CN103041371A - 脂联素在制备治疗老年缺血性脑卒中药物中的应用 - Google Patents

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缪婕
沈琳辉
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本发明属于医药制备领域，特别涉及脂联素在制备治疗老年缺血性脑卒中药物中的应用，本发明采用缺血/再灌注小鼠模型，通过AAV载体基因治疗，将脂联素分别转染至老年小鼠、成年小鼠脑内，使脂联素在小鼠脑内局部高表达。tMCAO造模，观察脂联素对老年小鼠及成年小鼠脑后缺血后脑萎缩程度、血管新生、神经变化等的影响。结果表面：脂联素对老年小鼠脑缺血后脑萎缩的改善效果比成年小鼠更显著，具有抗缺血的脑保护作用；脂联素对老年小鼠神经学功能的恢复效果明显；脂联素可促进老年小鼠脑缺血区域血管生成；脂联素对促进老年组小鼠脑内动脉增生效果显著；脂联素对老年小鼠脑缺血后神经发生促进作用较成年小鼠更显著。

Description

脂联素在制备治疗老年缺血性脑卒中药物中的应用
技术领域
本发明属于医药制备领域，特别涉及脂联素在制备治疗老年缺血性脑卒中药物中的应用。
背景技术
缺血性脑卒中是严重威胁人类健康的常见病、多发病，具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点。目前缺血性脑卒中已成为西方发达国家仅次于癌症和心血管疾病的第三大主要死因，占全球死因10%；而我国第三次国民死因调查结果显示，脑卒中已上升成为我国第一位死因。每年新发脑卒中约200万人，死于脑卒中约有150万，75%存活者伴有不同程度的残疾。卒中致残和致死的危害给社会和家庭造成沉重的经济和心理负担。尽管脑卒中可发生于各个年龄段，但随着年龄增加脑卒中发病率显著升高。老龄是缺血性脑卒中最重要的危险因素。研究发现，55岁以后，脑卒中发病率以指数方式成倍增长；75-89%脑卒中患者发病在65岁以上，50%患者发生在70岁以上，约25%发生在85岁以上。随着当今社会人口结构老龄化进程的加快，老年缺血性脑卒中发病率将进一步升高，脑卒中已成为老年人致死的重要病因。
脂联素是脂肪组织分泌的一种特异性细胞因子，具有增加胰岛素敏感性、抗炎、抗动脉粥样硬化的特点。脂联素在血循环中浓度较高，通过与脂联素受体（adiponectin receptor）结合发挥生物学作用，脂联素受体存在两种：即AdipoR1、AdipoR2。由于其具有抗糖尿病、抗动脉粥样硬化、抗炎、抑制肿瘤生长等特性，成为国内外学者研究的热点。
衰老可直接影响脂肪因子的分泌，造成脂联素分泌异常。中年以后，脂肪重新分布导致的腹型肥胖可致多种脂肪因子分泌紊乱，脂联素表达下调，瘦素、IL-6、TNF-α及抵抗素等过度生成，造成系统性炎症反应及胰岛素抵抗。老年时期，脂肪代谢障碍和脂肪萎缩引起脂肪因子分泌异常，引发或促进胰岛素抵抗。动物学实验证实，快速老化小鼠（SAP1小鼠）的脂联素水平明显低于对照组小鼠。
临床上对老年人脂联素水平的观察结果并不一致，目前尚未证实脂联素与年龄有显著相关性。脂联素水平与脑卒中严重程度呈负相关，与脑卒中死亡率及致残率密切相关，老年缺血性脑卒中比年轻患者愈后更差，而卒中后脑内脂联素的表达高低是否与愈后相关，目前这方面的研究仍是空白。现有的文献也没有记载脂联素在治疗老年缺血性脑卒中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供脂联素在治疗老年缺血性脑卒中药物中的新用途，为临床上更合理的将脂联素（以下简称APN）用于老年缺血性脑卒中的治疗及治疗的时间靶点提供合理实验数据和科学依据。
本发明涉及脂联素在制备治疗老年缺血性脑卒中药物中的应用。
本实验采用缺血/再灌注小鼠模型，通过AAV载体基因治疗，将脂联素分别转染至老年小鼠、成年小鼠脑内，使脂联素在小鼠脑内局部高表达。tMCAO造模，观察脂联素对老年小鼠及成年小鼠脑后缺血后脑萎缩程度、血管新生、神经变化等的影响；比较老年小鼠、成年小鼠脑缺血的神经功能学改变，而后进一步观察老年小鼠、成年小鼠脑缺血后脂联素的表达时程、表达部位，从而可评估脂联素与老年缺血性脑损伤中的关系，得出脂联素在老年小鼠脑缺血性脑卒中的治疗效果，为临床上合理使用脂联素提供实验数据。
