CN102994507A - 视网膜色素变性相关基因的鉴别以及与其相关的产品、方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及复合杂合突变的鉴定，特别是视网膜色素变性相关的复合杂合突变的鉴定。具体而言，本发明提供了鉴定视网膜色素变性相关复合杂合突变的方法，所鉴定出的基因和/或突变用于鉴别视网膜色素变性的用途，以及用于诊断视网膜色素变性的产品及其用途。

Description

视网膜色素变性相关基因的鉴别以及与其相关的产品、方法及用途

发明领域

本发明属于遗传学、分子生物学，具体涉及遗传性疾病致病基因的鉴定，特别是视网膜色素变性相关基因的鉴定、用于鉴定的产品及其用途；以及所鉴定出的经突变的基因、其翻译产物或包含它们中的一种或多种的宿主细胞。

背景技术

视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa，RP)是一类以色素层和中央-周边视网膜的黄斑部损伤为特征的进行性视网膜色素变性。根据我国部分地区调查资料，群体患病率约为1/3500。该病的典型临床特征包括：早期出现夜盲，随后出现进行性视野缩小与视力下降、视网膜骨细胞样色素沉着、视盘呈蜡黄色萎缩和视网膜电图(Electroretinogram，ERG)杆锥细胞功能下降等。不同的RP患者因发病年龄、严重程度、临床表型、进展情况及遗传模式的不同，而呈现出不同的表型和遗传异质性。许多和RP相关的不同基因突变导致类似的表型，这使得对RP患者根据表型来判断基因型带来了困难。近20-30％的RP患者同时伴有非眼部疾病，如听力损失、肥胖及认知障碍等。

根据遗传方式可分为常染色体显性遗传(autosomal dominant RP，ADRP)、常染色体隐性遗传(autosomal recessive RP，ARRP)、X-连锁遗传(X-linked RP，XLRP)、双基因型遗传(digenentic RP)和线粒体DNA遗传等。不同遗传方式的RP在不同人群所占的比例存在一定程度的差异，通常ADRP，ARRP和XLRP在RP病例中所占的比例分别为15-20％，20-25％和10-15％。其余40％-50％的患者无家族史，称为散发性RP，其中大部分属于常染色体隐性遗传。迄今报道的双基因遗传RP是由ROM1杂合子突变合并RDS杂合子突变引起的RP病例，比较少见。线粒体突变导致的色素变性常伴有全身的综合征，迄今为止所发现的与线粒体突变有关的基因有MTTS2基因和MTATP6基因。

已报道的RP相关位点有50多个。还有约一半的RP患者，致病原因不明(Hartong DT，Berson EL，Dryja TP.Retinitis pigmentosa.Lancet.2006，368：1795-1809)。对于已知的任何一种RP致病基因，其在总的RP患者中所占的比例都比较小。携带这些异常的RP患者占到总RP患者人数的一半左右，还有约一半的RP，致病原因不明。加上之前所述的RP存在高度的遗传异质性，这给鉴定RP的致病突变的工作带来了困难。

因此，对已知候选基因进行常规的桑格(sanger)测序来寻找致病突变的效率不高。

发明内容

最近，外显子组测序(exome sequencing)被成功地应用于发现稀有单基因疾病的致病基因，如Freeman-Sheldon综合症的MYH3基因，Schinzel-Giedion综合征的SETBP1基因，以及严重大脑畸形的WDR62突变等(Ng SB，Turner EH，Robertson PD，等人，Targeted capture andmassively parallel sequencing of 12 human exomes.Nature 2009，461(7261)：272-276；Hoischen A，van Bon BW，Gilissen C，等人De novomutations of SETBP1 cause Schinzel-Giedion syndrome.Nat Genet2010；42(6)：483-5；Bilguvar K，Ozturk AK，Louvi A，等人，Whole-exome sequencing identifies recessive WDR62 mutations insevere brain malformations.Nature 2010，467(7312)：207-210)。全外显子测序技术已被证明为降低稀有单基因疾病候选基因甚至发现其致病基因的有力、有效手段，仅通过对几个很少的个体(包括患者及正常对照)的全外显子进行测序来筛选与疾病相关的变异，其成功率大为提升。如研究人员(Ng et al.Exome sequencing identifies the causeof a mendelian disorder.Nat Genet(2010)vol.42(1)pp.30-35)选择了来自三个独立家系的四名米勒综合症患者，对他们进行外显子测序，得到的数据与公共SNP数据库和先前测得的8个HapMap个体的外显子数据对比，过滤掉普通变异和个体独有的变异后，科学家发现在这四名患者中都具有以前未知的两个突变位点，都位于一个称之为DHODH的基因上，此基因编码一种在嘧啶合成通路中起到关键作用的酶。随后科学家又用Sanger测序在另外三个米勒综合症患病家系中验证，证实了米勒综合症患者均存在这一基因突变。

本研究通过外显子组测序技术对一伴有先天性白内障，角膜厚度变薄和高度近视的RP家系(具体系谱图见图1)进行了分析，成功鉴定出致病突变。

该RP家系来自于四川省泸州，共四代。通过对所有22位现存家系成员进行详细的眼科检查(包括裂隙灯生物显微镜检查，眼底检查，眼底荧光血管造影(fundus fluorescein angiography，FFA)，光学相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)，B超，角膜中央厚度(central cornea thickness，CCT)和视网膜电图(electroretinography，ERG)。确诊了其中4位为RP患者，且均为第三代(见图1)。所有患者均表现为类似的临床特征(见图2)，包括周边视网膜色素沉着，发病较晚，无夜盲史，先天性白内障，高度近视，角膜变薄。

对患者的常见RP致病基因包括RHO，RDS，RP1，RP2，RPGR(包括ORF15，此基因的突变热区)，ROM1，RPE65和TULP1基因的外显子进行测序后，未发现致病突变，在患者及正常对照中发现以下SNP：RP1上的rs444772，rs446227，rs414352；RDS上的rs7764439，rs390659，rs425876，rs434102；RPGR上的rs5918520，但是这些SNP似乎都与疾病没有关联。这暗示着可能存在着更复杂的分子遗传学机理有待揭示。

因此，发明人进一步研究了可能与RP相关的致病基因以及其中可能存在的相关突变。

突变的CYP4V2基因、其翻译产物及包含它们中的一种或多种的宿主 细胞

一方面，本发明涉及突变的人CYP4V2基因，其特征在于，含有所述突变的人CYP4V2基因和/或其翻译产物的受试者患有视网膜色素变性(RP)疾病。所述突变的人CYP4V2基因也包括经分离的包含所述基因的核酸分子。

