CN102994424B - 一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法，按常规方法配制液体培养基并接种，按照现有方式进行光合细菌的培养；将菌体吸附收集装置安置在培养容器上，菌体吸附收集装置的光源套管竖直插入培养液中，培养一段时间，光合细菌将吸附在菌体吸附收集装置的光源套管外壁上，从培养液中取出菌体吸附收集装置，刮取光源套管外壁吸附的光合细菌菌泥，再将菌体吸附收集装置的光源套管置于培养液中，重复吸附收集、刮取菌泥的步骤，获得超浓缩光合细菌菌体；将刮下的菌泥按比例与辅料混合，直接干燥粉碎或造粒干燥，即得到高含量光合细菌固体制剂。本发明实现了在光合细菌连续培养、连续收集超浓缩光合细菌菌体，操作简单，节能经济。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学技术领域，具体涉及一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法。
背景技术
光合细菌(Anoxygenic Photosynthetic Bacteria，APB)是指一类在厌氧条件下，利用各种有机物或无机物作为电子供体进行光合作用但不释放氧气的原核微生物的总称。在自然界分布极为广泛，是地球上物质转化和能量循环中重要的一大类群微生物。
光合细菌及其制剂在农业、水产养殖、畜牧业以及水体净化等领域应用广泛，取得了较好的经济效益和社会效益。目前制备光合细菌产品的方法主要分为两大类，即固态培养法和液体培养法。由于光的限制，固体发酵一般采用浅层或薄层发酵工艺、干燥制备产品，制剂稳定、易于储藏和运输，但生产过程难以控制，难以实现规模化。目前使用的产品大多为液态发酵工艺制备的液态制剂，液态制剂起效快，但基本上以原始培养液形式面世，单位液体制剂中有效菌量相对较低，约为109cell/ml数量级，液态制剂产品体积大、包装容器费用高、运输成本较高。而且，生产高质量液态制剂对生产设备和灌装设备要求很高，生产过程必须全程控制无菌操作，需要对培养基和培养设备进行彻底灭菌，灌装也需要昂贵的设备和高要求的无菌环境，投资和生产成本很大。若达不到严格无菌要求，一旦某个环节控制不严而使液态菌剂不纯，或采用非无菌工艺（开发体系）生产的液态制剂，产品在包装、储存和运输过程中杂菌繁殖，甚至导致产品变质，将严重影响产品质量。因此，解决液态光合细菌制剂面临的制剂稳定、储存和运输问题，是摆在生产者面前紧迫的问题。将液态制剂浓缩制，或干燥制备成固体制剂，是维持光合细菌产品制剂稳定的重要策略，不仅制剂储存稳定性提高，而且也降低运输成本。
将液态发酵工艺生产的液态制剂浓缩或干燥的方法和工艺，目前已经很多研究并普遍应用，达到了制剂稳定的目的。概括起来浓缩和干燥的方法主要包括两类：（1）直接辅料吸附干燥法：运用的载体物质很多，如：稻壳粉、谷糠、麦麸、淀粉、轻质碳酸钙、沙土或无污染的土壤等多种有机物或无机物，以及它们的组合。然后用气流干燥、低温真空干燥、流化低温干燥和喷雾干燥法等。（2）液态制剂浓缩加辅料干燥法，浓缩的方法已有很多，主要包括自然沉降法、絮凝沉降法、絮凝过滤法、吸附沉降法、高速离心法、超滤法等6类方法；浓缩制剂直接干燥或加入辅料干燥，根据浓缩程度不同，可采用多种方法干燥，诸如：气流干燥、低温真空干燥、喷雾干燥、真空冷冻干燥等；尽管光合细菌菌剂浓缩和干燥的方法很多，各有其特点，在生产光合细菌高浓缩制剂和固态制剂方面发挥了重要作用，探索光合细菌制剂的新思路和新方法，为生产实践服务将一直受到重视。
