CN103145814A - 杀虫蛋白质、其编码基因及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杀虫蛋白质、其编码基因及用途，杀虫蛋白质包括：(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有杀虫活性的由(a)衍生的蛋白质；或(c)与SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明杀虫蛋白质不仅表达量高且稳定性好，对昆虫害虫的毒力强。

Description

杀虫蛋白质、其编码基因及用途

技术领域

本发明涉及一种杀虫蛋白质、其编码基因及用途，特别是涉及一种改造的PIC3-01杀虫蛋白质、其编码基因及用途。

背景技术

植物虫害是导致农作物损失的主要因素，给农民造成重大的经济损失，甚至影响到当地人口的生存状况。为了防治植物虫害，人们通常使用广谱化学杀虫剂和生物杀虫制剂，但二者在实际应用中都具有局限性：化学杀虫剂会带来环境污染的问题，并导致抗药性昆虫的出现；而生物杀虫制剂在环境中容易降解，在生产上需要重复施用，大大增加了生产成本。

为了解决化学杀虫剂和生物杀虫制剂在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。PIC3杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是不溶性伴孢结晶蛋白。

PIC3蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性pH环境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏细胞膜内外的渗透压变化及pH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。

每年因植物虫害造成的粮食损失巨大，例如玉米螟、棉铃虫、小菜蛾、东方黏虫或二化螟等。目前未发现PIC3杀虫蛋白在植物中的表达水平和毒力的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种杀虫蛋白质、其编码基因及用途，所述PIC3-01杀虫蛋白在植物中(尤其为玉米和水稻)具有较高的表达量和毒力。

为实现上述目的，本发明提供了一种杀虫蛋白质，包括：

(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有杀虫活性的由(a)衍生的蛋白质；或

(c)与SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。

进一步地，所述杀虫蛋白质为与SEQ ID NO:2具有至少95%序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。

更进一步地，所述杀虫蛋白质为与SEQ ID NO:2具有至少99%序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。

为实现上述目的，本发明提供了一种杀虫基因，包括：

(a)编码权利要求1-3任一项所述杀虫蛋白质的核苷酸序列；或

(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白质的核苷酸序列；或

(c)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

所述严格条件可为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5%SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜1次。

为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述杀虫基因。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述杀虫基因或所述表达盒的重组载体。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述杀虫基因或所述表达盒的转基因宿主生物，包括植物细胞、动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。

进一步地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产生杀虫蛋白质的方法，包括：

获得所述转基因宿主生物的细胞；

在允许产生杀虫蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；

回收所述杀虫蛋白质。

为实现上述目的，本发明还提供了一种用于增加昆虫靶范围的方法，包括：将所述杀虫蛋白质或所述表达盒编码的杀虫蛋白质在植物中与至少一种不同于所述杀虫蛋白质或所述表达盒编码的杀虫蛋白质的第二种杀虫核苷酸一起表达。

进一步地，所述第二种杀虫核苷酸可以编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。

可选择地，所述第二种杀虫核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。

在本发明中，PIC3-01杀虫蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物（第1亲本)可以通过遗传工程操作表达PIC3-01杀虫蛋白质，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。因此可以使用RNAi技术特异性剔除或关闭特定基因的表达。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产生抗虫植物的方法，包括：将所述杀虫基因或所述表达盒或所述重组载体导入植物。

优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。

为实现上述目的，本发明还提供了一种用于保护植物免受由昆虫害虫引起的损伤的方法，包括：将所述的杀虫基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受昆虫害虫侵害量的杀虫蛋白质。

优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。

将所述的杀虫基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，在本发明中为将外源DNA导入植物细胞，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。

为实现上述目的，本发明还提供了一种控制昆虫害虫的方法，包括：使昆虫害虫与抑制量的所述杀虫蛋白质或由所述杀虫基因编码的昆虫抑制性蛋白接触。

优选地，所述昆虫害虫是鳞翅目昆虫害虫。

本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。

本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。

本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了DNA的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将DNA的一条链转录为一条mRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mRNA实际上是从DNA的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子(密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸)，其可作为开放阅读框(ORF)阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的DNA有相当功能的RNA和PNA(肽核酸)。

本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明杀虫基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明杀虫基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。

本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6×SSC、0.5%SDS溶液中，在65℃下与SEQ ID NO:1发生特异性杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜1次。

因此，具有抗虫活性并在严格条件下与本发明序列1杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40%-50%同源，大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源。即序列同一性的范围分布在至少大约40%-50%、大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同源性。

本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的杀虫活性特征的部分和/片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有杀虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗鳞翅目昆虫害虫和/或鞘翅目昆虫害虫的生物活性的蛋白。

本发明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端的缺失，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)蛋白质为昆虫毒素。在一些情况下(特别是植物中的表达)，使用编码截短蛋白质的截短基因可能是有利的。优选的截短基因一般编码全长蛋白质的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。

