CN102998472A - 一种用于非均相免疫快速分析的自动化装置及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析化学的生物分析领域，特别涉及一种用于非均相免疫快速分析的装置和方法，装置包括毛细管、试剂管和程控微泵，毛细管、试剂管和程控微泵依次相连成一个通道，程控微泵驱动毛细管和试剂管通道内的所有液体。本发明利用毛细管比表面积大的特性，将其作为非均相免疫反应的载体，大大缩短了免疫分析的孵育时间。极大地简化了分析实施阶段的操作，减少了现场分析的时间，实现了多步非均相免疫分析中液体操纵全过程的自动化。与传统的非均相免疫分析相比，此法在耗时和操作简便性上有明显的改善。

Description

一种用于非均相免疫快速分析的自动化装置及其使用方法

 

技术领域

本发明涉及分析化学的生物分析领域，特别涉及一种用于非均相免疫快速分析的装置和方法。

 

背景技术

免疫分析是利用抗原和抗体间的特异性反应对目标分析物进行检测的分析方法，是检测蛋白质最主要的方法。非均相免疫分析，如酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和荧光免疫分析（Fluorescence immunoassay, FIA），由于分析过程中加入了清洗过程，使得其特异性和灵敏度大大提高，目前已经成为临床及实验医学进行定量免疫分析的主要技术，广泛应用于心脏疾病、流行病、代谢疾病诊断等各领域。但是，当前基于多孔板的常规非均相免疫分析样品周转和免疫孵育时间长，从采集样品到出具结果需要一到数天时间；并且，此法操作涉及样品和多个试剂的量取、加入、反应孵育、清洗等复杂操作，过程繁琐，通常在医院或者医疗站的实验室中由专业操作人员借助精密仪器完成。然而面对急性心肌梗塞等许多突发性疾病以及急性传染病，耗时的实验室检测分析已不能满足其需要。虽然免疫试纸条技术已成为成熟的便携式现场免疫检测，但该法因为只能给出定性或半定量结果而在需要准确定量的应用场合受到很大限制。因此，迫切需要建立一种简单快速、能准确定量的便携式免疫分析系统和方法，以实现免疫分析的现场快速准确定量。

微流控技术已应用于免疫分析系统的研究。但免疫分析涉及样品和多个试剂的量取、加入、反应孵育、清洗等复杂操作，目前报道的能实现非均相免疫全过程集成的自动化微流控分析系统较主要采用集成微泵微阀系统、离心力驱动系统或电润湿磁珠免疫分析系统等。这些非均相免疫快速自动分析方法，虽然已有效解决了以往存在孵育时间长的问题，但芯片加工、过程控制、样品的现场引入等方面仍存在较大问题。尤其是，样品和试剂通常要在同一时间装入芯片，这限制了芯片的准备过程和使用过程的分离，使得其难以在分析现场使用，且上述工作均需借助微加工手段，成本高昂，离实用尚有不少距离。

 

发明内容

本发明旨在针对现有技术的问题作出改进，采用毛细管系统和程控液体驱动技术，为非均相免疫分析提供一种现场快速自动分析的装置和方法。

本发明的具体技术方案如下：

本发明是一种用于非均相免疫分析的快速自动化装置，装置包括毛细管、试剂管和程控微泵，毛细管、试剂管和程控微泵依次相连成一个通道，程控微泵驱动毛细管和试剂管通道内的所有液体。

本发明所述的毛细管是非均相免疫反应的固相载体，通过化学或物理方法在内壁表面固定抗原或者抗体。

本发明所述的毛细管是石英或玻璃或聚苯乙烯透明材料，以便于反应完成后利用光学检测器直接对毛细管进行原位检测，毛细管内径在10微米–5000微米之间。选择小内径的毛细管，有助于提高通道的比表面积，提高反应效率，缩短免疫反应的孵育时间。

本发明所述的试剂管内以水相液段的形式封装非均相免疫反应所需的所有水相试剂，包括免疫反应试剂、荧光标记抗原或抗体、酶标记抗原或抗体、酶催化底物、清洗液；按免疫分析的要求，将所需的不同水相试剂以液段形式顺序装入试剂管，不同的水相液段之间由与水不互溶的油相液段间隔，以防止不同试剂液段在封装、储存、运输、分析驱动等过程中发生相互混合；油相液段是矿物油或烷烃或与水不互溶且生物相容性好的物质；试剂管两端由石蜡或环氧乙烷或橡胶等密封，从而实现多个试剂、清洗液在管内的顺序独立存储，冷藏有利于生化试剂的储存。试剂管内径在0.1毫米—50毫米范围内，其材质是聚四氟乙烯，或聚丙乙烯，或聚苯乙烯，或玻璃，或石英等材料。

