CN103140241A - 抗原特异性超声造影剂、其制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诊断和/或治疗用途的抗原特异性超声造影剂、其制备方法及其在超声诊断成像和治疗中的用途。特别是，已证明一旦其结合到所述组织并适宜地受声波作用，所述造影剂可用于将药物和/或其他生物活性成分选择性输送到患病组织并在该位点释放。此外，通过在长时间内单独对患病组织赋予改进的造影图像增强，所述超声造影剂可以区分患病组织与周围的(健康)组织。

Description

抗原特异性超声造影剂、其制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及诊断性和/或治疗性的抗原特异性超声造影剂、其制备方法及其在超声诊断成像(通常称为超声诊断成像)、以及在其他类型诊断成像和/或在治疗中的用途。
特别地，现已证实，由于其通过在长时间内仅对患病组织赋予改进的造影图像增强，从而选择性检测并揭示肿瘤组织/肿瘤实体，同时将其与邻近(健康的)组织区分的能力，所述造影剂可用于将适合的药理学物质和或其他生物活性成分，还包括非回声图像造影剂，选择性地携带并释放到患病组织中。
背景技术
超声造影剂(或CM)是能够增强超声影像反差的物质。
迄今为止，在最常用的超声造影剂中，所谓的第二代造影剂基本由包含在适合包膜中的气体微泡组成，所述气体优选为惰性气体(例如六氟化硫、全氟己烷、全氟碳化物、空气、氮气)；优选所述包膜是以所谓的微胶囊/微泡/微球体/微囊泡/微气球的形式存在，其完全或基本上由适宜的稳定性物质，例如磷脂或白蛋白形成。
增强超声信号的成分是气体，其回声系数(echogenicity coefficient)远大于大多数生物固体和液体的回声系数。常用的造影剂由例如包含气体的微胶囊/微泡/微球体/微囊泡/微气球(下文一般简称为微球体)组成，其特征在于特异的共振频率f0(通常以MHz计)，即其中颗粒开始进入压缩和稀疏(rarefaction)的循环相的振动频率。所谓第二代造影剂特别有用的原因在于其共振频率包含在现有超声仪器已常用的超声频率范围内。
在注射进入血流中后，所述造影剂在被超声波束击中时开始共振。因此，它们产生反射的超声波束，显示了由注射物质的性质或由入射的受声波作用(insonating)的超声波束的性质导致的物理特征。
特别是，考虑到微球体的物理特征，如果其膜的厚度和刚性较大，则相比于具有较薄因而弹性较好的膜的颗粒，其产生强度较小(即，用处较小的)声波响应。
另一方面，太薄的膜的缺点是过于脆弱，因而对入射超声波束施加的压力作用抵抗较小。在这种情况下，微球体会在很短时间内(通过声孔作用(sonoporation)或通过空化作用(cavitation))被破坏，以致于不能提供对诊断有用的图像。
如果与超声波束接触的微球体数增多，则可见单个颗粒/微球体的回声系数线性增加。也就是说，所述系数是单个微球体系数与注射进入血流的微球体数乘积获得的总值。
对于入射超声波束，其基本参数是频率和声强(通常以KPa计)。特别是，声强在反射波束范围和颗粒振动类型的表征中至关重要。
确切地说，如果造影剂微球体被声压较低(平均10-20KPa范围内)且频率等于造影剂(CM)共振频率的超声波束击中，则其仅发生线型的形状改变。在这种情况下，所得压缩相平均起来与稀疏相相等，且反射超声信号向各方向传播(这就是所谓的散射现象)。相反，如果入射波束(仍保持与共振波束相等的频率)具有较高值的声压(例如，40KPa-50KPa范围内)，则所得稀疏相大于压缩相。这种作用使微球体能够产生富集在为共振频率数倍(即，2f0、3f0、4f0等)的系列谐波频率的反射超声波束。此外，更大的声强例如高达约1MPa的声强导致产生次谐波频率(f0/2、f0/5等)。通常，大于1MPa的强度导致微球体破裂，该效应用于使用第一代CM的超声成像技术中。
反射超声波束的强度(以Pa或dB计)与入射超声波束的强度和造影剂的回声系数成正比，而与构成造影剂的微球体半径成反比。
上述谐波频率由多倍或次倍量(sub-multiples)的受声波作用的超声波束基频形成。该谐波的产生基本上由微球体形状上发生的弹性改变引起的。如上所示，所述改变通过由超声波束施加的声压质量引起的微球体本身的压缩和稀疏相产生。