本发明具有以下优点：1、脂联素对老年小鼠脑缺血后脑萎缩的改善效果比成年小鼠更显著，具有抗缺血的脑保护作用；2、脂联素对老年小鼠神经学功能的恢复效果明显；3、脂联素可促进老年、成年小鼠脑缺血区域血管生成，而且脂联素治疗的老年小鼠缺血后血管生成比成年小鼠治疗后更多；4、脂联素对促进老年组小鼠脑内动脉增生效果显著；5、脂联素对老年小鼠、成年小鼠脑缺血后均有促进神经发生的作用，且对老年小鼠脑缺血后神经发生促进作用较成年小鼠更显著，神经发生的促发作用对脂联素改善脑缺血神经功能亦非常关键。
附图说明
图1是AAV-GFP转染后GFP在老年组、成年组小鼠大脑中的表达图。
图2是AAV-APN转染后APN在老年组、成年组小鼠大脑中的表达图。
图3是AAV-APN定位注射后APN蛋白在老年组、成年组小鼠大脑中的表达图。
图4是转染AAV-APN后APN在缺血脑组织中的表达图。
图5是过表达APN减轻老年组、成年组小鼠缺血后脑萎缩的测试图。
图6是老年组、成年组小鼠经APN治疗后脑缺血后mNSS评分图。
图7是老年组、成年组小鼠经APN治疗后平衡木行走时间测试图。
图8是老年组、成年组小鼠经APN治疗后转棒行走时间测试图。
图9是老年组、成年组小鼠经APN治疗后转角实验结果图。
图10是tMCAO手术后2周，老年组、成年组缺血脑组织微血管图。
图11是tMCAO手术后4周，老年组、成年组缺血脑组织微血管图。
图12是tMCAO手术后4周，老年组、成年组缺血脑组织动脉密度图。
图13是tMCAO手术后2周，老年组、成年组SVZ区神经变化图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
实验用的小鼠模型：本次实验中，采用清洁级雄性CD-1成年小鼠30只，年龄10-12周，体重25-30g，清洁级雄性CD-1老年小鼠30只，年龄20-24月，体重45-50g，均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，以上小鼠在人工控制的昼夜节律光环境中饲养，小鼠的饮水与饮食不受任何限制。
实验用的基因载体：携带脂联素（以下简称APN）治疗基因的2型重组腺相关病毒载体rAAV2-APN（以下简称AAV-APN），空白对照载体rAAV2-EGFP（以下简称AAV-GFP），两种载体均购自本元正阳基因技术有限公司，两种载体均含有CMV启动子，病毒滴度均为4.3×1011(vector genomes)/mL。
1、小鼠大脑立体定位载体注射
将小鼠分成AAV-APN转基因老年组、AAV-GFP转基因老年对照组、AAV-APN转基因成年组、AAV-GFP转基因老年对照组共四组。
应用氯胺酮/赛拉嗪（100/10mg/kg）腹腔注射麻醉上述四组小鼠，麻醉成功后固定于脑立体定向仪上。碘伏消毒小鼠头部的皮肤，行头顶部正中手术切口，长约lcm，暴露前囟，于前囟后1mm、旁开中线2mm为定位点，电钻磨开颅骨直到显露硬膜。将lOul微量注射器固定于立体定向仪，在注射定位点上方垂直进针，以微螺旋定量推进器匀速缓慢注射病毒载体，其中向脂联素治疗组注射病毒载体为rAAV2-APN，注射量为5ul(4×109v.g.)，向空白对照组注射病毒载体为rAAV2-GFP，注射量为5ul(4×109v.g.)，注射速率为0.2ul/min。注射完毕待15min后缓慢拔针。骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合皮肤。
接受AAV-APN、AAV-GFP定位注射的各组动物术后均未出现神经功能缺损体征、皮毛正常，进食无异，体重无减轻，未发生动物死亡。证明脑室内注射rAAV2载体对动物的生理状况无明显影响，安全可行。
2、定位注射后各组小鼠接受tMCAO手术：