本发明所述的程控微泵具有双向液体驱动能力，其泵速、运行时间可调，通过设定泵速和运行时间可确定其抽取或排出的液体体积，其操作过程能完全由程序控制自动完成。

本发明公开了一种用于非均相免疫分析的快速自动化装置的操作方法，所述的操作过程分为两个阶段：阶段一是毛细管和试剂管的准备阶段，即完成抗原或抗体在毛细管内壁上的固定和所需的多个试剂在试剂管内的预封装；阶段二是连接毛细管、试剂管和程控微泵，开启程控微泵，以预设程序全自动实现免疫分析液体操控的全部操作。

本发明所述的在操作过程的第一阶段，进行抗原或抗体在毛细管内壁表面的固定操作，以及免疫分析所需的水相试剂液段和油相间隔液段在试剂管中的预先装载操作。试剂和油相间隔液段的预封装操作可由程序控制注射泵配合多孔板技术自动实现，准备好后冷藏备用。

本发明所述的在操作过程的第二阶段，连接毛细管、试剂管和程控微泵，程控微泵在程序控制下将样品液体定量吸入毛细管内，然后反转泵驱动方向，液流反向，将吸入的样品连同预先封装在试剂管内的一系列试剂液段顺序通过毛细管排出，依次完成非均相免疫分析中的抗原或抗体结合、清洗、标记抗体或抗原结合、清洗、检测反应的全部液体操作。

本发明所述的在操作过程的第二阶段，由程控微泵按事先设定的程序控制各个液体通过毛细管时的流动方向和流速。

本装置的有益效果在于：

     利用毛细管比表面积大的特性，将其作为非均相免疫反应的载体，大大缩短了免疫分析的孵育时间。设计的免疫分析装置和方法将完整的免疫分析过程分为了准备阶段和分析实施两个阶段。把分析过程复杂的多个试剂和清洗液的量取操作提前到准备阶段，并以液段预封装的形式顺序存储在试剂管中，极大地简化了分析实施阶段的操作，减少了现场分析的时间，实现了多步非均相免疫分析中液体操纵全过程的自动化。与传统的非均相免疫分析相比，此法在耗时和操作简便性上有明显的改善。

附图说明

图 1 是根据本发明的一个优选实施例1的免疫分析装置结构示意图；

图 2 是根据本发明的装置用于荧光免疫分析的各分析步骤示意图；

图 3 是本发明的优选实施例1用于荧光免疫分析获得的结果示意图。

图中，1是毛细管，2是试剂管，3是程控微泵，4是羊抗人Anti-IgG抗体，5是IgG抗原，6是油相，7是清洗液a，8是羊抗人Anti-IgG抗体溶液，9是清洗液b，10是人IgG抗原样品溶液，11是荧光标记羊抗人Anti-IgG抗体。

 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明：

图1是根据本发明一个优选实施例的免疫分析装置结构示意图。装置由毛细管1、试剂管2和程控微泵3三部分构成。毛细管1为3 厘米长，内径为75微米的透明石英毛细管，在准备阶段内毛细管内壁预先固定了羊抗人Anti-IgG抗体4。试剂管2由5 cm长，内径250微米的聚四氟乙烯（Polytetrafluoroethene, PTFE）管构成。在准备阶段采用程序控制注射泵配合多孔板依次将2 μL PBS清洗液a7，1 μL浓度为500 μg/mL荧光标记的羊抗人Anti-IgG抗体溶液8，1 μL PBS清洗液b9装入PTFE管内，液段之间用油相（Perfluoro-di-n-butylmethylamine, FC-40）6间隔。程控微泵3是一个具有双向驱动能力的微型蠕动泵，通过控制器可以任意设定驱动方向、驱动速度和运行时间。

图2是本发明的装置用于荧光免疫分析的各分析步骤示意图，右侧为分析过程各步骤试剂液段的位置状态，左侧为各步骤对应的毛细管内免疫反应过程。连接毛细管1、试剂管2与程控微泵3，将毛细管的开放口插入人IgG抗原样品溶液10，开启程控微泵，微泵在程序控制下自动完成以下操作：

（A）控制程序微泵3将1 μL人IgG抗原样品溶液10吸入毛细管1，即以2.0 μL/min的速度抽取人IgG抗原样品溶液10持续0.5 min，样品中的IgG抗原5被预先固定在毛细管1内壁的羊抗人Anti-IgG抗体4捕获；

