CN103097397B - 作为抗癌化合物载体的线粒体穿透肽 - Google Patents

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Abstract

在发明描述了包含连接至抗癌化合物的线粒体穿透肽（MPP）的化合物，以及它们的使用方法。

Description

作为抗癌化合物载体的线粒体穿透肽
技术领域
本发明涉及定位至线粒体的可穿透细胞的肽和它们作为抗癌化合物载体的应用。
背景技术
线粒体的产能能力取决于限制离子或其他小分子透过的屏障的保存。线粒体内膜的高疏水性、紧密堆积结构对大多数分子种类是不可透过的--对于指导氧化磷酸化的质子泵送关键的性质1。内膜的不透过性已阻碍了可以靶向线粒体的其他重要生物学功能（凋亡触发）的药物分子的递送2。考虑到已在多种癌细胞中观察到了耐凋亡性3，能够通过将凋亡因子靶向线粒体来干涉可以使得新的抗癌剂策略能够发展。
发明内容
根据一个方面，提供了包含连接至抗癌化合物的线粒体穿透肽（MPP）的化合物。
根据另外的方面，提供了本文中描述的用于治疗癌症的化合物。
根据另外的方面，提供了包括在本文中描述的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
根据另外的方面，提供了包括在本文中描述的多种化合物的化合物库。
根据另外的方面，提供了治疗癌症的方法，包括给予受试者治疗有效量的本文中描述的组合物。
根据另外的方面，提供了在本文中描述的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
根据另外的方面，提供了在本文中描述的组合物用于治疗癌症的应用。
根据另外的方面，提供了在癌细胞中诱导凋亡的方法，包括给予治疗有效量的本文中描述的组合物。
附图说明
参照以下描述和附图可以很好地理解本发明的实施方式。在描述和附图中，类似的数字指的是类似的结构或过程。在附图中：
图1示出了mt-Cbl的线粒体定位和毒性。（A）用于研究线粒体药物定位的荧光标记的mt-Cbl结合物的结构。在所有其他测定中，乙酰基在肽N端取代噻唑橙（to）荧光基团。（B）如通过分离的线粒体的免疫金染色法和TEM成像观测的，MPP在线粒体基质中的定位。在分离的小鼠线粒体内观测到相应于生物素化肽的定位的金纳米颗粒（注意电子密集、较暗区表示在用于染色的条件下的线粒体基质）。（C）100s线粒体的结果的定量为主要的基质定位提供了定量证据。（D）与Mitotracker633相比，to-mt-Cbl在活的海拉细胞中的细胞内定位。（E）在温育24小时之后mt-Cbl对海拉细胞的毒性。（F）用在海拉细胞中Cbl靶向线粒体观察的提增加水平的超氧化物。MitoSOX染色以及通过流式细胞仪的评估与提高的超氧化物一致。（G）Cbl的线粒体递送使海拉细胞中的线粒体膜去极化。通过JC-1染色的流式细胞术分析线粒体膜电势。绘制平均值，n=3，误差棒是平均数标准误差。双尾t-检验用于确定P值。
图2示出了Cbl和mt-Cbl在不同的细胞器中引起DNA损伤。相对扩增17.7kb的核DNA区段，和8.9kb的线粒体DNA区段。在PCR分析之前用Cbl（150μΜ）或mt-Cbl（3μΜ）处理HL60细胞2小时。损伤/10kb值包含在图示的条棒之上。
图3示出了响应于由Cbl和mt-Cbl造成的DNA损伤不同的基因表达曲线。（A）涉及检测DNA损伤和诱导凋亡的基因的定量PCR阵列用于评估用LC25剂量的Cbl或mt-Cbl处理2或24小时的HL60细胞的RNA表达曲线。为了评估连接酶III的表达，用LC50剂量的Cbl或mt-Cbl处理细胞1小时。从mt-Cbl结果中减去*MPP表达改变。绘制平均值，n=3，误差棒等于SEM。（B）具有大于≥4倍表达改变的定量PCR阵列高亮击中（hit）的结果。（C）定量PCR击中的蛋白表达水平。在用免疫印迹法评估蛋白水平之前用LC25剂量的Cbl（17μΜ）或mt-Cbl（3μΜ）处理HL60细胞。除了DDIT3水平以外，在2小时处理之后进行所有印迹，它们是在Cbl温浴24小时之后评估的。β-肌动蛋白用作加载对照。（D）涉及mt-Cbl毒性的GADD45G途径效应物蛋白的表达水平。用Cbl、MPP、或mt-Cbl处理HL60细胞，并且使用免疫印迹法来评估蛋白水平。β-肌动蛋白用作加载对照。GADD45G途径的下游蛋白，JNK和p38，显示当Cbl和mt-Cbl处理时是上调的。此外，当mt-Cbl活化JNK时，Cbl似乎活化p38。
图4示出了MPP-Cbl活性的评估和初级CLL细胞的治疗窗。（A）在LC25和LC50下，在血红细胞（RBC）（健康供体）、外周血干细胞（PBSC）（健康供体）、单核细胞（健康供体）和CLL患者细胞中评估的Cbl和MPP-Cbl活性。与来源于健康供体的那些细胞相比较，Cbl和MPP-Cbl两者对于CLL患者样品细胞具有较高选择性毒性。通过膜联蛋白V/塞特克思红（Sytoxred）细胞染色来测定活力百分比。发现在本实验中使用的浓度下，含有Cbl和MPP-Cbl的RBC的溶血活性是最小的。绘制平均值，n>5，误差棒是平均数标准误差。双尾t-检验用于确定P值。（B）外周血细胞、单核细胞、和CLL患者细胞的MPP吸收以及线粒体膜电势。通过流式细胞术测定的噻唑橙(to)-MPP的吸收显示了CLL细胞中较高水平的肽吸收。如通过JC-1染色的FACS分析测定的线粒体膜电势（降低的JC-1比表示较低的线粒体膜电势）表明与来自健康供体的PBSC和单核细胞相比，CLL患者细胞较高的线粒体膜电势。绘制平均值，n=3，误差棒是平均数标准误差。
