CN103091341B - 实体肿瘤细胞放射敏感性检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种实体肿瘤细胞放射敏感性检测方法：取受检肿瘤样品组织，制备成单细胞悬液；取体外悬浮培养的淋巴瘤细胞作为外参对照；分别将受检肿瘤样品和作为外参对照的淋巴瘤细胞的单细胞悬液分为照射组和空白对照组，照射组的单细胞悬液均采用5Gy剂量X射线单次照射，空白对照组的单细胞悬液均不进行放射线照射；将各组单细胞悬液进行细胞裂解及漂洗；经裂解后的各组细胞进行电泳；对电泳后的各组细胞进行PI染色；在荧光显微镜下，对受检肿瘤样品的照射组和空白对照组细胞分别进行肿瘤/正常细胞分类采图，同时对外参对照细胞进行采图；对受检肿瘤样品细胞中的肿瘤细胞、正常细胞和外参对照细胞的图像进行数据处理，判断受检肿瘤样品细胞的放射敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测实体肿瘤的细胞放射敏感性的方法。
背景技术
实体肿瘤细胞的放射敏感性检测是研究预测实体肿瘤细胞放射反应性的基础，其前提条件是需先行建立灵敏、稳定、可操作性强的实体肿瘤细胞放射敏感性检测方法。为此，国外几个主要放射生物研究中心多年来相继开展了预测肿瘤放射敏感性的研究，并陆续推出了一些有潜在价值的检测方法，如SF2（2Gy照射后的细胞存活分数）、Tpot（潜在倍增时间）、微核率、原代细胞克隆形成分析及细胞黏着分析等。由于这些实验方法操作复杂，稳定性、成功率较低，至今多停留在体外培养细胞水平无法真正用于实体肿瘤活检组织细胞放射敏感性检测。
发明人经过多年的实践摸索，结合实际对“彗星（Comet）”分析法（Ostling于1984年首先推出的检测外周血及体外培养细胞DNA链断裂的实验方法）不断进行改良研究，终于研发和建立了可用于实体肿瘤活检组织样品细胞放射敏感性检测的方法。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种可用于实体肿瘤组织样品的细胞放射敏感性检测的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种实体肿瘤细胞放射敏感性检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）取受检肿瘤样品组织，制备成单细胞悬液；
（2）取体外悬浮培养的淋巴瘤细胞作为外参对照；分别将受检肿瘤样品和作为外参对照的淋巴瘤细胞的单细胞悬液分为照射组和空白对照组，照射组的单细胞悬液均采用5Gy剂量X射线单次照射，空白对照组的单细胞悬液均不进行放射线照射；
（3）将各组单细胞悬液进行细胞裂解及漂洗；
（4）经裂解后的各组细胞进行电泳；
（5）对电泳后的各组细胞进行PI染色；
（6）在荧光显微镜下，对受检肿瘤样品的照射组和空白对照组细胞分别进行肿瘤/正常细胞分类采图，同时对外参对照细胞进行采图；
（7）对受检肿瘤样品细胞中的肿瘤细胞、正常细胞和外参对照细胞的图像进行测量和数据处理，判断受检肿瘤样品细胞的放射敏感性。
如上所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述单细胞悬液的制备方法可采用机械研磨法或消化液消化法。
如上所述的检测方法，优选地，步骤（3）中所述细胞裂解及漂洗的操作为：将空白对照组照射组的细胞悬液分别与1%低溶点琼脂糖混合后铺在预冷的载玻片上制成琼脂糖胶板；将各胶板在裂解液中裂解50-60分钟，之后漂洗3次。
如上所述的检测方法，优选地，取浓度为2-5×104个/mL的细胞悬液0.25mL与1%低溶点琼脂糖0.75mL混合。
