CN103054841A

CN103054841A - 一种t0901317在制备治疗或预防丙型肝炎药物中的应用

Info

Publication number: CN103054841A
Application number: CN2011103167440A
Authority: CN
Inventors: 陈绪林; 曾晶; 廖庆姣; 吴阳
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2031-10-18
Also published as: CN103054841B

Abstract

本发明公开了一种T0901317（N-（2，2，2-三氟乙基）-N-［4-［2，2，2-三氟-1-羟基-1-（三氟甲基）乙基］苯基］-苯磺酰胺）在制备治疗或预防丙型肝炎病毒药物中的应用。选用无毒性浓度的药物进行抗病毒实验，通过检测T0901317对病毒基因复制的影响，显示了这种小分子化合物具有显著的抗病毒活性并呈剂量依赖相关。接着用T0901317处理不同基因亚型的丙型肝炎假病毒系统,结果显示该化合物抑制了病毒生活周期史早期的病毒进入环节。还检测了T0901317与其它抗丙型肝炎病毒药物联合用药的抗病毒能力，能抑制1a，1b，2a基因型型病毒进入，具有广谱的抗病毒活性且靶点新颖，临床上尚未有以进入为靶点的抗丙肝病毒的药物。和其他抗丙型肝炎病毒药物联合用药有良好的效果。

Description

一种T0901317在制备治疗或预防丙型肝炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及属于医药技术领域，更具体涉及一种小分子化合物T0901317(N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺)制备治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)药物中的应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)发现于1989年，它是引起输血后非甲非乙型肝炎的主要病原体。目前全球约有1.7亿人感染HCV。HCV感染呈世界性分布，感染率约有3％，其中每年新增病例300～400万。我国血清流行病学调查资料显示，一般人群HCV阳性率为3.2％。HCV的主要传播途径包括输血或血制品的传播、静脉吸毒传播、性接触和母婴传播等。HCV感染极易导致慢性化，只有20％左右的HCV感染者可自愈，而大约80％的急性感染者会发展成为慢性感染，其中20％的慢性感染者会在其后的5到10年终发展为肝硬化，甚至肝癌。HCV除了会影响肝脏之外，还会引起其他组织和器官的病变。例如：混合型冷凝球蛋白血症，非何杰金氏淋巴瘤和膜性增生性肾丝球肾炎。

丙型肝炎病毒在分类学上属于黄病毒科(Flaviviridae)的肝病毒属(Hepacivirinae)，为有包膜的单股正链RNA病毒，基因组全长9.4～9.6Kb，由5′端非翻译区(5′nontranslated region，5′NTR)、一个长的开放阅读框(openreading frame，ORF)、3′端非翻译区(3′nontrnaslated region，3′NTR)组成。HCV的ORF编码一个约3010-3040个氨基酸的多聚蛋白前体，在宿主细胞蛋白酶和病毒自身编码的蛋白酶作用下，被切割后产生至少10种蛋白产物。分别为病毒的结构蛋白C、E1、E2、P7，主要构成HCV的衣壳和包膜；病毒的非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B，在病毒蛋白的加工成熟和基因组复制中起关键作用。此外，在Core编码区发现一个移码阅读框，其编码的蛋白称为F蛋白，目前对其功能尚不清。第十一届国际HCV及其相关病毒专题讨论会(2004年)在之前基础上制定并通过了一个统一的HCV分类标准。根据此标准，HCV被分为6个主要的基因型(1、2、3、4、5、6)和若干个基因亚型。HCV的基因型分布存在比较显著地域性差异：在美国和西欧的主要是1a和1b型，中东地区的埃及主要为4型，南非主要是5型，中非主要是1型和4型，东南亚主要是3型和6型。而在我国HCV 1b和2a基因型较为常见，其中以1b型为主。

