.60 (2H, dm, J = 41 Hz, NCH2CH 2F)、6.70-6.80 (1H, m,NCCHCFCHCH)和7.00-7.10 (2H, m, NCCHCFCHCH)确认7-氟-9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺的结构。
通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 1.14 (3H, t, J = 7 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.33(3H, t, J = 7 Hz, N(CH2CH 3)2)、1.80-2.15 (4H, m, 2-和3-CH 2), 2.70-2.80 (2H, m,1-CH 2), 3.50-3.80 (4H, m, N(CH 2CH3)2)、4.20-4.35 (1H, m, 4-CH)、4.40 (2H, dm, J= 21 Hz, NCH 2CH2F)、4.60 (2H, dm, J = 41 Hz, NCH2CH 2F)、6.55-6.65 (1H, m,NCCHCHCHCF)、6.90-7.05 (1H, m, NCCHCHCHCF)和7.05-7.15 (1H, m, NCCHCHCHCF)确认5-氟-9-(2-氟-乙基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(非放射性成像剂10)的结构。
实施例11：9-(2-[ 18 F]氟-乙基)-2-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺 (成像剂11)
实施例11(a)：4-(4-甲基-环己-1-烯基)-吗啉(44)
在配备有dean stark装置的烧瓶中，将4-甲基环己酮(20.1 g, 179.3毫摩尔, 22mL)和吗啉(31.3 g, 359.0毫摩尔, 31.4 mL)的溶液在苯(55 mL)中回流26小时。在真空下去除苯，减压下通过蒸馏纯化粗产物，得到23 g (70%)油状4-(4-甲基-环己-1-烯基)-吗啉(44) (10 mmHg时b.p. 120℃)。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3)：δH 0.94 (3H, d, J = 6.0Hz, CH 3)、1.15-1.35 (1H, m, CH 2CH=CN)、1.50-1.80 (3H, m, CH2CH 2CHCH3)、2.00-2.25(4H, m, CH 2 CH=CN和CH 2CH2CHCH3)、2.65-2.95 (4H, m, OCH2NCH 2)、3.73 (4H, t, J = 6.0Hz, OCH 2NCH2)和4.60-4.65 (1H, m, CH2CH=CN)确认其结构。
实施例11(b)：5-甲基-2-氧代-环己烷甲酸乙酯(45)
在氮气下向4-(4-甲基-环己-1-烯基)-吗啉(44) (23 g, 127.0毫摩尔)的苯(55mL)溶液中加入氯甲酸乙酯(7.5 g, 69.0毫摩尔, 6.6 mL)，同时快速搅拌该烯胺溶液。回流18小时后，冷却溶液并过滤。用无水乙醚洗涤烯胺盐酸盐的沉淀。让滤液和洗涤物重新回到反应烧瓶中，加入10%的水性HCl (40 mL)。剧烈搅拌混合物15-30分钟。分离各层，用乙酸乙酯(2 x 100 mL)萃取水层，在真空中浓缩合并的有机层。通过减压蒸馏纯化粗材料，得到12.5 g (53%)油状5-甲基-2-氧代-环己烷甲酸乙酯(45) (10 mmHg时b.p. 85℃ - 90℃)。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3)：δH 0.85-0.95 (3H, m, CH 3)、1.17 (3H, t, J = 7 Hz,OCH2CH 3)、1.25-2.00 (5H, m, 5-CH, 4-和6-CH 2), 2.15-2.40 (3H, m, 1-CH和3-CH 2)和4.00-4.20 (2H, m, OCH 2CH3)确认其结构。
实施例11(c)：5-甲基-2-氧代-环己烷甲酸二乙酰胺(46)
将含5-甲基-2-氧代-环己烷甲酸乙酯(45) (5.9 g, 32毫摩尔)、DMAP (1.12 g,10毫摩尔)和二乙胺(4.7 g, 65毫摩尔, 6.7 mL)的甲苯(90 mL)在回流下加热4天。让反应物冷却，减压下去除甲苯，得到黄色油状物。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (20-50% B, 80 g)洗脱来纯化粗材料，得到4.4 g (65%)黄色油状5-甲基-2-氧代-环己烷甲酸二乙酰胺(46)。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 0.8-1.05 (9H, m, CH 3和N(CH2CH 3)2)、1.05-2.10 (5H, m, 5-CH和4-和6-CH 2)、2.15-2.80 (2H, m, 3-CH 2), 2.95-3.55 (5H, m,1-CH和N(CH 2CH3)2)确认其结构。
