CN103045481B

CN103045481B - 一种促进小球藻生长并提高其叶绿素和菌体蛋白含量的方法

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Publication number: CN103045481B
Application number: CN201310004747.XA
Authority: CN
Inventors: 陈育如; 孙欢; 赵乙萱; 刘军利; 卫民
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2013-01-08
Filing date: 2013-01-08
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2033-01-08
Also published as: CN103045481A

Abstract

本发明涉及一种快速促进小球藻（Nannochlorisoculata）生长并且提高其叶绿素和单细胞蛋白含量的方法。本发明是在小球藻培养液中添加来自生物质热解的内醚糖或经脱毒处理的纤维素热解液，内醚糖添加量为5mM-50mM，纤维素热解液添加量按重量计为0.25%-2%。以纤维素生物质高温热解产物内醚糖或热解液作为促进剂，结果表明：内醚糖或热解液能明显促进小球藻的生长，促进率最高达194%，并可显著提高叶绿素和菌体蛋白含量，从而可提高纤维素生物质的利用价值。

Description

一种促进小球藻生长并提高其叶绿素和菌体蛋白含量的方法

技术领域

本发明涉及利用廉价纤维素生物质促进小球藻生长及提高叶绿素量和菌体蛋白的方法。

背景技术

小球藻属于绿藻门，是一类普通单细胞藻类，形状呈圆形或椭圆形，种类繁多，在淡水、海水中均有分布，在人工培养基上也能良好生长，是第一种人工培养的微藻（陈颖,李文彬,孙勇如.小球藻生物技术研究应用现状及展望[J].生物工程进展,1998,18(6):12-16）。由于小球藻分布广泛，生长速度快，易于培养，是进行生物技术研究很好的材料。小球藻作为一种添加剂，可以广泛用于食品行业，同时可以利用其生产叶绿素、脯氨酸、油脂（李志勇,郭祀远,李琳．微藻保健食品的开发与利用[J].食品研究与开发.1997,18(2).38-40）。在临床上小球藻已用于多种疾病如高血压、糖尿病、婴儿营养不良、动脉粥样硬化和高胆固醇血症的治疗等（Pinnan Soong.Production and Development of Chlorella and Spirulina in Taiwan.Shelefand Soeder CJ[J].Algae Biomass Production an d Use．Amserdam，1997,103:23-26.）。利用小球藻处理废水，可有效地去除废水中有机物质氮、磷和重金属，并且还可异氧培养，将富含养分的无毒废水进行资源化处理，为废水的资源化处理提供了一条新的高效而经济的途径(胡月薇，邱承光．小球藻处理废水研究进展[J]．环境科学与技术,2003,26(4):48-49)。此外，小球藻还具有抗肿瘤、抗微生物生长及增强免疫力等生理作用。本发明以纤维素生物质高温热解产物内醚糖或热解液作为生长促进剂，可以提高小球藻的产量，为上述各种应用提供更多的原材料。

纤维素类生物质主要指树木、农作物、草类等,广义的生物质还包括城市垃圾和工农业产品的下脚料等（Mckendry P.Energy production from biomass(part1):overview ofbiomass[J].Bioresource Technology,2002,83：37-46）。目前的生物质处理方法主要有酸解、酶解和热化学处理法,其中热化学转化通常又可分为热解、气化和燃烧法,热解技术是热化学处理技术研究的核心和热点，是在完全无氧或氧含量极小因而氧化反应程度极为有限的情况下进行的降解反应(Demirbas A.Biomass resource facilities and biomass conversion processing for fuels andchemicals[J].Energy Conversion&Management,2001,42:1357-1378)(Bridgewater A V.Principles and practice of biomass fast pyrolysis processes for liquids[J].Journal of Analytical andApplied Pyrolysis,1999,51:3-22)。热解技术与稀酸水解法、同步糖同化法相比，原料处理时间短，糖得率高，有望降低生产成本(任普鲜,蒋剑春,杨秀山,刘军利.木质纤维素快速热解产物生产燃料乙醇研究进展[J].生物质化学工程，2009,43(3):47-51)。