图5示出了在显示耐药性和耐凋亡的细胞系中MPP-Cbl的毒性。（A）MPP-Cbl对白血病细胞系组（M2、K562、HL60、和U937）的毒性。绘制平均值，n>3，误差棒是平均数标准误差。插图：用6μΜ的MPP-Cbl处理后HL60膜联蛋白V-FITC（A-FITC）/塞特克思红（SytoxRed）（SR）细胞染色的FACS分析。示出了在各象限中的群体（population）百分数（A-FITC-/SR-：活的；FITC+/SR-：凋亡；A-FITC-/SR+：坏死；A-FITC+/SR+：死亡）。（B）Cbl对白血病细胞系的毒性示出了两种不同的群体，HL60和U937对Cbl敏感，K562和M2耐Cbl。插图与部分（a）相同，但是使用34μΜ的Cbl。（C）在耐Cbl细胞系中的耐凋亡性。如通过膜联蛋白V/塞特克思红染色的细胞（黑色棒）的FACS分析测定的白血病细胞系对星状孢子素的响应。图示了活细胞的百分率。与HL60和U937相比较，在K562和M2细胞系中星状孢子素处理诱导较少的细胞死亡。K562和M2细胞系显示较高水平的Bcl-XL表达（白色棒）（针对蛋白质印迹参见图6）。（D）在WT或耐Cbl细胞（CblR）中MPP-Cbl的毒性。细胞与（A）中的相同。单独的Cbl没有显示CblR中凋亡细胞群体的增加，然而，对于WT和CblR细胞系两者都检测到了用MPP-Cbl处理的凋亡响应。
图6示出了在白血病细胞系中BclXL和β-肌动蛋白水平的蛋白质印迹。如上文描述的进行蛋白印迹分析。通过BCA测定法来测定总蛋白水平，并且如用β-肌动蛋白加载对照所看到的，将相等的蛋白加入各孔中。
图7示出了Cbl和MPP-Cbl之间在A2780野生型细胞中LC50的比较。如上所述，用Cbl（右侧曲线）和MPP-Cbl（左侧曲线）来处理A2780野生型细胞。用CCK8测定法来分析毒性。
图8示出了通过mt-Cbl的DNA烷基化。（A）在细胞固定之后Cbl保持线粒体中的MPP。用活的海拉细胞温育荧光标记的mt-Cbl和对照肽（MPP），并在未固定的细胞中观察线粒体定位。在固定和穿透条件下，mt-Cbl保持线粒体定位而MPP扩散至细胞核和细胞质。此后，用脱氧核糖核酸酶（10单位）温育细胞以催化DNA的裂解。用脱氧核糖核酸酶处理致使mt-Cbl定位的扩散。（B）mt-Cbl的烷基化活性。当用Cbl烷基化时通过测定4-(4-硝基苄基)吡啶的吸光度来监测烷基化活性。与单独的Cbl相比，连接靶向线粒体的肽使结合的苯丁酸氮芥的烷基化能力降低了约2倍。（C）通过mt-Cbl和Cbl交联分离的DNA。用不同浓度的mt-Cbl或Cbl（2-200μΜ）处理DNA致使浓度依赖性交联形成（左）。通过mt-Cbl和Cbl（右）的时间依赖性DNA交联（从5-60min改变）。
具体实施方式
在以下描述中，给出了许多详细描述以提供对本发明的透彻理解。然而，应理解的是可以在没有这些具体描述的情况下实施本发明。
难以进入线粒体基质已限制了抗癌剂的治疗靶向该细胞器。在此，我们报道了使用合成肽载体将烷化剂苯丁酸氮芥成功递送至线粒体。该药剂的线粒体靶向性显著增强了其活性，并且促使多种癌细胞系以及具有保留活性的患者样品，甚至具有耐药性或不能触发凋亡的细胞中的凋亡细胞死亡。
根据一个方面，提供了包含连接至抗癌化合物上的线粒体穿透肽（MPP）的化合物。
“抗癌化合物”包括用于治疗癌症所给予的任何物质。典型地，大多数化学治疗药物可以分为烷化剂、抗代谢物、蒽环类、植物碱、拓扑异构酶抑制剂、和其他抗肿瘤剂。根据公开的方面以及与MPP结合使用的优选抗癌剂包括以下。
在一些实施方式中，抗癌剂连接至MPP的C端。
在其他实施方式中，抗癌剂连接至MPP的N端。
在一个实施方式中，该化合物是Fxr3-Cbl。
优选本发明的MPP具有正电荷和亲脂性（在本文中确定的对于穿过质膜和线粒体膜重要的性质）。因此，MPP含有阳离子和疏水性残基以提供带正电荷的亲脂性，这有助于通过质膜和线粒体膜。阳离子氨基酸如赖氨酸（K）、精氨酸（R）、氨基苯丙氨酸、和鸟氨酸可以结合到MPP中以提供正电荷，而疏水性残基如苯丙氨酸（F）、环己基丙氨酸（Fx）、氨基八精氨酸（animooctaarginine）（Hex）、二苯基丙氨酸（F2）、和(1-萘基)-L-丙氨酸（Nap）可以结合到MPP中以赋予亲脂性。虽然在MPP内带电荷的和疏水性残基的排列没有特别限制，只要MPP具有适当的电荷和亲脂性以穿过质膜和线粒体膜即可，但是MPP可以包括交替的带电荷的和疏水性残基以增加MPP内的亲脂性水平。
如本领域技术人员将理解的，可以使用已建立的肽合成技术（包括自动或手动技术）来制备根据本发明的MPP，。
MPP的长度没有具体限制，但是通常具有适合穿过质膜和线粒体膜的长度，单独地或连接至另一种物质上，如生物制剂（如将描述的）。通常，MPP将由4-20个残基组成。
MPP可以包括一个或多个改性以赋予MPP期望的性质的残基，例如，提高的细胞内稳定性。在这个方面，例如MPP可以包括d-立体异构体、和末端修饰如酰胺末端。
在一些实施方式中，MPP可以穿过线粒体的内膜，优选以电势依赖的方式。
在一些实施方式中，MPP包括+3的电荷和至少约-1.7的logP值。
在其他实施方式中，MPP包括+5的电荷和至少约-2.5的logP值。
优选地，MPP是SEQIDNO:1-7中的任何一种。
根据另外的方面，提供了在本文中描述的用于治疗癌症的化合物。
根据另外的方面，提供了包括在本文中描述的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
根据另外的方面，提供了包括多种在本文中描述的多种化合物的化合物库。
根据另外的方面，提供了治疗癌症的方法，包括给予受试者治疗有效量的本文中描述的组合物。
根据另外的方面，提供了在本文中描述的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
根据另外的方面，提供了在本文中描述的组合物用于治疗癌症的应用。
根据另外的方面，提供了在癌细胞中诱导凋亡的方法，包括给予治疗有效量的本文中描述的组合物。
如在本文中使用的，“药学上可接受的载体”是指生理学相容的任何一种或全部的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，等等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇，等等，以及其组合中的一种或多种。在很多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包括少量的辅助性物质如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们增加药剂的货架期或效力。