在一个具体的实施方式中，所述突变导致人CYP4V2基因的第9号外显子(SEQ ID NO：3)和第7号外显子(SEQ ID NO：12)不翻译。

在一个具体的实施方式中，所述突变导致经突变的人CYP4V2基因的翻译产物中不含有：(1)第9号外显子(SEQ ID NO：3)所编码的多肽或其部分；以及(2)第7号外显子(SEQ ID NO：12)所编码的多肽或其部分。

在特别的实施方式中，所述突变分别位于或包含人CYP4V2基因的第9号外显子的剪接位点(见下面的SEQ ID NO：10中以下划线标示的碱基ag)以及第7号外显子的剪接位点(见下面的SEQ ID NO：11中以下划线标示的碱基ag)。

人CYP4V2基因的第9号外显子的剪接位点：

cttctttgttgggtatttgatgggtatttagcatgccatgccttgatccacctgttctttttagatgtctgcacccccagcccccactgctctttcaggtcatcttatctac

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gggagagggaaactttctaatgtctaccttgctccggtctcataatgtattgactacttcttgacagcaggttacagagttctaaaaggcactgaagccgtcatcat

tccctatgcattgcacagagatccgag(SEQ ID NO：10)

人CYP4V2基因的第7号外显子的剪接位点：

taaatgaaagaaactagcatattttataagaaaatgtgttaactagggtgcatccaagtccaaacagaagcatgtgattatcattcaaatcatacagGTCATC

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ttttaaagtagtttaactaaagaagattcattatattttaattagaaatta(SEQ ID NO：11)

在一个具体的实施方式中，所述突变的人CYP4V2基因包含IVS8-2A和IVS6-8del17bp的突变，其中所述IVS8-2A突变是指人CYP4V2基因第8号内含子中-2处碱基A的突变；IVS6-8del17bp突变指位于人CYP4V2基因第6号内含子与第7号外显子中的突变，其中从所述第6号内含子的-8位开始的17个碱基缺失，所述缺失的17个碱基为从所述第6号内含子的-8位到第7号外显子第9位的碱基。

在一个具体的实施方式中，所述突变的人CYP4V2基因包含IVS8-2A→G和IVS6-8del17bp/insGC突变，其中所述IVS8-2A→G突变是指人CYP4V2基因第8号内含子中-2位处A→G的碱基突变；IVS6-8del17bp/insGC突变指位于人CYP4V2基因第6号内含子与第7号外显子中的突变，其中从所述第6号内含子的-8位开始的17个碱基被GC取代，而被取代的17个碱基为从所述第6号内含子的-8位到第7号外显子第9位的碱基。

在另一个方面，本发明涉及所述突变的人CYP4V2基因的翻译产物。

在又一个方面，本发明涉及宿主细胞，其包含所述经突变的人CYP4V2基因和/或其翻译产物。

试剂(诊断试剂)

在另一个方面，本发明涉及一种试剂，其能够鉴别出人CYP4V2基因中是否存在突变，含有具有所述突变的人CYP4V2基因的受试者患有视网膜色素变性疾病。

在一个具体的实施方式中，所述试剂能够鉴别出人CYP4V2基因的第9号外显子(SEQ ID NO：3)和第7号外显子(SEQ ID NO：12)是否被翻译。

在一个具体的实施方式中，所述试剂能够鉴别出人CYP4V2基因的翻译产物中是否含有：(1)第9号外显子(SEQ ID NO：3)所编码的多肽或其部分；以及(2)第7号外显子(SEQ ID NO：12)所编码的多肽或其部分。

在一个具体的实施方式中，所述试剂能够鉴别出人CYP4V2基因的第9号外显子的剪接位点以及第7号外显子的剪接位点处的突变。

在一个具体的实施方式中，所述试剂能够鉴别出人CYP4V2基因中的IVS8-2A和IVS6-8del17bp突变，其中所述IVS8-2A突变指人CYP4V2基因第8号内含子中-2位处碱基A的突变；IVS6-8del17bp突变指位于人CYP4V2基因第6号内含子与第7号外显子中的突变，其中从所述第6号内含子的-8位开始的17个碱基缺失，而所缺失的17个碱基为从所述第6号内含子的-8位到第7号外显子第9位的碱基。特别地，所述试剂用于诊断视网膜色素变性。

在一个具体的实施方式中，所述试剂能够鉴别出人CYP4V2基因中的IVS8-2A→G和IVS6-8del17bp/insGC突变，其中所述IVS8-2A→G突变指人CYP4V2基因第8号内含子中-2位处A→G的碱基突变；IVS6-8del17bp/insGC突变指位于人CYP4V2基因第6号内含子与第7号外显子中的突变，其中从所述第6号内含子的-8位开始的17个碱基被GC取代，而被取代的17个碱基为从所述第6号内含子的-8位到第7号外显子第9位的碱基。

特别地，本发明的所述试剂用于诊断视网膜色素变性。

在具体的实施方式中，所述试剂可以是用于鉴定核酸中碱基修饰(例如碱基突变、添加、缺失等)的任何试剂，例如用于PCR反应的引物、用于核酸杂交的探针等。特别地，所述试剂还可以是为了用于例如下列方法而设计的试剂：单链构象异构多态分析技术(Single-strandconformationpolymorphism，SSCP)、异质性双链构像多态性分析(Heteroduplex，HTX)、变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient GetElectrophoresis，DGGE)、错配裂解法(Dismate cleavage，DC)、变性高效液相色谱分析(Denaturing high-performanceliquidchromatograph，DHPLC)、毛细管电泳(Capillaryelectrophoresis，CE)、碱基切割序列扫描(Base Exicision SequenceScanning BESS)、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH0)、等位基因特异性扩增(ASA)、RNA单链钩象多态性检测(PCR-rSSCP)、双脱氧测序单链片段构象多态性分析(PCR-ddF)、限制性内切酶指纹技术(PCR-REF)、酶错配裂解法(Enzyme mate cleavage，EMC)、错配化学切割法(Chemicalcleavage mate，CCM)、测序(Sequencing)、多重PCR测序、基因芯片测序、引物延伸(Primer Extension，PEX)等。

在具体的实施方式中，本发明的所述试剂可以进一步含有能够检测出其它常见RP致病基因(例如但不限于RHO，RDS，RP1，RP2，RPGR(包括ORF15，此基因的突变热区)，ROM1，RPE65和TULP1基因等)中的突变的试剂。

在一个具体的实施方式中，本发明的所述试剂可以包含PCR引物，将所述引物用于PCR扩增后所得的PCR产物(即PCR引物的扩增产物)指示样品中是否存在突变的人CYP4V2基因，含有具有所述突变的人CYP4V2基因的受试者患有视网膜色素变性疾病。