HCV整个生活周期都在细胞质中完成，包括以下几个主要步骤：(1)吸附及侵入：病毒表面蛋白和细胞受体结合，决定病毒粒子的嗜性和宿主特异性。HCV目前只能感染人和黑猩猩。人的肝细胞是主要的被感染细胞，其他被报道可感染的还有B淋巴细胞，树突状细胞等。吸附及侵入的过程通过HCV包膜蛋白E1、E2与HCV的受体分子结合来完成，这些陆续发现的受体包括：CD81、低密度脂蛋白受体(LDLR)、清道夫受体SR-BI、Claudin-1、occludin等，可能还存在其它新的受体。(2)病毒基因组释放：HCV病毒粒子由网格蛋白介导内吞进入细胞，在低pH值诱导下，释放出核衣壳和基因组。(3)HCV多聚蛋白合成和加工：HCV的正链基因组在5′NTR核糖体进入位点(IRES)介导下被翻译形成一个大的多聚蛋白，多聚蛋白前体被病毒和宿主蛋白酶切割后产生结构蛋白和非结构蛋白。(4)病毒基因组的复制：HCV首先以正链RNA为模板合成负链，再以负链为模板合成正链。研究表明HCV复制发生在ER(内质网)上的膜网结构中。(5)病毒粒子的组装：病毒核衣壳的组装通常包括衣壳蛋白的多聚化和核衣壳对基因组RNA的包装过程，最近研究表明HCV病毒粒子的组装可能是在细胞内的脂滴周围完成。(6)病毒粒子的成熟和释放：HCV病毒粒子可能在内质网上出芽，然后通过高尔基体将成熟病毒粒子释放到细胞膜外。

现阶段抗-HCV的治疗方法主要局限于聚乙二醇偶联的长效α干扰素(peg-IFN)和病毒唑(Ribavirin)的结合疗法。该疗法对HCV的治愈率只有40％(1型HCV感染者)～80％(2型HCV感染者)，且疗程长，价格昂贵，副作用明显。当然，随着针对HCV研究的不断深入，许多以HCV蛋白为靶点的药物不断涌现。Telaprevir与Boceprevir同属于直接抗病毒药物中蛋白酶抑制剂(PI)，随着这两个直接抗病毒药物Telaprevir以及Boceprevir在2011年的陆续上市，丙型肝炎的标准治疗方案将有重大的改进。但是目前尚无有效疫苗预防HCV感染。因此，HCV感染仍然是目前危害全球人口健康的一个重要公共卫生问题。

T0901317的中文名是N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺；为人工合成的小分子化合物。目前没有T0901317在抗丙型肝炎病毒方面的应用。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，是在于提供了一种小分子化合物T0901317在制备治疗或预防丙型肝炎病毒药物中的应用，从而为临床上丙型肝炎的治疗提供一种安全高效毒副作用小的小分子化合物。T0901317在无毒性范围内能够有效地抑制丙型肝炎病毒的进入，可进一步开发为治疗或预防丙型肝炎病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。

为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案是：

一种化合物在制备或预防丙型肝炎病毒药物中的应用，该化合物T0901317的中文名是N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺，具有结构式I所示的结构式：

结构式I

一种T0901317在制备治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)药物中的应用，其步骤是：

A.T0901317对Huh7.5.1的细胞毒性实验：Huh7.5.1细胞按8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，分别用0nM、100nM、500nM、1000nM的T0901317进行处理，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时后，以3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(噻唑蓝，MTT)法检测细胞的存活率。结果显示，T0901317对Huh7.5.1的CC₅₀(半数致死浓度)为18.1μM。

B.T0901317抗丙型肝炎病毒活性的评价：(1)质粒PJFH1-Luc-5AGFP的构建：在PJFH1上进行质粒改造，选取NS5A编码区C端一个酶切位点XhoI(nt7523～nt7528，aa419～aa420)插入EGFP基因。为使hRLuc基因插入到JFH1基因组的5′NTR与core基因之间，在5′NTR后添加了51nt的HCV core基因编码序列ΔC，使重组病毒的5’端IRES功能完整；紧接着通过一个口蹄疫病毒2A蛋白自切割短肽(foot-and-mouth disease virus 2A，FMDV 2A)融合在hRLuc基因的C端。(2)病毒JFH1和JFH1-Luc-5AGFP的制备：以XbaI线性化后的质粒pJFH1、PJFH1-Luc-5AGFP为模板，体外转录得到病毒基因组RNA，然后电转Huh-7.5.1细胞。9～10天后，将出现明显细胞病变，于是收集培养基上清，分装后-80℃冻存。为了得到大量的病毒储存液，以0.02的感染复数用病毒感染Huh7.5.1细胞，待出现明显细胞病变后，收集感染性上清，储存待用。(3)将Huh7.5.1细胞按4×10⁴个/孔接种于24孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。用DMEM培养基将T0901317稀释成0nM、100nM、500nM、1000nM 4个浓度，每组2个重复。将不同剂量药物加入到培养皿中12h后，按0.2的感染复数加入JFH1-Luc-5AGFP病毒，感染后72h进行GFP荧光信号检测。然后通过观察NS5A-GFP荧光强度变化原位检测病毒NS5A基因表达来研究药物抗病毒活性；(4)将Huh7.5.1细胞按4×10⁴细胞/孔接种于24孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。用DMEM培养基将T0901317稀释成0nM、100nM、500nM、1000nM 4个浓度，每组3个重复。将不同剂量药物加入到培养皿中12h后，按0.2的感染复数加入JFH1-Luc-5AGFP病毒，感染后72h后进行荧光素酶检测，然后通过检测荧光素酶活性来研究药物抗病毒活性；(5)将Huh7.5.1细胞按2×10⁵细胞/孔接种于6孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。用DMEM培养基将T0901317稀释成0nM、100nM、500nM、1000nM 4个浓度。将不同剂量药物加入到培养皿中12h后，按0.2的感染复数加入野生型JFH1病毒，收取细胞样品，通过免疫印迹的方法检测HCV非结构蛋白NS3表达来研究药物抗病毒活性。结果显示，T0901317的EC₅₀(半数有效浓度)为78.64nM，治疗指数(TI，TI＝CC₅₀/EC₅₀)约为230。实验结果说明T0901317有很好的抗病毒活性。