实施例11(d)：3-溴-2-羟基-5-甲基-环己-1-烯甲酸二乙酰胺(47)
将5-甲基-2-氧代-环己烷甲酸二乙酰胺(46) (4.4 g, 21毫摩尔)溶解于乙醚(5mL)中，在N2下冷却至0℃。在15分钟内逐滴加入溴(3.32 g, 21毫摩尔, 1.1 mL)，让反应混合物经90分钟温热至室温。将混合物缓慢倒入冰冷的饱和碳酸钠水溶液(40 mL)中，用乙酸乙酯(3 x 40 mL)萃取。在真空中干燥和浓缩合并的有机层，得到6.1 g (定量的)米白色固体的3-溴-2-羟基-5-甲基-环己-1-烯甲酸二乙酰胺(47)。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3)δH 0.8-1.20 (9H, m, CH 3和N(CH2CH 3)2)、1.80-2.40 (5H, m, CH 2CH(CH3)CH 2)、3.15-3.55(4H, m, N(CH 2CH3)2)、4.65-4.74 (1H, m, CHBr)和12.04 (1H, s, OH)确认其结构。
实施例11(e)：9-(2-苄氧基-乙基)-2-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙 酰胺(48)
在N2下于50℃将3-溴-2-羟基-5-甲基-环己-1-烯甲酸二乙酰胺(47) (4.0 g, 14毫摩尔)和(2-苄氧基-乙基)-苯基-胺(21；按照实施例3(c)制备) (6.3 g, 28毫摩尔)的混合物搅拌3小时，反应物变成褐色。将所得混合物溶解于丙-2-醇(14 mL)中，加入无水氯化锌(5.72 g, 42毫摩尔)。在N2下将混合物加热至回流达16小时，然后在真空中浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯(200 mL)中，用2 N HCl (50 mL)、水(2 x 50 mL)和碳酸钾水溶液(2 x50 mL)洗涤，然后在真空中干燥和浓缩。通过SCX柱(40mL)并然后通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (10-50% B, 100 g, 12 CV, 85 mL/分钟)洗脱来纯化粗混合物，得到467mg (8%)白色固体的9-(2-苄氧基-乙基)-2-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(48)。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 1.20-1.40 (9H, m, CH3和N(CH2CH3)2)、1.90-2.20 (3H, m, 2-CH和3-CH2), 2.35-2.45 (1H, m, 1-CH2)、2.85-2.95 (1H, m, 1-CH2)、3.40-3.70 (4H, m, N(CH2CH3)2)、3.70-3.80 (1H, m, 4-CH)、4.10-4.30 (4H, m,NCH2CH2OBn)、4.43 (2H, s, OCH2Ph)和7.00-7.30 (9H, m, CHCHCHCH和Ph)确认其结构。
实施例11(f)：9-(2-羟基-乙基)-2-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰 胺(49)
向9-(2-苄氧基-乙基)-2-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(48)(460 mg, 1.1毫摩尔)的甲醇(25 mL)溶液中加入Pd/C (100 mg)的甲醇(5 mL)浆液。将混合物置于Parr氢化器上，在氢气氛下振摇24小时。通过硅藻土垫过滤反应物，用甲醇洗涤，在真空中浓缩，得到250 mg (79%)黄色油状9-(2-羟基-乙基)-2-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(49)，不经纯化将其用于下一步骤。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3)δH 1.20-1.40 (9H, m, CH 3和N(CH2CH 3)2)、1.90-2.20 (3H, m, 2-CH和3-CH 2)、2.35-2.45(1H, m, 1-CH 2)、2.85-2.95 (1H, m, 1-CH 2)、3.40-3.70 (4H, m, N(CH 2CH3)2)、3.70-3.80(1H, m, 4-CH)、4.10-4.30 (4H, m, NCH 2CH 2OH)、6.91 (1H, t, J = 7 Hz, NCCHCHCHCH)、7.00 (1H, t, J = 7 Hz, NCCHCHCHCH)、7.12 (1H, d, J = 7 Hz, NCCHCHCHCH)和7.15(1H, d, J = 7 Hz, NCCHCHCHCH)确认其结构。