在一个具体的实施方式中，所述PCR引物的扩增产物指示样品中是否存在导致人CYP4V2基因的第9号外显子(SEQ ID NO：3)和第7号外显子(SEQ ID NO：12)不被翻译的突变。

在具体的实施方式中，所述PCR引物的扩增产物指示样品中人CYP4V2基因的第9号外显子的剪接位点以及第7号外显子的剪接位点是否存在突变。

在具体的实施方式中，所述PCR引物的扩增产物指示样品中是否存在人CYP4V2基因中的所述IVS8-2A和IVS6-8del17bp突变。

在具体的实施方式中，所述PCR引物的扩增产物指示样品中是否存在所述IVS8-2A→G和IVS6-8del17bp/insGC突变。

本发明的每一个所述PCR引物均为多核苷酸，其含有至少5个碱基，例如5-10、5-15、5-20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50个或者更多个碱基。

在一个具体实施方式中，每一个所述PCR引物均与人CYP4V2基因序列中至少一个相应长度的片段或其互补核酸在严格条件下杂交。

在一个具体的实施方式中，每一个所述PCR引物均与人CYP4V2基因序列中至少一个相应长度的片段或其互补核酸有至少60％的序列同一性，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。

在一个具体的实施方式中，本发明的所述试剂包含至少两对PCR引物，其中第一对引物的扩增产物指示待测样品中是否存在导致人CYP4V2基因的第9号外显子(SEQ ID NO：3)不被翻译的突变；而其中第二对引物的扩增产物指示待测样品中是否存在导致人CYP4V2基因的第7号外显子(SEQ ID NO：12)不被翻译的突变。

在一个具体的实施方式中，所述第一对引物的扩增产物指示待测样品中人CYP4V2基因的第9号外显子的剪接位点处是否存在突变；而所述第二对引物的扩增产物指示待测样品中人CYP4V2基因的第7号外显子的剪接位点是否存在突变。

在一个具体的实施方式中，所述第一对引物的扩增产物指示待测样品中是否存在人CYP4V2基因中的所述IVS8-2A突变；而第二对引物的扩增产物指示待测样品中是否存在人CYP4V2基因中的所述IVS6-8del17bp突变。

在一个具体的实施方式中，所述第一对引物的扩增产物指示待测样品中是否存在所述IVS8-2A→G突变；而所述第二对引物的扩增产物指示待测样品中是否存在所述IVS6-8del17bp/insGC突变。

在具体的实施方式中，所述第一对引物与第二对引物不相混合。

特别地，在一个具体实施方式中，所述第一对引物中的每一个引物均与SEQ ID NO：10所示序列中的至少一个相应长度的片段或其互补核酸在严格条件下杂交；并且所述第二对引物中的每一个引物均与SEQ IDNO：11所示序列中的至少一个相应长度的片段或其互补核酸在严格条件下杂交。

在又一个具体实施方式中，所述第一对引物中的每一个引物均与SEQID NO：10所示序列中的至少一个相应长度的片段或其互补核酸有至少60％的序列同一性，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性；并且所述第二对引物中的每一个引物均与SEQ ID NO：11所示序列中的至少一个相应长度的片段或其互补核酸有至少60％的序列同一性，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。

在又一个具体的实施方式中，所述第一对引物的序列分别如SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7所示。在另外的实施方式中，所述第二对引物的序列分别如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。

试剂盒

在另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含本发明所述的试剂。在具体的实施方式中，所述试剂盒还可以包含用于特定反应的缓冲液、洗涤液和/或酶(例如DNA聚合酶)。特别地，所述试剂盒用于诊断视网膜色素变性。

用途

在又一个方面，本发明涉及所述突变的人CYP4V2基因、其翻译产物、包含所述突变的人CYP4V2基因或其翻译产物的宿主细胞、本发明的试剂或试剂盒用于诊断视网膜色素变性的用途。

在又一个方面，本发明涉及所述试剂或试剂盒用于制备诊断工具(例如诊断剂、诊断试剂盒、诊断设备等)的用途，所述诊断工具用于诊断视网膜色素变性。

此外，本发明的突变的人CYP4V2基因、其翻译产物、包含所述突变的人CYP4V2基因或其翻译产物的宿主细胞还可被用于构建特定的疾病模型(例如RP疾病模型)，所述疾病模型可以通过制造携带所述基因、翻译产物或宿主细胞的转基因动物(例如转基因小鼠)等而实现。

因而，在另一个方面，本发明还涉及本发明的突变的人CYP4V2基因、其翻译产物、包含所述突变的人CYP4V2基因或其翻译产物的宿主细胞的用途，其用于产生视网膜色素变性动物模型，或用作药物靶点，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生视网膜色素变性动物模型，或用作药物靶点。

诊断方法

在另外的方面，本发明涉及诊断受试者是否患有视网膜色素变性或处于患有视网膜色素变性的风险中的方法，所述方法包括下列步骤：

从受试者中采取样品，检测所述样品中是否存在本发明所述的人CYP4V2基因中的突变(例如上文中所列的突变)。

在一个具体的实施方式中，所述方法包括下列步骤：

1)从受试者中采取DNA样品(其可来自于例如组织、血液如外周血、体液等)；

2)从所述样品中提取基因组DNA并任选地通过例如凝胶电泳对所提取的DNA进行鉴定；

3)将本发明的所述试剂与所述DNA样品相混合；

4)进行适当的反应并根据反应的结果判断所述样品中是否含有本发明所述的人CYP4V2基因中的突变。

在另一个具体的实施方式中，所述方法包括下列步骤：

1)从受试者中采取DNA样品(其可来自于例如组织、血液如外周血、体液等)；

2)从所述样品中提取基因组DNA并任选地通过例如凝胶电泳对所提取的DNA进行鉴定；

3)针对人CYP4V2基因的序列设计分别用于鉴定所述人CYP4V2基因中的突变的引物；

4)将所述引物加入样品中，并任选地加入适当的酶(例如，DNA聚合酶)和/或缓冲液；并在PCR仪中进行PCR反应；

5)对由步骤5)获得的PCR产物进行DNA测序；

6)将测序结果与正常人CYP4V2基因的相应序列进行比较，判断是否存在所述突变。

在一个实施方式中，所述突变是导致人CYP4V2基因的第9号外显子(SEQ ID NO：3)和第7号外显子(SEQ ID NO：12)不翻译的突变。

在一个具体的实施方式中，所述突变是导致经突变的人CYP4V2基因的翻译产物中不含有：(1)第9号外显子(SEQ ID NO：3)所编码的多肽或其部分；以及(2)第7号外显子(SEQ ID NO：12)所编码的多肽或其部分的突变。

