CN103003403B - 羟基脂肪酸酯从源油的回收和纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从源油回收、纯化和富集羟基脂肪酸的方法。所述方法包括以下步骤：(a)甲基化所述源油，以在其中形成羟基脂肪酸甲酯和非羟基脂肪酸甲酯；(b)用包含戊烷/己烷和短链醇的有机溶剂混合物将羟基脂肪酸甲酯与非羟基脂肪酸甲酯分离；和(c)从所述有机溶剂混合物分别回收羟基脂肪酸甲酯和非羟基脂肪酸甲酯。可用所述方法回收、纯化和富集的羟基脂肪酸包括蓖麻油酸、12-羟基-顺-9，15-十八碳二烯酸(densipolic acid)、14-羟基-11-二十碳烯酸(lesquerolic acid)和14-羟基-11，17-二十碳二烯酸(auricolic acid)。可将所述非羟基脂肪酸甲酯回收、纯化和进一步加工成生物柴油燃料和/或润滑剂。

Description

羟基脂肪酸酯从源油的回收和纯化
技术领域
本发明涉及从源油回收、纯化和富集羟基脂肪酸的方法。
背景技术
从蓖麻籽(Ricinus communis L.(蓖麻))回收的油由于其羟基脂肪酸(HFA)蓖麻油酸(式1)的高含量(即在80％-90％范围内)，所以在许多工业工艺和/或合成中是重要的原料。
高活性羟基可参与多种化学反应，并得到不同的最终产品如润滑剂、涂料和药品。例如，从蓖麻油回收后，蓖麻油酸可以进一步转化为癸二酸和辛醇。癸二酸可与六亚甲基二异氰酸酯聚合产生尼龙-6，10。辛醇可用于生产增塑剂。蓖麻油酸在羟基基团上发生的脱水产生共轭双键结构。因此，蓖麻油酸可用作半干性油。
不过，蓖麻植物及其籽含有对许多生物体包括哺乳动物、鸟类物种和海洋生物具有剧毒的蓖麻毒素和蓖麻碱。因此，有与蓖麻籽作物收获和加工成油相关的重大安全担忧。
克服使用蓖麻籽和蓖麻油的工作的不利的一个策略是基因修饰其它类型油籽植物以生产蓖麻油酸。不过，已发现，与蓖麻籽相比，此类基因转化植物通常产生非常低水平的蓖麻油酸。因此，需要相当大的努力和花费以从由基因修饰植物生产的源油回收、纯化和富集蓖麻油酸和其它HFA。
可能通过结合低温结晶的方法从雷斯克勒(Lesquerella fendleri和Lesquerella gordonii)油回收羟基脂肪酸14-羟基-11-二十碳烯酸(lesquerolicacid)和14-羟基-11，17-二十碳二烯酸(auricolic acid)。首先将雷斯克勒(Lesquerella)油水解3小时，然后酸化，得到游离脂肪酸(FFA)。然后用己烷萃取FFA，用磷酸盐缓冲液洗涤，并干燥以回收FFA。然后将FFA溶解在己烷中，冷却至-25℃，过夜以使得HFA结晶和分离。最后，过滤、洗涤并干燥HFA。尽管该方法富集羟基廿碳烯酸和14-羟基-11，17-二十碳二烯酸从55-59％至85-99％，收率为94％，但是该过程需要大量的溶剂、长的处理时间以及小心控制的加工温度(即-25℃)。
从源油分离HFA的另一个方法基于盐溶解分级分离。蓖麻油酸的钾盐通过在特定温度下它们在不同溶剂系统中的不同溶解度来从蓖麻油中分离。然而，除了该方法复杂，该方法对于从油酸和亚油酸分离蓖麻油酸是无效的。
其它策略评价基于脂肪酸的尿素分级分离从源油分离和回收HFA。然而，发现该方法对多不饱和脂肪酸(PUFA)而非对HFA的分离和回收是更有用的。
从源油回收HFA的其它方法包括液-液萃取步骤。这些方法基于FFA/FAME的极性及其在双相溶剂系统中的溶解度。不过，这些方法是复杂的，且需要大量的溶剂和长的处理时间。
发明内容
本发明的示例性实施方案涉及从源油回收、纯化和富集羟基脂肪酸的方法。该方法通常包括以下步骤：(a)甲基化源油以形成羟基脂肪酸甲酯和非羟基脂肪酸甲酯的共混物；(b)用包含甲基戊烷/己烷和短链醇的有机溶剂混合物将羟基脂肪酸甲酯与非羟基脂肪酸甲酯分离；和(c)分别回收羟基脂肪酸甲酯和非羟基脂肪酸甲酯。
一些示例性的实施方案涉及回收、纯化和富集羟基脂肪酸的方法，羟基脂肪酸的实例为蓖麻油酸(12-羟基-9-顺式-十八碳烯酸)、12-羟基-顺式-9，15-十八碳二烯酸(densipolic acid)、14-羟基-顺式-11-二十碳烯酸和14-羟基-顺式-11，17-二十碳二烯酸等。