如上所述的检测方法，优选地，所述裂解液的组成为：1mol/L氯化钠和0.003mol/L十二烷基肌氨酸钠的混合溶液，pH12.8-13.0。
如上所述的检测方法，优选地，步骤（4）中所述电泳的操作为：细胞裂解及漂洗后，将所述胶板置于电泳液中进行电泳20分钟；所述电泳液的成分为：2mmol/L的EDTA和0.03mol/L的NaOH的混合溶液。
如上所述的检测方法，优选地，步骤（5）中所述PI染色的时间为20分钟，染色时PI染液的终浓度为3.7μmol/L。
如上所述的检测方法，优选地，步骤（6）中所述肿瘤/正常细胞分类采图的操作为：在荧光显微镜下观察琼脂糖胶板内的受检肿瘤样品细胞，从胶板的左上角起、以之字形顺序、根据细胞核DNA含量对肿瘤细胞和正常细胞进行分类采图，其中肿瘤细胞的DNA含量较正常细胞为大，对肿瘤细胞和正常细胞分别采集100幅以上的细胞图像。
如上所述的检测方法，优选地，步骤（7）中所述对图像的数据处理的操作为：对图像进行细胞彗星尾力矩的测量，受检肿瘤样品细胞的放射敏感度等于95%受检肿瘤样品细胞与外参对照细胞的彗星尾力矩差值之比；
所述彗星尾力矩，是指细胞图像上彗星尾部的长度与尾部DNA百分数的乘积；
所述彗星尾力矩差值，是指照射组细胞的彗星尾力矩值与自身空白对照细胞的彗星尾力矩值的差值；
所述的95%受检肿瘤样品细胞，是将占细胞总数5%的坏死细胞的尾力矩值不纳入分析，坏死细胞的尾力矩值体现为极端数值，将之去除以排除干扰。
如上所述的检测方法，其中，所述的实体肿瘤组织是指肿瘤鳞癌组织、肿瘤腺癌组织或肿瘤未分化癌组织。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种用于实体肿瘤活检组织样品细胞放射敏感性检测的方法。在“彗星”分析法的改进上，本发明方法首先设计并规范了检测过程中系统误差的校正指标和方法；首先设计并建立了对肿瘤样品中混合存在的肿瘤细胞和正常组织细胞进行分别分析放射敏感性的检测方法；并且提供了与本发明方法相适应的实体肿瘤样品放射敏感性检测报告的阅读方法。
利用本发明方法，可在转化研究（translationalRes）中，通过定量分析实体肿瘤组织样品细胞的DNA损伤效应，评估实体肿瘤组织细胞的放射敏感性，以得到体外培养细胞检测难以实现的更接近在体肿瘤细胞实际放射反应性的分析结果。通过比较不同实体肿瘤细胞的放射敏感性差异可以阐释各种作用因素（物理/化学/生物）对实体肿瘤放射敏感性的影响及机制，以加深对临床肿瘤个体间放射敏感性差异的理解。
附图说明
图1为鼻咽癌样品的细胞放射敏感性的分析报告图例之一，其中图1A（A1-A8）是作为外参对照的体外培养的淋巴瘤细胞的分析报告，图1B（B1-B8）是受测样品经分类采图后的正常细胞的分析报告，图1C（C1-C8）是受测样品经分类采图后的肿瘤细胞的分析报告。
图2为鼻咽癌样品的细胞放射敏感性的分析报告图例之二，其中图2A（A1-A8）是受测样品经分类采图后的正常细胞的分析报告，图2B（B1-B8）是受测样品经分类采图后的肿瘤细胞的分析报告，图2C（C1-C8）是作为外参对照的体外培养的淋巴瘤细胞的分析报告。
图3为鼻咽癌样品的细胞放射敏感性的分析报告图例之三，其中图3A（A1-A8）是受测样品经分类采图后的正常细胞的分析报告，图3B（B1-B8）是受测样品经分类采图后的肿瘤细胞的分析报告，图3C（C1-C8）是作为外参对照的体外培养的淋巴瘤细胞的分析报告。
具体实施方式
本发明提供了一种实体肿瘤细胞放射敏感性检测方法，其主要原理及功效在于：
