CN102977106A - 一类具有外周镇痛作用的κ阿片受体激动剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)的κ阿片受体激动剂或其药学上可接受的盐。此类化合物有很强的体外激动κ阿片受体的活性，EC50均为nM水平，其中活性最强的化合物的EC50为9.57±0.19nM，可用于外周镇痛。镇痛试验的结果表明，扭体抑制率与化合物浓度存在剂量依赖关系。

Description

一类具有外周镇痛作用的κ阿片受体激动剂
技术领域
本发明涉及一类κ阿片受体激动剂，可以在激活受体后产生外周镇痛作用。
背景技术
κ阿片受体(κ-opioid receptor，OP2，KOR)属于G蛋白偶联的7次跨膜受体超家族成员中的一种亚型。研究表明，κ阿片受体与痛觉调节、利尿作用、神经内分泌物的分泌有关。κ阿片受体激活后通过Gi蛋白调节能够抑制腺苷酸环化酶(AC)活性，降低细胞内环腺苷酸(cAMP)的水平，抑制蛋白激酶A(PKA)及其调控的蛋白质磷酸化，发挥镇痛作用。
κ阿片受体(κ-opioid receptor，OP2，KOR)属于G蛋白偶联的7次跨膜受体超家族成员中的一种亚型。研究表明，κ阿片受体与痛觉调节、利尿作用、神经内分泌物的分泌有关。κ阿片受体激活后通过Gi蛋白调节能够抑制腺苷酸环化酶(AC)活性，降低细胞内cAMP的水平，抑制蛋白激酶A(PKA)及其调控的蛋白质磷酸化。初级感觉神经元内及其外周末梢上存在着κ阿片受体，在炎症及神经损伤的情况下，κ阿片受体合成增加并转运到神经末梢或者受损部位，增加传导痛觉冲动的神经纤维中的κ阿片受体的表达，增强外周镇痛作用。
疼痛是一种复杂的生理心理活动，是临床上最常见的症状之一。它包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感觉，以及机体对伤害性刺激的痛反应(躯体运动性反应和/或内脏植物性反应，常伴随有强烈的情绪色彩)。痛觉可作为机体受到伤害的一种警告，引起机体一系列防御性保护反应。但另一方面，疼痛作为报警也有其局限性(如癌症等出现疼痛时，已为时太晚)。而某些长期的剧烈疼痛，对机体已成为一种难以忍受的折磨。疼痛的感知同时涉及到感官和情感变化，尤其慢性疼痛，往往伴随着抑郁、焦虑及生活质量的下降。因此，镇痛是医务工作者面临的重要任务。阿片类药物在急性和慢性疼痛的治疗中发挥着重要的作用。虽然此类药物的在急性疼痛的感官鉴别中的特点在动物实验和临床调查中已经完整诠释，但是它们在慢性疼痛中的作用并没有深入研究。目前，应用于临床的外周镇痛药物主要为μ阿片受体镇痛药，如芬太尼类药物。还未有κ阿片受体镇痛药应用于临床。
近年来，大多数研究表明κ阿片受体的激活可以改变心脏功能仅有少数研究表明κ阿片受体与疼痛相关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗阿尔茨海默病的化合物，该化合物是κ阿片受体激动剂，对阿尔茨海默病有预防或者治疗作用。本发明所述的化合物包括含治疗有效量的化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。本发明采用高通量筛选技术，建立了κ阿片受体激动剂高通量筛选模型并应用于化合物大规模筛选，通过筛选一批从CHEMDIV公司购买的化合物并进行功能性验证寻找到了具有化学式(I)的κ阿片受体激动剂，同时对其进行相关的AD药效学和机制研究。
本发明的技术方案为：在中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)内稳定转染κ阿片受体，建立κ阿片受体激动剂高通量筛选模型，进行初筛，复筛，构效关系分析，在此基础上进行动物整体药效学实验，得到一类具有外周镇痛作用的候选药物。具体步骤如下：
步骤一：建立及培养稳定转染κ阿片受体的CHO细胞株。
步骤二：标准曲线的测定及最佳细胞数确定。
步骤三：阳性药验证。
步骤四：采用稳转细胞株和摸索的最佳检测条件对化合物进行κ阿片受体激动剂的高通量筛选，得到有明显量效关系的化合物。
步骤五：进行动物整体镇痛实验，得到一类具有外周镇痛作用的候选药物。
附图说明：
图1：标准曲线及最佳细胞数曲线
图2：阳性药(κ阿片受体特异性激动剂：U50,488)量效关系曲线
图3：化合物量效关系曲线
图4：化合物8对小鼠冰醋酸扭体试验扭体次数的影响
图5：化合物8对小鼠冰醋酸扭体试验潜伏期的影响
具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式
1.建立及培养稳定转染κ阿片受体的CHO细胞株。