一般而言，优选的谐波频率为二次谐波频率，因为其易于显示在超声仪器上。这是由于二次谐波频率是与基频最接近的频率，因此可更适当地识别。
在接受相(receipt phase)期间得到恰当设置时，超声探头能够检测/读取此频率。此外，取决于所用的超声检测方法(借助适当的软件)，可以利用广泛的不同技术方案，分析来自不同结构的反射信号。例如，可以减去来自静态组织(static tissue)的谐波，表征仅来自于血管设备的信号，调节信号相或其幅度或二者。在所有情况下，最终目的都是相对于没有浸渍造影剂的解剖结构，以显著的造影增强度，单独选择性地识别并区分出浸渍了造影剂的解剖结构。
从技术观点出发，当CM注射进入血流，且超声探头放置于要分析的特定身体组织区域上时，可以按照以下三相进行微球体移动：
-动脉相(从第10至第35秒)；
-软组织相(从第40至第120秒)；
-静脉相(从第120秒开始，直至造影剂从所检查器官的血液循环中消失)。
众所周知，除了产生有效成像对比度的能力，超声造影剂还可包含药理学物质和/或其他生物活性成分，包括其他类型的非超声造影剂，并且一旦受到适合的超声波束进行适当的声波作用，即能够将这些成分释放到聚集这些成分的患病组织中。
因此，充分稳定且位点特异的超声造影剂是非常有用的，例如能随着时间的推移而必要而选择性地将患病组织(例如，肿瘤)与邻近的健康组织区分开来，并且能以受控，特别是可调的方式将药理学物质释放到所述组织中。换句话说，一方面，稳定且能够至少在成功进行所需超声诊断检查所需的所有必要时间内，相比于邻近的健康组织，选择性地对患病组织给出高造影图像增强的超声造影剂是非常有用。另一方面，考虑到对由所述药物的错误输液速率所引起的并发症的补救，所述超声造影剂是否还能够以操作者能调节的方式将适合的药物选择性释放到所述患病组织中也同样非常重要。
现已尝试对上述需求作出回应。
因此，例如，已制造出包含惰性气体的微球体，其中包含对患病/肿瘤组织中存在的一种或多种抗原特异的一种或多种受体。
在现有技术的该类造影剂中，将所述受体(例如，单克隆和非单克隆抗体和/或它们的片段，例如，Fab's，即，抗原结合的片段)引入微球体膜，例如，插入其磷脂链组分。已尝试在灌注造影剂时，通过这种方式辅助/促使所述受体与存在于待成像组织内的相应抗原之间形成特异且可能强烈的结合。此方法还可潜在地用于携带掺入到所述微球体内的适合药物，在通过包含所述超声CM的血流灌注所需组织时，若对这些组织进行适合的超声处理，即可将所述药物连续释放到所述组织中。
迄今为止，该系统仍仅在实验阶段使用，还不可能在人体组织中便利地再现。
上述系统的主要缺点之一在于包含在微泡内的药物不能以受调控的方式释放以符合病人的需要，而是仅通过微球体与入射超声波束之间的一次相互作用同时释放；在必须进行低速药物灌注或给药的临床情况下，例如，在颈动脉斑块溶解血栓的治疗过程中，这严重危害了给药的安全性。
例如，WO2008/110958公开了一种包含超声敏感性颗粒的组合物，所述超声敏感性颗粒包含用于选择性释放生物物质的由脂质体制成的颗粒亚群(sub-group)。然而，该文献没有公开或暗示利用其膜在结构上基本由对某些抗原具有特异性的受体形成的同心微泡的可能性。
WO2007/008220公开了一种脂质体与中性或白蛋白包被的碱性微泡的内部和外部结合的方法，但是其没有记载使用多于一个界面增大声孔作用的功效，也没有提及或暗示利用其膜在结构上基本或主要由对某些抗原具有特异性的受体形成的同心微泡的可能性。
Liang H-D等人("Sonoporation,drug delivery,andgene therapy",Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers.Journal of Engineering inMedicine.Part H,Mechanical Engineering Publications,Ltd.,London GB,Vol.224no.2,(2010.01.01),pages434-361)详细记载了超声领域的最新创新；但没有提及甚至没有暗示利用其膜在结构上基本或主要由对某些抗原具有特异性的受体形成的同心微泡的可能性。
技术问题