如在本文中使用的，“治疗有效量”是指在必要的剂量和特定的持续时间下实现期望的治疗结果的有效量。药剂的治疗有效量可以根据多种因素而改变，例如个体的病状、年龄、性别、和体重，以及药剂在个体体内引起期望的反应的能力。治疗有效量也是治疗有益效果超过药剂的任何毒性或有害效果的量。
以下实施例是本发明各个方面的示例性说明，并不限制如在本文中披露的本发明的广泛的方面。
实施例
方法
细胞培养条件。在37°C和5%的CO2下，在用10%（v/v）的FBS补充的MEMα（Invitrogen，Carlsbad）中培养海拉细胞。在RPMI1640+10%的FBS中培养U937细胞，伊思考夫改良型杜尔贝可培养基（Iscove'sModifiedDulbecco'sMedia）+10%的FBS用于OCI-AML2、HL60、K562、OCI-M2、LY17和Daudi。在37°C和5%的CO2下，在RPMI1640+10%的FBS中培养A2780野生型和耐Cbl系，并且一周一次地用100μΜ的Cbl处理耐Cbl系持续1小时以保持耐受性。
肽合成和表征。如前描述的25，26，使用PreludeProteinTechnologies肽合成仪在RinkamideMBHA树脂（0.7mmol/g，100-200目）（NovaBiochem）上进行固相合成。以25μmol或50μmol的规模合成肽。如前描述的27，合成噻唑橙（to），并使用处于N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中的HBTU（4当量，ProteinTechnologies，Tucson）（HBTU=O-（苯并三唑-l-基）-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯）和DIPEA（8当量，Sigma-Aldrich，St.Louis）（DIPEA=N，N-二异丙基乙胺）将其连接至肽上，过夜。使用处于DMF中的HBTU（4当量）和DIPEA（4当量）使苯丁酸氮芥（Sigma-Aldrich，St.Louis）连接至肽上。使用乙酸酐、吡啶、和DCM（1:5:10，Sigma）使未标记的肽的N端加帽（cap）。使肽脱保护，并且使用TFA:三异丙基硅烷:H2O（95:2.5:2.5）从树脂上切割，并在冰冷的醚中沉淀。在C18柱上，处于在0.1%TFA中的H2O/MeCN梯度通过RP-HPLC将全部肽纯化至>95%，并通过电喷射离子化质谱证实身份（identity）。纯化后立即在液氮中快速冷冻包含苯丁酸氮芥的肽，并冻干至干燥。使用63,000M-1cm-1的消光系数2，在500nm下定量噻唑橙标记的肽。使用15200M-1cm-1的苯丁酸氮芥消光系数28，在258nm下定量苯丁酸氮芥连接的肽。使用BCA测定法（Pierce，Rockford）来定量未标记的肽。
表1、肽结合物列表
化合物 肽序列
to-mt-Cb1 TO-FxrFxrFxrk-Cb1
mt-Cb1或MPP-Cb1 Ac-FxrFxrFxrk-Cb1
MPP Ac-FxrFxrFxr
to-MPP TO-FxrFxrFxr
生物素-MPP 生物素-FxrFxrFxr
生物素-mt-Cbl Cb1-FxrFxrFxrk-生物素
共焦显微术——活细胞。在实验前一天，在8孔μ-玻片（μ-slides）（iBidi，德国）中以25,000个细胞/孔的密度接种细胞。在用2%（v/v）的FBS补充的OPTI-MEM（Invitrogen，Carlsbad）中进行肽温育（5μΜ）持续指定时间。当说明时，加入Mitotracker633（Invitrogen，Carlsbad）持续温育的最后20min。然后洗涤细胞两次并使用倒置ZeissLSM510共焦显微镜成像。
共焦显微术——固定的细胞。如上平铺海拉细胞并在37°C和5%的CO2下，用处于不含酚红的MEMα中的5μΜ肽处理5min。然后去除肽溶液并在37°C和5%的CO2下，用新鲜培养基置换持续25分钟。用PBS洗涤细胞两次并在-20°C下用丙酮温育10min。再次用PBS洗涤细胞两次，并在4°C下用0.1%的TritonX-100温育5min，用PBS洗涤并如上成像。当说明时，在成像之前，在37°C下用处于lx脱氧核糖核酸酶缓冲液中的10个单位的脱氧核糖核酸酶温育细胞2小时。
TEM成像。如前描述的1，从新鲜小鼠肝脏中分离线粒体。使用呼吸测量法证实功能性。仅当在状态III呼吸（存在ADP）下的氧消耗水平高于在状态II呼吸下的>4倍时（表明良好结合的线粒体），才使用分离的细胞器。通过BCA测定法（Sigma）来确定线粒体的蛋白质浓度。在PBS中将线粒体稀释至0.5mg/mL，并在25°C下用生物素-FxrFxrFxr温育20分钟。加入冰冷的PBS并且通过离心使线粒体成粒。在室温下将颗粒固定在处于PBS中的1%戊二醛中持续90min，用PBS洗涤，然后在4°C下用1%的四氧化锇固定2hr。使用分级的乙醇使颗粒脱水，随后用环氧丙烷和Epon-Araldite树脂逐步渗入。在60°C下在树脂中固化颗粒48小时。将这些块（block）分割成60nm，并在60°C下将这些部分附着至镍格栅（grid）上持续30min。在室温下使格栅漂浮在饱和的偏高碘酸钠水溶液中持续1小时，洗涤，然后用1%的BSA封闭，用抗生物素（JacksonImmunolabs）随后用蛋白A-金（Aurion，10nm）标记。用水清洗格栅并用2%的乙酸双氧铀染色5分钟。为了定量金标记，对于每个计数事件，对200个金颗粒（用于较高密度标记的样品）或400个线粒体（用于较低密度标记的样品）进行计数。每种样品进行最少三次计数事件。在不同的部分上进行计数。
毒性分析。在96孔平底组织培养板（Starstedt，德国）中以12,000个细胞/孔的密度接种海拉细胞。在96孔平底板（CellStar，locato）中，以50,000个细胞/孔的密度接种白血病细胞系（K562、OCI-M2、U937、HL60、AML2、LY17、Daudi）。在96孔平底组织培养板（Starstedt，德国）中，以25,000个细胞/孔平铺A2780野生型和A2780耐Cbl细胞。去除培养基并洗涤细胞。在细胞适当的培养基中进行肽温育，在OPTI-MEM培养基中进行海拉细胞的温育。在37°C和5%的CO2下温育过夜之后，使用CCK-8活力染料（Dojindo，Rockville），在450nm的吸光度下分析细胞活力。使用GraphpadPrism软件（Graphpad，LaJolla）进行统计分析。