由于遗传密码子的丰余性，多种不同的DNA序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的DNA序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响杀虫活性的序列，亦包括保留杀虫活性的片段。

本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为：小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。

保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年纽约学术出版社(Academic Press)出版的《Protein》中进行了描述。最常见的互换有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thu/Ser，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly，以及它们相反的互换。

对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(如参见，Cunningham和Wells，1989，Science244：1081-1085)。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的抗虫活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定(参见，如de Vos等，1992，Science255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol224:899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters309：59-64)。

因此，与序列2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于60%，优选的大于75%，更优选的大于80%，甚至更优选的大于90%，并且可以大于95%。也可以根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性和/或类似性。

本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子，增强子，前导序列，内含子以及其它可操作地连接到所述杀虫基因的调节序列。

所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、ubi启动子、水稻GOS2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)，如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(pinⅠ和pinⅡ)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。

所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。

所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV(玉米矮缩花叶病毒)前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(BiP)；苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列(AMV RNA4)；烟草花叶病毒(TMV)前导序列。

所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)增强子、玄参花叶病毒(FMV)增强子、康乃馨风化环病毒(CERV)增强子、木薯脉花叶病毒(CsVMV)增强子、紫茉莉花叶病毒(MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)和花生褪绿线条花叶病毒(PCLSV)增强子。

对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Act1内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，CAT-1内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和“超级泛素”内含子。

所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂Ⅱ(pinⅡ)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。

本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示：启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。

本发明中所述的“杀虫”是指对农作物害虫是有毒的。更具体地，目标昆虫是害虫，例如，但不限于，大部分鳞翅目害虫，如玉米螟、二化螟、棉铃虫、小菜蛾或东方黏虫等。

本发明中，所述杀虫蛋白质为PIC3-01氨基酸序列，如序列表中SEQ IDNO:2所示。所述杀虫基因为PIC3-01核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:1所示。所述杀虫基因为用于植物，特别是玉米转化的DNA序列，除了包含由PIC3-01核苷酸序列编码的蛋白质的编码区外，也可包含其他元件，例如编码转运肽的编码区、编码选择性标记的蛋白质或赋予除草剂抗性的蛋白质的编码区。

本发明中PIC3-01杀虫蛋白质对大多数鳞翅目害虫具有毒性。本发明中的植物，特别是玉米，在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含PIC3-01核苷酸序列，通过表达抑制量的该蛋白而保护其免受害虫的威胁。抑制量是指致死的或亚致死的剂量。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，该植物可基本消除对化学或生物杀虫剂的需要(所述化学或生物杀虫剂为针对由PIC3-01核苷酸序列编码的蛋白质所靶向的昆虫的杀虫剂)。

植物材料中杀虫晶体蛋白(ICP)的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码杀虫蛋白质的mRNA进行定量，或直接特异性检测产生的杀虫蛋白质的量。

可以应用不同的试验测定植物中ICP的杀虫效果。本发明中目标昆虫主要为鳞翅目害虫，更具体地为亚洲玉米螟或二化螟等。

此外，包含本发明杀虫蛋白质(PIC3-01氨基酸序列)的表达盒在植物中还可以与至少一种编码除草剂抗性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敌草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、对除草剂茅草枯的抗性基因、对氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制剂(如PPT)的抗性基因，从而获得既具有高杀虫活性、又具有除草剂抗性的转基因植物。

本发明提供了一种杀虫蛋白质、其编码基因及用途，具有以下优点：

1、毒力强。本发明杀虫蛋白质PIC3-01的杀虫毒力强，尤其是针对危害玉米的鳞翅目害虫。

2、表达量高。本发明杀虫基因PIC3-01采用玉米的偏好密码子，完全符合玉米基因的特性，使得本发明杀虫基因特别适合在单子叶植物中表达，尤其是玉米和水稻，其表达量高且稳定性好。

3、杀虫谱广。本发明杀虫蛋白质PIC3-01蛋白不仅对亚洲玉米螟表现出较高的抗性，而且首次报道了本发明杀虫蛋白质PIC3-01蛋白对二化螟也具有较高的活性，因此在植物上应用前景广阔。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明杀虫蛋白质、其编码基因及用途的含有PIC3-01核苷酸序列的重组克隆载体DBN01-T构建流程图；

图2为本发明杀虫蛋白质、其编码基因及用途的含有PIC3-01核苷酸序列的重组表达载体DBN100083构建流程图；

图3为本发明杀虫蛋白质、其编码基因及用途的含有天然序列的重组表达载体DBN100083N构建流程图；

图4为本发明杀虫蛋白质、其编码基因及用途的转基因玉米植株的PIC3杀虫蛋白质的mRNA相对含量图；

图5为本发明杀虫蛋白质、其编码基因及用途的转基因玉米植株接种亚洲玉米螟的抗虫效果图；

图6为本发明杀虫蛋白质、其编码基因及用途的转基因水稻植株的PIC3杀虫蛋白质的mRNA相对含量图；

图7为本发明杀虫蛋白质、其编码基因及用途的转基因水稻植株接种二化螟的抗虫效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明杀虫蛋白质、其编码基因及用途的技术方案。