现有研究表明，通过控制热解条件可以有效地将纤维素类物质转化成含有高浓度内醚糖(1,6-脱水-βD-吡喃葡萄糖)的热解液,但自然界能利用内醚糖的微生物很少。随着纤维素热解技术研究的深入，内醚糖在微生物培养中的应用引起了人们关注。内醚糖可促进树干毕赤酵母的生长，在YPD培养基中加入0.1%的内醚糖，菌体浓度增加14.3%，乙醇产率提高25.4%(代江红，余志晟，王晓燕，张洪勋.树干毕赤酵母菌对内醚糖的利用，食品与发酵工业[D].北京：中国科学院研究生院，2010)。韩国应用内醚糖对微球藻进行培养，最高促生长量为150%(Luyen H Q,Cho J,Shin H,et al.Microalgal growth enhancement by levoglucosan isolatedfrom the green sea-weed Monostroma nitidum[J].Journal of Applied Phycology，2007,19(2):175-180)。但韩国报道中应用的内醚糖为藻类的提取物。

叶绿素具有排除肠、肝、肾及血管中毒素，净化血液，刺激细胞组织重生等作用，因此以内醚糖和热解液为促进剂，可大幅度增加叶绿素产量。

小球藻是单细胞蛋白(SCP)的重要来源之一。小球藻所含的维生素A、维生素E、硫氨素、核黄素、吡多醇、维生素B12、维生素C、生物素、肌醇、叶酸、泛酸钙、烟酸及叶绿素等增加了其作为SCP的价值。通过以内醚糖和热解液促生小绿球藻，为小球藻单细胞蛋白的高质量生产提供了一条有效途径。

纤维素类生物质原料来源广泛，以纤维素生物质热解液的主要产物-内醚糖和热解液为促进剂，可使纤维素生物质得到更有效的利用。

发明内容

本发明旨在用内醚糖和热解液促进小球藻（Cladophora aegagrophila）快速生长，并提高培养液中菌体叶绿素和菌体蛋白含量。

本发明提供一种促进小球藻生长并提高叶绿素和菌体蛋白含量的方法，是在小球藻培养液中添加来自生物质热解的内醚糖或经脱毒处理的纤维素热解液。内醚糖添加量为5mM-50mM，最适浓度为25mM，纤维素热解液添加量按重量庇计为0.25%-2%，最适浓度为0.5%。

本发明除在培养液中添加内醚糖或热解液外，其他培养条件按常规培养小球藻的要求进行。分别用血球板计数法和光密度法测定小球藻的生物量。

本发明中的内醚糖来自秸秆、木材或竹材纤维素热解液，与从生物中直接提取相比，其来源、生产效率和产量均有巨大的优势，经实验发现热解液和内醚糖对藻类叶绿素和蛋白质含量均有提高的作用。内醚糖为纤维素热解液的主要成分之一，热解液中主要成分为内醚糖（约占38%），但热解液中还含有酚类、醛类等对小球藻有害的物质，所以热解液必须脱毒后才能使用。利用热解液中内醚糖的成分作为促进剂，无须从热解液中提取和纯化内醚糖，热解液中的内醚糖不经提取作为作为液体促进剂使用成本更低。

本发明中所提到的热解液或内醚糖通过常规方法制备，具体方法是将秸秆、竹材、木材等生物质烘干并粉碎，利用管式炉热解反应器（主要由管式炉热解器、电加热器、温控仪、冷凝和真空系统组成）在高温条件下进行热解，收集冷凝得到的组分即为热解液，热解液经脱毒使用，或经常规提取方法得到其中的内醚糖。

本发明中所述的热解液经脱毒是指：将热解液稀释后，加入脱毒剂（5%活性炭脱毒+5%氢氧化钙、5%活性炭、5%沸石等），室温下震荡脱毒2h，过滤后即得到脱毒好的热解液。