线粒体的超氧化物水平分析。在实验前24小时，以24孔板的100,000个/孔平铺海拉细胞，并用处于OPTI-MEM（Invitrogen，Carlsbad）中的Cbl或MPP-Cbl处理1小时。去除培养基并根据制造商的说明书用MitoSox（Invitrogen，Carlsbad）温育细胞。用PBS洗涤细胞，胰蛋白酶消化并用FACSCanto（BD，FranklinLakes）通过流式细胞术进行分析。
膜联蛋白V凋亡测定。以24孔板（GreinerBio-one，德国）的200,000个细胞/孔接种白血病细胞系（K562、OCI-M2、U937、HL60）。在24孔板中以75,000个细胞/孔（BD，FranklinLakes）的密度平铺A2780WT和耐Cbl细胞。通过Ficoll分离从外周血获得健康供体的单核细胞。以200,000个/孔（GreinerBio-one，德国）平铺CLL患者样品、PBSC、和健康供体的单核细胞。一式三份地，用处于细胞适宜培养基中的指示浓度的肽温育细胞。随后在37°C和5%的CO2下温育过夜，根据制造商的说明书，用膜联蛋白V-FITC（BDPharmingen，FranklinLakes）和塞特克思红（Invitrogen，Carlsbad）将细胞染色。使用FACSCanto（BD，FranklinLakes）进行流式细胞术。通过加入3μΜ的星状孢子素（Sigma-Aldrich，St.Louis）并且温育过夜，来实现由星状孢子素诱导的凋亡。
蛋白质印迹。如上培养白血病细胞，并在溶解（10mM的Tris、200mM的NaCl、1mM的EDTA（pH7.4）、1mM的PMSF、0.5%的NP-40、1%的TritonX-100、1X蛋白酶抑制剂混合剂（cocktail）（Bioshop，Burlington，ON）之前在4°C下用PBS洗涤两次，30min。然后在1,200rcf、4°C下使细胞离心5min，使用双金鸡宁酸（BCA）测定法（Pierce，Rockford）来定量蛋白质水平。在加载到15%的凝胶上之前，在8x样品缓冲液中稀释15μg的总蛋白并且加热至42°C持续5min。在100V下跑（run）凝胶1小时，然后将蛋白质转移至100V的硝酸纤维素膜上持续40min。用5%的脱脂牛奶封闭膜1小时，然后根据制造商的说明书用一抗探测（1:500的BclXL抗体[Abeam,Cambridge,Massachusetts]、1:2000的β-肌动蛋白抗体[Abeam]、1:1000的磷酸化JNK[Abeam]、1:1000磷酸化p38[Abeam]、1:1000的GADD45G[SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,California]、1:1000的PPP1R15A[SantaCruzBiotechnology]、1:1000的DNA连接酶III[SantaCruzBiotechnology]、1:1000的p21[SantaCruzBiotechnology]、以及1:1000的DDIT3[CellSignalingTechnology,Beverly,Massachusetts]）。然后洗涤膜并在ECL化学发光检测（GEAmersham）之前用1:5000的驴抗小鼠或山羊抗兔IgG-HRP二抗温育1小时。
溶血测定。在健康供体外周血的Ficoll分离期间获得的血红细胞用于该测定。用PBS洗涤细胞直至上清液澄清。在伊思考夫培养基中制备肽溶液，并横过96孔板制备1:2的稀释度。对于每个孔，加入2μL的血红细胞，混和然后在37°C和5%的CO2下温育1小时。对于100%溶解，向3个孔中加入0.1%的TritonX-100，对于0%溶解，使用不含肽的3个孔中的细胞。在1000xg下使板旋转10min，然后将50μL的上清液转移至新板，与50μL的PBS混和并在415nm下读数。
肽吸收。一式三份地，在24孔板和在伊思考夫培养基中以200,000个细胞/孔接种CLL患者样品、PBSC和健康供体B细胞。然后用5μΜ的标记有噻唑橙的肽温育细胞15min，用PBS洗涤并在FACSCanto（BD，FranklinLakes）上分析以测定细胞内肽的相对浓度。
线粒体膜电势。在实验之前24小时，以50,000个细胞/孔接种海拉细胞。一式三份地，在24孔板中在伊思考夫培养基中以200,000个细胞/孔接种CLL患者样品、PBSC和健康供体B细胞。然后在37°C下，用2μΜ的5,5',6,6'-四氯-l,1',3,3'-四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物（JC-1，Invitrogen，Carlsbad）温育细胞持续20分钟。然后用1mL的PBS洗涤各样品两次，在BDFACSCCanto上读取之前在300μL的PBS中重悬。在488nm下激发样品，在526nm（绿色）和595nm（红色）下收集发射。为了获得线粒体膜电势（红/绿），用来自红色通道的发射除以来自绿色通道的发射。对于膜去极化研究，在用JC-1温育之前在OPTI-MEM（Invitrogen，Carlsbad）中用Cbl或MPP-Cbl处理海拉细胞1小时。用PBS洗涤细胞，胰蛋白酶消化并且分析（如上）。
比色法烷基化化验。使用4-(4-硝基苄基)吡啶（4-NBP）（Thomas等，1992）来测试烷基化。简言之，用处于包含85mM的三乙醇胺（pH7.2）和43%的丙酮的缓冲液中的4-NBP（0.7%w/vol）温育化合物（200-450μΜ）。在37°C下温育反应30-120min。通过在干冰/乙醇浴中冷冻来终止反应。为了使样品生长（develop），加入100ml的乙酸乙酯和25μl的5NNaOH，随后涡旋。在540nm下读取有机乙酸乙酯的吸光度。