第一实施例、PIC3-01基因序列的获得和合成

1、获得PIC3-01基因序列

PIC3-01杀虫蛋白质的氨基酸序列(731个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:2所示；依据玉米偏好性密码子获得编码相应于所述PIC3-01杀虫蛋白质的氨基酸序列(731个氨基酸)的核苷酸序列(2196个核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:1所示。玉米的密码子使用偏好性可参考http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=381124。

2、合成上述PIC3-01核苷酸序列

所述PIC3-01核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述PIC3-01核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的5’端还连接有SphI酶切位点，所述PIC3-01核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的3’端还连接有SpeI酶切位点。

同时，合成PIC3-01取代核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:3所示)，其为所述PIC3-01氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO:2所示)中第352位Arg替换为His；合成的所述PIC3-01取代核苷酸序列(SEQ ID NO:3)的5’端还连接有SphI酶切位点，所述PIC3-01取代核苷酸序列(SEQ ID NO:3)的3’端还连接有SpeI酶切位点。

同时，合成PIC3-01截短核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:4所示)，其为所述PIC3-01氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO:2所示)的第1至718位氨基酸；合成的所述PIC3-01截短核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的5’端还连接有SphI酶切位点，所述PIC3-01截短核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的3’端还连接有SpeI酶切位点。

同时，合成PIC3-01添加核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:5所示)，其为所述PIC3-01氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO:2所示)中在第731位后添加3个氨基酸Gln、Ser、Asn；合成的所述PIC3-01添加核苷酸序列(SEQID NO:5)的5’端还连接有SphI酶切位点，所述PIC3-01添加核苷酸序列(SEQID NO:5)的3’端还连接有SpeI酶切位点。

第二实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌

1、构建含有PIC3-01核苷酸序列的重组克隆载体DBN01-T

将合成的PIC3-01核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT：A3600)上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体DBN01-T，其构建流程如图1所示(其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；PIC3-01为PIC3-01核苷酸序列(SEQ ID NO:1)；MCS为多克隆位点)。

然后将重组克隆载体DBN01-T用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞(Transgen，Beijing，China，CAT：CD501)，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA(重组克隆载体DBN01-T)，42℃水浴30秒；37℃水浴1小时(100rpm转速下摇床摇动)，在表面涂有IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入150μl新配制的溶液II(0.2M NaOH，1%SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(4M醋酸钾，2M醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70%的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含RNase(20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经SphI和SpeI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01-T中插入的所述PIC3-01核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列，即PIC3-01核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将合成的所述PIC3-01取代核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体DBN02-T，其中，miPIC3-01为PIC3-01取代核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。酶切和测序验证重组克隆载体DBN02-T中所述PIC3-01取代核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将合成的所述PIC3-01截短核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体DBN03-T，其中，mtPIC3-01为PIC3-01截短核苷酸序列(SEQ ID NO:4)。酶切和测序验证重组克隆载体DBN03-T中所述PIC3-01截短核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将合成的所述PIC3-01添加核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体DBN04-T，其中，maPIC3-01为PIC3-01添加核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。酶切和测序验证重组克隆载体DBN04-T中所述PIC3-01添加核苷酸序列正确插入。

2、构建含有PIC3-01核苷酸序列的重组表达载体DBN100083

用限制性内切酶SphI和SpeI分别酶切重组克隆载体DBN01-T和表达载体DBNBC-01(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))，将切下的PIC3-01核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-01的SphI和SpeI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100083，其构建流程如图2所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；Ubi：玉米Ubiquitin(泛素)基因启动子(SEQ ID NO:6)；PIC3-01：PIC3-01核苷酸序列(SEQ ID NO:1)；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:7)；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因(SEQ ID NO:8)；LB：左边界)。

将重组表达载体DBN100083用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA(重组表达载体DBN100083)，42℃水浴30秒；37℃水浴1小时(100rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶SphI和SpeI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100083在SphI和SpeI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即PIC3-01核苷酸序列。

按照上述构建重组表达载体DBN100083的方法，将SphI和SpeI酶切重组克隆载体DBN02-T切下的所述PIC3-01取代核苷酸序列插入表达载体DBNBC-01，得到重组表达载体DBN100083-i。酶切和测序验证重组表达载体DBN100083-i在SphI和SpeI位点间即为所述PIC3-01取代核苷酸序列。

按照上述构建重组表达载体DBN100083的方法，将SphI和SpeI酶切重组克隆载体DBN03-T切下的所述PIC3-01截短核苷酸序列插入表达载体DBNBC-01，得到重组表达载体DBN100083-t。酶切和测序验证重组表达载体DBN100083-t在SphI和SpeI位点间即为所述PIC3-01截短核苷酸序列。