本发明的一些示例性实施方案涉及回收和加工非羟基脂肪酸甲酯为生物柴油燃料和/或润滑剂的方法。
附图说明
结合对以下附图的参考阐述本发明，在附图中：
图1是显示本发明的用于从源油分离和回收羟基脂肪酸的示例性方法的示意性流程图；
图2是显示本发明的用于从源油分离和回收羟基脂肪酸的另一示例性方法的示意性流程图；和
图3是显示用于将非羟基脂肪酸甲酯分离为饱和非羟基脂肪酸甲酯和不饱和非羟基脂肪酸甲酯的示例性方法的示意性流程图。
具体实施方式
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。为充分理解本文描述的发明，本文提供以下的首字母缩写词、术语和定义。
如本文所用，术语“贫化的”指在数量或含量上减少的。
如本文所用，术语“富集的”指在数量或含量上增加的。
如本文所用，术语“选择的”指优先选取，以在所选部分中增加所选的一个或多个物体、一个或多个项目或一个或多个事物的百分比。
如本文所用，FFA指游离脂肪酸。
如本文所用，FAME指脂肪酸甲酯。
如本文所用，HFA指羟基脂肪酸。
如本文所用，HFAME指羟基脂肪酸甲酯。
如本文所用，NHFA指非羟基脂肪酸。
如本文所用，NHFAME指非羟基脂肪酸甲酯。
本发明的示例性实施方案涉及从源油回收HFA的方法。一些方面涉及回收的HFA的纯化。一些方面涉及纯化的HFA的浓缩和/或富集的方法。源油来自含有HFA的植物物质。示例性的植物物质包括种子、坚果、茎、叶、块茎等。植物物质可收获或另外地回收自天然存在的和/或杂交的和/或基因修饰的和/或基因工程化的植物。合适植物的实例为包含HFA的产生高油含量谷物或种子或坚果的那些植物，包括但不限蓖麻子、亚麻荠、豆类(legume)、棕榈植物、雷斯克勒属(Lesquerella sp.)、基因修饰的芸苔属(Brassica sp.)、基因修饰的十字花属(Brassicacea sp.)、基因修饰的亚麻荠、基因修饰的雷斯克勒属、基因修饰的玉米、基因修饰的豆类和基因修饰的棕榈植物。特别合适的是用可操作地连接到启动子的、编码表达一个或多个HFA(即蓖麻油酸和/或12-羟基-顺式-9，15-十八碳二烯酸和/或14-羟基-11-二十碳烯酸和/或14-羟基-11，17-二十碳二烯酸)的基因序列基因工程化的非食品用寄主植物。令人惊奇地，已发现本发明的方法对于从基因工程化的植物的种子或坚果油回收HFAME是有用的，其中源油包含以重量计小于6％的HFAME，然后从源油纯化和浓缩HFAME至约68％w/w及更大。
可通过本发明的方法回收和/或纯化和/或富集的示例性羟基脂肪酸包括蓖麻油酸(12-羟基-9-十八碳二烯酸)、12-羟基-9，15十八碳二烯酸、14-羟基-顺式-11-二十碳烯酸和14-羟基-11，17-二十碳二烯酸等。
本发明的某些示例性实施方案涉及从源油同时或依次回收HFA和NHFA的方法。一些方面涉及分别纯化回收的HFA和NHFA。一些方面涉及分别浓缩和/或富集纯化的HFA和NHFA。合适的源油来自含有HFA和NHFA的植物物质，例如来自由植物产生的种子或坚果的植物物质。植物可以是天然存在的、杂交的、基因修饰的和/或基因工程化的。合适植物的实例为含有HFA的产生高油含量谷物或种子或坚果的那些植物，包括但不限于蓖麻子、亚麻荠、雷斯克勒属、基因修饰的芸苔属、基因修饰的十字花属、基因修饰的亚麻荠、基因修饰的雷斯克勒属、基因修饰的玉米、基因修饰的豆类和基因修饰的棕榈植物。特别合适的是用编码表达蓖麻油酸的基因序列基因工程化的非食品用寄主植物。令人惊奇地，已发现本发明的方法对十从含有以重量计小于6％HFA的种子或坚果物质回收HFA是有用的，然后纯化和富集HFAME至约68％w/w及更大，并同时回收、纯化和富集NHFAME至约90％w/w及更大。