因此，迄今为止，医学领域中仍强烈而深切地需要一种超声造影剂，其在受到适合类型的声波作用后，能够在足够长/有用的时间内，形成相比于邻近组织(通常，健康的组织)，仅选择性地和适当地(即，足够强地)与待成像的组织(通常，患病的组织)的结合，此后，能以收调节和控制的方式释放与其结合的药理学或生物活性物质，以至少在用于成功进行所需的选择性超声诊断成像且同时完成所需的选择性治疗处理并根据需要调节的所有充分且必要时间内，选择性赋予所述(待成像的)组织显著高的且延长的造影图像增强性。
发明内容
申请人完全出乎意料地发现，上述技术问题可以通过制备由多个适合的不同微球体组成的超声造影剂而得到充分解决，其中，所述微球体彼此嵌套、相对于彼此基本同心，其中，每个所述微球体均由膜包被且包含适宜的惰性气体和适宜的生物活性成分，所述膜包含作为其组成成分的适量的对某些抗原具有抗原特异性的适合受体。
因此，如所附独立权利要求所述，本发明的一个实施方式为一种抗原特异性超声造影剂，其由彼此不同的至少两个微球体组成，其中一个微球体插入到另一个微球体内，每个所述微球体由膜包被并且包含适合的惰性气体，所述膜由适量的高亲和力受体及其稳定剂形成，所述受体对存在于待成型组织内的某些抗原具有特异性。
然后，如所附独立权利要求所述，本发明的一个实施方式为包含上述造影剂的超声造影药物组合物。
此外，如所附独立权利要求所述，本发明的一个实施方式为用于制备上述造影剂的方法。
如所附独立权利要求所述，本发明的另一个实施方式为上述造影剂用于对组织(优选患病/肿瘤组织)进行相对于周围的(优选健康的组织)组织的选择性超声成像的用途。
如所附独立权利要求所述，本发明的另一个实施方式为上述超声造影剂作为药物和/或其他生物活性成分的选择性载体的用途。
此外，如所附独立权利要求所述，本发明的另一个实施方式为上述超声造影剂用于以选择性和受调节的方式向患病组织释放药理学活性成分的用途。
本发明的其他实施方式均描述于所附的从属权利要求中。
具体实施方式
根据本发明，所述抗原特异性超声造影剂由彼此不同的至少两个(或更多)微球体组成，其中每一个微球体插入到另一个微球体内，且每个所述微球体：
由膜包被，所述膜对于每个微球体各不相同，并且基本由有效量的至少一种高亲合力受体和最低有效量的至少一种稳定剂构成，其中，所述高亲合力受体存在于待成像和/或待药理治疗的组织中的某些抗原具有特异性，所述稳定剂与所述受体之间的重量比在10:1至1:1范围内；和
包含惰性气体，用于各微球体的所述惰性气体是相同或不同的。
优选地，本发明的造影剂由彼此不同，一个放置于另一个内部且彼此基本同心的两个微球体组成。
包被所述至少两个微球体中各个微球体的膜各不相同：确切地说，包被外微球体的膜与包被内微球体的膜不同。
所述膜包含有效量的至少一种抗原特异性受体，所述抗原特异性受体存在于待成像和/或药理治疗的组织中的某些抗原具有高亲合力。更优选所述膜仅包含一种单抗原特异性受体。事实上，两个微球体均是抗原特异性的。
在本发明特别优选的实施方式中，所述受体对每种类型的膜都是相同的，即对包被外微球体的膜和包被内微球体的膜是相同的。
例如，所述受体可选自包括以下的组：抗体(单克隆抗体或非单克隆抗体)和/或其片段(例如Fabs)，和/或对内皮细胞、心肌细胞、适当的固有层细胞、间质细胞、表达于动脉粥样硬化斑块中的细胞具有特异性的VEGFR(血管内皮生长因子受体)受体，以及免疫球蛋白、补体片段、肽和脂质激素、神经递质的特异性受体。
特别优选的受体是对某些抗原具有特异性的具有高亲合力的抗体Fab片段。相比于完整抗体，优选使用抗体Fab片段是由于缺少其Fc片段(可结晶片段)的抗体丧失其细胞毒性和补体分子激活性。以此方式，可以去除或至少基本上减少副作用的发作。
优选包被每个所述微球体的所述膜进一步包含最低有效量的具有稳定作用的至少一种物质(在本发明的某些实施方式中，在任何情况下还可具有两种或多种稳定剂的混合物)。所述至少一种稳定剂基本上对膜发挥其作用，但也对所述抗原特异性受体发挥其作用，因此，使膜(即，确切而言是装配的受体-稳定剂)在适当的时间内保持在组织内基本球形结构的完整，以便使其接近靶点并在进行诊断和/或治疗步骤所需的全部时间内与靶点有效结合。
所述至少一种稳定剂对于每种类型的膜各不相同：确切地说，包被外微球体的膜内包含的稳定剂与包被内微球体的膜内包含的稳定剂不同。