在特别的实施方式中，所述突变分别位于或包含人CYP4V2基因的第9号外显子的剪接位点以及第7号外显子的剪接位点。

在一个具体的实施方式中，所述突变为人CYP4V2基因的突变IVS8-2A和IVS6-8del17bp。

在一个具体的实施方式中，所述突变为人CYP4V2基因的突变IVS8-2A→G和IVS6-8del17bp/insGC。

在具体的实施方式中，每一个所述PCR引物均为多核苷酸，其含有至少5个碱基，例如5-10、5-15、5-20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50个或者更多个碱基。

在一个具体实施方式中，每一个所述PCR引物均与人CYP4V2基因序列中至少一个相应长度的片段或其互补核酸在严格条件下杂交。

在一个具体的实施方式中，每一个所述PCR引物均与人CYP4V2基因序列中至少一个相应长度的片段或其互补核酸有至少60％的序列同一性，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。

在一个具体的实施方式中，所述PCR引物的序列分别与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示序列中的至少一个相应长度的片段或其互补核酸有至少60％的序列同一性，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。

在又一个具体的实施方式中，所述引物的序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。

治疗剂

本发明还涉及一种治疗剂，其用于在有需要的受试者中治疗视网膜色素变性，所述治疗剂包含选自下列的试剂：

1)能够纠正患者中CYP4V2基因中的突变而使其回复为野生型的试剂；

2)使得患者中所述经突变的CYP4V2基因不能被转录或不能被翻译的试剂；

3)使得患者中所述经突变的CYP4V2基因的翻译产物失去活性的试剂。

在一个具体的实施方式中，所述突变是导致人CYP4V2基因的第9号外显子(SEQ ID NO：3)和第7号外显子(SEQ ID NO：12)不翻译的突变。

在一个具体的实施方式中，所述突变是导致经突变的人CYP4V2基因的翻译产物中不含有：(1)第9号外显子(SEQ ID NO：3)所编码的多肽或其部分；以及(2)第7号外显子(SEQ ID NO：12)所编码的多肽或其部分的突变。

在特别的实施方式中，所述突变为分别位于或包含人CYP4V2基因的第9号外显子的剪接位点以及第7号外显子的剪接位点的突变。

在一个具体的实施方式中，所述突变包括人CYP4V2基因中IVS8-2A和IVS6-8del17bp的突变。

在一个具体的实施方式中，所述突变包括人CYP4V2基因中的IVS8-2A→G和IVS6-8del17bp/insGC突变。

在具体的实施方式中，本发明的所述治疗剂可以进一步含有能够纠正其它常见RP致病基因(例如但不限于RHO，RDS，RP1，RP2，RPGR(包括ORF15，此基因的突变热区)，ROM1，RPE65和TULP1基因等)中的突变的试剂。

治疗方法

本发明还涉及治疗视网膜色素变性的方法，所述方法包括如下步骤：

向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的所述治疗剂。

特别地，本发明的治疗剂施用方式可以是传统的施用途径，包括静脉滴注、肌肉注射、阴道、口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径，但不仅局限于此。

附图说明

图1RP家系系谱图。黑色实心代表患者，空心代表正常人。圆形代表女性，正方形代表男性。箭头指向代表先证者。斜线代表已去世的成员。

图2.家系的临床检查结果。(A)眼底周边视网膜色素沉着、视网膜血管变细，视网膜脉络膜萎缩等典型的RP表现。(B)FFA也可见双眼视网膜脉络膜萎缩。(C)OCT显示视网膜神经纤维层变薄。(D)ERG波幅消失。(E)裂隙灯下可见晶体前囊膜下点状浑浊，如箭头所示。(F)B超显示双眼后部眼环向后隆起，表现为巩膜后葡萄肿，为高度近视。

图3CYP4V2基因的突变分析。在III8和其他3位患者上均发现CYP4V2基因的IVS6-8del17bp/insGC和IVS8-2A→G处的复合杂合突变。其中IVS6-8del17bp/insGC突变由母亲II2所携带。IVS8-2A→G突变由II1的兄弟II3所携带。这意味着此突变十分可能在II1上也存在。另一内含子上的变异IVS6-7C→T与疾病无关联。

具体实施方式

在本发明中，术语“突变”是指基因序列或DNA序列中一个或数个(例如几个)碱基的添加、缺失和/或置换。当用于描述基因所编码的产物或者蛋白质时，“突变”指的是所述蛋白质或编码产物中一个或数个(例如几个)氨基酸残基的添加、缺失和/或置换。

在本发明中，术语“杂合突变”是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中。

在本发明中，术语“复合杂合突变”是指是指同一基因的不同位置出现2处或2处以上的杂合突变。

在本发明中，术语“非同义改变”是指突变引起了改变后的密码子编码不同的氨基酸的改变。

在本发明中，“单链构象异构多态分析技术(Single-strandconformationpolymorphism，SSCP)”是指一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。这种方法就被称作单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymor-phism，SSCP)分析。在PCR-SSCP技术中，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性，其基本过程是：1)PCR扩增靶DNA；2)将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；3)将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；4)最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA的迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。

在本发明中，“引物延伸(Primer Extension，PEX)”的原理是将引物合成到突变位点之前的一个碱基，然后与基因组DNA退火，分别于两管中加入一种同位素或非放射性标记的野生型和突变型的互补碱基，使各自的引物得以延伸一个或几个碱基，经电泳鉴定该碱基是否已掺入，从而分别判断样品是属于野生型还是突变型的。

在本发明中，术语“IVS8-2A→G突变”是指人CYP4V2基因第8号内含子中-2位处A→G的碱基突变。

在本发明中，“IVS6-8del17bp/insGC突变”是指位于人CYP4V2基因第6号内含子与第7号外显子中的突变，其中从所述第6号内含子的-8位开始的17个碱基被GC取代，而被取代的17个碱基为从所述第6号内含子的-8位到第7号外显子第9位的碱基。

在本发明中，“PCR引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5-10、5-15、5-20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50个或者更多个碱基的多核苷酸片段。