本发明的某些示例性实施方案涉及用于从包含HFA的源油浓缩和/或纯化HFAME的方法(图1和图2)。将所选的源油通过与KOH/甲醇混合物混合来甲基化20，得到FAME。然后将FAME与80％甲醇和非极性溶剂如甲基戊烷/己烷混合。使得到的混合物30分离成含NHFAME上层相和含HFAME下层相。通过将下层相脱溶剂回收HFAME40。用C1-3醇例如80％甲醇洗涤上层NHFAME相50，然后使其分离成第二含NHFAME上层相和第二含HFAME下层相。通过将第二下层相脱溶剂回收另外的HFAME60。用80％甲醇第三次萃取第二NHFAME上层相70，然后使其分离成第三含NHFAME上层相和第三含HFAME下层相。通过将第三下层相脱溶剂回收另外的HFAME80。将从各次萃取回收的HFAME汇集85。富集的HFAME包含蓖麻油酸和/或densipolic aicd和/或14-羟基-11-二十碳烯酸和/或14-羟基-11，17-二十碳二烯酸等。任选地，如果必要，继续洗涤第三含NHFAME上层相90，分离另外的HFAME，该HFAME随后可通过脱溶剂回收100，并与之前通过图2所示的方法回收的HFAME汇集105。
洗涤过的含NHFAME相90，110包含饱和NHFAME和不饱和NHFAME的共混物。如果需要，可将饱和NHFAME和不饱和NHFAME分离，并通过包括与尿素-有机溶剂混合物220络合的方法200从NHFAME相回收，产生饱和的NHFAME富集的固体级分和不饱和的NHFAME富集的液体级分210(图3)。在该方法此步骤中选择使用的溶剂是含或不含水的C1-3醇，溶剂与尿素的重量比为至少约2∶1，优选约3∶1至10∶1，最优选约4∶1至5∶1。尿素应使用尿素与脂肪酸的重量比为至少1∶1，优选重量比为约2∶1至5∶1，最优选约3∶1。小于约1∶1的重量比倾向于导致不完全的脂肪酸络合，而重量比超过约5∶1则增加加工成本而产率或分离效率没有随之增加。
可通过任何公知的固-液分离技术实现富集的饱和脂肪酸-富集的NHFAME固体级分230和不饱和脂肪酸-富集的NHFAME液体级分240从共混物210的分离。合适的方法和系统具体包括但不仅限于倾析、逆流倾析、重力沉降、过滤、压榨、离心及它们的组合。将用过的尿素-溶剂溶液250从不饱和-NHFAME富集的液体级分240回收，之后可将不饱和-NHFAME与新鲜尿素-有机溶剂混合物220混合，以进一步沉淀饱和脂肪酸-富集的固体，然后可从剩余的不饱和NHFAME富集的液体级分260回收饱和脂肪酸-富集的固体。将用过的尿素-溶剂溶液290从不饱和-NHFAME富集的液体级分280回收，之后将不饱和-NHFAME300用酸化至pH约3-4的水310洗涤。分离废水流330后，如果需要，可使用纯化的不饱和NHFAME320以产生耐寒的生物柴油燃料。
提供下面的实施例以更全面地描述本发明，并且提出它们用于非限制性例示的目的。
实施例
实施例1：使用蓖麻油作为源油纯化HFAME
将蓖麻油在100℃下真空干燥30分钟，然后冷却至60℃。将无水KOH(油重量的2％w/w)溶解在于烧杯中的甲醇(油重量的20％w/w)中。一旦油冷却至60℃，将KOH/甲醇混合物加入油中。将混合物在旋转蒸发仪中混合4小时。然后，将混合物转移到分液漏斗中用于相分离。上层包含蓖麻油甲酯。将下层回收，并适当地丢弃。将上层转移到烧杯中，并在氮气下加热至60℃，然后对加热的上层进行皂分析。然后，将Trysil S615加入到加热的上层(每1000ppm皂1％w/w Trysil S615)，然后混合15分钟，之后过滤回收并将蓖麻油甲酯与残余皂分离。然后将含有HFAME和NHFAME的蓖麻油甲酯级分真空干燥，并储存用于后续用作本发明的HFAME纯化方法的示例性实施方案中的起始材料。
如下进行HFAME从蓖麻油甲酯级分的分离和纯化。在分液漏斗中，将10g蓖麻油甲酯与含有200g80％甲醇和50g甲基戊烷/己烷的混合物混合，获得1∶20∶5((w/w/w；甲酯∶80％甲醇∶甲基戊烷/己烷)的比率。将混合物剧烈振摇30秒，然后使其分离成两层。NHFAME分离入上层，而HFAME分离入下层。将各层分离并脱溶剂，得到富集的NHFAME和HFAME级分。将每级分10μL用4ml己烷稀释，并分别通过配备有DB-23柱(0.25mm X 30M，0.25μm厚)和火焰离子化检测器的气相色谱仪(Agilent型号6890N)。蓖麻油、富集的HFAME和NHFAME的脂肪酸组成(FAC)列于表1中。
表1：蓖麻油甲酯、HFAME和NHFAME的脂肪酸组成。
这些数据表明该方法将回收和富集的级分中的HFAME浓度从86.18％增加到99.37％。
实施例2：从由基因工程化大豆植物压榨的油纯化HFAME