应用重组酶介导的盒交换技术(Recombinase-Mediated Cassette Exchange，RMCE)批量构建G蛋白偶联受体细胞株，并使其稳定转染κ阿片受体，培养CHO-OP2细胞使其达到稳定生长状态。
2.标准曲线的测定及最佳细胞数确定。
为验证实验体系的正确性以及能筛选出可靠的κ阿片受体激动剂，在建立模型时需要测定标准曲线并确定最佳细胞数。待CHO-OP2细胞生长到80％的时用0.5mM EDTA的PBS消化细胞，离心去除上层液体，最后将细胞用刺激缓冲液重悬用于确定最佳细胞数。使用PerkinElmer公司的LANCETM cAMP 384Kit试剂盒，配制标准cAMP梯度稀释液及腺苷酸环化酶激活剂(forskolin)梯度稀释液。标准曲线测定方法：将cAMP的标准溶液4μmol/L(
Figure BSA00000822458200031
cAMP检测试剂盒自带)，用刺激缓冲液逐级稀释为终浓度4倍的工作浓度，cAMP与抗体溶液各5μl加入384孔板中共同孵育45分钟，加入10μl终止液，孵育一个小时后检测；最佳细胞数检测方法：将5mM的forskolin母液用刺激缓冲液逐级稀释为终浓度2倍的工作浓度，forskolin与含有细胞的抗体溶液各5l加入384孔板中共同孵育45分钟，加入10μl终止液，孵育一个小时后在EnVision微孔板测读仪上检测。根据forskolin量效曲线窗口(性噪比S/B)及曲线与cAMP标准曲线斜率相近的细胞浓度作为最佳细胞数。标准曲线及最佳细胞数确定见图1。
3.选用κ阿片受体选择性激动剂U50,488对所建立的高通量筛选模型进行验证并且根据量效曲线计算其的EC50。
阳性药测定方法：将23.8mM的U50,488母液，用刺激缓冲液逐级稀释为终浓度4倍的工作浓度，配置能引起最佳细胞数Ratio EC90效应的forskolin稀释液。阳性药U50,4882.5μl与含有最佳细胞数的抗体溶液5μl加入384孔板中共同孵育15分钟，再将forskolin稀释液2.5ul加入384孔板中孵育30分钟，加入10μl终止液再孵育一个小时后用EnVision微孔板测读仪检测。阳性药量效曲线见图2。
4.在上述的最佳检测条件下进行κ阿片受体激动剂的的初筛和复筛。
初筛与复筛过程相同，初筛只选用一个浓度对8万个化合物进行初步筛选，再选择初筛有效的化合物梯度稀释8个浓度进行复筛，过程如下：用Janus全自动加样工作站稀释化合物并吸取5μl转移到384孔板中，再用Multidrop自动加样仪将含有最佳细胞数的抗体溶液5μl加入384孔板中，两者共同孵育45分钟后，Multidrop自动加样仪将10μl终止液加入384孔板中，再次孵育一个小时，用EnVision微孔板测读仪检测。复筛得到一系列具有κ阿片受体激动作用的化合物，各个化合物的EC50见图3。
复筛实验结果
筛选得到的化合物可以根据母核的结构总结为一类，结构式与EC50如下：
1：5-苯基-7-(三氟甲基)-4，5，6，7-四氢吡唑并[1，5a]嘧啶
表1复筛得到的一类活性化合物结构
Figure BSA00000822458200042
表2复筛得到的活性化合物EC50
Figure BSA00000822458200051
动物行为学实验结果
实验方法：小鼠给药半小时后注射冰醋酸，观察并记录注射冰醋酸后20min小鼠的扭体次数及潜伏时间，结果见图4，图5。计算镇痛百分率，进行统计学处理，以T检验判断其显著性。镇痛百分率(％)＝(对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数)/对照组平均扭体次数
表3化合物10对小鼠冰醋酸扭体试验的影响
Figure BSA00000822458200052
Figure BSA00000822458200053
注：与对照组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01
结论：镇痛试验的结果表明，化合物10在高浓度时的镇痛效果稍弱于阳性药U50,488，效果较好。扭体抑制率与浓度存在剂量依赖关系。

Claims (3)

1.下式化合物或其药学上可以接受的盐：
Figure FSA00000822458100011
其中：
R1代表氢原子、氯原子或酰胺基，其中酰胺基氮原子上可连接六元环烷基或具有3-5个碳原子的低级烷基；
R2代表氢原子或酰胺基，其中酰胺基氮原子上可连接具有5-6个碳原子的环烷基或叔丙基；
R3代表氢原子、氟原子或溴原子。
2.权利要求1要求保护的式(I)的化合物或其药学上可以接受的盐用于制备κ阿片受体激动剂的用途。
3.按照权利要求2的用途，作为κ阿片受体激动剂，用于治疗外周疼痛。
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