光合细菌具有较强的趋光贴壁性，有些菌株贴壁现象十分严重，特别是光源管贴壁，严重地影响了光的穿透率，制约了光合细菌在光生物反应器中的生长速率。然而，利用光合细菌趋光贴壁现象这一原理收集光合细菌菌体细胞，高效生产超浓缩光合细菌具有重要的探索意义。王育锋等利用光合细菌的趋光特性，发明了一种培养和浓缩光合细菌一体装置（实用新型专利：ZL 922119846.2），其装置的设计思路为：利用外照光源，在圆形培养容器内设置矩形菌体毛刷，培养过程中菌体在内壁聚集，放出大部分培养液后，利用矩形菌体毛刷刷下菌体，可制备浓缩20~50倍的菌液。虽然毛刷刷洗管壁能够得到浓缩菌液，但很难直接刮取菌体；外置光源光能利用率低，大容量反应器中央存在光照暗区，或者菌体密度较高时透光的距离和光强衰减，光合细菌的生长受到影响，培养周期长，生产效率低。因此，只有实现高效利用光能，实现连续规模化液体培养工艺，高效、经济地生产超浓缩光合细菌菌体制剂，才能更符合生产实践发展的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法，以实现在光合细菌连续培养、连续收集获得超浓缩光合细菌菌体，操作简单，节能经济。
为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法，在培养容器中，按常规方法配制液体培养基并接种，按照现有搅拌和控温方式进行光合细菌的培养；将菌体吸附收集装置安置在培养容器上，菌体吸附收集装置的光源套管竖直插入培养液中，在光合细菌培养过程中，菌体吸附收集装置为光合细菌生长提供光照的同时，不断吸附贴壁的光合细菌菌体；培养一段时间，培养液中的光合细菌将吸附在菌体吸附收集装置的光源套管外壁上，从培养液中取出菌体吸附收集装置，刮取光源套管外壁吸附的光合细菌菌泥，再将菌体吸附收集装置的光源套管置于培养液中，继续培养一段时间，重复取出菌体吸附收集装置、刮取菌泥、再置于培养液中的步骤，即不断地获得超浓缩光合细菌菌体；培养过程中通过补充养分，调节培养液pH，使光合细菌的培养能连续运行；将刮下的菌泥按一定比例与辅料混合，直接干燥粉碎或造粒干燥，即得到高含量光合细菌固体制剂。
所述菌体吸附收集装置分为单光源管菌体吸附收集装置和阵列光源管菌体吸附收集装置。在一个培养容器上可以适配安置多个菌体吸附收集装置。单光源管菌体吸附收集装置，可以从培养容器上逐个取出，逐个刮取光源套管上的菌泥。从培养容器安放的阵列光源管菌体吸附收集装置上，也可以逐个取出单光源管菌体吸附收集装置，逐个刮取光源套管上的菌泥；也可以将阵列光源管菌体吸附收集装置整体取出，逐个刮取菌泥，或采用统一刮板统一刮取菌泥。
所述菌体吸附收集装置由光源、光源套管和法兰组成；光源套管上端开口而下端密封，法兰粘结在光源套管上，距套管上端开口一定距离，光源安置到光源套管内部，构成一个单光源管菌体吸附收集装置。若将多个单光源管菌体吸附收集装置的光源套管竖直穿过一块多孔平板，通过单光源管菌体吸附收集装置的法兰，固定或者安放在平板上，光源套管竖直悬挂，构成阵列光源管菌体吸附收集装置。
所述菌体吸附收集装置的光源套管为透光材质管材，如：硬质玻璃、有机玻璃、石英玻璃，管直径为50mm~200mm，长度为400mm~2300mm，上端开口，下端封闭；法兰的形状为圆板形或方板形，材质为不锈钢、硬质塑料或有机玻璃，法兰中央有一个中央孔，周围有许多螺栓孔；光源套管穿过法兰的中央孔，用粘合剂将法兰紧密粘结在光源套管上，法兰距套管上端开口的距离为50mm~200mm；匹配光源套管的长度，每个光源套管中安装1~3只节能日光灯管或一套LED光源带，构成一只单光源管菌体吸附收集装置；光源套管的上开口与光源的导线用橡胶密封套环密封并用固定卡卡紧，用于防水。2~20只单光源管菌体吸附收集装置安装在一块多孔平板上，构成阵列光源管菌体吸附收集装置；平板材质为金属、硬质有机玻璃或硬质塑料，形状为圆形、方形或长方形，在平板上按同心圆方式或矩阵式打2~20孔，取单光源管菌体吸附收集装置，自上而下穿过平板孔，每孔插入一只，通过法兰悬挂或者将法兰固定在平板上，各光源套管与平板垂直，光源套管呈悬挂式，组装成一套阵列光源管菌体吸附收集装置。