用于从大豆油回收、纯化和富集HFA的示例性方法显示在图1中。从基因工程化的大豆植物收获种子，该基因工程化的大豆植物使用pMS737.4载体提供编码非天然HFA的蓖麻子油酸羟化酶(oleate hydroxylase)基因序列。作为引入油酸羟化酶基因序列的结果，基因修饰的大豆植株产生蓖麻油酸(即大豆中的非天然HFA)。将种子压榨以产生包含非天然HFA的大豆油(即HF-豆油)。将HF-豆油在100℃下真空干燥30分钟，然后冷却至60℃。将无水KOH(油重量的2％w/w)溶解在于烧杯中的甲醇(油重量的20％w/w)中。一旦油冷却至60℃，则将KOH/甲醇混合物加入油中。在旋转蒸发仪中将混合物混合4小时。然后，将混合物转移到分液漏斗中用于相分离。上层包含豆油甲酯。将下层回收，并适当地丢弃。将上层转移到烧杯中，并在氮气下加热至60℃，然后对加热的上层进行皂分析。然后，将Trysil S615加入到加热的上层(每1000ppm皂1％w/w Trysil S615)，然后混合15分钟，之后过滤回收并将豆油甲酯与残余皂分离。然后将含有HFAME和NHFAME共混物的豆油甲酯级分真空干燥，并储存随后用作本发明的HFAME纯化方法的示例性实施方案中的起始材料。
将包含HFAME和NHFAME共混物的豆油甲酯分级与80％甲醇和100％己烷/甲基戊烷以1∶5∶5(w/w/w)的比率混合在一起。将该第一混合物在氮气下在环境室温搅拌约1-2小时。然后将所述第一混合物转移到分液漏斗中，并使其静置一段时间，以使发生相分离(称为第一次萃取)。将包含HFAME和甲醇的第一下层相从分液漏斗回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。将包含NHFAME和己烷/甲基戊烷的第一上层相回收，然后与80％甲醇和100％己烷/甲基戊烷以1∶5∶5(w/w/w)的比率混合在一起。将该第二混合物在氮气下在环境室温搅拌约1-2小时。然后将所述第二混合物转移到分液漏斗中，并使其静置一段时间，以使发生相分离(称为第二次萃取)。将包含HFAME和甲醇的第二下层相从分液漏斗回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。将包含NHFAME的第二上层相回收，然后与80％甲醇和100％甲基戊烷/己烷以1∶5∶10(w/w/w)的比率混合在一起。将该第三混合物在氮气下在环境室温搅拌约1-2小时。然后将所述第三混合物转移到分液漏斗中，并使其静置一段时间，以使发生相分离(称为第三次萃取)。将包含HFAME和甲醇的第三下层相从分液漏斗回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。将包含NHFAME的第三上层相回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。脱溶剂的NHFAME适合用于进一步加工以生产耐寒的生物柴油和/或润滑剂。通过用4mL己烷稀释各萃取物的10μL等分试样及然后使其通过配备有DB-23柱(0.25mm X 30M，0.25μm厚)和火焰离子化检测器的气相色谱仪(Agilent型号6890N)来分析和定量来自各萃取物的HFAME和NHFAME的脂肪酸组成。显示HF-豆油、纯化的HFAME和NHFAME级分的脂肪酸组成的数据在表2中列出。
表2：HF-豆油、HFAME和NHFAME级分的脂肪酸组成
*第一次萃取
**第二次萃取
***第三次萃取
数据显示，尽管HF-豆油的总HFAME含量小于6％(w/w)，但是在用甲醇和己烷的溶剂混合物的甲基化HF-豆油脂肪酸的三次洗涤液和萃取物的每种中，在回收和富集的产物中的％HFAME含量超过68％，同时NHFAME总收率为93.42％(w/w)。
实施例3-5：使用模型系统作为源油富集HFAME
可将植物系统遗传工程化以使其能够从C18：1-9产生C18：1-OH。此外，C18：2也可来自C18：1-9。可能这三种脂肪酸的合成和产生是相互关联的，并且在不同类型的植物中可有相当大的不同。此外，C18：1-9和C18：2的极性可能与C18：1-OH相似，从而影响从源油分离和回收C18：1-OH。因此，制备包含C18∶1、C18：2和C18：1-OH的不同混合物(即配方)的模型系统并用于评价用于分离、回收、纯化和富集C18：1-OH的本发明方法的示例性实施方案的功效。