在本发明中，“互补核酸”指与所引述的核酸序列完全互补的核酸。

在本发明中，“严格条件”是指本领域所熟悉的参数。对核酸，被称为严格的杂交条件典型的是在低离子强度和恰好低于DNA杂交复合物熔点(T_m)(典型地，低于杂交物T_m约3℃)的温度下。更高的严格性限定了探针序列和靶之间更专一的相关性。核酸杂交中所用的严格条件在本领域中众所周知，可在汇编这类方法的参考文献中找到，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等编，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，1989，或Current Protocols in MolecularBiology，F.M.Ausubel等编，John Wiley & Sons，Inc.，New York.“严格条件”的实例是在6xSSC中于65℃下杂交。另一严格条件的实例是在杂交缓冲液中于65℃下杂交，杂交缓冲液由3.5xSSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mMNaH₂PO₄[pH7]，0.5％SDS，2mM EDTA组成(SSC是0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH7；SDS是十二烷基硫酸钠；而EDTA是乙二胺四乙酸)。杂交之后，转上DNA的膜在2xSSC中于室温下清洗，然后在最高68℃的温度下于0.1xSSC/0.1xSDS中清洗。在进一步的实施例中，杂交水溶液的使用的替代是杂交甲酰胺溶液的使用。应用例如50％甲酰胺溶液和42℃，严格的杂交条件能因此被实现。有其它能被应用的条件、试剂等，并将导致类似的严格程度。

在某些实施方式中，本发明的试剂可以进一步以标记物进行标记。所述标记物可以是放射性同位素如¹²⁵I、酶、酶的底物、发光物质如异鲁米诺和吖啶酯、荧光物质如荧光素和罗丹明、生物素和有色物质如乳胶颗粒和胶体金等。标记用的酶可以是过氧化物酶(如辣根过氧化物酶HRP)、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。对于这些反应中合适的底物有2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、鲁米诺-过氧化氢、邻苯二胺-过氧化氢(针对过氧化物酶)、对硝基苯磷酸盐、4-甲基磷酸伞型酮、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰基)苯基-1，2-二乙氧基烷(针对碱性磷酸酶)、对硝基苯-β-D-半乳糖和甲基伞形酮-β-D-半乳糖(针对β半乳糖苷酶)。其它的标记包括量子点标记、生色团标记、酶标记、亲和配体标记、电磁自旋标记、重原子标记、标记有纳米微粒光散射标记或其它纳米微粒的探针、异硫氰酸荧光素(FITC)、TRITC、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy-7、得克萨斯红、Phar-Red、异藻红蛋白(APC)、以及酶标记如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I²-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶和半抗原偶联物如洋地黄毒苷或二硝基苯酚、或能够形成配合物的结合配对如链霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗体配合物如包括兔IgG和抗-兔IgG；荧光基团如伞形三糖(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、绿荧光蛋白、藻红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、二苯乙烯、荧光黄、Cascade蓝、二氯三嗪基荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、荧光镧系络合物如包括铕和铽、Cy3、Cy5、分子信标(molecular beacons)和其荧光衍生物、发光材料如鲁米诺；光散射或细胞质基因组共振材料如金或银颗粒或量子斑(quantum dot)：或放射性材料如¹⁴C、¹²³I、¹²⁴I、¹³¹I、Tc99m、³⁵S或³H；或球珠(spherical shell)，以及标记有本领域已知的任何其它信号产生标记物的探针。例如，可检测的分子包括但不限于荧光基团以及前面所述其它已知的，如在Joseph R.Lakowicz(Editor)所编的Principles of Fluorescence Spectroscopy，PlenumPub Corp，第二版(July 1999)和Richard P.Hoagland的第六版的Molecular Probes Handbook所描述的。在某些实施方式中，标记物包括半导体纳米微晶如量子斑(即Qdots)，参见U.S.P 6,207,392。Qdots可从Quantum Dot Corporation购得。用于本发明的半导体纳米微晶包括Group II-V半导体的纳米微晶如MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe和其混合物以及Group III-V半导体的纳米微晶如GaAs、InGaAs、InP、InAs和其混合物。Group IV半导体如锗或硅的使用，或有机半导体的使用，在某些条件下可能是方便可行的。半导体纳米微晶也可以包括合金，其含有两种或多种选自于Group III-V化合物、Group II-VI化合物、Group IV元素和其组合物的半导体。

在本发明中，核酸的碱基序列的同一性可应用多种由NCBI(Bethesda，Maryland)开发的公开可得的软件工具计算得到。示例的工具包括Altschul SF等的启发式算法(J Mol Biol，1990，215：403-410)，也称为BLAST。Pairwise和ClustalW比对(BLOSUM30矩阵设置)以及Kyte-Doolittle水疗分析可应用公开(EMBL，Heidelberg，Germany)和商业(例如来自Oxford MolecularGroup/Genetics Computer Group，Madison，WI的MacVector序列分析软件)的类型而获得。前述核酸的Watson-Crick互补链也被本发明所包括。

在本发明中，术语“诊断工具”指任何可能用于诊断的试剂、试剂盒、包含所述试剂或试剂盒的其它装置、设备或机器等。

本发明的试剂、试剂盒或诊断工具中可进一步包含不会影响活性物质效力的其它缓冲液、载体或媒介等，例如一种或多种水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、乙醇和其他类似物，以及上述物质的组合。所述其它缓冲液、载体或媒介等可进一步包括能提高所述试剂(例如PCR引物)的保存期限或效用的微量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等。

在本发明中，术语“纠正”基因中的突变是指，将突变基因中经突变的碱基回复至野生型基因中相应位置的碱基，或者使得经“纠正”的基因所编码的产物与相应野生型基因所编码的产物具有相同的氨基酸序列、功能和/或活性。

在具体的实施方式中，本发明的所述能够纠正患者中的基因突变的试剂包括但不限于，例如：突变基因的特异性RNAi试剂、突变蛋白的特异性抗体、特异性的核酸分子或在DNA修复中起作用的酶，及其组合。

在本发明中，术语“失去活性”是指核酸分子或蛋白质分子不再能够参与细胞内的各种生物学反应或化学反应，不再能够影响包含其的宿主细胞的功能和/或在体外的各种测试中不再显示出区别于空白对照的任何显著性差异。

在本发明中，术语“宿主细胞”指其中可导入核酸或蛋白质的任何细胞，其包括但不限于，例如大肠杆菌或枯草菌细胞等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞的动物细胞。

下面结合具体实施例与附图，进一步对本发明加以阐释。应理解，这些实施例并不应在任何方面构成对本发明的限制。除非另有说明，本申请中所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里的普通技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在遗传分析、细胞培养、分子生物学、生物化学、免疫学等领域的实验操作中的步骤均为相应领域内广泛使用的常规命名和步骤。

实施例

实施例1鉴别RP家系的患者中与疾病相关的突变

发明人用Agilent SureSelect Human All Exon试剂盒(Agilent公司)结合Solexa高通量测序技术(即使用Illumina公司的测序仪Hiseq2000依照生产商提供的使用说明进行操作，其介绍或产品手册可见http://www.illumina.com/)对该家系中的三名患者(III2，III4，III6)和一名家系内正常人(II2)的外显子组序列进行了测序。所使用的方法和步骤均是根据生产商提供的使用说明书和本领域的常规技术进行的，简要地实验过程如下：