分离DNA的交联。由公开方法的变型来确定经分离pBR322DNA的交联30。简言之，用处于25mM的三乙醇胺（pH7.2）和1mM的EDTA中在指示的浓度和时间下的化合物温育pBR322DNA。通过加入50mM的EDTA和150μg/ml的过量短寡核苷酸DNA来终止反应。在95°C下，在变性缓冲液（30%的DMSO、1mM的EDTA、溴酚蓝、二甲苯蓝、和0.4%的SDS）中使样品变性3min，并在干冰/乙醇浴中快速冷冻。在处于TAE缓冲液中的0.8%琼脂糖中进行电泳，并在运行之后用溴化乙锭染色。
定量实时PCR。如指示的，在含有Cbl、mt-Cbl、或MPP的伊思考夫培养基（Invitrogen）中以LC25剂量（分别为17、3、和3μΜ）温育600,000个HL60细胞持续2或24小时。对于Lig3，以LC50剂量（分别为34、6、和6μΜ）温育细胞1小时。然后根据制造商的说明书使用Rneasy迷你试剂盒（QIAGEN，Hilden，德国）来分离RNA。在NanoDrop上定量RNA，使用RT2第一链试剂盒（RT2FirstStrandKit）（SABiosciences，Frederick，马里兰）将1μg转化成cDNA。然后使用人类DNA损伤信号通路PCR阵列（PAHS-029，SABiosciences）或用根据制造商的说明书购自SABiosciences的选择的引物来进行定量PCR。使用由SABiosciences提供的基于网络的软件来进行数据分析。独立地设计Lig3、p21、和GAPDH引物：LIG3，正向GAAATGAAGCGAGTCACAAAAGC（SEQIDNO:8）和反向GTACCCTTCACATCCTTCAGC（SEQIDNO:9）；p21，正向CCTCATCCCGTGTTCTCCTTT（SEQIDNO:10）和反向GTACCACCCAGCGGACAAGT（SEQIDNO:11）；和GAPDH，正向CAACGGATTTGGTCGTATTGG（SEQIDNO:12）和反向GCAACAATATCCACTTTACCAGAGTTAA（SEQIDNO:13）。以与上述方法类似的方式进行所有其他步骤。如由SABiosciences的制造商推荐的，相比于对照细胞，显示表达水平≥4倍改变的基因被认为是击中（hits）的。使用购自SABiosciences的引物，用3次生物学重复来证实所有击中。
通过定量PCR测定DNA损伤率。使用Cbl（150μΜ）或mt-Cbl（3μΜ）处理总共5x106个HL60细胞持续2小时。用QIAGENGenomicTip和GenomicDNA缓冲液系列试剂盒（QIAGEN）从冷冻的细胞颗粒中分离DNA，并使用PicoGreen染料（Invitrogen）进行定量。如之前描述的31，使用GeneAmpXLPCR试剂盒（Perkin-Elmer）来进行8.9kb线粒体区段和17.7kbβ-珠蛋白靶序列的定量扩增。在给定的剂量D下，以D=-InAD/AC计算损伤率，其中AD是在该剂量下扩增的，AC是未损伤对照中的扩增水平。患者样品的收集。按照研究伦理委员会（researchethicsboard）（REB）批准的协议在书面知情同意之后，收集来自正常个体和患有CLL的病人的外周血细胞。通过Ficoll-Hypaque离心法分离单核细胞。细胞或者新鲜地使用或在-150°C下以有活力状态保存在10%的DMSO、40%的FBS、和α-培养基中。PBSC是由根据REB批准的协议获得的干细胞移植供体体内获得的过量非格司亭移动细胞。
结果和讨论
为了提供用于线粒体递送生物活性物质（cargo）的载体，Horton,K.L.,Stewart,K.M.,Fonseca,S.B.,Guo,Q.&Kelley,S.O.ChemBiol15,375-82(2008)描述了可以有效地使各种附连物质穿过质膜和线粒体膜的线粒体穿透肽（MPP）4，5。
通过引用整体合并入本文中的Horton,K.L.,Stewart,K.M.,Fonseca,S.B.,Guo,Q.&Kelley,S.O.Mitochondria-penetratingpeptides.ChemBiol15,375-82(2008)，包括以下SEQIDNO:1-6。
表2
在此，我们研究了具有临床相关抗癌活性的物质，氮芥苯丁酸氮芥（Cbl），的线粒体递送的影响。Cbl是一种有效的烷化剂，其用于治疗白血病并且其活性与细胞核基因组的烷基化相关6。在此，我们报道了该药剂靶向线粒体，并且记载了该细胞器特异性药物避免使癌症治疗无效的两种常见耐受性机制的独特能力。
选择Cbl作为线粒体递送的优选药物，因为其显示快速反应动力学并且不需要细胞活化。此外，羧酸部分提供了易于连接至MPP的理想官能团。为了产生Cbl的线粒体特异性形式，药物连接至具有序列FxrFxrFxr（Fx=环己基丙氨酸，r=d-精氨酸）（图1A，表1）的MPP。该肽进入线粒体基质（图1B），因此是用于递送Cbl以进行线粒体DNA烷基化的适宜载体。该肽完全由使其耐受细胞内降解的人造氨基酸组成。该肽序列是基于之前的工作设计的，表明将环己基丙氨酸单元包括在序列内引入了足以能够穿透线粒体膜的疏水性，而阳离子单元驱动横过包围线粒体的能量屏障的吸收4。通过常规固相合成产生肽，然后通过连接至C端赖氨酸残基连接药物。在体外证实了在线粒体靶向的结合物中Cbl保留了烷基化活性和DNA交联活性（图8B和8C）。还证实了将药物置于N端导致可比较的效应，而MPP-药物结合物的活性几乎没有改变（未显示数据）。
为了测试这种MPP是否可以有效地将Cbl递送至线粒体，将荧光团噻唑橙（to）7连接至N端以跟踪细胞内的定位（图1A）。用可以通过免疫金TEM可视化的生物素化的MPP来证实肽穿透进入到线粒体基质中（图1B）。100s线粒体的定量结果提供了主要基质定位的定量证据（图1C）。在活的海拉细胞中的细胞内定位与线粒体特异性染料Mitotracker强烈地关联，表明Cbl成功地累积在线粒体内（图1D）。
通过温育海拉细胞和结合物，使得烷基化能够发生，然后固定细胞并穿透它们的膜，还评估了线粒体内MPP-Cbl的烷基化活性（图8A）。MPP-Cbl结合物保持其线粒体定位（甚至当膜穿透时），而当膜破裂时MPP对照肽从线粒体扩散至细胞质和细胞核。在固定和穿透之后，用脱氧核糖核酸酶处理细胞以使DNA片段化，这导致MPP-Cbl扩散（图8A）。这些观测表明MPP-Cbl在线粒体内反应。