按照上述构建重组表达载体DBN100083的方法，将SphI和SpeI酶切重组克隆载体DBN04-T切下的所述PIC3-01添加核苷酸序列插入表达载体DBNBC-01，得到重组表达载体DBN100083-a。酶切和测序验证重组表达载体DBN100083-a在SphI和SpeI位点间即为所述PIC3-01添加核苷酸序列。

3、构建含有天然序列的重组表达载体DBN100083N(正对照)

按照本发明第二实施例中1所述的构建含有PIC3-01核苷酸序列的重组克隆载体DBN01-T的方法，利用天然序列(SEQ ID NO:9)构建含有天然序列的重组克隆载体DBN01R-T。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01R-T中插入的天然序列为序列表中SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，即天然序列正确插入。

按照本发明第二实施例中2所述的构建含有PIC3-01核苷酸序列的重组表达载体DBN100083的方法，利用天然序列构建含有天然序列的重组表达载体DBN100083N，其构建流程如图3所示(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供)；Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；Ubi：玉米Ubiquitin(泛素)基因启动子(SEQ ID NO:6)；mN：天然序列(SEQ ID NO:9)；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:7)；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因(SEQID NO:8)；LB：左边界)。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组表达载体DBN100083N中插入的天然序列为序列表中SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，即天然序列正确插入。

4、重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体DBN100083、DBN100083-i、DBN100083-t、DBN100083-a和DBN100083N(天然序列)用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶AhdI和AatII对重组表达载体DBN100083、DBN100083-i、DBN100083-t和DBN100083-a酶切后进行酶切验证，用限制性内切酶StyI和BglII对重组表达载体DBN100083N(天然序列)酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN100083、DBN100083-i、DBN100083-t、DBN100083-a和DBN100083N(天然序列)结构完全正确。

第三实施例、转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株的获得及验证

1、获得转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31(Z31)的幼胚与第二实施例中4所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2和3构建的重组表达载体DBN100083、DBN100083-i、DBN100083-t、DBN100083-a和DBN100083N(天然序列)中的T-DNA(包括玉米Ubiquitin基因的启动子序列、PIC3-01核苷酸序列、PIC3-01取代核苷酸序列、PIC3-01截短核苷酸序列、PIC3-01添加核苷酸序列、天然序列、PMI基因和Nos终止子序列)转入到玉米染色体组中，获得了转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的玉米植株和转入天然序列的玉米植株(正对照)；同时以野生型玉米植株作为负对照。

对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将PIC3-01核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1：侵染步骤)。在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(OD₆₆₀=0.4-0.6，侵染培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L，pH5.3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：恢复步骤)。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂(甘露糖)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、琼脂8g/L，pH5.8)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时。

2、用TaqMan验证转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株

分别取转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的玉米植株和转入天然序列的玉米植株的叶片约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测PIC3基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为负对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测PIC3基因拷贝数的具体方法如下：

步骤11、分别取转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的玉米植株、转入天然序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

步骤13、用NanoDrop2000(Thermo Scientifc)测定上述样品的基因组DNA浓度；

步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测PIC3-01核苷酸序列、PIC3-01取代核苷酸序列、PIC3-01截短核苷酸序列和PIC3-01添加核苷酸序列：

引物1(CF1)：TGCGGTGTCTAACCACTCAGC如序列表中SEQ ID NO:10所示；

引物2(CR1)：ATGCACAGGGAGTCTTCGATTC如序列表中SEQ ID NO:11所示；

探针1(CP1)：CAGATGGACCTCCTGCCAGATGCG如序列表中SEQ IDNO:12所示；

以下引物和探针用来检测天然序列：

引物3(CF2)：CCTATGGCCGCTTTCAGTTG如序列表中SEQ ID NO:13所示；

引物4(CR2)：TGTGGTGCGCATCGATTC如序列表中SEQ ID NO:14所示；

探针2(CP2)：CTCCGCACCTTCCGATTGGGCT如序列表中SEQ ID NO:15所示；

PCR反应体系为：

所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μl，100μM浓度的探针50μl和860μl1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。

PCR反应条件为：

利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。

实验结果表明，PIC3-01核苷酸序列、PIC3-01取代核苷酸序列、PIC3-01截短核苷酸序、PIC3-01添加核苷酸序列和天然序列均己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的玉米植株和转入天然序列的玉米植株均获得了含有单拷贝PIC3基因的转基因玉米植株。