1)将从所述患者或正常人的血液样品中提取的基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头而制备杂交文库，此实验是根据http://www.illumina.com/support/documentation.ilmn处提供的I11umina/Solexa标准建库说明书进行的；

2)使按照Illumina/Solexa标准建库说明书建好的文库与SureSelect Biotiny lated RNA Library(BAITS)(使用SureSelect HumanAll Exon Kit)进行杂交富集(实验方法参照http://www.genomics.agilent.com提供的G3360-90020_SureSelect_Indexing_1.0(1).pdf实验流程进行)，再经过LM-PCR(ligationmediated PCR)的线性扩增后在测序平台上进行测序，所使用的测序平台为Illumina Hiseq 2000，读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度最少为30。

3)测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software 1.7进行处理，经过过滤去污染、使用SOAPaligner 2.20(Li R，Li Y，Kristiansen K，et al，SOAP：short oligonucleotide alignmentprogram.Bioinformatics 2008，24(5)：713-714；Li R，Yu C，Li Y，eaal，SOAP2：an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics 2009，25(15)：1966-1967.)比对参考基因组(hg18/build36.3)，获得比对到基因组上的独特定位读出结果(Uniquemapped reads)。靶区域的基因型由SOAPsnp(Li R，Li Y，Fang X，YangH，et al，SNP detection for massively parallel whole-genomeresequencing.Genome Res 2009，19(6)：1124-1132.)确定。

结果，在三位患者中均发现有32216个单核苷酸多态性(SNPs)和2477处的插入/缺失。随后对结果通过dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi)，千人基因组数据库(www.1000genomes.org/)，HapMap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)等公共数据库的过滤，去掉所有已知的变异。在正常对照II2上出现的相同变异也进行过滤处理。最终得到了26个只存在于三位患者身上，而不存在于正常对照中的杂合变异。

实施例2：视网膜色素变性相关复合杂合突变的进一步鉴定

如上文的描述可知，本发明中所检测的RP家系一共有4位患者，均为第三代，第二、四代无患者。这意味着遗传方式应为隐性遗传，即只有出现纯合突变或复合杂合突变(同一基因不同位置出现2处杂合突变)时才会发病。然而，在实施例1中过滤后得到的26个变异均为杂合突变，这使得发明人开始寻找复合杂合突变的可能性。

在实施例1中所鉴别的26个杂合突变所对应的基因中，CYP4V2据报道与结晶样视网膜色素变性(Bietti crystalline corneoretinaldystrophy，BCD)有关(Li A，Jiao X，Munier FL，Schorderet DF，etal.Bietti crystalline corneoretinal dystrophy is caused bymutations in the novel gene CYP4V2.Am J Hum Genet.2004，74：817-826.)。CYP4V2基因(cytochrome P450，family 4，subfamily V，polypeptide 2)(OMIM 608614)位于4q35.1，包含11个外显子，编码525个氨基酸的蛋白质，主要功能结构域与CYP450家族4的蛋白质同源。Li等人分析了25个BCD家系的CYP4V2基因，在23个家系发现突变。在BCD患者中发现的所有CYP4V2基因突变均以隐性方式存在突变。而据上文的分析可知，本发明鉴定的突变很可能是复合杂合突变，即不同于关于BCD所鉴定的隐性突变。

有文献报道(Shan M，Dong B，Zhao X，等人Novel mutations in theCYP4V2 gene associated with Bietti crystalline corneoretinaldystrophy.Mol Vis.2005，11：738-743；Lin J，Nishiguchi KM，Nakamura M，et al.)(Recessive mutations in the CYP4V2 gene inEast Asian and Middle Eastern patients with Bietti crystallinecorneoretinal dystrophy.J Med Genet.2005，42：e38.)，CYP4V2的IVS8-2A→G突变会引起BCD。经比对，该突变位于CYP4V2基因第8号内含子(SEQ ID NO：1)剪接位点的受体位点(Acceptor site)，所得到的突变后的相应序列如SEQ ID NO：2所示。比较突变后的序列(SEQID NO：2)与原序列(SEQ ID NO：1)可见，人CYP4V2基因第8号内含子中-2位的碱基由A突变为了G(A→G)。通过Berkeley Drosophila的剪接位点预测工具和NetGene2剪接位点预测工具对这个剪接位点突变进行预测。结果均显示，突变造成该剪接位点消失，以致第九外显子(SEQID NO：3)不翻译。

为了验证本发明中使用的RP家系是否符合复合杂合突变模式，对测序数据重新进行了过滤，寻找患者在同一基因上有2个变异位点，而对照只有其中一个变异位点的数据，发现了2个非同义改变，分别是c.775C→A(CYP4V2基因编码区第775位C→A的突变)和IVS6-8del17bp/insGC(此突变位于CYP4V2基因第6内含子中，其中从第-8位开始的17个碱基被GC取代，被替代的17个碱基为从第6号内含子区-8位到第7号外显子第9位)。突变c.775C→A据文献报道(Lin J，Nishiguchi KM，Nakamura M，Dryja TP，Berson EL，等人(2005)Recessive mutations inthe CYP4V2 gene in East Asian and Middle Eastern patients withBietti crystalline corneoretinal dystrophy.J Med Genet 42：e38.)无致病性，而突变IVS6-8del17bp/insGC是一个17个碱基的缺失(即由两个插入的碱基GC取代该17个碱基)，缺失的这17个碱基中包括7号外显子的剪接受体位点，导致7号外显子不翻译。关于IVS6-8del17bp/insGC，突变前的序列如SEQ ID NO：4所示，突变后的序列如SEQ ID NO：5所示。

在下面的序列中进一步标示了所述突变，其中用下划线标记的部分为突变位点，小写字母为内含子序列，大写字母为外显子序列。

IVS8-2A→G所在序列：

cttctttgttgggtatttgatgggtatttagcatgccatgccttgatccacctgttctttttagatgtctgcacccccagcccccactgctctttcaggtcatcttatctac

ttgctttcatcagGGAAGTCTGACCGTCCCGCTACAGTAGAAGACCTGAAGAAACTTCGGTATCTGGAATGTGTTATTAAGGAGA

CCCTTCGCCTTTTTCCTTCTGTTCCTTTATTTGCCCGTAGTGTTAGTGAAGATTGTGAAGTGGgtaagtatgctatacctaaagtagaa

gggagagggaaactttctaatgtctaccttgctccggtctcataatgtattgactacttcttgacagcaggttacagagttctaaaaggcactgaagccgtcatcat

tccctatgcattgcacagagatccgag(SEQ ID NO：10)