首先，在现有肿瘤细胞放射敏感性检测的实验操作中，实验条件及试剂、仪器设备的稳定与否是构成系统误差的主要原因，因此在本发明检测方法中，我们设计了以体外培养的淋巴瘤细胞作为外参对照，以外参对照细胞照射与不照射细胞的尾力矩（TailMoment，TM）差值作为基准指标，以进行实验系统误差的校正（包括试剂、仪器和实验条件等存在的误差）和肿瘤样品细胞放射敏感性分析的阳性参照。数百例的肿瘤样品检测实践证明，这是确保在肿瘤样品细胞放射敏感性检测中降低系统误差对检测结果判断干扰及正确判断受检样品细胞放射敏感性差异的关键因素，这在国内外均未有先例。
其次，已知实体肿瘤是异质性非常明显的细胞群体，即正常细胞及不同分化程度的肿瘤细胞交织混合存在。细胞群的细胞异质性对正确判断实体肿瘤放射敏感性具有重要影响。因此，要分析检测肿瘤样品中不同性质和类型的细胞的放射敏感性，首先应对受检细胞群的异质性细胞加以区分，才能实现合理地体现异质性肿瘤细胞群不同细胞的放射敏感性差异，进而恰当分析和预测实体肿瘤的放射敏感性。
第三，病理形态学观察显示，受检肿瘤样品中主要包含两类细胞：一类是正常细胞（包括弥散分布的小淋巴细胞及纤维细胞），另一类是不同分化程度的肿瘤细胞。其中，各个肿瘤细胞的细胞核虽大小不一，但均明显大于正常的淋巴/纤维细胞，荧光染色后DNA含量也明显大于淋巴/纤维细胞（细胞核的大小与DNA含量正相关）。因此，在本发明检测方法中，我们设计了根据受检细胞荧光染色后荧光强度的大小（体现出细胞核的DNA含量），在荧光显微镜下对肿瘤/正常细胞进行分类采图的操作步骤，以使“彗星”分析结果能合理地体现异质性肿瘤细胞群体不同细胞的放射敏感性。
本发明的具体步骤为：
（1）取受检肿瘤样品组织，制备单细胞悬液；单细胞悬液的制备方法可采用现有技术中的机械研磨法或消化液消化法。
（2）取体外悬浮培养的淋巴瘤细胞作为外参对照；分别将受检肿瘤样品和作为外参对照的淋巴瘤细胞的单细胞悬液分为照射组和空白对照组，照射组的单细胞悬液均采用5Gy剂量X射线单次照射，空白对照组的单细胞悬液均不进行放射线照射；
（3）将各组的细胞悬液与1%低溶点琼脂糖（Agarose,TypeVII，SIGMA）混合后铺在预冷的载玻片上制成琼脂糖胶板；优选地，分别取浓度约为2-5×104个/mL细胞悬液0.25mL与1%低溶点琼脂糖0.75mL，混匀。
（4）将制成的各组胶板在裂解液中裂解50-60分钟，之后漂洗3次；优选地，所述裂解液的组成为1mol/L氯化钠和0.003mol/L十二烷基肌氨酸钠的混合溶液，pH12.8-13.0。
（5）经裂解并漂洗后，各组细胞进行电泳20分钟；优选地，电泳液的成分为2mmol/L的EDTA和0.03mol/L的NaOH的混合溶液。
（6）电泳后的各组细胞进行PI（PropidiumIodide，碘化丙啶）染色20分钟；优选地，PI染液的终浓度为3.7μmol/L。
（7）在荧光显微镜（BX51，Olympus；100W汞灯，620nm通滤片）下，对受检肿瘤样品的照射组和空白对照组细胞分别进行肿瘤/正常细胞分类采图：观察琼脂糖胶板内的细胞，从胶板的左上角起以“之”字形顺序、根据细胞核DNA含量对肿瘤细胞（大细胞）和正常细胞（小细胞）进行分类采图，每类各采集100幅左右细胞图像。
（8）对受检肿瘤样品细胞中的肿瘤细胞、正常细胞和外参对照细胞的图像进行细胞彗星尾力矩（TM）的分析测量，统计数据并绘制受照射细胞及空白对照细胞的DNA含量及TM分布的散点图和直方图。每例受检肿瘤样品的细胞放射敏感性分析都包含淋巴瘤细胞外参对照的“彗星”分析结果、正常细胞（淋巴/纤维细胞）的“彗星”分析结果及肿瘤细胞的“彗星”分析结果。