第四实施例、转基因玉米植株的RT-PCR检测

1、转基因玉米植株的杀虫蛋白质(PIC3蛋白)的mRNA含量检测

分别取0.2g转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的玉米植株和转入天然序列的玉米植株的新鲜叶片(心叶)作为样品，液氮研磨收集100-200mg组织，后加入1ml所述TRIZOL提取液，涡旋使样品充分裂解，室温放置5min；加入0.2ml氯仿(chloroform)剧烈振荡混匀15s，室温放置10min；4℃下，12000rpm的转速下离心10min，取上清液加入0.5ml(或0.5X开始体积)的RNase-Free水，再加入1ml的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，室温放置10min，沉淀；4℃下，12000rpm的转速下离心10min，取沉淀加入1ml质量分数为75%的乙醇洗涤RNA沉淀；4℃下，8000rpm的转速下离心10min，去上清，RNA稍晾干约10-15min，加入100μl体积的RNase-Free水充分溶解；RNA样品DAaseI酶切，

如：20μl RNA样品(≤5μg，溶于水或者TE Buffer)

混匀，37℃温浴30min，DNaseI灭活(DNaseI说明书)

加入1/10体积的3M NaOAc(RNase free，pH5.2)及3V的乙醇沉淀RNA；-80℃下，放置2h，2-8℃下，12000rpm的转速下离心10min；加入500μl质量分数为75%的乙醇洗涤，2-8℃下，10000rpm的转速下离心5min；加入质量分数为75%的乙醇再洗一次，离心后，再空甩一次，吸干离心管壁上的乙醇。室温干燥10-15min；加入100μl RNase free水充分溶解，离心去杂质，上清即为制备的总RNA；光密度法测定总RNA的浓度及纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)(GeneQuant)；总RNA电泳，检测总RNA是否降解(可放于-80℃保存)。加入2μg总RNA，1μl引物，1μl10mM dNTPs，补水(RNase-free水)至13μl；65℃变性10min后立即冰浴2min，退火；加入4μl5×M-MLV buffer，1μl20mM DTT，1μl RNase Inhibitor和1μl M-MLV(Invitrigen)；42℃温浴1-2h后，取出于-20℃保存备用。每份样品取0.1μg用于Real-time PCR(RT-PCR)检测，引物如下：

计算方法参照Livak et al.“Analysis of Relative Gene Expression Data UsingReal-Time Quantitative PCR and theMethod”,Method(2001)25(4)：402-408。

同时以野生型玉米植株和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。转入PIC3-01核苷酸序列的共3个株系(S1、S2和S3)，转入PIC3-01取代核苷酸序列的共2个株系(S4和S5)，转入PIC3-01截短核苷酸序列的共2个株系(S6和S7)，转入PIC3-01添加核苷酸序列的共2个株系(S8和S9)，转入天然序列的共2个株系(S10和S11)，经Taqman鉴定为非转基因的(NGM1)共1个株系，野生型的(CK1)共1个株系；从每个株系选5株进行测试，每株重复6次。

转基因玉米植株的PIC3杀虫蛋白质的mRNA含量的实验结果如图4所示。结果表明，转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株中的PIC3杀虫蛋白质的mRNA相对含量为转入天然序列的玉米植株的5倍左右。本领域技术人员熟知的，RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可直接用于检测细胞中基因的转录水平，进而间接地说明该基因的表达水平和蛋白表达量和稳定性。因此，这一结果表明依据玉米的偏好密码子优化的PIC3-01核苷酸序列显著地增加了PIC3-01蛋白在玉米中表达的稳定性和表达量。与转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株的相比，转入PIC3-01取代核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的玉米植株和转入PIC3-01添加核苷酸序列的玉米植株中PIC3杀虫蛋白质的mRNA含量无显著差异。

2、转基因玉米植株的抗虫效果检测

将转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的玉米植株、转入天然序列的玉米植株、野生型玉米植株和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株(V3-V4时期)对亚洲玉米螟进行抗虫效果检测。

分别取转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的玉米植株、转入天然序列的玉米植株、野生型玉米植株和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将玉米叶片去除叶脉，同时剪成约1cm×2cm的长条状，取1片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的滤纸上，所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头人工饲养的亚洲玉米螟(初孵幼虫)，虫试培养皿加盖后，在温度26-28℃、相对湿度70%-80%、光周期(光/暗)16：8的条件下放置3天后统计幼虫死亡情况，计算各样品中亚洲玉米螟的平均死亡率。转入PIC3-01核苷酸序列的共3个株系(S1、S2和S3)，转入PIC3-01取代核苷酸序列的共2个株系(S4和S5)，转入PIC3-01截短核苷酸序列的共2个株系(S6和S7)，转入PIC3-01添加核苷酸序列的共2个株系(S8和S9)，转入天然序列的共2个株系(S10和S11)，经Taqman鉴定为非转基因的(NGM1)共1个株系，野生型的(CK1)共1个株系；从每个株系选5株进行测试，每株重复6次。结果如表1和图5所示。