所述菌体吸附收集装置在光源套管底部粘接相同直径的金属短棒，或者在光源套管内底部放入适量铁砂，用于克服浮力，保证光源套管在培养液中竖直排列。
所述光合细菌培养过程中，控制适宜的温度，连续或者间隔一定时间，适量地补充培养液的营养成分、调节培养液适宜的pH，维持光合细菌良好生长和连续培养。每隔24小时~72小时收集一次光合细菌菌体。
所述光合细菌培养过程中，温度和pH不要求精确控制，控制在适宜的范围内即可。对大多数光合细菌种类来说，温度控制在25~37℃，pH在6.5~9.0范围内即可生长良好，每隔24小时~72小时收集一次光合细菌菌体。将温度控制在28~35℃，pH控制在7.0~8.0生长更好，每隔24小时~48小时收集一次光合细菌菌体。
本发明适合于趋光贴壁光合微生物细胞的收集和浓缩，尤其是生长过程中趋光贴壁光合细菌菌体细胞的收集和浓缩。
本发明是光合细菌规模化液体连续发酵连续收集菌体细胞一体化制备超浓缩光合细菌菌体的技术。基本思路是以光合细菌趋光贴壁为原理，将照明光源套管置于培养液中，提供光合细菌生长需要光的照，同时吸附菌体细胞，从光源套管上收集菌体得到浓缩的菌体细胞。克服现有趋光贴壁菌液浓缩技术外置光源光能利用率较低、难以获得超浓缩菌体、难以连续化生产、生产周期长、生产率较低、成本高的不足，高效利用光能、可采用连续液体培养工艺培养光合细菌，连续收集超浓缩光合细菌菌体，同时也明显不同于目前广泛使用的光合细菌液体浓缩工艺技术，减少了现有菌液浓缩工艺技术环节，实现了在光合细菌连续培养、连续收集获得超浓缩光合细菌菌体，操作简单，环保、节能又经济。
附图说明
图1是菌体吸附收集装置的结构示意图；
图2是单光源管菌体吸附收集装置的结构示意图。
标号说明
A.单光源管菌体吸附收集装置；B.阵列光源管菌体吸附收集装置；C.培养容器；
1.密封套环；2.光源套管上口；3.固定法兰；4.光源固定连接头；5.光源套管；6.日光灯管；7.光源套管下端堵头和金属短棒；8.阵列光源管菌体吸附收集装置的多孔平板.
具体实施方式
如图1和图2所示，一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法，在培养容器C中，按常规方法配制液体培养基并接种，按照现有搅拌和控温方式进行光合细菌的培养；将菌体吸附收集装置安置在培养容器C上，菌体吸附收集装置的光源套管5竖直插入培养液中，在光合细菌培养过程中，菌体吸附收集装置为光合细菌生长提供光照的同时，不断吸附贴壁的光合细菌菌体；培养一段时间，培养液中的光合细菌将吸附在菌体吸附收集装置的光源套管5外壁上，从培养液中取出菌体吸附收集装置，刮取光源套管外壁吸附的光合细菌菌泥，再将菌体吸附收集装置的光源套管置于培养液中，继续培养一段时间，重复取出菌体吸附收集装置、刮取菌泥、再置于培养液中的步骤，即不断地获得超浓缩光合细菌菌体；培养过程中通过补充养分，调节培养液pH，使光合细菌的培养能连续运行；将刮下的菌泥按一定比例与辅料混合，直接干燥粉碎或造粒干燥，即得到高含量光合细菌固体制剂。
所述菌体吸附收集装置分为单光源管菌体吸附收集装置A和阵列光源管菌体吸附收集装置B。在一个培养容器上可以适配安置多个菌体吸附收集装置。单光源管菌体吸附收集装置A，可以从培养容器C上逐个取出，逐个刮取光源套管上的菌泥。从培养容器C安放的阵列光源管菌体吸附收集装置上，也可以逐个取出单光源管菌体吸附收集装置，逐个刮取光源套管上的菌泥；也可以将阵列光源管菌体吸附收集装置整体取出，逐个刮取菌泥，或采用统一刮板统一刮取菌泥。