所述稳定剂选自例如包括以下的组：白蛋白、磷脂、半乳糖、棕榈酸、氰基丙烯酸酯(cianoacrylate)。优选的稳定剂是白蛋白、磷脂、棕榈酸、半乳糖和其混合物；特别优选的是白蛋白、磷脂和棕榈酸/半乳糖混合物。
更优选白蛋白，因为其对蛋白质(抗体、Fab's等)发挥强稳定作用，因而甚至在低剂量下也可有效地合并(amalgamate)形成微球体膜的蛋白质分子，而不过分降低其浓度以及因此降低其功效。
添加的稳定剂的量是所需的最低量：在任何情况下，仅为以适当的/所需的方式充分稳定微球体膜的量。通常，受体:稳定剂之间的重量比为10:1至1:1是适合的；优选所述比在7.5:1至1.5:1之间；更优选5:1至2:1；更进一步优选4:1至2.5:1。在本发明特别优选的实施方式中，所述受体:稳定剂之间的重量比为3.5:1；优选为约3:1。
实际上，相对于所述膜的总重量，所述微球体膜可包含高达约91重量%的最大受体量。优选地，取决于所需的实施方式，相对于所述膜的总重量，所述受体的量可达到约88%或83%或80%或77重量%；更优选相对于所述膜的总重量为75重量%。因此，由上文清楚可见，与现有技术已知和实践的相反，所述抗原特异性受体不是以平均有限的量插入膜内或其外表面上或其内部，而是其结构性整体的部分，而稳定剂的量是给予膜本身所需稳定性所需要的最低可能量(取决于抗原特异性受体的类型)。
实际上，所述非常低的稳定剂量预想不到地显示对于给予所述微球体膜显著稳定性是绰绰有余的。因此，与已知的现有技术相比，本发明可通过完全预想不到的方式获得非常稳定的微球体，其中的膜主要或基本上由抗原特异性受体(优选抗体的Fab)构成。因此，相比于本领域已知的包含抗原特异性受体的微泡，所述微球体对所需靶点、组织或器官具有明显更高(至少高出10-15%，但也可能≥20%或更多)的特异性。因此，本发明特别创新和有优势的方面是获得了预想不到地稳定的微球体，尽管事实上其膜在结构上是由少量稳定剂和大量的抗原特异性受体形成，所述抗原特异性受体确保相比于现有技术已知的微球体明显更好的特异性。
仅作为实例，在本发明优选的实施方式中，白蛋白是包被外微球体的膜内包含的稳定剂，而磷脂是包被内微球体的膜内包含的稳定剂。
在本发明另一个优选的实施方式中，则情形相反：即，白蛋白是包被内微球体的膜内包含的稳定剂，而磷脂是包被外微球体的膜内包含的稳定剂。
在其他优选实施方式中，包被微球体之一的膜可例如，包含棕榈酸/半乳糖混合物作为稳定剂。在所述混合物中，两种组分之间以例如10:1至1:10之间的重量比(w:w)存在；优选5:1至1:5之间；更优选约1:1。
形成根据本发明的抗原特异性超声造影剂的所述至少两个基本同心的微球体的每一个中包含的气体对于每种类型的微球体相同或不同；确切地说，外微球体内包含的气体与内微球体内包含的气体相同或不同。
所述气体例如选择包含以下的组：六氟化硫、全氟己烷、全氟碳化物、空气、氮气。特别优选六氟化硫、空气和全氟己烷；更优选六氟化硫和空气。
仅作为实例，在本发明优选的实施方式中，六氟化硫是外微球体内包含的气体，而空气是内微球体内包含的气体。
在本发明另一个优选的实施方式中，情形是相反的：即，六氟化硫是内微球体内包含的气体，而空气是外微球体内包含的气体。
在本发明进一步优选的实施方式中，六氟化硫或空气或全氟己烷包含在外微球体内或内微球体内。
在本发明特别优选的实施方式中，根据本发明的所述抗原特异性超声造影剂进一步包含有效量的至少一种生物活性物质，例如选自：与主要的抗原特异性受体不同的抗原特异性受体；药物(仅作为说明而绝非限制，例如抗肿瘤药物)；其他类型的物质，如分子成像中使用的分子、用于常规放射医学、计算机断层摄影术(computerized tomography)、磁共振、核医学的放射造影剂；生物活性分子如激素、维生素；遗传物质如核苷、核苷酸；肽的、脂质的、糖类性质(glucidic nature)的合成物质，以便所得超声造影剂(CM)可同时用作所述物质的选择性传送体(transmitter)或载体。特别是，诊断成像中使用的上述的分子优选选自：磁铁矿纳米颗粒、碘酸盐化合物、复合的顺磁性离子。
优选根据本领域已知技术，将所述至少一种生物活性物质插入或偶联/结合到组成本发明造影剂的所述至少两个微球体的每个微球体。优选将所述生物活性物质插入包被各微球体的膜中和/或其内部。