表1、转基因玉米植株接种亚洲玉米螟的抗虫实验结果

表1的结果表明：转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株和转入天然序列的玉米植株中都可以选到对亚洲玉米螟具有一定抗性的植株，但转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株的试虫死亡率显著高于转入天然序列的玉米植株。转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株的试虫死亡率在85%左右或以上，而转入天然序列的玉米植株的试虫死亡率在30%左右。图5的结果表明：转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株虽然不会造成初孵幼虫的大量死亡，但是却对幼虫发育进度造成极大的抑制，3天后幼虫基本仍处于初孵状态或介于初孵-阴性对照状态之间，且其叶片损伤率也较小。

由此证明转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株具有较高抗虫能力，即表达PIC3-01蛋白水平高的转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株也具有较高的毒力，因此依据玉米的偏好密码子优化的PIC3-01核苷酸序列显著地增加了PIC3-01蛋白在玉米中表达的毒力。此外，与转入PIC3-01核苷酸序列的玉米植株的相比，转入PIC3-01取代核苷酸序列的玉米植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的玉米植株和转入PIC3-01添加核苷酸序列的玉米植株中PIC3-01蛋白的毒力无显著差异。

第五实施例、转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株的获得及验证

1、获得转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的粳稻品种日本晴的愈伤组织与第二实施例中4所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2和3构建的重组表达载体DBN100083、DBN100083-i、DBN100083-t、DBN100083-a和DBN100083N(天然序列)中的T-DNA(包括玉米Ubiquitin基因的启动子序列、PIC3-01核苷酸序列、PIC3-01取代核苷酸序列、PIC3-01截短核苷酸序列、PIC3-01添加核苷酸序列、天然序列、PMI基因和Nos终止子序列)转入到水稻染色体组中，获得了转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的水稻植株和转入天然序列的水稻植株(正对照)；同时以野生型水稻植株作为负对照。

对于农杆菌介导的水稻转化，简要地，把水稻种子接种在诱导培养基(N6盐、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝胶3gL，pH5.8)上，从水稻成熟胚诱导出愈伤组织(步骤1：愈伤诱导步骤)，之后，优选愈伤组织，用农杆菌悬浮液接触愈伤组织，其中农杆菌能够将PIC3-01核苷酸序列、PIC3-01取代核苷酸序列、PIC3-01截短核苷酸序列、PIC3-01添加核苷酸序列和天然序列传递至愈伤组织上的至少一个细胞(步骤2：侵染步骤)。在此步骤中，愈伤组织优选地浸入农杆菌悬浮液(OD660=0.3，侵染培养基(N6盐、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、pH5.4))中以启动侵染。愈伤组织与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤3：共培养步骤)。优选地，愈伤组织在侵染步骤后在固体培养基(N6盐、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上培养。在此共培养阶段后，有一个“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(N6盐、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤4：恢复步骤)。优选地，愈伤组织在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的愈伤组织在含选择剂(甘露糖)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤5：选择步骤)。优选地，愈伤组织在有选择剂的筛选固体培养基(N6盐、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖10g/L、甘露糖10gL、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤6：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(N6分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述N6分化培养基(N6盐、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、6-苄氨基腺嘌呤2mg/L、奈乙酸1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖15g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于30℃下培养。

2、用TaqMan验证转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株

分别取转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的水稻植株和转入天然序列的水稻植株的叶片约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测PIC3基因的拷贝数。同时以野生型水稻植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测PIC3基因拷贝数的具体方法如下：

步骤31、分别取转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的水稻植株、转入天然序列的水稻植株和野生型水稻植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

步骤32、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

步骤33、用NanoDrop2000(Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；

步骤34、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

步骤35、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型水稻植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测PIC3-01核苷酸序列、PIC3-01取代核苷酸序列、PIC3-01截短核苷酸序列和PIC3-01添加核苷酸序列：

引物1(CF1)：TGCGGTGTCTAACCACTCAGC如序列表中SEQ ID NO:10所示；

引物2(CR1)：ATGCACAGGGAGTCTTCGATTC如序列表中SEQ ID NO:11所示；

探针1(CP1)：CAGATGGACCTCCTGCCAGATGCG如序列表中SEQ IDNO:12所示；

以下引物和探针用来检测天然序列：

引物3(CF2)：CCTATGGCCGCTTTCAGTTG如序列表中SEQ ID NO:13所示；

引物4(CR2)：TGTGGTGCGCATCGATTC如序列表中SEQ ID NO:14所示；

探针2(CP2)：CTCCGCACCTTCCGATTGGGCT如序列表中SEQ ID NO:15所示；

PCR反应体系为：

所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μl，100μM浓度的探针50μl和860μl1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。

PCR反应条件为：

利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。

实验结果表明，PIC3-01核苷酸序列、PIC3-01取代核苷酸序列、PIC3-01截短核苷酸序、PIC3-01添加核苷酸序列和天然序列均己整合到所检测的水稻植株的染色体组中，而且转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的水稻植株和转入天然序列的水稻植株均获得了含有单拷贝PIC3基因的转基因水稻植株。