实施例3：
制备脂肪酸甲酯的5种模型混合物以评价不同亚油酸(C18：2)和羟基化油酸(C18：1-OH)水平对用本发明示例性方法分离和纯化C18：1-OH的影响。该模型混合物包括棕榈酸(C16：0)、硬脂酸(C18：0)、油酸(C18：1-9；C18：1-11)、亚油酸(C18：2)、亚麻酸(C18：3)、花生酸(C20：0)、二十碳烯酸(C20：1-11)利蓖麻油酸(C18：1-OH)的甲酯。棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸和二十碳烯酸的甲酯购买自Nu-Chek Prep公司(Elysian，明尼苏达州，美国)。根据实施例1中描述的方法从蓖麻油中分离和回收蓖麻油酸甲酯。通过GC分析测定得到的C18：1-OH HFAME的纯度和浓度。各配方制备20克的量，并储存在冷冻箱中直到需要。制备5种模型混合物即配方1-5用于该研究，如表3所示。对于该研究，各配方的油酸含量是恒定的，而亚油酸和蓖麻油酸的水平是不同的。
表3：
各配方的HFAME和NHFAME组分如下进行分级分离。将约10g模型FAME与80％甲醇和己烷/甲基戊烷以1∶5∶5(w/w/w)的比率在分液漏斗中混合。将混合物剧烈振摇30秒。然后使混合物分离成明显的两层，之后将各相回收和脱溶剂。进行两次分级分离(重复)，每次分级分离用10g样品进行。如之前实施例所述，使用GC分析样品中的脂肪酸组成。使用重量分析法测定HFAME的重量收率，并计算百分比收率。重复进行研究一次，将数据平均并示于表4中。
表4中的数据显示，当C18：1-OH在模型油混合物中以非常低的水平即总FAC的3.82％存在时，则该方法回收和富集包含超过70％的级分(配方1)。由于C18：1-OH浓度从配方1混合物中的3.82％持续增加到配方5混合物中的11.94％，所以在其相应的HFAME级分中C18：1-OH的浓度从70.14％增加至84.75％，从而证明通过该方法从不同源油分离、同收和富集HFA。
实施例4
制备脂肪酸甲酯的5种模型混合物以评价不同油酸(C18：1)和蓖麻油酸(C18：1-OH)水平对用本发明示例性方法分离和纯化羟基脂肪酸的影响。该模型混合物包括棕榈酸(C16：0)、硬脂酸(C18：0)、油酸(C18：1-9；C18：1-11)、亚油酸(C18：2)、亚麻酸(C18：3)、花生酸(C20：0)、二十碳烯酸(C20：1-11)和蓖麻油酸(C18：1-OH)的甲酯。棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸和二十碳烯酸的甲酯购买自Nu-Chek Prep公司(Elysian，明尼苏达州，美国)。根据实施例1中描述的方法从蓖麻油中分离和回收蓖麻油酸甲酯。通过GC分析测定得到的C18：1-OH HFAME的纯度和浓度。各配方制备20克的量，并储存在冷冻箱中直到需要。制备5种模型混合物即配方6-10用于该研究，如表5所示。对于该研究，各配方的亚油酸含量是恒定的，而油酸和蓖麻油酸的水平是不同的。
如实施例3所述，分级分离、富集和分析各配方的HFAME和NHFAME组分。使用重量分析法测定HFAME的重量收率，并计算百分比收率。重复进行研究一次，将数据平均并示于表6中。
表5：
表6中的数据显示，当C18：1-OH在模型油混合物中以非常低的水平即总FAC的3.82％存在时，则该方法回收和富集包含超过70％的级分(配方6)。由于C18：1-OH浓度从配方6混合物中的3.82％持续增加到配方10混合物中的12.63％，因此在其相应的HFAME级分中C18：1-OH的浓度从70.14％增加至79.94％，从而证明通过该方法从不同源油分离、回收和富集HFA。
实施例5