仅作为优选的实例而绝非限制本发明，根据本发明的一个实施方式，超声造影剂由以下组成：一个外微球体，其由气体(如空气或六氟化硫或全氟己烷)的气泡构成，并由最低有效量(例如，Fab's:白蛋白为3:1的优选重量比例)的白蛋白稳定的抗体的Fab's的膜包被；一个内微球体，其位于前述外微球体(基本与其同心)内部，由气体(如空气或六氟化硫或全氟己烷)的气泡构成，并由最低有效量(例如，Fab's:磷脂为3:1的优选重量比例)的磷脂稳定的抗体的Fab's膜包被。
所述两个同心的微球体可进一步包含有效量的生物活性剂，例如上文所述的药物、造影剂、生物分子等。
根据需要，也可以制备相反的制剂(reverse formulation)。
例如，在本发明的另一个实施方式中，可以通过颠倒所述结构的化学组分来实现超声造影剂。因此，所述造影剂将由以下组成：
一个外微球体，其由磷脂稳定的抗原特异性物质(优选Fab)构成(抗原特异性物质：磷脂的重量比优选为3:1)，并且包含作为气体六氟化硫，并且在某些情况下，包含适量的如上所述的生物活性剂和/或药理学物质；
一个内微球体，其置于前述外微球体的内部，由白蛋白稳定的抗原特异性物质(优选Fab)构成(抗原特异性物质：白蛋白的重量比优选为3:1)，并且包含作为气体六氟化硫，并且在某些情况下，包含适量的如上所述的生物活性剂和/或药理学物质。
所述生物活性剂和/或药理学物质的优选量可根据细胞/组织/器官和/或待治疗疾病的类型而改变，并且在任何情况下已成为本领域技术临床人员治疗常识的一部分。
始终作为进一步的实例，而绝非限制本发明，本发明的超声造影剂可由两个同心微球体构成，其中：
a)外微球体包含作为惰性气体的空气和以上文所述的重量比存在的作为膜稳定剂的棕榈酸/半乳糖混合物，和
内微球体包含作为惰性气体的六氟化硫和作为膜稳定剂的磷脂；
b)外微球体包含作为惰性气体的空气和作为膜稳定剂的白蛋白，和
内微球体包含作为惰性气体的空气和以上文所述的重量比存在的作为膜稳定剂的棕榈酸/半乳糖混合物；
c)外微球体包含作为惰性气体的全氟己烷和作为膜稳定剂的白蛋白，和
内微球体包含作为惰性气体的六氟化硫和以上文所述的重量比存在的作为膜稳定剂的棕榈酸/半乳糖混合物；
d)外微球体包含作为惰性气体的空气和作为膜稳定剂的白蛋白，和
内微球体包含作为惰性气体的六氟化硫和以上文所述的重量比存在的作为膜稳定剂的棕榈酸/半乳糖混合物；
e)外微球体包含作为惰性气体的六氟化硫和以上文所述的重量比存在的作为膜稳定剂的棕榈酸/半乳糖混合物，和
内微球体包含作为惰性气体的全氟己烷和作为膜稳定剂的磷脂；
f)外微球体包含作为惰性气体的六氟化硫和以上文所述的重量比存在的作为膜稳定剂的棕榈酸/半乳糖混合物，和
内微球体包含作为惰性气体的空气和作为膜稳定剂的磷脂；
g)上述a)至f)的每一种造影剂中，外微球体的组分与内微球体的组分已颠倒。
优选在所述a)至g)的造影剂中，稳定膜的物质的总量与Fab之间的重量比为约1:3，因此确认，相对于本领域的现有技术，完全出乎意料地使用了相当高的Fab量。
更优选地，通过采取上述相同的方式和量，所述a)至g)的造影剂进一步包含有效量的生物活性剂如药物、造影剂、生物分子等。
从尺寸的角度看，在所有可能的实施方式中，一个上述的单个微球体平均直径在≤1μm至<7μm的范围内；更优选所述平均直径≤2μm至<4μm；更进一步优选所述平均直径≤3.5μm。
这样，所述外微球体的膜厚不超过平均400nm；优选其<300nm；更优选其<200nm。
此外，所述内微球体的膜厚不超过400nm；优选其<300nm；更优选其<200nm。
因此，本发明造影剂的总平均直径(即，构成本发明的超声造影剂的所述至少两个同心微球体的基本为球形的总体)不超过8μm；优选其<7μm；更优选其<6μm。
所述值不超过红血细胞平均直径(为约8μm)，因此，其保证了本发明造影剂的安全性。
此外，因为小于10μm，其还保证了所述造影剂颗粒能跨过肺屏障。
作为上述公开的结果，因此，本发明的一个实施方式还包括包含依照上述造影剂的超声造影图像组合物。
所述造影剂优选依照本领域已知的配制步骤制备。