第六实施例、转基因水稻植株的RT-PCR检测

1、转基因水稻植株的杀虫蛋白质(PIC3蛋白)的mRNA含量检测

分别取0.2g转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的水稻植株和转入天然序列的水稻植株的新鲜叶片(心叶)作为样品，液氮研磨收集100-200mg组织，后加入1ml所述TRIZOL提取液，涡旋使样品充分裂解，室温放置5min；加入0.2ml氯仿(chloroform)剧烈振荡混匀15s，室温放置10min；4℃下，12000rpm的转速下离心10min，取上清液加入0.5ml(或0.5X开始体积)的RNase-Free水，再加入1ml的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，室温放置10min，沉淀；4℃下，12000rpm的转速下离心10min，取沉淀加入1ml质量分数为75%的乙醇洗涤RNA沉淀；4℃下，8000rpm的转速下离心10min，去上清，RNA稍晾干约10-15min，加入100μl体积的RNase-Free水充分溶解；RNA样品DAaseI酶切，

如：20μl RNA样品(≤5μg，溶于水或者TE Buffer)

混匀，37℃温浴30min，DNaseI灭活(DNaseI说明书)

加入1/10体积的3M NaOAc(RNase free，pH5.2)及3V的乙醇沉淀RNA；-80℃下，放置2h，2-8℃下，12000rpm的转速下离心10min；加入500μl质量分数为75%的乙醇洗涤，2-8℃下，10000rpm的转速下离心5min；加入质量分数为75%的乙醇再洗一次，离心后，再空甩一次，吸干离心管壁上的乙醇。室温干燥10-15min；加入100μl RNase free水充分溶解，离心去杂质，上清即为制备的总RNA；光密度法测定总RNA的浓度及纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)(GeneQuant)；总RNA电泳，检测总RNA是否降解(可放于-80℃保存)。加入2μg总RNA，1μl引物，1μl10mM dNTPs，补水(RNase-free水)至13μl；65℃变性10min后立即冰浴2min，退火；加入4μl5×M-MLV buffer，1μl20mM DTT，1μl RNase Inhibitor和1μl M-MLV(Invitrigen)；42℃温浴1-2h后，取出于-20℃保存备用。每份样品取0.1μg用于Real-time PCR(RT-PCR)检测，引物如下：

计算方法参照Livak et al.“Analysis of Relative Gene Expression Data UsingReal-Time Quantitative PCR and the

Method”,Method(2001)25(4)：402-408。

同时以野生型水稻植株和经Taqman鉴定为非转基因的水稻植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。转入PIC3-01核苷酸序列的共3个株系(S12、S13和S14)，转入PIC3-01取代核苷酸序列的共2个株系(S15和S16)，转入PIC3-01截短核苷酸序列的共2个株系(S17和S18)，转入PIC3-01添加核苷酸序列的共2个株系(S19和S20)，转入天然序列的共2个株系(S21和S22)，经Taqman鉴定为非转基因的(NGM2)共1个株系，野生型的(CK2)共1个株系；从每个株系选5株进行测试，每株重复6次。

转基因水稻植株的PIC3杀虫蛋白质的mRNA含量的实验结果如图6所示。结果表明，转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株中的PIC3杀虫蛋白质的mRNA相对含量为转入天然序列的水稻植株的5倍左右。本领域技术人员熟知的，RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可直接用于检测细胞中基因的转录水平，进而间接地说明该基因的表达水平和蛋白表达量和稳定性。因此，这一结果表明依据水稻的偏好密码子优化的PIC3-01核苷酸序列显著地增加了PIC3-01蛋白在水稻中表达的稳定性和表达量。与转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株的相比，转入PIC3-01取代核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的水稻植株和转入PIC3-01添加核苷酸序列的水稻植株中PIC3杀虫蛋白质的mRNA含量无显著差异。

2、转基因水稻植株的抗虫效果检测

将转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的水稻植株、转入天然序列的水稻植株、野生型水稻植株和经Taqman鉴定为非转基因的水稻植株对二化螟进行抗虫效果检测。

分别取转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01取代核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01添加核苷酸序列的水稻植株、转入天然序列的水稻植株、野生型水稻植株和经Taqman鉴定为非转基因的水稻植株的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将水稻叶片去除叶脉，同时剪成约1cm×2cm的长条状，取2片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的滤纸上，所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头人工饲养的二化螟(初孵幼虫)，虫试培养皿加盖后，在温度26-28℃、相对湿度70%-80%、光周期(光/暗)16：8的条件下放置3天后，根据二化螟幼虫发育进度、死亡率和叶片损伤率三项指标，获得抗性总分：总分=100×死亡率+[100×死亡率90×(初孵虫数/接虫总数)+60×(初孵-阴性对照虫数/接虫总数)+10×(阴性对照虫数/接虫总数)]+100×(1-叶片损伤率)。转入PIC3-01核苷酸序列的共3个株系(S12、S13和S14)，转入PIC3-01取代核苷酸序列的共2个株系(S15和S16)，转入PIC3-01截短核苷酸序列的共2个株系(S17和S18)，转入PIC3-01添加核苷酸序列的共2个株系(S19和S20)，转入天然序列的共2个株系(S21和S22)，经Taqman鉴定为非转基因的(NGM2)共1个株系，野生型的(CK2)共1个株系；从每个株系选5株进行测试，每株重复6次。结果如表2和图7所示。