C.T0901317对丙型肝炎假病毒(HCVpp)进入影响的研究：将4×10⁴的Huh7.5.1细胞接种到24孔板，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。用培养基将T0901317稀释成0nM、100nM、500nM、1000nM 4个浓度，每组三个重复。处理后的Huh7.5.1细胞分别感染VSVpp和HCVpp1a、1b型病毒，72h后用Luciferase Assay System试剂盒(promega，E1501)检测荧光素酶活性，通过检测荧光素酶的活性研究这两种药物特异性对HCV进入的影响。结果显示，T0901317能有效的抑制HCVpp的进入，而且呈剂量依赖效应。

D.T0901317与其它具有抗HCV活性的药物的联合用药研究：将Huh7.5.1细胞按8×10³个/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。将环孢霉素A(CsA)或MK-70092倍梯度稀释，加入到孔板中，作为单独用药的对照组，每组3个重复；另外再在每个稀释浓度中分别加入500nM的T0901317作为联合用药的试验组，每组三个重复。加药后即加入JFH1-Luc-5AGFP病毒，72h后，裂解细胞，通过检测荧光素酶活性来研究T0901317与其它药物联合用药的效果。结果说明T0901317能够有效的用于非α干扰素依赖的联合用药治疗。

利用现代常用药物制剂手段，可将T0901317可以作成活性成分制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂等任何一种药学上可接受的剂型。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.T0901317是小分子化合物，其CC₅₀是18.1μM。T0901317剂量依赖地抑制丙型肝炎病毒感染，其EC₅₀是78.64nM，治疗指数约为230。这说明T0901317是低毒高选择性的抗HCV的药物。

2.能抑制1a，1b，2a基因型型病毒进入，具有广谱的抗病毒活性且靶点新颖，临床上尚未有以进入为靶点的抗丙肝病毒的药物。

3.和其他抗丙型肝炎病毒药物联合用药有良好的效果。可以结合现有的抗丙型肝炎病毒治疗药物进行联合治疗，将丙型肝炎的治愈率提高到80％以上。

附图说明

图1为一种T0901317的化学结构式。

图2为一种T0901317对Huh7.5.1的细胞毒性检测示意图。

图3为用一种T0901317处理被带有双报告基因的病毒JFH1-Luc-5AGFP感染的Huh7.5.1细胞示意图。

通过观察NS5A-GFP荧光强度变化原位检测病毒NS5A基因表达来研究药物抗病毒活性。

图4为用一种T0901317处理被带有双报告基因的病毒JFH1-Luc-5AGFP感染的Huh7.5.1细胞示意图。

通过检测荧光素酶活性来研究药物抗病毒活性。

图5为用一种T0901317处理被野生型病毒JFH1感染的Huh7.5.1细胞示意图。

通过免疫印迹的方法检测HCV非结构蛋白NS3表达来研究药物抗病毒活性。

图6为用一种T0901317处理分别被HCV假病毒系统(HCVpp)和VSV假病毒系统(VSVpp)感染的Huh7.5.1细胞示意图。

通过检测荧光素酶的活性研究这两种药物特异性对HCV进入的影响。

图7为检测一种T0901317与其他药物联合用药的效果示意图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。