所述菌体吸附收集装置A由光源（日光灯管6）、光源套管5和固定法兰3组成；光源套管5上端开口而下端密封，固定法兰3粘结在光源套管5上，距光源套管上口2一定距离，光源通过光源固定连接头4安置到光源套管5内部，构成一个单光源管菌体吸附收集装置A。若将多个单光源管菌体吸附收集装置A的光源套管5竖直穿过一块多孔平板8，通过单光源管菌体吸附收集装置的固定法兰3，固定或者安放在平板上，光源套管5竖直悬挂，构成阵列光源管菌体吸附收集装置B。
所述菌体吸附收集装置的光源套管5为透光材质管材，如：硬质玻璃、有机玻璃、石英玻璃，管直径为50mm~200mm，长度为400mm~2300mm，上端开口，下端封闭；固定法兰3的形状为圆板形或方板形，材质为不锈钢、硬质塑料或有机玻璃，固定法兰3中央有一个中央孔，周围有许多螺栓孔；光源套管5穿过法兰的中央孔，用粘合剂将法兰紧密粘结在光源套管5上，固定法兰3距光源套管上口2的距离为50mm~200mm；匹配光源套管的长度，每个光源套管5中安装1~3只节能日光灯管6或一套LED光源带，构成一只单光源管菌体吸附收集装置A；光源套管上开口2与光源的导线用橡胶密封套环1密封并用固定卡卡紧，用于防水。2~20只单光源管菌体吸附收集装置安装在一块多孔平板上，构成阵列光源管菌体吸附收集装置；平板材质为金属、硬质有机玻璃或硬质塑料，形状为圆形、方形或长方形，在平板上按同心圆方式或矩阵式打2~20孔，取单光源管菌体吸附收集装置，自上而下穿过平板孔，每孔插入一只，通过法兰悬挂或者将法兰固定在平板上，各光源套管与平板垂直，光源套管呈悬挂式，组装成一套阵列光源管菌体吸附收集装置。
所述菌体吸附收集装置在光源套管底部粘接相同直径的金属短棒，或者在光源套管内底部放入适量铁砂，此光源套管下端堵头和金属短棒7用于克服浮力，保证光源套管在培养液中竖直排列。
实施例1
菌种：海洋紫色硫细菌YL28（Marichromatium gracile YL28），本室分离鉴定。培养基配方（g/L）：无水乙酸钠1.45，（NH4)2SO4 1.3，酵母浸出粉0.1，Mg2SO4 0.1，CaCl2 0.75，KH2PO4 0.32，K2HPO4 0.48，NaCl 15~20，生长因子储存液1ml，微量元素储存液1ml，加蒸馏水至1L。
将单光源管菌体吸附收集装置安装在培养容器C上：菌体吸附收集装置的光源管总长度为420mm，直径为50mm，材质为透明有机玻璃管材，内置光源为20瓦节能灯管1只。培养容器为透明有机玻璃圆柱型容器，内径为200mm，罐体高度为420mm。按配方配制液体培养基，起始pH约为7.0，灭菌冷却至约35℃，通过电磁泵将培养基泵入反应容器中，按有效容积的5%（v/v）接入液体种，有效容积约12L，有效光源管长度（浸入液体中的长度）约为300mm。
第一种培养方式：循环搅拌，控制培养液温度约（33±1）℃，开启光源培养。培养72小时，取出菌体吸附装置刮取光源管上的菌体，每间隔48小时刮取菌体一次，调节一次调节pH约为8，补充起始培养基营养液约30%，继续培养8天，共收集菌体5次，收集菌体65.93g，平均每次每米光源管收集44.0g。
第二种培养方式：循环搅拌，控制培养液温度约（28±1）℃，开启光源培养。培养72小时，取出菌体吸附装置刮取光源管上的菌体，每间隔36小时刮取菌体一次，调节一次调节pH约为8.5，补充起始培养基营养液约30%，继续培养6天，共收集菌体5次，收集菌体61.5g，平均每次每米光源管收集41.0g。
第三种培养方式：循环搅拌，控制培养液温度约（30±1）℃，开启光源培养。每隔12小时调节一次调节pH约为7，培养72小时，取出菌体吸附装置刮取光源管上的菌体，每间隔24小时刮取菌体一次，补充起始培养基营养液约30%，继续培养4天，共收集菌体5次，收集菌体67.0g，平均每次每米光源管收集44.7g。