在大脑立体定位注射载体后7天，四组小鼠行tMCAO术。小鼠称重，将小鼠面罩扣于口鼻部，连接麻醉气体，手术显微镜下做颈部正中切口，暴露胸骨舌骨肌后，钝性分离颌下腺，暴露左侧胸锁乳突肌和二腹肌，先后分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，分别依次结扎，在颈外动脉另栓一根丝线，只打虚结不系紧。剪断颈外动脉远端，将栓线从颈外动脉处逆行插向颈总动脉的分叉处，将栓线转至与颈内动脉平行，轻缓地将栓线小心经颅内段颈内动脉插入至感到轻微阻力，此时栓线头端大致已经通过大脑中动脉开口处到达大脑前动脉处。进线深度约为9±1mm。监测脑血流量的变化，谨慎调节插入栓线深度使血流值下降到20％以下，表明缺血术成功。结扎固定线栓，分层缝合皮肤线栓。
插入栓线1小时后，回抽栓线使其头端回到颈外动脉内，恢复颈内动脉血流，经多普勒脑血流仪测定血流恢复到缺血前基线水平，表明再灌注成功。
3、实验测试结果如下：
（1）、老年组、成年组小鼠脑组织内腺相关病毒介导的基因转染及表达
检测各组小鼠AAV-GFP基因转染后脑内GFP的表达。结果如图1所示（其中，CTX：皮质；BG：基底神经节；CC：胼胝体），AAV-GFP脑内定位注射两周后，老年组及成年组注射部位、注射部位周围区和注射部位远端均有多量GFP信号表达，老年组与成年组间无明显差异，而对侧非注射半球未见GFP表达。
检测各组小鼠AAV-APN转染后注射侧脂联素在脑内的表达。AAV-APN转染7天后小鼠脑内注射侧有多量APN信号表达，检测结果如图2b和图2d所示（Bar=100μm，箭头为脂联素阳性细胞），而非注射侧无表达，具体见图2a和图2c。定量比较老年组、成年组脑内APN表达阳性的细胞数目，未见统计学差异。由此证明，AAV-APN在老年组及成年组小鼠均可实现转染，转染效率无明显差异。
通过Western Blot法观察各组小鼠注射侧脑组织的APN蛋白表达。结果如图3显示（其中，GFP为：AAV-GFP转染；APN为：AAV-APN转染；Y为:成年组；A为：老年组），老年组及成年组AAV-APN基因转导后注射侧APN蛋白表达较GFP对照组显著增加，7天达到高峰，持续维持三周左右；老年组与成年组小鼠转染后脑内APN蛋白表达无明显差异。
采用免疫荧光双染法，以细胞标记物CD31、NeuN、GFAP分别标记血管内皮细胞、神经元细胞、星性胶质细胞，以观察AAV-APN基因转染后脂联素在脑组织各类细胞的定位表达。检测结果如图4所示，从图中可看出，脂联素(见图4d、图4e和图4f)与CD31（见图a）、NeuN（见图b）有大量共表达，与GFAP（见图d）也可共表达（其中，Bar=100μm，箭头处为共表达重叠处）。检测结果说明AAV-APN基因转染后使脑内脂联素表达增加，正常脑组织血管内皮细胞、神经元细胞及星性胶质细胞均有表达，多表达于血管内皮细胞及神经元细胞。
（2）、脂联素减少缺血后脑萎缩
分别测量了APN-老年组、APN-成年组、GFP-老年组、GFP-成年组小鼠在tMCAO后14天时缺血侧大脑半球体积，以检测脂联素对缺血性脑卒中后脑萎缩程度的影响，比较脂联素对老年组、成年组缺血后的治疗作用，焦油紫染色，具体见图5所示：成年组小鼠tMCAO后14天，GFP-成年组小鼠缺血侧大脑有明显萎缩，而APN-成年组缺血半球萎缩程度较轻；老年组小鼠亦得到类似结果，APN-老年组小鼠缺血侧大脑萎缩程度较GFP-老年组明显减轻。结果说明脂联素可减少缺血后脑萎缩。
（3）、脂联素改善缺血后小鼠的长期神经功能
为了评估脂联素对老年组、成年组小鼠缺血后神经功能修复作用，于术前、术后1天、7天、14天和28天分别进行了行为学检测，包括mNSS评分、平衡木行走试验（Beam walk test）、转棒行走试验（Rotor-rod test）以及转角实验（Corner test）。
mNSS评分结果，具体见图6所示，APN-成年组小鼠tMCAO术后14天及28天评分均低于GFP-成年组小鼠；APN-老年组小鼠术后7天、14天、28天mNSS分值均显著低于GFP-老年组小鼠。比较tMCAO术后28天，老年组、成年组经APN治疗后mNSS评分改善程度，检测结果说明APN对老年组改善比成年组更大。