细胞培养模型是最常用的筛选模型，其优点在于：可提供大量遗传性状相同的细胞为研究对象，操作方便，可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物的有效浓度和治疗指数，为后期机理研究提供更多基础。在1989年鉴定出HCV之后的很多年里，HCV细胞培养系统的进展十分缓慢。原因主要有两方面：一方面是HCV基因组分子克隆中的困难；另一方面的困难是支持HCV感染和复制的细胞系缺乏。经过20多年的发展，目前，主要有三种HCV细胞培养系统：HCV感染性克隆系统(infectious HCV cell culture system)、HCV假病毒系统(HCV pseudoparticle system)和HCV复制子系统(HCV replicon system)。本发明采用了以上三个系统，分别验证了T0901317对HCV感染、进入和RNA复制的影响。

实施例1：T0901317抗丙型肝炎病毒活性的评价

1.实验材料

1.1细胞、质粒、病毒和药物

Huh7.5.1细胞由Dr.F.V.Chisari惠赠；含有HCV 2a型JFH1病毒株基因组全序列的质粒pJFH1由Dr.Takaji Wakita教授惠赠；质粒pEGFP-N1购自Clontech公司；质粒pGL4.70[hRLuc]购自promega公司。带有双报告基因的病毒JFH1-Luc-5AGFP由本实验室制备；T0901317购自sigma公司。

1.2试剂

DMEM培养基购自GIBCO公司；Renilla荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；抗HCV NS3小鼠单克隆抗体，购自河南省生物工程技术研究中心；抗GAPDH小鼠单克隆抗体购自北京中山金桥公司；HRP标记的羊抗小鼠二抗购自Thermo公司；限制性内切酶购自NEB公司。

1.3实验仪器

蔡司高级倒置显微镜Axio observer A1(Carl Zeiss)；化学发光检测仪为Alpha Innotech公司FluorChem HD2系统；

检测仪为promega公司产品；Mini-PROTEAN垂直蛋白电泳设备购自BioRad公司；VE-186转移电泳槽购自上海天能科技有限公司。

2.实验方法与结果

2.1药物细胞毒性检测

37℃，5％CO2加湿培养箱中培养。使用含有10％FBS、100U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞至90％汇合度后传代，传代比例1/4-1/6。Huh7.5.1细胞按8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用培养基将药物以10mM为起始浓度进行梯度稀释，每梯度3个复孔。培养72h后于每孔中加入5mg/ml MTT 20μl，置细胞培养箱中继续培养；培养4h后，弃培养液上清，每孔加入100μl/孔三联溶解液(溶解液由SDS 10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml，用双蒸水溶解配成100ml)，37℃培养箱中溶解过夜后酶联检测仪检测570nm波长处吸光值，校正波长为630nm，并计算各药物浓度细胞存活率。

结果显示(图2)：T0901317的CC₅₀为18.1μM，说明有比较安全的适用范围。2.2质粒PJFH1-Luc-5AGFP的构建和病毒JFH1和JFH1-Luc-5AGFP的制备；

在PJFH1上进行质粒改造，选取NS5A编码区C端一个酶切位点XhoI(nt7523～nt7528，aa419～aa420)插入EGFP基因(扩增自PEGFP-N1质粒)。为使hRLuc基因(扩增自pGL4.70[hRLuc]质粒)插入到JFH1基因组的5′NTR与core基因之间，在5′NTR后添加了51nt的HCV core基因编码序列ΔC，使重组病毒的5’端IRES功能完整；紧接着通过一个口蹄疫病毒2A蛋白自切割短肽(foot-and-mouth disease virus 2A，FMDV 2A)融合在hRLuc基因的C端，使其与HCV Core蛋白分离。质粒构建成功后，测序鉴定。以XbaI线性化后的质粒pJFH1、PJFH1-Luc-5AGFP为模板，体外转录得到病毒基因组RNA，然后电转Huh-7.5.1细胞。9～10天后，将出现明显细胞病变，于是收集培养基上清，分装后-80℃冻存。为了得到大量的病毒储存液，以0.02的感染复数用病毒感染Huh7.5.1细胞，待出现明显细胞病变后，收集感染性上清，储存待用。