将MPP-Cbl对海拉细胞的细胞毒性与母体肽和未结合的Cbl进行比较。使用细胞活力测定法，观察到与Cbl相比较，MPP-Cbl的效力增加了100倍（图1E）。在测试的浓度范围内母体肽没有显示显著的毒性，证实了细胞死亡是因为药物的活性，而不是载体。为了证实效力增加是由于干扰了线粒体功能，评估了细胞器膜电势和超氧化物水平。已显示线粒体DNA损伤增加了线粒体超氧化物水平并使该细胞器的膜去极化8。当MPP-Cbl处理而不是用Cbl（一种其活性与细胞核基因组的烷基化相关的药剂）处理时（图1F和1G）显示了这两种观察结果。这些数据支持我们的假设，即MPP-Cbl是特异性作用在线粒体靶标上的。为了评估mt-Cbl在白血病细胞中的活性和特异性，我们评估了其在白血病细胞系组中的毒性。观察到了类似水平的毒性。例如，在HL60细胞中，与Cbl相比，mt-Cbl再次显示出效力增加（表4），对于Cbl和mt-Cbl而言EC50分别为34和6.8μΜ。
通过比较两种基因组的PCR扩增的效力，定量评估了细胞核相对于（versus）线粒体DNA的烷基化。用Cbl或mt-Cbl处理HL60细胞，独立地评估细胞核和线粒体基因组的损伤。分析了β-球蛋白基因上细胞核DNA的17.7kb区段和线粒体DNA的8.8kb片段。Cbl主要破坏细胞核DNA，很少损伤线粒体，然而mt-Cbl引起线粒体DNA扩增的显著减少，对细胞核基因组具有最小的影响（图2）。
之前的研究探索了用于Cbl的混和的细胞质和细胞核的细胞内递送的细胞穿透肽，仅记载了活性增加约10倍9，表明Cbl的线粒体递送导致活性进一步增加。如果增加的吸收是潜在因素，该增加超过预期的情况，因为相对于之前使用的细胞穿透肽4，在此处使用的MPP是可比的，而不是增加吸收。活性的提高很可能不是由于线粒体基因组和其核对应物之间的主要差异。线粒体基因组中缺乏内含子增加了损伤靶向实质性DNA序列的可能性10。此外，线粒体基因组并未如核基因组一样包装，使得其对于DNA损伤剂更加敏感500倍11。此外，线粒体DNA修复途径不如细胞核中进行的那么复杂12。所有这些因素可以有助于观察到效力增加100倍。
使用定量实时PCR阵列来评估84种基因的组，其中的10种具有线粒体活性（表3）。已知这10种基因涉及DNA损伤信号传导、修复、凋亡、和细胞周期抑制。如果与未处理的细胞相比，基因显示≥4倍的改变，认为它们是差异表达的（图3B），并且使用单独合成的PCR引物，用3个生物学重复来证实击中。该分析显示，当细胞核相对于线粒体DNA的烷基化发生时，活化了不同的途径。DDIT3/GADD153显示响应于Cbl表达增加了5倍，但是使用mt-Cbl则没有改变，表明该基因主要涉及对核DNA损伤做出响应。相对于单独的Cbl，使用mt-Cbl将另外两种基因上调至较高程度：PPP1R15AGADD34（4倍）和GADD45G（15倍）（图3A和3B）。在mt-Cbl和Cbl两者存在下，p21被过表达。证实了mRNA水平的这些改变导致蛋白质表达的相应改变（图3C）。有趣地，已知线粒体靶向的上述基因则不受影响。
已知基因的生长抑制和DNA可诱导损伤（GADD）的家族涉及凋亡和细胞周期抑制32，并且也已知p21蛋白在DNA损伤信号传导中起重要作用。已显示p21与GADD45G相互作用33，其可以活化p38或INK途径34。在用Cbl或mt-Cbl处理之后，用免疫印迹法评估这些途径的活化，有趣地，观察到了不同的活化，其中Cbl活化了p38并且mt-Cbl活化了JNK（图3D）。这些结果显示当相同的化合物靶向不同的细胞内部位点时，出现了不同的细胞响应。
也研究了在Cbl和mt-Cbl处理的细胞中连接酶III的水平。该连接酶，存在于细胞核和mt两者中，是后者细胞器中唯一的连接酶，并且涉及大多数形式DNA损伤的修复35。因此，响应于线粒体基因组的mt-Cbl诱导型损伤，可以观察到该基因增加的表达。实际上，在用mt-Cbl处理的细胞中检测到了这种情况（图3A；图3C）。
表3、包含在定量PCR阵列中的靶向线粒体的蛋白列表
基因符号 基因名称 细胞功能
OGG1 8-羟鸟嘌呤DNA糖基化酶 损伤的DNA结合，碱基切除修复
RAD18 RAD18同系物（酿酒酵母） 损伤的DNA结合
APEX1 APEX核酶 碱基切除修复
MUTYH mutY同系物（大肠杆菌） 碱基切除修复，错配修复
NTHL1 nth核酸内切酶III样1（大肠杆菌） 碱基切除修复
UNG 尿嘧啶-DNA糖基化酶 碱基切除修复
MRE11A 减数分裂重组11同系物A（酿酒酵母） 双链断裂修复
RAD50 RAD50同系物（酿酒酵母） 双链断裂修复
MLH1 mutL同系物（大肠杆菌） 错配修复
AIFM1 凋亡诱导因子，线粒体结合因子1 凋亡
Cbl是临床使用的治疗方法，用于治疗白血病6。为了确定在原发性癌症细胞中MPP-Cbl结合物是否能够显示超过母体化合物的增加的活性，我们评估了从慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者体内分离的B细胞的毒性曲线。为了评估正常细胞以及评估该化合物是否显示治疗窗，使用来自健康供体的外周血干细胞（PBSC）和单核细胞来评估MPP-Cbl的治疗窗。使用MPP-Cbl处理，我们观察到了针对CLL患者细胞的活性，其在健康细胞中显著地较低，表明肽结合物存在治疗窗（图4A）。此外，在本研究使用的浓度下，MPP-Cbl显示了极小的溶血水平（图4A），表明在白血病细胞消融的浓度下对血红细胞没有毒性。
为了研究治疗窗的来源，我们评估了MPP在CLL细胞、单核细胞、和PBSC中的细胞吸收。MPP在CLL细胞中的吸收高于在健康细胞中的吸收，表明在这些细胞中可能达到较高的药物浓度（图4B）。此外，用CLL细胞观察到了较高的相对线粒体膜电势（图4B），表明在该细胞类型中存在线粒体积累的较大的驱动力。已广泛报道了癌细胞和健康细胞之间的线粒体膜电势的差异13，之前也已观察到了由于该性质的不同药物毒性（如在用罗丹明123和MKT-077的研究中14-16）。然而，在此药物不是作为非定域的亲脂性阳离子递送的；因此，肽载体提供了特异性。因此，MPP为线粒体药物递送提供了通用载体，从而保留了治疗窗。