实施例2
菌种和培养基配制按实施例1方法进行。
将阵列4只光源管菌体吸附收集装置安装在培养容器上，菌体吸附收集装置的光源管总长度为2300mm，直径为60mm，内置光源为30瓦节能灯管2只。培养容器为圆柱型容器，内径为4000mm，罐体高度为2000mm。按配方配制培养基，起始pH约为7.0，灭菌冷却至约35℃，通过电磁泵将培养基泵入反应容器中，按有效容积的5%（v/v）接入液体种，有效容积约200L，有效光源管长度约为2000mm。循环搅拌，控制培养液温度约（30±1）℃，开启光源培养。每隔12小时调节一次调节pH约为7，培养72小时，取出菌体吸附装置刮取光源管上的菌体，每间隔36小时刮取菌体一次，补充浓缩10倍的新鲜培养基一次，继续培养6天，共收集菌体5次，收集菌体1862g，每次平均收集菌体372.4g，平均每次每米光源管收集46.55g。
生产效率分析：
按30天计算，在约为200L的圆柱形培养容器中进行光合细菌的培养，采用阵列4只、每只有效长度为2m的光源管菌体吸附收集装置收集菌体，按照实施例2每次的平均生产量372.4g计算。从培养72小时收集第一次，然后每36小时收获一次菌体，收集18批，共收集菌体30.516kg。在同样的培养容器和光照条件下分批培养，每一批次培养5天，共收获6批；通过离心收集细胞，每升培养液收集5.62g菌体，收集菌体总量为6.744kg[计算公式：5.62（g/L）×200（L）×6（批）÷1000]。由此可见，光源管菌体吸附收集装置收集的菌体量是分批培养获得菌体量的5倍，生产效率明显提高。
本发明的技术优势和特点
一、本发明实现了光合细菌连续培养连续收集菌体细胞一体化，在培养过程中收集超浓缩菌体。培养过程连续化，采用光照厌氧并限制有机物碳源的方法，培养菌体始终处于优势、生长快、污染程度低。克服了现有分批培养周期长、趋光贴壁透光性差，生产效率低缺点；减少了现有菌液浓缩工艺环节，降低了菌液浓缩能源和时间消耗；生产效率提高，生产成本降低。
二、利用光合细菌生长趋光贴壁的原理，采用光源管细胞吸附法收集菌体细胞，与现有趋光贴壁菌液浓缩的方法相比具有明显优势，克服了外置光源利用率低、浓缩程度低和难以实现连续生产的不足，具有光能利用率高、菌体生长快，连续培养连续吸附收集菌体细胞，浓缩程度高的优势。本发明采用光源管菌体吸附收集装置，将光照培养、吸附收集菌体两个工艺和二为一，直接收集超浓缩菌体细胞，降低了菌体浓缩过程的能耗。菌体浓缩程度高，含水量少，进一步脱水干燥耗能低。
三、本发明采用光源管菌体吸附收集装置收集菌体细胞的方法，间隔一定时间刮取光源套管外壁的光合细菌菌体，避免了因贴壁而造成的光强衰减，菌体一边生长，一边吸附取出菌体，菌悬液透光性好，菌体生长快，生产效率高，节能、经济。
四、本发明方法和装置相对简单和成本低廉、适用范围广。可以根据反应器的形状设计加工阵列光源管菌体吸附收集装置，适用于水泥池槽、圆柱形和立方体形等各种形状的反应器；通过支架或漂浮，甚至可用于局部自然水域，应用范围广泛。光源管菌体吸附收集装置，加工简单，成本低廉，操作方便，生产规模可大可小，进一步改进可实施半机械化和机械化操作。
Claims (7)
1.一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法，在培养容器中，按常规方法配制液体培养基并接种，按照现有搅拌和控温方式进行光合细菌的培养；其特征在于：将菌体吸附收集装置安置在培养容器上，菌体吸附收集装置的光源套管竖直插入培养液中，在光合细菌培养过程中，菌体吸附收集装置为光合细菌生长提供光照的同时，不断吸附贴壁的光合细菌菌体；培养一段时间，培养液中的光合细菌将吸附在菌体吸附收集装置的光源套管外壁上，从培养液中取出菌体吸附收集装置，刮取光源套管外壁吸附的光合细菌菌泥，再将菌体吸附收集装置的光源套管置于培养液中，继续培养一段时间，重复取出菌体吸附收集装置、刮取菌泥、再置于培养液中的步骤，即不断地获得超浓缩光合细菌菌体；培养过程中通过补充养分，调节培养液pH，使光合细菌的培养能连续运行；将刮下的菌泥与辅料混合，直接干燥粉碎或造粒干燥，即得到高含量光合细菌固体制剂；