表2、转基因水稻植株接种二化螟的抗虫实验结果

表2的结果表明：转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株和转入天然序列的水稻植株中都可以选到对二化螟具有一定抗性的植株，但转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株的生测总分显著高于转入天然序列的水稻植株。转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株生测总分在230分以上，而转入天然序列的水稻植株的生测总分在130分左右。图7的结果表明：转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株虽然不会造成初孵幼虫的大量死亡，但是却对幼虫发育进度造成极大的抑制，3天后幼虫基本仍处于初孵状态或介于初孵-阴性对照状态之间，且其叶片损伤率也较小。

由此证明转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株具有较高抗虫能力，即表达PIC3-01蛋白水平高的转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株也具有较高的毒力，因此依据玉米的偏好密码子优化的PIC3-01核苷酸序列显著地增加了PIC3-01蛋白在水稻中表达的毒力。此外，与转入PIC3-01核苷酸序列的水稻植株的相比，转入PIC3-01取代核苷酸序列的水稻植株、转入PIC3-01截短核苷酸序列的水稻植株和转入PIC3-01添加核苷酸序列的水稻植株中PIC3-01蛋白的毒力无显著差异。

综上所述，本发明PIC3-01杀虫基因采用玉米的偏好密码子，使得本发明杀虫基因特别适合在单子叶植物中表达，尤其是玉米和水稻，本发明PIC3-01杀虫蛋白质不仅表达量高且稳定性好，对昆虫害虫的毒力强，尤其是鳞翅目昆虫害虫。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (18)

1.一种杀虫蛋白质，其特征在于，包括：

(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有杀虫活性的由(a)衍生的蛋白质；或

(c)与SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述杀虫蛋白质，其特征在于，所述杀虫蛋白质为与SEQID NO:2具有至少95%序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.根据权利要求1所述杀虫蛋白质，其特征在于，所述杀虫蛋白质为与SEQID NO:2具有至少99%序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。

4.一种杀虫基因，其特征在于，包括：

(a)编码权利要求1-3任一项所述杀虫蛋白质的核苷酸序列；或

(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白质的核苷酸序列；或

(c)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

5.一种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求4所述杀虫基因。

6.一种包含权利要求4所述杀虫基因或权利要求5所述表达盒的重组载体。

7.一种包含权利要求4所述杀虫基因或权利要求5所述表达盒的转基因宿主生物，其特征在于，包括植物细胞、动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。

8.根据权利要求7所述转基因宿主生物，其特征在于，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。

9.一种产生杀虫蛋白质的方法，其特征在于，包括：

获得权利要求7或8所述转基因宿主生物的细胞；

在允许产生杀虫蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；

回收所述杀虫蛋白质。

10.一种用于增加昆虫靶范围的方法，其特征在于，包括：将权利要求1-3任一项所述杀虫蛋白质或权利要求5所述表达盒编码的杀虫蛋白质在植物中与至少一种不同于权利要求1-3任一项所述杀虫蛋白质或权利要求5所述表达盒编码的杀虫蛋白质的第二种杀虫核苷酸一起表达。

11.根据权利要求10所述用于增加昆虫靶范围的方法，其特征在于，所述第二种杀虫核苷酸可以编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。

12.根据权利要求10所述用于增加昆虫靶范围的方法，其特征在于，所述第二种杀虫核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。

13.一种产生抗虫植物的方法，其特征在于，包括：将权利要求4所述杀虫基因或权利要求5所述表达盒或权利要求6所述重组载体导入植物。

14.根据权利要求13所述产生抗虫植物的方法，其特征在于，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。

15.一种用于保护植物免受由昆虫害虫引起的损伤的方法，其特征在于，包括：将权利要求4所述杀虫基因或权利要求5所述表达盒或权利要求6所述重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受昆虫害虫侵害量的杀虫蛋白质。

16.根据权利要求15所述用于保护植物免受由昆虫害虫引起的损伤的方法，其特征在于，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。

17.一种控制昆虫害虫的方法，其特征在于，包括：使昆虫害虫与抑制量的权利要求1-3任一项所述杀虫蛋白质或由权利要求4所述杀虫基因编码的昆虫抑制性蛋白质接触。

18.根据权利要求17所述控制昆虫害虫的方法，其特征在于，所述昆虫害虫是鳞翅目昆虫害虫。

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