在本发明的一个实施方式中，可适合地将本发明造影剂的组分或前体单个制备并预包装到适宜的试剂盒中(并以该形式分配给医师)，以易于将其放在一起并在要使用前重构，例如，通过适宜地混合和轻轻搅拌所述组分/前体。所述试剂盒的制备和构建与通常制作已知和销售的诊断试剂盒类似，并作必要的修正。
优选通过采取通常用于制备本领域已知的包含气体的超声造影剂微泡的已知制备技术来实施用于制备本发明微球体和造影剂的方法。
因此，在本发明的优选实施方式中，通过传统方法制备内微球体膜，所述方法包括至少一个阶段，在所述阶段中，在惰性气体(优选六氟化硫、空气、全氟己烷)气氛下，将由与适量稳定物混合的有效量的至少一种抗原特异性受体构成的冻干物质粉末与例如生理溶液适当搅拌足够长的时间，以获得由抗体/抗原特异性膜包被的所述气体的微球体，其中，所述稳定物选自包含以下的组：磷脂、白蛋白、半乳糖、棕榈酸、氰基丙烯酸酯和/或其混合物(优选磷脂、白蛋白、半乳糖、棕榈酸)，所述膜包含所述抗原特异性受体(优选抗体的Fab)。
所述膜可重现现有技术中已知的某些CM的结构，因此，通过利用通常用于其制备的新方法合成所述膜。
这样，所述外微球体膜的实施方式包括至少一个阶段，其中，在惰性气体(优选六氟化硫、空气、全氟己烷)气氛下，例如，在密封的小瓶中，且在先前获得的(内)微球体存在下，将Fab/稳定剂的混合物(优选重量比为3:1)的冻干粉末与生理溶液(0.9%的NaCl)混合，并在室温下适当搅拌几分钟，例如手动搅拌或超声处理，从而得到上述本发明造影剂的基本为球形的核。
仅作为实例，而绝非限制本发明，所述方法优选包括第一阶段a)，其中：
a)在六氟化硫气氛下，例如在密封的小瓶中，将由重量比为3:1的至少一种抗原特异性受体(Fab)和一定量磷脂(约10-20mg)构成的混合物形成的冻干粉末与约2.5mL生理溶液(0.9%的NaCl)混合，在室温下适当搅拌几分钟，例如手动搅拌或超声处理，从而得到具有单磷脂膜并包含六氟化硫的所述预制超声造影微球体(所谓的内微球体)的第一微悬浮液。
所述第一阶段a)后是第二阶段b)，其中：
b)在六氟化硫或另一种惰性气体的气氛下，在具有约2.5mL生理溶液(0.9%的NaCl)的密封小瓶中，向来自前一阶段a)的微球体添加由Fab/白蛋白3:1w:w(约10-20mg)构成的冻干混合物。将其整体在室温下适当搅拌几分钟，例如手动搅拌或超声处理，从而得到包含本发明同心微球体(由一个内微球体和与其不同的一个外微球体组成)的第二微悬浮液。
一经制备，现有微泡(在密封的小瓶中)的最大储存时间为约6小时。
这样，其在外围血血流中的持续时间为约6分钟。
相比于已知的，本发明超声造影剂的同心微球体的平均稳定性比现有微泡高出很多(优选高出1.1至5倍)，因此也更好。本发明超声造影剂的同心微球体在外围血血流中的平均持续时间估计为至少7分钟；优选至少8分钟；更优选至少9分钟；更优选10分钟或更长。
考虑到本发明超声造影剂所示的上述预想不到的特征，已可预想不到地发现其结构可使其获得在表达某些抗原的组织内部特别长的特异持久性，其中，存在于本发明同心微球体剂的膜中的受体(Fab's)对所述抗原具有特异性；或以靶向且受控的方式释放包含在两个微球体内的药物。
实际上，所述至少两个同心微球体的膜在其化学结构的组成方面具有实质性的区别，并因此导致其在超声检验中可见性的区别，以及对药物释放的有效调节。此作用发生的原因在于，有必要依据是否需要产生对一个膜或其他膜的空化作用(cavitation)而施加不同特征的超声波束。
换句话说，例如，对由白蛋白包被空气制成的微球体产生空化作用所需要的声功率不同于对由磷脂包被六氟化硫形成的微泡产生相同效应所需的声功率。因此，在(通过施加适宜的声功率)激发外微球体膜的空化作用，随后相应地释放其包含或结合的药物后，也可以随后(通过施加适宜的不同声功率)产生内微球体膜的空化作用，同时相应地进一步释放其包含/或结合的药物。相比于仅通过单个同类膜而激发释放的情况，该方式可获得延长更多的药物释放(以及，由此获得靶组织对所述药物延长的和逐步的吸收)。
因此，使用由具有不同化学组成的膜和由相同或不同的气体形成的本发明的至少两个同心微球体的发明合理性在于，膜化学组成和其包含的气体以不同方式影响了用于激发空化作用的声束的特征。