考虑到已经在白血病中检测到了耐Cbl性17-18，我们研究了向线粒体递送Cbl是否能够改变耐药性机制的效力。我们测试了未改性药物在骨髓和淋巴细胞系组中的活性，并观察到在两种细胞系（K562和OCIM2）中，母体药物具有减弱的效力。这两种细胞系比同组的剩余部分的耐Cbl性高约10倍（图5B和表4）。
表4、在白血病细胞系组中的LC50值汇总
细胞系 Cbl LC50 MPP-Cbl LC50
M2 311±24μM 7.5±1μM
K562 306±26μM 8.7±0.4μM
LY17 55±7μM 8.3±1μM
HL60 34±6μM 6.8±0.6μM
U937 34±5μM 5.9±0.7μM
AML2 28±3μM 6.4±0.4μM
DAUDI 27±7μM 9.8±0.8μM
已知许多癌细胞类型通过改变凋亡前或抗凋亡因子的水平来提高凋亡诱导的阈值（threshold），从而导致化学治疗耐受性。为了确定耐Cbl细胞是否通常是耐凋亡的，我们测试了这些系对于凋亡诱导剂星状孢子素的敏感性。有趣地，这两种耐Cbl细胞系显示了降低的凋亡诱导率（图5C）。因为抗凋亡因子的过表达是耐凋亡的一种机制19，20，我们研究了抗凋亡蛋白BclXL的表达水平。之前已显示BclXL在某些癌症中是过表达的，并且认为其抗凋亡活性造成耐药性21。实际上，在这两种耐Cbl系中，我们观察到了远高于敏感系的BclXL水平（图5C，图6）。这表明BclXL的过表达以及因而发生的凋亡抑制可以成为耐Cbl性的基础。当在该组中测试MPP-Cbl的活性时，在测试的所有系中都观察到了增强（图5A）。此外，Cbl和MPP结合物对细胞死亡的机制似乎相似，其中通过流式细胞术可以清楚早期凋亡的细胞（插图5A和5B）。MPP-Cbl结合物在这些耐凋亡细胞系中仍然显示高水平的细胞毒性的事实说明，将毒性药物递送至线粒体为克服癌细胞通常采用的抗药作用的机制提供了有效方法。
癌细胞中耐药性的另一种主要形式是由于促进药效团化学失活的酶或其他因子的过表达。对于Cbl，通过谷胱甘肽改性的失活是耐药性的常见机制。将谷胱甘肽三肽加入Cbl中（由谷胱甘肽-S-转移酶（GST）催化的反应），不仅导致Cbl失活22，其也促进通过识别谷胱甘肽改性的异生物质的泵从细胞中的流出23。为了分析MPP-Cbl是否能够避免由这种类型的化学失活引起的耐药性，我们测试了该结合物在已知过表达细胞质GST-μ亚型的耐Cbl性的卵巢癌细胞系中的活性24。使用膜联蛋白-V凋亡测定法，我们观察到Cbl能够在野生型细胞系中而不能在耐Cbl系中引起细胞死亡，毒性是可不显著的（甚至在100μΜ下）（图5D）。有趣地，MPP-Cbl能够在低得多的浓度（9μΜ）下引起细胞死亡，该值可与野生型和耐性系两者比较。通过细胞活力测定法也证实了该发现（图7）。MPP结合至Cbl似乎限制了通过细胞质GST-μ的改性和失活。野生型和耐Cbl系之间可比较的活性支持以下观点：将药物靶向以及固定（sequester）至线粒体也能够避免耐药性的化学机制。
我们已证明了靶向癌细胞的线粒体以对抗耐药性的优点，并且示出了Cbl的线粒体递送致使效力的显著增加。重要地，即使MPP将Cbl引导至新的靶点--线粒体基因组，由于CLL细胞和健康细胞之间膜电势的差别，也保持了治疗窗。这些研究也示出了Cbl的线粒体区室化（compartmentalization）能够通过生物化学机制（干扰凋亡途径）和化学机制（药物失活）来避免耐药性。由于许多耐药性机制涉及定位在质膜以及细胞质内的因子（例如，流出泵和失活的酶），因此药物固定至线粒体中用作避免多种耐药性机制的方法。因此，线粒体递送作为目前临床上使用的“再利用”FDA批准药物的方法，似乎是为用于开发新型抗癌剂的值得进行的策略。
虽然在本文中已描述了本发明的优选实施方式，本领域技术人员应当理解的是，在没有偏离本发明的精神或随附权利要求的范围的情况下，可以对其做出改变。在本文中公开的所有参考文献通过引用整体结合在此。
参考文献
1.Muratovska，A.，Lightowlers，R.N.，Taylor，R.W.，Wilce,J.A.&Murphy，M.P.AdvDrugDelivRev49，189-98(2001).
2.Taylor，R.C.，Cullen，S.P.&Martin，S.J.NatRevMolCellBiol9,231-41(2008).
3.Hanahan，D.&Weinberg，R.A.Cell100，57-70(2000).
4.Horton，K.L.,Stewart,K.M.，Fonseca，S.B.，Guo，Q.&Kelley，S.O.ChemBiol15，375-82(2008).
5.Yousif,L.F.，Stewart，K.M.，Horton，K.L.&Kelley，S.O.Chembiochem10，2081-8(2009).
6.Begleiter，A.，Mowat，M.，Israels，L.G.&Johnston，J.B.LeukLymphoma23，187-201(1996).
7.Carreon，J.R.，Stewart,K.M.,.Mahon，K.P.,.Jr.，Shin，S.&Kelley，S.O.BioorgMedChemLett17，5182-5(2007).
8.Santos，J.H.,Hunakova，L.，Chen，Y.，Bortner，C.&VanHouten，B.JBiolChem278，1728-34(2003).
9.Myrberg，H.，Zhang，L.，Mae，M.&Langel，U.BioconugChem19，70-5(2008).
10.Preston，T.J.，Abadi，A.，Wilson，L.&Singh，G.AdvDrugDelivRev49，45-61(2001).
11.Allen，J.A.&Coombs，M.M.Nature287，244-5(1980).
12.Singh，G.&Maniccia-Bozzo，E.CancerChemotherPharmacol26，97-100(1990).