实施例11(g)：甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-2-甲基-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)- 乙酯
向9-(2-羟基-乙基)-2-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(49) (250mg, 0.8毫摩尔)的二氯甲烷(10 mL)溶液中加入吡啶(633 mg, 8.0毫摩尔, 0.6 mL)。让反应物冷却至0℃，加入甲磺酰氯(367 mg, 3.2毫摩尔, 0.2 mL)。让反应物温热至室温过夜。用2 N HCl (2 x 20 mL)和水(2 x 20 mL)洗涤混合物，在真空中干燥和浓缩。通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (0-100% B, 10 g, 34 CV, 30 mL/分钟)洗脱来纯化粗材料，然后用乙醚捣碎，得到250 mg (80%)白色固体的甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-2-甲基-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙酯。通过13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 12.9、13.0、15.2、22.0、29.7、30.2、36.7、36.8、40.8、41.6、42.0、67.8、108.6、109.5、118.6、119.6、121.2、126.4、136.2、136.4、173.7确认其结构。
实施例11(h)：9-(2-[ 18 F]氟-乙基)-2-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙 酰胺(成像剂11)
如实施例1(f)中所述来实施用18F标记甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-2-甲基-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)-乙酯。
半制备型HPLC：HICHROM ACE 5 C18柱(100 x 10 mm内径)，粒径5 μm；流动相A：水，流动相B：甲醇；流动梯度：3ml/分钟；0-26分钟50 % B；波长254 nm；tR成像剂11 15分钟。
分析型HPLC：Phenomenex Luna C18柱(150 x 4.6 mm内径)，粒径5 μm；流动相A：水，流动相B：甲醇；流动梯度：1ml/分钟；0-1分钟40 % B；1-20分钟40-95 %B；波长230 nm；tR成像剂11 17分钟。放射化学产率14±13% (n=3)非衰变校正，时间90-120分钟，放射化学纯度≥99%。图6显示成像剂11和非放射性成像剂11的共洗脱。
实施例12：9-(2-氟-乙基)-2-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(非 放射性成像剂11)的合成
在N2下于50℃将3-溴-2-羟基-5-甲基-环己-1-烯甲酸二乙酰胺(47；按照实施例11(d)制备) (2.0 g, 7毫摩尔)和(2-氟-乙基)-苯基-胺(24；按照实施例4(a)制备) (1.9g, 14毫摩尔)的混合物搅拌3小时，反应物变成褐色。将所得混合物溶解于丙-2-醇(7 mL)中，加入无水氯化锌(2.86 g, 21毫摩尔)。在N2下将混合物加热至回流达16小时，然后在真空中浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯(100 mL)中，用2 N HCl (30 mL)、水(2 x 30 mL)和碳酸钾水溶液(2 x 30 mL)洗涤，然后在真空中干燥和浓缩。通过SCX柱(40 mL)并然后通过硅胶色谱用石油(A)和乙酸乙酯(B) (0-100% B, 100 g, 12 CV, 85 mL/分钟)洗脱来纯化粗混合物，得到400 mg (17%)白色固体的9-(2-氟-乙基)-2-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-4-甲酸二乙酰胺(非放射性成像剂11)。通过1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 1.10-1.35 (9H,m, CH 3和N(CH2CH 3)2)、1.95-2.10 (2H, m, 3-CH 2)、2.30-2.50 (1H, m, 2-CH), 2.70-2.80(2H, m, 1-CH 2)、3.40-3.70 (4H, m, N(CH 2CH3)2)、4.05-4.15 (1H, m, 4-CH)、4.30 (2H,dm, J = 21 Hz, NCH 2CH2F)、4.65 (2H, dm, J = 41 Hz, NCH2CH 2F)和7.00-7.30 (4H, m,NCCHCHCHCH)确认其结构。