因此，有必要取决于需要进行空化作用的微球体类型(即，取决于膜和其包含的气体的类型)，而使用具有不同效力(potency)的声束。以该方式，可以通过改变受声波作用波束的声功率而对本发明的至少两个同心微球体不同膜产生连续的空化作用，从而获得更长且受调控的药理学释放。
受声波作用的波束的声功率平均在0.1至1MPa的范围内；优选0.1至0.9MPa；更优选0.2至0.83MPa，这取决于待接受空化作用的膜的化学成分的类型(和气体的类型)。
这样，超声波束频率平均在1至3MHz的范围内；优选1.1至2.9MHz；更优选1.15至2.85MHz。
仅作为实例而绝非束缚或限制本发明的应用范围，对由两个同心微球体组成的本发明超声造影剂进行超声处理，其中，所述两个同心微球体的外微球体由Fab和磷脂(重量比为3:1，且包含六氟化硫和作为活性成分的一种抗肿瘤剂)形成，而内微球体由Fab和白蛋白(重量比为3:1，且包含空气和作为活性成分的一种抗肿瘤剂)形成。
首先，使用频率在1.10至2.85MHz范围和声功率在0.2至0.4MPa范围的超声波束(其导致外微球体磷脂膜的穿孔和随后的空化作用，同时相应释放其包含或结合的药物)，然后，使用频率相同和声功率为0.83MPa的超声波束(其导致内微球体白蛋白膜的穿孔和随后的空化作用，同时相应释放其包含或结合的药物)，对所述造影剂进行声波处理。
由此发现，可通过适宜地改变受声波作用的波束的声功率导致两种不同膜的连续空化作用，并因此在造影剂产生极高选择性且牢固结合的区域获得延长的和受调控的药理学释放。
根据本发明，由其中所有微球体均对某些抗原具有特异性的至少两个同心微球体形成的造影剂，能保持固定在表达所述抗原的组织上的时间比传统造影剂颗粒长得多。
结果，相比于其他周围的组织，所述组织的结构对造影图像增强的反映更积极且持续更长的时间。平均从造影剂注射开始120秒起检测到这种选择性且延长的造影图像增强。这样，所述增强的选择性提高还以完全预想不到地方式发生在从施用开始120秒前。
所有这些均可归因于以下事实：通过本发明造影剂的创新性结构(如上所述，主要由对某些抗原具有特异性的高亲合力抗体形成)，可以赋予这两种免疫学成分(抗体:抗原)优越的结合强度，以及赋予所有微球体优越的稳定性。
这样，本发明的特别重要方面在于，能以受控且受调节的方式输送包含(或结合)在至少两个同心微球体的内腔的药理学物质。
这是借助于差异性声波作用而实现的，其中，由两次应用声功率不同的超声波束进行所述差异性声波作用，和能以受调节的方式(即，顺序地)进行同心微球体膜的声孔作用和空化作用。确切地说，例如，为了产生由白蛋白包被的空气微球体的空化作用，所需要的声功率不同于在由磷脂包被六氟化硫形成的微球体上获得相同效应所需的声功率。因此，相比于在释放仅发生于单个同类层的情况下所出现的状况，在激发外微球体膜的空化作用后，可以依次激发内微球体膜的空化作用，从而获得延长更多的药物释放(并由此获得组织对所述药物延长的和逐步的吸收)。
因此，本发明的目的还在于，以延长且逐步的方式向位点、组织或器官特异性/选择性释放药物的方法，其通过将本发明造影剂施用到所述组织，然后应用效力和/或强度不同的超声波束对其进行特异性且随时间有差别的空化作用。
优选地，将本发明的造影剂配制为在适宜的生理学上可接受的水性介质中的可注射悬浮液，从而得到所需超声造影剂。
本发明的造影剂可用于很多不同的治疗用途。例如，患有缺血性猝发病(ischemic ictus)患者的溶解血栓治疗会出现很多并发症，所述并发症与所用物质(其产生公知的出血性副作用)的药效动力学有关，也与血栓形成的溶解速度有关。因此，能调节药物从血流到损伤的传递速度的治疗方法可用于临床实践。在缺血性猝发病的治疗中，具有至少两个同心微球体的造影剂
在缺血性猝发病的治疗中，对声功率不同的超声波束应用敏感的具有至少两个同心微球体的造影剂表现出了保护作用，其不仅适合于降低与灌注速率有关的危险，而且满足使用局部区域方法(根据通过内血管动脉进行的关于缺血性猝发血栓溶解的研究，其非常有效)的需要。
相同的推理路线对肢体外周缺血或心肌缺血过程中的溶栓治疗有效。
此外，此类CM的各种诊断性应用还特别在于对容易通过超声检验的有关器官(例如，睾丸、肝脏、甲状腺、乳房、四肢骨骼肌)的瘤形成的表征和治疗。通过这种超声造影剂，可以借助于靶向肿瘤标记物和靶向新血管生成过程中在内皮水平过表达(iper-expressed)的分子来表征损伤。