13.Davis,S.，Weiss，M.J.,Wong，J.R.，Lampidis,T.J.&Chen，L.B.JBiolChem260，13844-50(1985).
14.Modica-Napolitano，J.S.&Aprille，J.R.AdvDrugDelivRev49，63-70(2001).
15.Modica-Napolitano，J.S.&Aprille，J.R.CancerRes47，4361-5(1987).
16.Modica-Napolitano，J.S.etal.CancerRes56，544-50(1996).
17.Petrini，M.etal.BrJHaematol85，409-10(1993).
18.Pepper，C.,Thomas，A.,Hoy，T.&Bentley，P.BrJHaemato104,581-8(1999).
19.Reed，J.C.Oncogene17，3225-36(1998).
20.Lowe，S.W.&Lin，A.W.Carcinogenesis21，485-95(2000).
21.Minn,A.J.,Rudin，C.M.,Boise，L.H.&Thompson，C.B.Blood86，1903-10(1995)
22.Yang，W.Z.，Begleiter，A.，Johnston，J.B.，Israels，L.G.&Mowat，M.R.MolPharmacol41，625-30(1992).
23.Bamouin，K.etal.BrJCancer77,201-9(1998).
24.Horton，J.K.etal.BiochemPharmacol58，693-702(1999).
25.Horton，K.L.;Kelley,S.O.J.Med.Chem.52，3293-3299(2009).
26.Horton，K.L.；Stewart，K.M.；Fonseca，S.B.；Guo，Q.；Kelley，S.O.Chem.Biol.15，375-382(2008)
27.Carreon，J.R.；Stewart，K.M.；Mahon，K.P.,Jr.；Shin，S.；Kelley,S.O.Bioorg.Med.Chem.Lett.17,5182-5185(2007).
28.Cullis，P.M.；Green，R.E.；Malone，M.E.J.Chem.Soc.PerkinTrans.2，1503-1511(1995).
29.Frezza，C.；Cipolat，S.；andScorrano，L.Nat.Protoc.2,287-295(2007).
30.Sunters，A.；Springer，C.J.；Bagshawe，K.D.；Souhami，R.L.；andHartley，J.A.Biochem.Pharmacol.59-64(1992).
31.Santos，J.H.，Meyer，J.N.,Mandavili,，B.S.，andVanHouten，B.MethodsMol.Biol.，183-199(2006).
32.Smith，M.L.，andFomace，A.J.,Jr.Mutat.Res.340，109-124(1996).
33，Fan，W.，Richter,G.，Cereseto，A.，Beadling，C.，andSmith，K.A.Oncogene18，6573-6582(1999).
34.Lu，B.，Yu，H.，Chow，C.,Li，B.，Zheng，W.，Davis,R.J.，andFlavell，R.A.Immunity14，583-590(2001)，
35.Lakshmipathy，U.，andCampbell，C.Mol.Cell.Biol.19，3869-3876(1999).

Claims (16)

1.一种包含连接至抗癌化合物的由SEQIDNO.7组成的线粒体穿透肽(MPP)的化合物，其中所述抗癌化合物选自由以下组成的组：DNA嵌入剂、烷化剂、转录抑制剂、DNA酶抑制剂或DNA合成抑制剂。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述抗癌化合物是DNA嵌入剂异喹啉生物碱、吖啶、蒽环类或呋喃并香豆素。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述抗癌化合物是DNA嵌入剂黄连素、原黄素、道诺霉素、阿霉素、沙利度胺、补骨脂素或溴化乙锭。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述抗癌化合物是烷化剂氮芥、亚硝基脲、硫芥或铂化合物。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中所述抗癌化合物是烷化剂美法仑、苯达莫司汀、卡莫司汀、二2-氯乙基硫醚、硫半芥、顺铂、赛特铂、丝裂霉素、达卡巴嗪、苯丁酸氮芥、米托唑胺或替莫唑胺。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中所述转录抑制剂是多肽抗生素。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中所述转录抑制剂是放线菌素D。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中所述DNA酶抑制剂是拓扑异构酶抑制剂。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中所述DNA酶抑制剂是依托泊苷、米托蒽醌、安吖啶、替尼泊苷或依列替康。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中所述DNA合成抑制剂是DNA类似物。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中所述DNA合成抑制剂是氟达拉滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁、克拉屈滨或氟尿苷。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的化合物，其中所述抗癌化合物连接至所述MPP的C端。
13.根据权利要求1所述的化合物，是连接至苯丁酸氮芥的SEQIDNO.7。
14.一种药物组合物，包含权利要求1-13中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
16.一种由SEQIDNO:7组成的肽。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103275071B (zh) * 2013-05-17 2015-04-15 山西大学 一种香豆素衍生物及其制备方法和用途
CA2916492A1 (en) * 2013-06-27 2014-12-31 Stealth Biotherapeutics Corp Peptide therapeutics and methods for using same
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IL271845B2 (en) 2017-07-13 2024-06-01 Michael David Forrest Therapeutic modulators of the reverse mode of atp synthase
KR102248110B1 (ko) * 2018-10-02 2021-05-06 고려대학교 산학협력단 IF1 (ATPase inhibitory factor 1)을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물
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CN112336864A (zh) * 2019-08-08 2021-02-09 厦门大学 原黄素在肺癌治疗中的应用
WO2022157548A1 (en) 2021-01-24 2022-07-28 Forrest Michael David Inhibitors of atp synthase - cosmetic and therapeutic uses
US12304639B2 (en) 2023-08-29 2025-05-20 B/E Aerospace, Inc. Contiguous passenger seat rows configured to form a bed

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007108749A1 (en) * 2006-03-20 2007-09-27 Cepep Iii Ab Chimeric constructs between cancer-homing peptides and cell-penetrating peptides coupled to anticancer drugs and/or diagnostic agent/agents
WO2009036092A2 (en) * 2007-09-10 2009-03-19 University Of Massachusetts Mitochondria-targeted anti-tumor agents

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007108749A1 (en) * 2006-03-20 2007-09-27 Cepep Iii Ab Chimeric constructs between cancer-homing peptides and cell-penetrating peptides coupled to anticancer drugs and/or diagnostic agent/agents
WO2009036092A2 (en) * 2007-09-10 2009-03-19 University Of Massachusetts Mitochondria-targeted anti-tumor agents

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mitochondria-Penetrating Peptides;Kristin L. Horton等;《Chemistry & Biology》;20080430;图1、图3、表1 *

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