附图说明

图1内醚糖浓度对小球藻生长量的影响（培养时间5天）。

图2热解液浓度对小球藻生长量的影响（培养时间5天）。

图3内醚糖浓度对小球藻叶绿素含量的影响（培养时间5天）。

图4-图7内醚糖浓度（0mM，10mM，25mM，50mM）对小球藻促生长的显微摄影照片。

具体实施方式

以下结合具体的实验和数据进一步说明本发明，举例是为了说明本发明的过程，而非仅限于实施例。

叶绿素测定方法：小球藻培养液10mL，10000rpm离心5min，加入2ml DMF（二甲基甲酰胺）4℃避光24h，离心取上清液，测定647nm和664.5nm下吸光度，根据下式计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量：

叶绿素a=[12.7×OD_664.5]-[2.79×OD₆₄₇]

叶绿素b=[20.7×OD₆₄₇]+[4.62×OD_664.5]

总叶绿素Total chl＝17.9×OD₆₄₇+8.08×OD_664.5。

实施例1

50ml藻液中加入10mM内醚糖，另外一份作对照（不加内醚糖），在25℃，4000Lux光照强度的条件下培养5天（每天定时摇匀），用血球板计数法和光密度法检测小球藻的生长量，与空白对照相比，产量增加率为92%，总叶绿素量增加82%，菌体蛋白增加76%.(5mM-50mM浓度的内醚糖对小球藻促生作用见图1所示，对叶绿素含量的影响见图3所示)。

实施例2

50ml藻液中加入25mM内醚糖，另外一份作对照（不加内醚糖），在25℃，4000Lux光照强度的条件下培养5天（每天定时摇匀），用血球板计数法和光密度法检测小球藻的生长量，与对照相比，产量增加194%，总叶绿素含量增加156%，菌体蛋白增加122%。

实施例3

50ml藻液中加入50mM内醚糖，另外一份作对照（不加内醚糖），在25℃，4000Lux光照强度的条件下培养5天（每天定时摇匀），用血球板计数法和光密度法检测小球藻的生长量，与对照相比，产量增加155%，总叶绿素含量增加121%，菌体蛋白增加99%。

实施例4

50ml藻液中加入0.25%热解液(经5%活性炭脱毒+5%氢氧化钙脱毒)，另外一份作对照（不加热解液），在25℃，4000Lux光照强度的条件下培养5天（每天定时摇匀），用血球板计数法和光密度法检测小球藻的生长量，与对照相比，产量增加39%，总叶绿素含量增加32%，菌体蛋白增长29%.（浓度为0.25%-2%的热解液对小球藻促生长作用见图2所示）。

实施例5

50ml藻液中加入0.5%热解液(经5%活性炭脱毒+5%氢氧化钙脱毒)，另外一份作对照（不加热解液），在25℃，4000Lux光照强度的条件下培养5天（每天定时摇匀），用血球板计数法和光密度法检测小球藻的生长量，与对照相比，产量增加98%，总叶绿素含量增加87%，菌体蛋白增加72%。

实施例6

50ml藻液中加入1.25%热解液(经5%活性炭脱毒+5%氢氧化钙脱毒)，另外一份作对照（不加热解液），在25℃，4000Lux光照强度的条件下培养5天（每天定时摇匀），用血球板计数法和光密度法检测小球藻的生长量，与对照相比，产量增加60%，总叶绿素含量增加58%，菌体蛋白增加62%。

实施例7

将实施例5中热解液脱毒方法5%活性炭脱毒+5%氢氧化钙换成5%活性炭脱毒，与对照相比，小球藻产量增加52%，总叶绿素含量增加62%，菌体蛋白增加44%。

实施例8

.将实施例5中热解液脱毒方法5%活性炭脱毒+5%氢氧化钙换成5%沸石脱毒，与对照相比，小球藻产量增加63%，总叶绿素含量增加67%，菌体蛋白增加65%。

实施例9

将实施例5中热解液脱毒方法5%活性炭脱毒+5%氢氧化钙换成5%硅藻土脱毒，与对照相比，小球藻产量增加49%，叶绿素含量增加60%，菌体蛋白增加42%。

Claims

1.一种促进小球藻生长并提高叶绿素和藻体蛋白含量的方法，是在小球藻培养液中添加经脱毒处理的纤维素热解液，纤维素热解液添加量按重量计为0.25％-2％。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述纤维素热解液添加量为0.5％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述纤维素热解液是秸秆、木材或竹材纤维素热解液。