平衡木行走试验结果如图7所示，APN-成年组小鼠tMCAO术后14天及28天平衡木通过时间少于GFP-成年组小鼠；APN-老年组小鼠术后7天、14天、28天均显著低于GFP-老年组小鼠。
转棒行走实验结果见图8所示，术后28天，APN-成年组小鼠行走持续时间高于GFP-成年组；术后14天及28天，APN-老年组小鼠转棒行走持续时间较GFP-成年组明显增加。
转角实验结果见图9所示，术后14天及28天时，APN-成年组、APN-老年组小鼠左侧转角比例分别低于对照成年组、对照老年组。
（4）、脂联素刺激缺血脑组织血管新生
分别于短暂性脑缺血术后2周及4周，对APN-老年组、GFP-老年组、APN-成年组、GFP-成年组小鼠缺血侧脑组织进行血管计数。AAV-APN基因转导小鼠缺血后2周开始出现血管增粗、管径扩大，2-4周发展成新生血管。
tMCAO术后2周，Lectin染色观察脑内缺血周边区血管密度，结果如图10所示：APN-成年组缺血周边区血管密度较GFP-成年组有明显升高（196.0±5.6vs.134.4±4.7，P<0.01）；APN-老年组缺血周边区与GFP-老年组比较，血管密度也明显升高（183.2±6.3vs.103.84±5.0，P<0.01）；tMCAO术后4周，也得到类似的结果，具体见图11，APN-成年组、APN-老年组分别较对照组血管密度升高（成年组：245.2±3.6vs.157.2±7.7，P<0.01;老年组：237.5±8.2vs.135.5±4.7，P<0.01）。计算tMCAO术后APN组与GFP对照组脑缺血周边区血管数差值，比较观察脂联素对老年组、成年组小鼠缺血脑组织血管增生的影响，结果提示APN治疗后老年组小鼠脑缺血区血管增生较成年组更多（2周：79.3±7.5vs.61.6±9.3，P<0.01；4周：102.2±7.5vs.88.1±8，P<0.05）。说明，APN治疗对于老年组的效果更为显著。
应用alpha-smooth muscle actin染色标记动脉，观察脑缺血区动脉血管密度，检测结果如下：
tMCAO术后4周，α-SMA染色观察APN-老年组、GFP-老年组、APN-成年组、GFP-成年组缺血脑周边区动脉血管密度变化，检测结果具体见图12所示，APN-成年组、APN-老年组缺血区动脉血管数较对照组亦明显增高（成年组：16.3±1.9vs.6.0±0.8，P<0.01；老年组：13.5±1.3vs.0.8±0.7，P<0.01）。差值计算发现，APN老年组小鼠脑内动脉增生较成年组更多（12.7±1.6vs.10.3±1.2，P=0.05）。
（5）、脂联素促进缺血脑组织神经发生
脑缺血后大量神经细胞变性坏死，导致缺血性脑卒中致残率高，死亡率高，如何使新生的神经细胞迁移至脑损伤区恢复神经功能是研究的关键。Doublecortin（DCX）是神经元前体细胞标记物，PCNA是细胞新生标记物。在短暂性脑缺血术后2周，观察APN-成年组、GFP-成年组、APN-老年组、GFP-老年组，进行侧脑室室下区（Subventricular zone,SVZ）DCX染色细胞计数。结果显示，APN-成年组SVZ区DCX的表达较GFP-成年组有明显升高；APN-老年组缺血后SVZ区与GFP-老年组比较，DCX表达显著增加，具体见图13所示。计算tMCAO术后APN组与GFP对照组脑SVZ区DCX阳性细胞差值，比较观察脂联素对老年组、成年组小鼠缺血脑组织神经发生作用，结果说明：APN转导的老年组小鼠脑缺血后SVZ区神经发生较成年组更多。
对缺血周围区（peri-infarction）及海马回齿状区（Dentate Gyrus,DG）也进行了上述观察，结果显示APN-成年组在缺血周围区，DCX阳性细胞数量较GFP-成年组有明显升高；APN-老年组缺血周围区与GFP-老年组比较，DCX阳性细胞表达明显升高。在缺血周围区及DG区进行了DCX+/PCNA+共染色细胞计数分析，结果提示APN-成年组、APN-老年组分别较GFP对照组升高，具有统计学差异。同样的，差值比较发现，APN治疗的老年组小鼠脑缺血周围区、DG区神经发生较成年组更显著。

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