在DNA含量分布图上，横坐标为由细胞图像上的灰值强度量化衡量的DNA含量数值，具体来说：细胞图像中DNA表现为一定灰度值的像素点，这些灰度区域呈现出连续或发散的状态，通过图像处理算法，把这些符合一定灰度阈值的像素点分割出来，并通过闭运算，将分散的孤立区域连续起来。计算这些连续区域的面积作为DNA含量数值。在分辨率一定的情况下，同一系统下采集的各个细胞图象所计算出来的灰值强度完全可以反映出不同照射剂量下的细胞DNA含量的变化。图中的横坐标是代表DNA含量的灰度区域面积值，纵坐标是同一照射剂量下相同DNA含量的细胞个数。
（9）以“放射敏感度”作为评价受检样品的细胞放射敏感性的指标，放射敏感度=95%受检肿瘤样品细胞与外参对照淋巴瘤细胞的TM差值之比，放射敏感度值越大说明受检样品细胞对放射线照射越敏感。所述TM差值是指5Gy剂量照射后的照射组细胞的TM值与自身0照射的空白对照细胞的TM值的差值。
实施例1
图1为鼻咽癌样品的细胞放射敏感性的分析报告图例。图1A1-A8是作为外参对照的体外培养的淋巴瘤细胞的分析报告，用以进行系统误差的校正及放射敏感性评估的阳性参照。由图1A1至图1A8，依次为0照射下细胞DNA含量分布的直方图和散点图、5Gy照射后细胞DNA含量分布的直方图和散点图、0照射下细胞尾力矩（TM）分布的直方图和散点图以及5Gy照射后细胞尾力矩分布的直方图和散点图。如图所示，在本实验条件下，淋巴瘤细胞的DNA含量多分布在35-40道右侧。且由TM分布图可见，5Gy照射组的TM值明显大于0照射对照组的TM值（在显微镜下体现为，5Gy照射组的细胞核多有“彗尾”形成，而0照射对照组的细胞核多呈圆形），说明其对放射敏感。
图1B1-B8是某受测鼻咽癌样品经分类采图后的正常细胞的分析报告，由图1B1至图1B8，各图的实验条件和统计内容与由A1-A8一致，下文中的图1C1-C8，以及图2A1-A8、B1-B8、C1-C8和图3A1-A8、B1-B8和C1-C8各图也均按此顺序排列，不再赘述。如图所示，正常细胞的DNA含量主要在20-25道左侧。
图C1-C8是同一受测鼻咽癌样品经分类采图后的肿瘤细胞的分析报告，其DNA含量多在35-40道右侧。
实施例2
图2为某鼻咽癌样品经细胞放射敏感性检测后，表现为典型高放射敏感度（放射敏感型）的分析报告图例。其分析结果表现出，经5Gy照射后肿瘤样品组织内的大多数细胞（包括正常/肿瘤细胞）TM值均偏大，乃至大于经5Gy照射后的外参对照细胞（在显微镜下体现为有明显的“彗尾”形成）。图2A1-A8、B1-B8和C1-C8分别为供试样品的正常细胞、肿瘤细胞和外参对照淋巴瘤细胞的分析报告，如图所示，外参对照淋巴瘤细胞的TM差值为21.07，正常细胞的TM差值为23.6，放射敏感度为1.12（23.6/21.07），肿瘤细胞的TM差值为42.36，放射敏感度为2.01（42.36/21.07）。
临床肿瘤实际放射反应性测量结果显示：受检样品的分析结果与临床肿瘤消退率相吻合。50Gy照射后该受检样品供者的临床肿瘤消退率为90%。
实施例3
图3为某鼻咽癌样品经细胞放射敏感性检测后，表现为典型低放射敏感度（放射不敏感型）的分析报告图例。其分析结果表现出，经5Gy照射后肿瘤样品组织内的正常细胞（淋巴、纤维细胞）和肿瘤细胞的TM值均远小于经5Gy照射后的外参对照细胞（在显微镜下体现为无明显的“彗尾”形成）。图3A1-A8、B1-B8和C1-C8分别为供试正常细胞、肿瘤细胞和外参对照淋巴瘤细胞的分析报告，如图所示，外参对照淋巴瘤细胞的TM差值为73.24，正常细胞的TM差值为1.13，放射敏感度为0.02（1.13/73.24），肿瘤细胞的TM差值为13.03，敏感度为0.18（13.03/73.24）。