制备脂肪酸甲酯的5种模型混合物以评价不同亚油酸(C18：2)和油酸(C18：1)水平对用本发明示例性方法分离和纯化羟基脂肪酸的影响。该模型混合物包括棕榈酸(C16：0)、硬脂酸(C18：0)、油酸(C18：1-9；C18：1-11)、亚油酸(C18：2)、亚麻酸(C18：3)、花生酸(C20：0)、二十碳烯酸(C20：1-11)和蓖麻油酸(C18：1-OH)的甲酯。棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸和二十碳烯酸的甲酯购买自Nu-Chek Prep公司(Elysian，明尼苏达州，美国)。根据实施例1中描述的方法从蓖麻油中分离和回收蓖麻油酸甲酯。通过GC分析测定得到的C18：1-OH HFAME的纯度和浓度。各配方制备20克的量，并储存在冷冻箱中直到需要。制备5种模型混合物即配方11-15用于该研究，如表7所示。对于该研究，油酸和亚油酸的水平是不同的，而羟基化油酸的水平在五种配方中是恒定的。
如实施例3所述，分级分离、富集和分析各配方的HFAME和NHFAME组分。使用重量分析法测定HFAME的重量收率，并计算百分比收率。重复进行研究一次，将数据平均并示于表8中。
表7：
表8中的数据显示，当C18：1-OH在模型油混合物中以非常低的水平即总FAC的5.36％存在时，则该方法回收和富集包含超过70％的级分(配方11)。增加C18：2浓度和降低C18：1浓度同时保持C18：1-OH浓度恒定导致同收的C18：1-OH的量下降。不过，即使在配方15中，回收和纯化的HFA级分包含超过65％C18：1-OH，从而证明通过该方法从不同源油分离、回收和富集HFA。
实施例6：纯化HFAME的雷斯克勒油
用于从雷斯克勒油回收、纯化和富集HFAME的示例性方法显示在图2中。将雷斯克勒油在100℃下真空干燥30分钟，然后冷却至60℃。将无水KOH(油重量的1-2％w/w)溶解在于烧杯中的甲醇(油重量的20％w/w)中。一旦油冷却至60℃，则将KOH/甲醇混合物加入油中。在旋转蒸发仪中将混合物混合4小时。然后，将混合物转移到分液漏斗中用于相分离。上层包含雷斯克勒油甲酯。将下层回收，并适当地丢弃。将上层转移到烧杯中，并在氮气下加热至60℃，然后对加热的上层进行皂分析。然后，将Trysil300加入到加热的上层(每1000ppm皂1％w/w Trysil300)，然后混合15分钟，之后过滤回收并将雷斯克勒油甲酯与残余皂分离。然后将含有HFAME和NHFAME共混物的雷斯克勒油甲酯级分真空干燥，并储存后续用作本发明的HFAME纯化方法的示例性实施方案中的起始材料。
将包含HFAME和NHFAME共混物的雷斯克勒油甲酯级分与甲醇(80％-90％甲醇和剩余的水)和100％己烷/甲基戊烷以1∶5∶5(w/w/w)的比率混合在一起。将该第一混合物在氮气下在环境室温搅拌约1-2小时。然后将所述第一混合物转移到分液漏斗中，并使其静置一段时间，以使发生相分离(称为第一次萃取)。将包含HFAME和甲醇的第一下层相从分液漏斗回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。将包含NHFAME和己烷/甲基戊烷的第一上层相回收，然后与甲醇(80％-90％甲醇和剩余的水)和100％己烷以1∶5∶5(w/w/w)的比率例混合在一起。将该第二混合物在氮气下在环境室温搅拌约1-2小时。然后将所述第二混合物转移到分液漏斗中，并使其静置一段时间，以使发生相分离(称为第二次萃取)。将包含HFAME和甲醇的第二下层相从分液漏斗回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。将包含NHFAME的第二上层相回收，然后与甲醇(80％-90％甲醇和剩余的水)和100％甲基戊烷/己烷以1∶5∶10(w/w/w)的比率混合在一起。将该第三混合物在氮气下在环境室温搅拌约1-2小时。然后将所述第三混合物转移到分液漏斗中，并使其静置一段时间，以使发生相分离(称为第三次萃取)。将包含HFAME和甲醇的第三下层相从分液漏斗回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。将包含NHFAME的第三上层相回收，然后与甲醇(80％-90％甲醇和剩余的水)和100％甲基戊烷/己烷以1∶5∶10(w/w/w)的比率混合在一起。将该第四混合物在氮气下在环境室温搅拌约1-2小时。将所述第四混合物转移到分液漏斗中，并使其静置一段时间，以使发生相分离(称为第四次萃取)。