IVS6-8de l17bp/insGC所在序列：

taaatgaaagaaactagcatattttataagaaaatgtgttaactagggtgcatccaagtccaaacagaagcatgtgattatcattcaaatcatacagGTCATC

GCTGAACGGGCCAATGAAATGAACGCCAATGAAGACTGTAGAGGTGATGGCAGGGGCTCTGCCCCCTCCAAAAATAAACG

CAGGGCCTTTCTTGACTTGCTTTTAAGTGTGACTGATGACGAAGGGAACAGGCTAAGTCATGAAGATATTCGAGAAGAAGT

TGACACCTTCATGTTTGAGgtattgtatattgttaggttcagatatcattaaacaaatttcagttattgttagaatctttagcattattttttaaaacaatcaaa

ttttaaagtagtttaactaaagaagattcattatattttaattagaaatta(SEQ ID NO：11)

实施例3突变IVS8-2A→G与IVS6-8del17bp/insGC可用于鉴别RP的患病者

为了进一步验证所鉴别的突变能够用于鉴定RP疾病的发生，发明人进一步分别对4名家系内患者、11名家系内正常人和7名家系外正常人的基因进行了检测，通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法获得CYP4V2有关序列，根据序列测定的结果是属于突变型还是野生型，来验证所述CYP4V2突变与视网膜色素变性的相关性，具体实验过程如下：

3.1样品制备。

分别采取了4名家系内患者、11名家系内正常人和7名家系外正常人外周静脉血，从所述受试者中提取外周血2ml，根据生产商的使用说明用Qiagen血DNA抽提试剂盒(Qiamp Blood DNA mini Kit，Qiagen，Hilden，Germany)提取基因组DNA。通过1％琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA进行鉴定，条带清晰单一无杂带，含量均足以进行PCR反应。

3.2通过桑格法测序验证。

按照3.1中所述方法提取基因组DNA，通过分光光度计测量DNA的含量，并稀释至20ng/μL；

2)引物设计及PCR反应

a)引物序列：

根据突变IVS8-2A→G所在序列设计如下的引物：

正向引物：5′CCACTGCTCTTTCAGGTCATC 3′(SEQ ID NO：6)

反向引物：5′GGTCAAACCAATTCAGATGGA 3′(SEQ ID NO：7)；

根据IVS6-8del17bp/insGC所在序列设计如下的引物：

正向引物：5′AACTAGGGTGCATCCAAGTC  3′(SEQ ID NO：8)

反向引物：5′CAAATGTGTCTACTGCTGTGC 3′(SEQ ID NO：9)；

b)反应体系：10μL

LA Taq酶(5U/μL)                   0.1μL

2×GC Buffer I(加入了Mg2+)           5μL

2mM dNTP                           0.4μL

正向引物(100ng/μL)                0.2μL

反向引物(100ng/μL)                0.2μL

DNA模板                              1μL

dH2O                            加至10μL

c)反应条件：

94℃ 5分钟

72℃ 5分钟

4℃  保持

3)将步骤2中获得的获自4名家系内患者、11名家系内正常人和7名家系外正常人PCR扩增产物直接进行DNA测序。

结果：测序结果显示4名家系内患者同时共有IVS8-2A→G与IVS6-8del17bp/insGC这两种突变。3名家系内正常人有突变IVS8-2A→G，5名家系内正常人有突变IVS6-8del17bp/insGC，2名家系内正常人没有这两个突变。家系外正常人均无这两个突变。图3中显示了部分的测序结果作为示例，其它的测序图谱与之类似。

因此，上面的实验结果表明，本发明的CYP4V2中的隐性复合杂合突变可以用于视网膜色素变性病变的检测。

实施例4检测试剂盒

A.试剂盒的组成：

a)其中含有检测突变IVS8-2A→G的引物对：

正向引物：5′CCACTGCTCTTTCAGGTCATC 3′(SEQ ID NO：6)

反向引物：5′GGTCAAACCAATTCAGATGGA 3′(SEQ ID NO：7)；

b)以及检测突变IVS6-8del17bp/insGC的引物对：

正向引物：5′AACTAGGGTGCATCCAAGTC  3′(SEQ ID NO：8)

反向引物：5′CAAATGTGTCTACTGCTGTGC 3′(SEQ ID NO：9)；

其中a)部分与b)部分中的组分不相混合。

B.使用方法

1)将试剂盒的组成部分a)与b)中的组分分别与适量的待测DNA样品混合，随后进行PCR反应；

2)PCR反应产物经纯化后测序，将所得到的序列与CYP4V2正常基因序列比对，确定所得到的序列是否有IVS8-2A→G和IVS6-8del17bp/insGC复合突变。

Claims (10)

1.突变的人CYP4V2基因，其特征在于，含有所述突变的人CYP4V2基因和/或其翻译产物的受试者患有视网膜色素变性(RP)疾病；

优选地，所述突变导致人CYP4V2基因的第9号外显子(SEQ ID NO：3)和第7号外显子(SEQ ID NO：12)不翻译；

优选地，所述突变导致经突变的人CYP4V2基因的翻译产物中不含有：(1)第9号外显子(SEQ ID NO：3)所编码的多肽或其部分；以及(2)第7号外显子(SEQ ID NO：12)所编码的多肽或其部分；

优选地，所述突变分别位于或包含人CYP4V2基因的第9号外显子的剪接位点以及第7号外显子的剪接位点；

优选地，所述突变的人CYP4V2基因包含IVS8-2A和IVS6-8del17bp的突变，其中所述IVS8-2A突变是指人CYP4V2基因第8号内含子中-2处碱基A的突变；IVS6-8del17bp突变指位于人CYP4V2基因第6号内含子与第7号外显子中的突变，其中从所述第6号内含子的-8位开始的17个碱基缺失，所述缺失的17个碱基为从所述第6号内含子的-8位到第7号外显子第9位的碱基；

优选地，所述突变的人CYP4V2基因包含IVS8-2A→G和IVS6-8del17bp/insGC突变，其中所述IVS8-2A→G突变是指人CYP4V2基因第8号内含子中-2位处A→G的碱基突变；IVS6-8del17bp/insGC突变指位于人CYP4V2基因第6号内含子与第7号外显子中的突变，其中从所述第6号内含子的-8位开始的17个碱基被GC取代，而被取代的17个碱基为从所述第6号内含子的-8位到第7号外显子第9位的碱基。