所述造影剂还可用作药物的载体，其中所述药物具有对内皮水平表达的、作为肿瘤新血管生成标记物的分子的特异性受体。
类似地，还提出所述造影剂可作为肿瘤标记物的特异性造影剂，根据公知的局部微转移现象，其激发肿瘤细胞通过血管途径扩散到接近肿瘤的周围区域。
为了说明本发明的广泛应用前景，下文描述了本发明超声造影剂的可用的有利临床应用的非限定性实例。
-睾丸胚胎癌细胞对抗原如胎蛋白(AFP)和绒毛膜促性腺激素(HCG)显阳性。通过适当地使用本发明CM的抗体外胶囊(anticorpal external capsule)，对这两种抗原呈阳性的睾丸物质的选择性研究，可进行更好的诊断，或从诊断假设中排除混合型生殖细胞肿瘤(如，确切说是胚胎癌)，而不必被迫求助于对患者无用且危险的手术探查。
-很多上皮肿瘤表达细胞角蛋白：可根据细胞角蛋白8、18或19对诸如乳腺癌的肿瘤进行分类。此外，在鳞状细胞癌的病例中，可检测到细胞角蛋白5或细胞角蛋白6。
-使用本发明的α-胎蛋白特异性超声CM的研究可在肝肿瘤形成的诊断过程中提供优点。
-负载到本发明的超声CM上的Ca125可用于研究疑似为子宫或卵巢恶性肿瘤的肿块。
-CEA(癌胚抗原)可用于确认是否存在结肠直肠癌在肝水平的转移。
-某些CD(分化簇)抗原的研究可帮助诊断血细胞肿瘤。
-新血管生成过程中表达的分子在恶性瘤形成生长过程中是必要的和特征性的。抗VGEF抗体将有利地帮助鉴定该现象。
特别是，可见这些超声造影剂在儿童阶段使用特别有前途，在儿童阶段使用较少的入侵式诊断技术毫无疑问更符合需要而且更安全。实际上，可见本发明微泡较高的生物特异性/选择性对于限制使用活组织检查特别有前途；而且这当然也是儿童阶段所需要的。

Claims (11)

1.一种抗原特异性超声造影剂，其由彼此不同且一个位于另一个内部的至少两个微球体组成，其中所述微球体的每一个：
-由对于每个微球体各不相同的膜覆盖，所述膜基本由有效量的至少一种高亲合力受体和有效量的至少一种稳定剂构成，所述受体对存在于待成像和/或药物治疗的组织内的抗原具有特异性，所述受体:稳定剂之间的重量比在10:1至1:1之间；和
-还包含对于每个微球体相同或不同的惰性气体。
2.根据权利要求1所述的造影剂，其由两个微球体构成，其中所述微球体基本是同心的。
3.权利要求1或2所述的造影剂，其中所述至少一种抗原特异性受体选自包括以下的组：单克隆和/或非单克隆抗体，和/或其片段、Fabs，和/或对内皮细胞、心肌细胞、固有层细胞、间质细胞、表达于动脉粥样硬化斑块中的血凝块细胞具有特异的血管内皮生长因子受体VEGFR，和/或免疫球蛋白、补体片段、肽激素和/或脂质激素、神经传递素的特异性受体；优选对一种抗原具有特异性的抗体的Fabs。
4.权利要求1或2所述的造影剂，其中所述至少一种稳定剂选自包括以下的组：白蛋白、磷脂、半乳糖、棕榈酸、氰基丙烯酸酯和/或其混合物；优选白蛋白、磷脂、棕榈酸、半乳糖和/或其混合物；最优选白蛋白、磷脂和棕榈酸/半乳糖混合物。
5.前述任一项权利要求所述的造影剂，其中所述受体:稳定剂之间的质量比在7.5:1至1.5:1之间；更优选5:1至2:1。
6.前述任一项权利要求所述的造影剂，其中所述微球体的所述膜包含相对于所述膜的总重达约91重量%的量的受体。
7.前述任一项权利要求所述的造影剂，其中所述惰性气体选自包括以下的组：六氟化硫、全氟己烷、全氟碳化物、空气、氮气；优选六氟化硫、空气和全氟己烷；最优选六氟化硫和空气。
8.前述任一项权利要求所述的造影剂，其中所述至少两个微球体的任一个进一步包含或结合有效量的至少一种生物活性物质。
9.一种超声造影药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的造影剂的可注射水性悬浮液。
10.权利要求9所述的药物组合物的用途，其用于选择性和特异性将药物和/或生物活性成分输送到与周围健康组织相对照的患病组织。
11.用于以延长且逐步的方式特异性/选择性地释放药物到位点、组织或器官或区域的方法，其中所述方法包括向所述生物施用权利要求9所述的药物组合物，然后通过应用效力和强度不同的超声波束进行特异性且随时间有差别的空化作用。
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