将包含HFAME和甲醇的第四下层相从分液漏斗回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。将包含NHFAME的第四上层相回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。脱溶剂的NHFAME适合用于进一步加工以生产耐寒生物柴油和/或润滑剂。通过用4mL己烷稀释各萃取物的10μL等分试样及然后使其通过配备有DB-23柱(0.25mm X 30M，0.25μm厚)和火焰离子化检测器的气相色谱仪(Agilent型号6890N)来分析和定量来自各萃取物的HFAME和NHFAME的脂肪酸组成。在表9(使用80％甲醇的分级分离)和表10(使用90％甲醇的分级分离)中列出显示雷斯克勒油、纯化的HFAME和NHFAME级分的脂肪酸组成的数据。
表9：从使用80％甲醇进行分级分离获得的雷斯克勒油、HFAME和NHFAME级分的脂肪酸组成。
a第一次萃取
b第二次萃取
c第三次萃取
d第四次萃取
这些数据表明，当使用80％甲醇进行分级分离时所有四个HFAME级分的总HFAME含量都在94％以上。经过四次连续分级分离，从原始雷斯克勒油中回收36％的HFAME。通过将四个HFAME级分合并，我们能够获得含有95％总HFAME的HFAME级分，收率为22.54％。
表10：从使用90％甲醇进行分级分离获得的雷斯克勒油、HFAME和NHFAME级分的脂肪酸组成。
a第一次萃取
b第二次萃取
c第三次萃取
d第四次萃取
这些数据表明，当使用90％甲醇进行分级分离时所有四个HFAME级分的总HFAME含量都在79％以上。经过四次连续分级分离，从原始雷斯克勒油中回收87.02％的HFAME。通过将四个HFAME级分合并，我们能够以59.86％的收率获得含有86％总HFAME的HFAME级分。
与从80％甲醇分级分离得到的HFAME级分浓度(95％)相比，从90％甲醇分级分离得到的HFAME级分具有较低的HFAME浓度(86％)；不过，从90％甲醇分级分离得到的HFAME级分的收率(59.86％)高于从80％甲醇分级分离得到的HFAME级分的收率(22.54％)。取决于所需的HFAME浓度，可以在分级分离中使用不同的百分比甲醇。
实施例7：从基因工程化的亚麻荠油纯化HFAME
用于从基因工程化的亚麻荠油回收、纯化和富集HFA的示例性方法显示在图1中。将种子压榨产生包含非天然HFA的亚麻荠油(即HF-亚麻荠油)。然后用甲基戊烷/己烷萃取压过的亚麻荠油饼，得到残余油。将压过并溶剂萃取过的油合并，得到粗HF-亚麻荠油。将粗HF-亚麻荠油在100℃下真空干燥30分钟，然后冷却至60℃。将无水KOH(油重量的1-2％w/w)溶解于烧杯中的无水甲醇(油重量的20％w/w)中。一旦油冷却至60℃，则将KOH/甲醇混合物加入油中。在旋转蒸发仪中将混合物混合4小时。然后，将混合物转移到分液漏斗中用于相分离。上层包含亚麻荠油甲酯。将下层回收，并适当地丢弃。将上层转移到烧杯中，并在氮气下加热至60℃，然后对加热的上层进行皂分析。然后，将Trysil300加入到加热的上层(每1000ppm皂1％w/w Trysil300)，然后混合15分钟，之后过滤回收并将亚麻荠油甲酯与残余皂分离。然后将含有HFAME和NHFAME共混物的亚麻荠油甲酯级分在220℃下真空(0.1～0.2mmHg)蒸馏。将蒸馏的亚麻荠甲酯用水洗涤并储存以后续用作本发明的HFAME纯化方法的示例性实施方案中的起始材料。
将包含HFAME和NHFAME共混物的亚麻荠油甲酯级分与甲醇(70％-90％甲醇和剩余的水)和100％己烷/甲基戊烷以1∶5∶5(w/w/w)的比率混合在一起。将该第一混合物在氮气下在环境室温搅拌约1-2小时。然后将所述第一混合物转移到分液漏斗中，并使其静置一段时间，以使发生相分离(称为第一次萃取)。将包含HFAME和甲醇的第一下层相从分液漏斗回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。将包含NHFAME和己烷/甲基戊烷的第一上层相回收，然后与甲醇和100％己烷以1∶5∶5(w/w/w)的比率混合在一起。将该第二混合物在氮气下在环境室温搅拌约1-2小时。然后将所述第二混合物转移到分液漏斗中，并使其静置一段时间，以使发生相分离(称为第二次萃取)。