2.权利要求1所述的突变的人CYP4V2基因的翻译产物，或者包含权利要求1所述的突变的人CYP4V2基因和/或其翻译产物的宿主细胞。

3.试剂，其能够鉴别出人CYP4V2基因中是否存在突变，含有具有所述突变的人CYP4V2基因的受试者患有视网膜色素变性疾病；

优选地，所述试剂能够鉴别出人CYP4V2基因的第9号外显子(SEQ IDNO：3)和第7号外显子(SEQ ID NO：12)是否被翻译；

优选地，所述试剂能够鉴别出人CYP4V2基因的翻译产物中是否含有：(1)第9号外显子(SEQ ID NO：3)所编码的多肽或其部分；以及(2)第7号外显子(SEQ ID NO：12)所编码的多肽或其部分；

优选地，所述试剂能够鉴别出人CYP4V2基因的第9号外显子的剪接位点以及第7号外显子的剪接位点处的突变；

优选地，所述试剂能够鉴别出人CYP4V2基因中的所述IVS8-2A和IVS6-8del17bp突变；

优选地，所述试剂能够鉴别出人CYP4V2基因中的所述IVS8-2A→G和IVS6-8del17bp/insGC突变；

优选地，所述试剂进一步包含能够检测出其它常见RP致病基因(例如但不限于RHO，RDS，RP1，RP2，RPGR(包括ORF15，此基因的突变热区)，ROM1，RPE65和TULP1基因等)中的突变的试剂。

4.权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂包含PCR引物；

优选地，每一个所述PCR引物均为多核苷酸，其含有至少5个碱基，例如5-10、5-15、5-20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50个或者更多个碱基；

优选地，每一个所述PCR引物均与人CYP4V2基因序列中至少一个相应长度的片段或其互补核酸在严格条件下杂交；

优选地，每一个所述PCR引物均与人CYP4V2基因序列中至少一个相应长度的片段或其互补核酸有至少60％的序列同一性，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性；

优选地，所述试剂包含至少两对PCR引物，其中第一对引物的扩增产物指示待测样品中是否存在导致人CYP4V2基因的第9号外显子(SEQID NO：3)不被翻译的突变；而其中第二对引物的扩增产物指示待测样品中是否存在导致人CYP4V2基因的第7号外显子(SEQ ID NO：12)不被翻译的突变；

优选地，所述第一对引物的扩增产物指示待测样品中人CYP4V2基因的第9号外显子的剪接位点处是否存在突变；而所述第二对引物的扩增产物指示待测样品中人CYP4V2基因的第7号外显子的剪接位点是否存在突变；

优选地，所述第一对引物的扩增产物指示待测样品中是否存在人CYP4V2基因中的所述IVS8-2A突变；而第二对引物的扩增产物指示待测样品中是否存在人CYP4V2基因中的所述IVS6-8del17bp突变；

优选地，所述第一对引物的扩增产物指示待测样品中是否存在所述IVS8-2A→G突变；而所述第二对引物的扩增产物指示待测样品中是否存在所述IVS6-8del17bp/insGC突变；

优选地，所述第一对引物与第二对引物不相混合；

优选地，所述第一对引物中的每一个引物均与SEQ ID NO：10所示序列中的至少一个相应长度的片段或其互补核酸在严格条件下杂交；并且所述第二对引物中的每一个引物均与SEQ ID NO：11所示序列中的至少一个相应长度的片段或其互补核酸在严格条件下杂交；

优选地，所述第一对引物中的每一个引物均与SEQ ID NO：10所示序列中的至少一个相应长度的片段或其互补核酸有至少60％的序列同一性，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性；并且所述第二对引物中的每一个引物均与SEQ ID NO：11所示序列中的至少一个相应长度的片段或其互补核酸有至少60％的序列同一性，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性；

优选地，所述第一对引物的序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；

优选地，所述第二对引物的序列分别如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。

5.试剂盒，其包含：

权利要求1所述的突变的人CYP4V2基因、权利要求2所述的翻译产物或宿主细胞、权利要求3或4所述的试剂；和

任选地，缓冲液、洗涤液和/或酶(例如DNA聚合酶)。

6.权利要求1所述的突变的人CYP4V2基因、权利要求2所述的翻译产物或宿主细胞的用途，其用于产生视网膜色素变性动物模型，或用作药物靶点，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生视网膜色素变性动物模型，或用作药物靶点。

7.权利要求1所述的突变的人CYP4V2基因、权利要求2所述的翻译产物或宿主细胞、权利要求3或4所述的试剂或权利要求5所述的试剂盒用于制备诊断工具的用途，所述诊断工具用于诊断视网膜色素变性。

8.诊断受试者是否患有视网膜色素变性或处于患有视网膜色素变性的风险中的方法，所述方法包括下列步骤：

从受试者中采取样品，检测所述样品中是否存在权利要求1所述的人CYP4V2基因中的突变；

优选地，所述方法包括下列步骤：

1)从受试者中采取DNA样品(其可来自于例如组织、血液如外周血、体液等)；

2)从所述样品中提取基因组DNA并任选地通过例如凝胶电泳对所提取的DNA进行鉴定；

3)将权利要求3或4所述的试剂与所述DNA样品相混合；

4)进行适当的反应并根据反应的结果判断所述样品中是否含有权利要求1所述的突变；

优选地，所述方法包括下列步骤：

1)从受试者中采取DNA样品(其可来自于例如组织、血液如外周血、体液等)；

2)从所述样品中提取基因组DNA并任选地通过例如凝胶电泳对所提取的DNA进行鉴定；

3)针对人CYP4V2基因的序列设计分别用于鉴定权利要求1中所述突变的引物；

4)将所述引物加入样品中，并任选地加入适当的酶(例如，DNA聚合酶)和/或缓冲液；并在PCR仪中进行PCR反应；

5)对由步骤5)获得的PCR产物进行DNA测序；

6)将测序结果与正常人CYP4V2基因的相应序列进行比较，判断是否存在所述突变；

优选地，所使用的引物是权利要求4所述的PCR引物。

9.一种治疗剂，其用于在有需要的受试者中治疗视网膜色素变性，所述治疗剂包含选自下列的试剂：

1)能够纠正患者中CYP4V2基因中的突变而使其回复为野生型的试剂，其中所述突变为权利要求1中所述的人CYP4V2基因中的突变；

2)使得患者中所述经突变的CYP4V2基因不能被转录或不能被翻译的试剂；

3)使得患者中所述经突变的CYP4V2基因的翻译产物失去活性的试剂；

其中所述经突变的CYP4V2基因为根据权利要求1所述的突变的人CYP4V2基因；

优选地，所述治疗剂可以进一步含有能够纠正其它常见RP致病基因(例如但不限于RHO，RDS，RP1，RP2，RPGR(包括ORF15，此基因的突变热区)，ROM1，RPE65和TULP1基因等)中的突变的试剂。

10.治疗视网膜色素变性的方法，所述方法包括如下步骤：

向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求9所述的治疗剂。

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