实施例13：成像剂5的(S)和(R)对映异构体的制备
采用手性超临界流体(CO2)色谱法，在Kromasil Amycoat, 250x10 mm, 5 µm,100 Å柱上(使用30 % IPA、40℃、13ml/分钟、运行时间6分钟)将前体化合物甲磺酸2-(4-二乙基氨甲酰基-5-甲氧基-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基)乙酯(如实施例1(l)中阐述而得)分离成其对映异构体。将60 mg外消旋物溶解于1.4-二噁烷(2ml)中，对于每次运行，每次注入多至200 µl。获得两种对映异构体之间的基线分离。在来自Chiral Technologies的IC(250x4.6 mm, 5 µm，等度运行， 80:20 - MeOH: IPA、0.5 ml/分钟和室温)上，对两种分开的对映异构体的对映异构体纯度进行分析型HPLC测定，表明每种对映异构体的对映异构体纯度为99.5%。
使用FASTLabTM (GE Healthcare)盒来实施用18F标记前体化合物的(S)和(R)对映异构体。在GE PETrace回旋加速器上将由GE Healthcare提供的[18F]氟化物捕获在QMA柱上。将K222 (8mg)、KHCO3 (200µl, 0.1M aq.)和MeCN (1ml)加入到洗脱液小瓶1中。使用洗脱液小瓶1中的0.6 ml洗脱液来洗脱QMA柱。以100℃在20分钟内对18F洗出液进行干燥，接着在加入前体之前冷却至86℃。
将前体化合物的(S)和(R)对映异构体各3 mg溶解于1.6ml的CH3CN中。将1 ml 该溶液加入到反应管中。将反应管在100℃下加热15分钟。然后用2 ml水漂洗反应管。
如下实施半制备型HPLC：
0-40分钟 45%(B)
柱 ACE 5 C18柱, 5u, 100x10mm
洗脱液 水(泵A)：MeCN (泵B)
环体积(loop size ) 5 ml
泵速度 3 ml/分钟,
波长 254 nm, 2 AUFS
图7和8分别显示使用以上用于本发明的PET示踪物及其备选对映异构体的半制备方法获得的放射性(上)和UV (下) HPLC图谱。
如下实施分析型非手性HPLC：
0-25分钟 60%(B)
25-25.5分钟 60-95%(B)
25.5-26.5分钟 95%(B)
26.5-27分钟 95-60%(B)
27-30分钟 60%(B)
柱 Chromolith RP-18e 100x4.6mm (H10-0022) Luna C18 Guard
洗脱液 水(泵A)：MeOH (泵B)
环体积 20ul
泵速度 1ml/分钟,
波长 254, 230nm
图9和10分别显示使用以上用于本发明的PET示踪物及其备选对映异构体的分析型非手性方法获得的HPLC图谱。
如下实施分析型手性HPLC：
0-10分钟 20%(B)
柱 Chiralpak IC 250x4.6mm和Chiralpak IC保护柱
洗脱液 甲醇(泵A)：异丙醇(泵B)
环体积 10ul
泵速度 1ml/分钟,
波长 220, 230nm
图11和12分别显示使用以上用于本发明的PET示踪物及其备选对映异构体的手性HPLC方法获得的HPLC图谱。
本发明的PET示踪物的EOS产率为32%，其对映异构体为19%。
实施例14：成像剂5的(S)和(R)对映异构体的非放射性形式的合成
采用手性超临界流体(CO2)色谱法，在Kromasil Amycoat, 250x10 mm, 5 µm,100 Å柱上(使用20 % IPA、40℃、14ml/分钟、运行时间6分钟)将非放射性成像剂5 (如实施例2中阐述而得)分离成其对映异构体。将100 mg外消旋混合物溶解于1.4-二噁烷(2.5 ml)中，对于每次运行，每次注入多至200 µl。按时间分割各级分以确保不收集到混合的级分。在来自Chiral Technologies的IC (250x4.6 mm, 5 µm，等度运行，80:20 - MeOH: IPA、0.5 ml/分钟和室温)上，对两种分开的对映异构体的对映异构体纯度进行分析型HPLC测定，表明每种对映异构体的对映异构体纯度为99.5%。
实施例15：体外效能测定
使用自Le Fur等(Life Sci. 1983; USA 33: 449-57)修改的方法筛选对PBR的亲和力。测试本发明的体内成像剂的非放射性类似物。