临床肿瘤实际放射反应性测量结果显示：受检样品的分析结果与临床肿瘤消退率相吻合。50Gy照射后该受检样品供者的临床肿瘤消退率为28%。
Claims (9)
1.一种实体肿瘤细胞放射敏感性检测分析方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取受检肿瘤样品组织，制备成单细胞悬液；
(2)取体外悬浮培养的淋巴瘤细胞作为外参对照以及受检样品肿瘤细胞放射敏感性的阳性参照；分别将受检肿瘤样品的单细胞悬液和作为外参对照的淋巴瘤细胞的单细胞悬液分为照射组和空白对照组，照射组的单细胞悬液均采用5Gy剂量X射线单次照射，空白对照组的单细胞悬液均不进行放射线照射；
(3)将各组单细胞悬液进行细胞裂解及漂洗；
(4)经裂解后的各组细胞进行电泳；
(5)对电泳后的各组细胞进行PI染色；
(6)在荧光显微镜下，对受检肿瘤样品的照射组和空白对照组细胞分别进行肿瘤/正常细胞分类采图，同时对外参对照细胞进行采图；
(7)对受检肿瘤样品细胞中的肿瘤细胞、正常细胞和外参对照细胞的图像进行测量和数据处理，判断受检肿瘤样品细胞的放射敏感性；
其中，步骤(7)中所述对图像的数据处理的操作为：对图像进行细胞彗星尾力矩的测量，受检肿瘤样品细胞的放射敏感度等于95％受检肿瘤样品细胞与外参对照细胞的彗星尾力矩差值之比；所述彗星尾力矩差值为照射组细胞的彗星尾力矩值与自身空白对照细胞的彗星尾力矩值的差值。
2.如权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，步骤(1)中所述单细胞悬液的制备方法采用机械研磨法或消化液消化法。
3.如权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，步骤(3)中所述细胞裂解及漂洗的操作为：将空白对照组和照射组的细胞悬液与1％低溶点琼脂糖混合后铺在预冷的载玻片上制成琼脂糖胶板；将胶板在裂解液中裂解50-60分钟，之后漂洗3次。
4.如权利要求3所述的检测分析方法，其特征在于，取浓度为2-5×104个/mL的细胞悬液0.25mL与1％低溶点琼脂糖0.75mL混合。
5.如权利要求3所述的检测分析方法，其特征在于，所述裂解液的组成为：1mol/L氯化钠和0.003mol/L十二烷基肌氨酸钠的混合溶液，pH12.8-13.0。
6.如权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，步骤(4)中所述电泳的操作为：细胞裂解及漂洗后，将琼脂糖胶板置于电泳液中进行电泳20分钟；所述电泳液的成分为：2mmol/L的EDTA和0.03mol/L的NaOH的混合溶液。
7.如权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，步骤(5)中所述PI染色的时间为20分钟，染色时PI染液的终浓度为3.7μmol/L。
8.如权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，步骤(6)中所述肿瘤/正常细胞分类采图的操作为：在荧光显微镜下观察琼脂糖胶板内的受检肿瘤样品细胞，从胶板的左上角起、以之字形顺序、根据细胞核DNA含量对肿瘤细胞和正常细胞进行分类采图，其中肿瘤细胞的DNA含量较正常细胞为大，对肿瘤细胞和正常细胞分别采集100幅以上的细胞图像。
9.如权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，所述的实体肿瘤组织是指肿瘤鳞癌组织、肿瘤腺癌组织或肿瘤未分化癌组织。
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