2.3观察GFP阳性率来原位检测T0901317抗病毒株JFH1-Luc-5AGFP活性；

带有双报告基因的病毒JFH1-Luc-5AGFP在HCV非结构蛋白NS5A C末端带有GFP荧光标签，可以用荧光显微镜在活细胞中实时观察HCV在细胞中的感染和复制情况。将Huh7.5.1细胞按4×10⁴个/孔接种于24孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。用DMEM培养基将T0901317稀释成0nM、100nM、500nM、1000nM 4个浓度，每组2个重复。用DMEM培养基将T0901317稀释成不同剂量加入到培养皿中，12h后，按0.2的感染复数加入JFH1-Luc-5AGFP，感染后72h进行GFP荧光信号检测。为了将GFP荧光信号与细胞数进行校准和观察NS5A-GFP在细胞内的亚定位，申请人用DAPI进行细胞核染色实验。首先弃培养液上清，用固定液将细胞在室温固定30min；再用PBS(pH7.4)洗3次，每次5min；接着加入结合液稀释的DAPI染液室温孵育30min；最后用PBS(pH7.4)洗3次，每次5min；然后在普通倒置荧光显微镜下观察荧光信号。荧光显微镜下拍摄的GFP阳性细胞照片是从多个不同视野的照片中选取的具有代表性的一组。

结果显示(图3)：只用DMSO进行处理而未加药物的对照组中，有明显的GFP荧光信号，通过DAPI染色定量细胞数，分析每个视野内表达GPF的阳性细胞平均约为40～50％；与对照相比，药物处理后，GFP阳性细胞比率明显下降，且呈一定的剂量依赖效应。当用100nM的T0901317处理时，GFP阳性细胞比率减少为15％左右。当药物浓度增加到1μM时，两种药物处理后的GFP阳性细胞率更是下降到5％不到。实验结果说明T0901317有很好的抗病毒活性。

2.4通过检测荧光素酶活性来验证T0901317抗病毒株JFH1-Luc-5AGFP活性。

荧光素酶(Luciferase)报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测荧光素酶活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。申请人实验室制备的JFH1-Luc-5AGFP病毒株中带有Luciferase报告基因，因此可以很灵敏的定量药物对病毒基因表达的影响。将Huh7.5.1细胞按4×10⁴细胞/孔接种于24孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。用培养基将T0901317稀释成0nM、100nM、500nM、1000nM 4个浓度，每组3个重复。将不同剂量药物加入到培养皿中12h后，按0.2的感染复数加入JFH1-Luc-5AGFP病毒，感染后72h进行荧光素酶检测，待测细胞用PBS洗2遍，然后用Renilla荧光素酶检测试剂盒说明书的方法加入裂解液使细胞充分裂解，然后将裂解液加入稀释好的底物中，在荧光素酶检测仪上进行检测。结果以相对荧光单位数值(relative light units，RLU)显示。实验数据表示为三次独立实验的平均值，误差以标准差表示。

结果显示(图4)：将只有DMSO处理而未加药物的阳性对照组的平均荧光值设定为100％，T0901317处理后荧光素酶活性相对值随着药物剂量的增加而明显降低。经SPSS软件分析：T0901317的EC50为224nM。根据其相应的CC₅₀值，计算得到其治疗指数(SI)为175。

2.5通过免疫印迹来验证T0901317抗病毒株JFH1活性。

将Huh7.5.1细胞按2×10⁵细胞/孔接种于6孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。用DMEM培养基将T0901317稀释成0nM、100nM、500nM、1000nM 4个浓度。将不同剂量药物加入到培养皿中12h后，按0.2的感染复数加入JFH1病毒，感染后72h后收细胞进行免疫印迹检测。将细胞用PBS润洗1次后，再用1ml/孔的PBS将细胞吹打收集到EP管中，用含蛋白酶抑制剂的裂解液进行裂解后，按比例加入上样缓冲液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使蛋白分子按照分子量大小分开排列。接着通过电转的方法将蛋白分子转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5％(质量：体积)的脱脂牛奶进行封闭后，加入一抗4℃过夜结合。用TBST润洗3次，每次5min，洗脱非特异性结合，再加入相应二抗结合，TBST润洗3次后，进行底物显色检测。

结果显示(图5)：与仅加DMSO处理的对照组相比，T0901317处理后HCV非结构蛋白NS3的表达量明显减少，且呈剂量依赖效应。另外细胞看家基因GAPDH的免疫印迹亮度基本一致，说明上样时保持了较为一致的细胞数量。因此结果表明，T0901317明显抑制了HCV NS3基因的表达，具有显著的抗HCV JFH1病毒活性。