（B）反转程序微泵3驱动方向，以0.5 μL/min的速度将吸入的人IgG抗原样品溶液10推出毛细管1；

（C）程控微泵3继续以0.5 μL/min的速度驱动液流，将试剂管2内的PBS清洗液a7液段推出，洗去毛细管内未反应的IgG抗原5；

（D）程控微泵3继续以0.5 μL/min的速度驱动液流，将荧光标记羊抗人Anti-IgG抗体11液段推出，通过毛细管1，荧光标记羊抗人Anti-IgG抗体（11）与被捕获的IgG抗原5反应，在毛细管1内壁上形成荧光标记抗体-抗原-抗体复合物；

（E）程控微泵3继续以0.5 μL/min的速度驱动液流，将试剂管内的PBS清洗液b9液段推出，洗去未反应的荧光标记羊抗人Anti-IgG抗体11。

以上从样品引入到免疫反应完成全过程总时间为12 min。最后采用荧光检测器对反应后的毛细管1壁的荧光强度进行测定，样品浓度和荧光强度成正比。     

图3是本发明的优选实施例1用于荧光免疫分析获得的结果示意图，以人IgG为样品，在进样量为100 μL、流速为0.5 μL/min的条件下，考察了此微流控免疫分析系统的分析性能。在0-300 μg/mL浓度范围内，随着IgG浓度的升高，毛细管的荧光信号强度呈逐渐增加趋势，当浓度大于300 μg/mL时，毛细管的荧光强度已无明显变化，说明此时反应已经趋近饱和。IgG浓度在0-10 μg/mL范围内，荧光强度（I）与IgG浓度（C）的对应关系呈现线性，其线性回归方程为：I = 0.19C + 1.73，r² = 0.987。IgG的检出限为0.68 μg/mL（3σ）。连续5次测定浓度为100 μg/mL的人IgG溶液，其精密度（RSD）为2.4%（n = 5）。

Claims (8)

1.一种用于非均相免疫分析的快速自动化装置，所述的装置包括毛细管（1）、试剂管（2）和程控微泵（3），其特征在于，所述的毛细管（1）、试剂管（2）和程控微泵（3）依次相连成一个通道，所述的程控微泵（3）驱动毛细管（1）和试剂管（2）通道内的所有液体。

2.根据权利要求1所述的用于非均相免疫分析的快速自动化装置，其特征在于，所述的毛细管（1）是非均相免疫反应的固相载体，通过化学或物理方法在内壁表面固定抗原或者抗体。

3.根据权利要求2所述的用于非均相免疫分析的快速自动化装置，其特征在于，所述的毛细管（1）是石英或玻璃或聚苯乙烯透明材料，以便于反应完成后利用光学检测器直接对毛细管（1）进行原位检测，所述的毛细管（1）内径在10微米–5000微米之间。

4.根据权利要求1所述的用于非均相免疫分析的快速自动化装置，其特征在于，所述的试剂管（2）内以水相液段的形式封装非均相免疫反应所需的所有水相试剂，包括免疫反应试剂、荧光标记抗原或抗体、酶标记抗原或抗体、酶催化底物、清洗液；按免疫分析的要求，将所需的不同水相试剂以液段形式顺序装入试剂管（2），不同的水相液段之间由与水不互溶的油相液段间隔，以防止不同试剂液段在封装、储存、运输、分析驱动等过程中发生相互混合；油相液段是矿物油或烷烃或与水不互溶且生物相容性好的物质；试剂管（2）两端由石蜡或环氧乙烷或橡胶等密封。

5.根据权利要求1所述的用于非均相免疫分析的快速自动化装置，其特征在于，所述的程控微泵（3）具有双向液体驱动能力，其泵速、运行时间可调，通过设定泵速和运行时间可确定其抽取或排出的液体体积，其操作过程能完全由程序控制自动完成。

6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的用于非均相免疫分析的快速自动化装置的操作方法，其特征是所述的操作过程分为两个阶段：阶段一是毛细管（1）和试剂管（2）的准备阶段，即完成抗原或抗体在毛细管（1）内壁上的固定和所需的多个试剂在试剂管（2）内的预封装；阶段二是连接毛细管（1）、试剂管（2）和程控微泵（3），开启程控微泵（3），以预设程序全自动实现免疫分析液体操控的全部操作。

7.根据权利要求6所述的操作方法，其特征在于，在操作过程的第二阶段，连接所述毛细管（1）、试剂管（2）和程控微泵（3），程控微泵（3）在程序控制下将样品液体定量吸入毛细管（1）内，然后反转泵驱动方向，液流反向，将吸入的样品连同预先封装在试剂管（2）内的一系列试剂液段顺序通过毛细管（1）排出，依次完成非均相免疫分析中的抗原或抗体结合、清洗、标记抗体或抗原结合、清洗、检测反应的全部液体操作。

8.根据权利要求6所述的操作方法，其特征在于，在操作过程的第二阶段，由所述程控微泵（3）按事先设定的程序控制各个液体通过毛细管（1）时的流动方向和流速。

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