所述菌体吸附收集装置分为单光源管菌体吸附收集装置和阵列光源管菌体吸附收集装置，在一个培养容器上适配安置多个菌体吸附收集装置；
所述菌体吸附收集装置由光源、光源套管和法兰组成；光源套管上端开口而下端密封，法兰粘结在光源套管上，距套管上端开口一距离，光源安置到光源套管内部，构成一个单光源管菌体吸附收集装置；
所述多个单光源管菌体吸附收集装置的光源套管竖直穿过一块多孔平板，通过单光源管菌体吸附收集装置的法兰，固定或者安放在平板上，光源套管竖直悬挂，构成阵列光源管菌体吸附收集装置。
2.如权利要求1所述的一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法，其特征在于：所述菌体吸附收集装置的光源套管为透光材质管材，管直径为50mm～200mm，长度为400mm～2300mm，上端开口，下端封闭；法兰的形状为圆板形或方板形，材质为不锈钢、硬质塑料或有机玻璃，法兰中央有一个中央孔，周围有多个螺栓孔；光源套管穿过法兰的中央孔，用粘合剂将法兰紧密粘结在光源套管上，法兰距套管上端开口的距离为50mm～200mm；匹配光源套管的长度，每个光源套管中安装1～3只节能日光灯管或一套LED光源带，构成一只单光源管菌体吸附收集装置；光源套管的上开口与光源的导线用橡胶密封套环密封并用固定卡卡紧。
3.如权利要求1所述的一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法，其特征在于：2～20只所述的单光源管菌体吸附收集装置安装在一块多孔平板上，构成阵列光源管菌体吸附收集装置；平板材质为金属、硬质有机玻璃或硬质塑料，形状为圆形、方形或长方形，在平板上按同心圆方式或矩阵式打2～20孔，取单光源管菌体吸附收集装置，自上而下穿过平板孔，每孔插入一只，通过法兰悬挂或者将法兰固定在平板上，各光源套管与平板垂直，光源套管呈悬挂式，组装成一套阵列光源管菌体吸附收集装置。
4.如权利要求1所述的一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法，其特征在于：所述菌体吸附收集装置在光源套管底部粘接相同直径的金属短棒，或者在光源套管内底部放入铁砂。
5.如权利要求1所述的一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法，其特征在于：所述光合细菌培养过程中，控制温度，连续或者间隔一段时间，补充培养液的营养成分、调节培养液适宜的pH，维持光合细菌良好生长和连续培养；每隔24小时～72小时收集一次光合细菌菌体。
6.如权利要求5所述的一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法，其特征在于：所述光合细菌培养过程中，温度控制在25～37℃，pH在6.5～9.0范围内，每隔24小时～72小时收集一次光合细菌菌体。
7.如权利要求5所述的一种高效连续收集超浓缩光合细菌菌体的方法，其特征在于：所述光合细菌培养过程中，温度控制在28～35℃，pH控制在7.0～8.0，每隔24小时～48小时收集一次光合细菌菌体。
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