实施例2：T0901317对丙型肝炎假病毒(HCVpp)进入影响的研究

1.实验材料

1.1细胞、病毒和药物

Huh7.5.1细胞；T0901317；质粒PNL4.3-R-E-Luc和含有VSV病毒包膜蛋白的质粒pVpack-VSV-G由美国国立卫生研究院过敏症和传染病研究所艾滋病研究分部惠赠。含有HCV1a、1b包膜蛋白的质粒由戚中田老师惠赠。

1.2试剂

DMEM培养基购自GIBCO公司；转染试剂Lipofectamine2000购自invitrogen公司；Firefly荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。

1.3实验仪器

检测仪为promega公司产品。

2.实验方法与结果

2.1与活病毒相比，HCV假病毒具有相似的细胞感染特点，可用来模拟真病毒感染细胞的早期进入过程，而且假病毒内携带报告基因(EGFP、luciferase等)，可以快速方便地进行各种检测。HCV假病毒是用HCV包膜糖蛋白包装另一种病毒的基因组获得的病毒颗粒。本实验所采用的假病毒是由分别表达HCVE1E2全长基因和含有报告基因的无包膜的HIV-1前病毒基因组(pNL4.3.Luc.R-E-)共转染293T细胞，收集上清后超速离心纯化获得。将4×10⁴的Huh7.5.1细胞接种到24孔板，待细胞贴壁后待用。培养基将T0901317稀释成0nM、100nM、500nM、1000nM 4个浓度，每组三个重复。处理后的Huh7.5.1细胞感染VSVpp和HCVpp1a、1b型病毒，72h后用Luciferase Assay System试剂盒检测荧光素酶活性。

结果显示(图6)：T0901317能有效的抑制HCVpp的进入，而且呈剂量依赖效应，这说明T0901317抗HCV的活性是基于对HCV病毒进入的抑制。99T0901317对VSV假病毒的进入无明显影响，说明其对HCV进入的抑制作用是特异的。而且这两种药物对HCV1a、1b型的假病毒的进入都有抑制作用，说明T0901317作为HCV病毒进入抑制剂是无基因亚型选择性。

实施例3：T0901317与其它具有抗HCV活性的药物的联合用药研究。

1.实验材料

1.1细胞、病毒和药物

Huh7.5.1；病毒JFH1-Luc-5AGFP；T0901317；CsA(购自Sigma公司)和MK-7009(购自赞南公司)。

1.2试剂

DMEM培养基购自GIBCO公司；Renilla荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。

1.3实验仪器

检测仪为promega公司产品。

2.实验方法与结果

2.1将Huh7.5.1细胞细胞按8×10³个/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。将环孢霉素A(CsA)或MK-70092倍梯度稀释，加入到孔板中，作为单独用药的对照组，每组3个重复；另外再在每个稀释浓度中分别加入500nM的T0901317作为联合用药的试验组，每组三个重复。加药后即加入JFH1-Luc-5AGFP病毒，72h后，裂解细胞，通过检测荧光素酶活性来研究T0901317与其它药物联合用药的效果。

结果显示(图7)：环孢霉素A(CsA)通过拮抗HCV宿主因子亲环素蛋白A对RNA复制的促进来抑制HCV的复制；MK-7009是HCV NS3蛋白酶抑制剂，二者单独用药都有较好的抗HCV病毒活性。当与T0901317联合用药，在非常低浓度的CsA或MK-7009时就有非常明显的抗病毒活性。结果说明T0901317能够有效的用于非α干扰素依赖的联合用药治疗。

Claims

1.一种T0901317（N-（2，2，2-三氟乙基）-N-［4-［2，2，2-三氟-1-羟基-1-（三氟甲基）乙基］苯基］-苯磺酰胺）在制备治疗或预防丙型肝炎病毒药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抗丙型肝炎药物是以T0901317（N-（2，2，2-三氟乙基）-N-［4-［2，2，2-三氟-1-羟基-1-（三氟甲基）乙基］苯基］-苯磺酰胺）作为药物活性成分，制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂任何一种药学上可接受的剂型。

3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于本发明的化合物可在联合治疗中与其它具有抗HCV活性的化合物同时给药或分开给药，或通过将各化合物组合成组合物给药。