将包含HFAME和甲醇的第二下层相从分液漏斗回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。将包含NHFAME的第二上层相回收，然后与甲醇和100％甲基戊烷/己烷以1∶5∶10(w/w/w)的比率混合在一起。将该第三混合物在氮气下在环境室温搅拌约1-2小时。然后将所述第三混合物转移到分液漏斗中，并使其静置一段时间，以使发生相分离(称为第三次萃取)。将包含HFAME和甲醇的第三下层相从分液漏斗回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。将包含NHFAME的第三上层相回收，然后通过旋转蒸发脱溶剂。脱溶剂的NHFAME适合用于进一步加工以生产耐寒生物柴油和/或润滑剂。通过用4mL己烷稀释各萃取物的10μL等分试样及然后使其通过配备有DB-23柱(0.25mm X 30M，0.25μm厚)和火焰离子化检测器的气相色谱仪(Agilent型号6890N)来分析和定量来自各萃取物的HFAME和NHFAME的脂肪酸组成。表11中列出显示HF-亚麻荠油、纯化的HFAME和NHFAME级分的脂肪酸组成的数据。
表11：80％甲醇分级分离获得的HF-亚麻荠油、蒸馏的亚麻荠甲酯、HFAME和NHFAME级分的脂肪酸组成。
a第一次萃取
b第二次萃取
c第三次萃取
数据显示，三个HFAME级分中每一个的总HFAME含量均从9.18％升高到大于70％。通过将该三个级分合并，以7.1％的收率和75.29％的HFAME浓度获得HFAME级分。
虽然之前已经描述了本发明的具体示例性实施方案，但是应理解，其它实施方案也可能在本发明的范围内，本发明意欲包括这些实施方案。鉴于对本领域技术人员而言明显的众多变化和改变，认为本发明的范围仅由所附的权利要求所限制。

Claims (13)

1.一种用于从源油回收、纯化和富集羟基脂肪酸甲酯的方法，该方法包括：
(a)将所述源油与KOH/甲醇混合物混合，以在其中形成羟基脂肪酸甲酯和非羟基脂肪酸甲酯的混合物；
(b)用由短链醇、甲基戊烷和己烷组成的有机溶剂混合物将所述羟基脂肪酸甲酯与所述非羟基脂肪酸甲酯分离；和
(c)分别回收所述羟基脂肪酸甲酯和所述非羟基脂肪酸甲酯。
2.根据权利要求1的方法，其中所述短链醇是甲醇、乙醇和丙醇中之一。
3.根据权利要求1的方法，其中所述短链醇是甲醇。
4.根据权利要求1的方法，其中用短链醇洗涤所述回收的非羟基脂肪酸甲酯，以从其分离额外的羟基脂肪酸甲酯，并分别回收洗涤过的非羟基脂肪酸甲酯和所述额外的羟基脂肪酸甲酯。
5.根据权利要求4的方法，其中所述短链醇是甲醇、乙醇和丙醇中之一。
6.根据权利要求4的方法，其中所述短链醇是甲醇。
7.根据权利要求1的方法，其中所述羟基脂肪酸是蓖麻油酸、12-羟基-顺式-9,15-十八碳二烯酸、14-羟基-11-二十碳烯酸和14-羟基-11,17-二十碳二烯酸中之一。
8.根据权利要求1的方法，其中所述源油来自植物物质。
9.根据权利要求1的方法，其中所述源油来自蓖麻子植物物质、亚麻荠植物物质、棕榈植物物质、豆类植物物质、雷斯克勒属(Lesquerella sp.)植物物质和芸苔属(Brassica sp.)植物物质中之一。
10.根据权利要求1的方法，其中所述源油来自十字花科(Brassicacea sp.)植物物质。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述植物物质来自基因修饰的植物。
12.根据权利要求1或4的方法，其中将所述非羟基脂肪酸甲酯与尿素-C1-3醇混合物混合，其中所述C1-3醇与所述尿素的重量比的范围为2:1至10:1，并且所述尿素与所述脂肪酸甲酯的重量比范围为1:1至5:1，从而产生(i)与尿素络合的饱和非羟基脂肪酸甲酯和(ii)游离的不饱和非羟基脂肪酸甲酯的混合物，以及分别回收所述与尿素络合的饱和非羟基脂肪酸甲酯和所述游离的不饱和非羟基脂肪酸甲酯。
13.根据权利要求12的方法，其中所述游离的不饱和非羟基脂肪酸甲酯适合用于作为耐寒生物柴油。
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