每一测试化合物(溶解于50mM Tris-HCl, pH 7.4, 含有1% DMSO的10mM MgCl2)与0.3 nM [3H] PK-11195竞争结合Wistar大鼠心脏PBR。在50mM Tris-HCl, pH 7.4 10mMMgCl2中在25℃下使反应进行15分钟。在估计的Ki附近的300倍浓度范围内的6个不同浓度下筛选每一测试化合物。观测到下列数据：
成像剂 Ki (nM)
5 1.47
(S)-5 0.87
(R)-5 3.87
6 18.30
7 1.25
9 3.79
10 7.62
11 2.12
实施例16：体内生物分布方法
在体内生物分布模型中测试本发明的成像剂。
用1–3 MBq的测试化合物经由侧尾静脉注射成年雄性Wistar大鼠(200–300g)。在注射后2、10、30或60分钟(n = 3)后，对大鼠实施安乐死，对组织或流体进行采样用于γ计数器上的放射性测量。
观测到下列数据记录：
成像剂 脑2分钟(%ID/g) OB 30分钟(%ID/g) OB:Str 30分钟
5 0.52 0.36 3.00
(S)-5 0.53 0.45 3.20
(R)-5 0.53 0.23 2.90
6 0.51 0.25 2.50
7 0.55 0.34 3.40
9 0.56 0.41 3.72
10 0.50 0.51 3.19
11 0.51 0.42 3.50
%ID/g：每克的注射剂量百分比；OB：嗅球；Str：纹状体
图13-18分别图示了成像剂5-8、10和11在脑中的生物分布概况。可看出，本发明的体内成像剂有良好的脑摄取，在表达PBR的组织中有提高的特异性摄取。

Claims (13)

1.式I的体内成像剂在制备用于在受试者中鉴定和/或监测癌症的药物中的用途，其中所述癌症特征为外周苯并二氮杂受体(PBR)的异常表达，其中所述鉴定和/或监测包括以下步骤：
(a)将式I的体内成像剂给予所述受试者：
　(I)
其中：
R1为C1-3烷基或C1-3氟烷基；
R2为氢、卤素、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷基或C1-3氟烷氧基；
R3和R4独立为C1-3烷基、C7-10芳烷基，或R3和R4与其所连接的氮一起形成含氮的C4-6脂肪族环；
Y1为CH2；和
Y2为CH2、CH2-CH2、CH(CH3)-CH2或CH2-CH2-CH2；
并且其中所述式I的体内成像剂包含其为适于体内成像的放射性同位素的原子；
(b)让步骤(a)中所述给予的体内成像剂与在所述受试者中表达的PBR结合；
(c)使用适宜的体内成像程序检测由包含在步骤(b)的所述结合的体内成像剂中的放射性同位素发出的信号；
(d)产生代表步骤(c)中检测到的所述信号的分布和/或程度的图像；
(e)在所述受试者中测定PBR表达的分布和/或程度，其中所述表达与步骤(d)中产生的所述图像代表的所述信号的分布和/或程度直接相关；和
(f)在鉴定和/或监测所述癌症中使用如步骤(e)中所测定的PBR表达的分布和程度，
其中所述癌症选自神经胶质瘤、星形细胞瘤、卵巢癌、肝癌、纤维肉瘤和口腔癌。
2.权利要求1定义的用途，其中所述体内成像剂作为包含所述体内成像剂连同药理学上可接受的载体的放射性药物组合物来给予。
3.权利要求1-2中任一项定义的用途，其中所述适于体内成像的放射性同位素选自11C、18F和123I。
4.权利要求1-3中任一项定义的用途，其中式I的R1为甲基或C2-3氟烷基。
5.权利要求1-4中任一项定义的用途，其中式I的R2为氢、卤素、C1-3烷氧基或C1-3氟烷氧基。
6.权利要求1-5中任一项定义的用途，其中式I的R3和R4独立为甲基、乙基或苄基。
7.权利要求1-5中任一项定义的用途，其中式I的R3和R4与其所连接的氮一起形成含氮的C5-6脂肪族环。
8.权利要求1-7中任一项定义的用途，其中式I的Y2为CH2-CH2。
9.权利要求1定义的用途，其中所述体内成像剂具有式Ia：
　(Ia)
其中：
R2a为氢、卤素或C1-3烷氧基；
R3a和R4a独立为甲基、乙基或苄基；或与其所连接的氮一起形成吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基或吗啉基环；
Y2a如权利要求1对Y2所定义；和
n为1、2或3。
10.权利要求9定义的用途，其中对于式Ia：
R3a和R4a二者均为乙基；或R3a为甲基，R4a为苄基；或与其所连接的氮一起形成氮杂环庚烷基环；
R2a为氢、甲氧基或氟；
Y2a为CH2-CH2或CH(CH3)-CH2；和
n为2。
11.权利要求10定义的用途，其中所述体内成像剂具有以下化学结构：
。
12.权利要求11定义的用途，其中所述体内成像剂为具有以下化学结构的经纯化的对映异构体：
。
13.权利要求1-12中任一项定义的用途，在用于所述受试者的治疗方案的进程期间反复实施所述鉴定和/或监测，所述方案包括给予药物以抵抗癌症，其中所述癌症如权利要求1所定义。
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