CN102965440A - 一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法 - Google Patents

一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102965440A
CN102965440A CN2012105115479A CN201210511547A CN102965440A CN 102965440 A CN102965440 A CN 102965440A CN 2012105115479 A CN2012105115479 A CN 2012105115479A CN 201210511547 A CN201210511547 A CN 201210511547A CN 102965440 A CN102965440 A CN 102965440A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enos
rna
path
cam
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012105115479A
Other languages
English (en)
Inventor
潘连军
马洁桦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Original Assignee
Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital filed Critical Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority to CN2012105115479A priority Critical patent/CN102965440A/zh
Publication of CN102965440A publication Critical patent/CN102965440A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，包括检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量，和检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1三种蛋白量。本发明通过检测eNOS-NO通路中参与蛋白的表达及含量变化，进而提供一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法。

Description

一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法
技术领域
本发明涉及组织化学检测的方法，特别地，本发明涉及一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法。 
背景技术
血管内皮在阴茎的勃起过程中扮演了十分重要的角色, 血管内皮功能障碍是阴茎勃起功能障碍(ED)的病理基础之一, 并且，ED的发生往往早于其他伴有明显内皮损伤的心血管疾病如冠心病等，被认为是此类疾病的早期警报器。血管内皮细胞是循环血液与血管平滑肌细胞间的机械屏障，容易受到体内外多种因素如高血压、高血脂、高血糖、氧化应激、高同型半胱氨酸血症、吸烟等的损伤，受损后的血管内皮细胞功能尤其是内分泌功能失调，使其分泌的多种活性物质或是与这些活性物质有关的其他物质之间的平衡被打破，从而导致内皮损伤/功能障碍。 
保护阴茎血管内皮是勃起功能障碍治疗的新途径。现有研究证实, 雌激素通过直接效应(改善内皮功能、抑制血管平滑肌增殖、迁移)和间接效应(调节脂代谢、改善凝血纤溶系统功能和抗氧化作用) 改善血管功能，减弱有害刺激的细胞反应，是重要的心血管保护因素，雌激素是通过其受体对心血管内皮具有保护效应, 缺乏雌激素或其受体, 血管内皮易受损伤。雌激素受体(estrogenreceptor, ER)包括α和β2个亚型, 在血管内均有表达, 近年研究发现，阴茎海绵体内也存在ER，在包括啮齿类动物、兔等多个物种的阴茎中发现有ERα和ERβ的表达，且以ERβ为主。雌激素通过ER介导的血管保护作用涉及到与血管张力调控、内皮细胞凋亡、氧化应激、炎症反应、内皮祖细胞的增值与粘附等有关的多种分子，其中对内皮源性一氧化氮合酶 - 一氧化氮(eNOS-NO)途径相关分子的调控至关重要，此信号途径主要参与的蛋白有eNOS、小窝蛋白-1(caveolin-1)和钙调蛋白(Cam)，如何检测此信号途径中蛋白表达及含量的变化成为研究ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的重要问题。 
发明内容
本发明目的在于：通过检测eNOS-NO通路中参与蛋白的表达及含量变化，进而提供一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法。 
本发明采取的技术方案为：一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，包括检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量，和检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1三种蛋白量。 
所述eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量的检测，包括如下步骤： 
1) 组织总RNA的提取：
A. 选择刚刚死亡的ERβ缺陷型动物和正常动物，取部分阴茎中段组织冻存于液氮中，检测时从液氮中取冻存的阴茎组织，加入0.5 ml TRIzol试剂和液氮，充分研磨，直至阴茎组织成粉末状，最后补加0.5 ml TRIzol试剂，室温下静置5 min，保证样品体积不应超过TRIzol体积的10％，然后于4 ℃，12000×g离心15 min；
B. 取上清液置另一EP管中，每管加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15 s混匀；
C. 将匀浆的样品在室温下放置2～3 min，使核酸蛋白复合物完全分离，然后于 4 ℃，12000 ×g离心15 min；
D. 经离心后的样品分为三层，底层为黄色的有机相，上层为无色的水相和一个中间层，RNA主要存在于水相中，将水相转移到新的EP管中，加入等体积的异丙醇沉淀水相中的RNA，混匀并于室温放置10 min；
E. 于4 ℃，12000 ×g离心10 min，离心管底部会出现胶状RNA沉淀；
F. 移去上清，每管加入1 ml 75% 的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，于4 ℃，7600×g离心5 min；
G. 移去上清，沉淀在室温下干燥10 min，用适量的DEPC水溶解RNA沉淀, 用分光光度计测其浓度及纯度，取适量总RNA稀释后测定A260和A280的比值，计算RNA的浓度；
H. 取8 μl RNA样品用1.0%琼脂糖进行电泳，观察RNA的完整性；
2）反转录
使用Fermentas第一链cDNA合成试剂盒进行反转录反应，反应体系如下：
 5×Reaction buffer 4.0 μl
10 mmol/L dNTP 2.0 μl
Olig(dT)18引物 1.0 μl
RNA酶抑制剂 1.0 μl
M-MuLV反转录酶(200 U /μl) 1.0 μl
RNA模板 1 μg
无核酶水 补至20 μl
反应条件为：42 ℃反应60 min，70 ℃ 5 min 灭活，产物于-20 ℃保存待用；
3）聚合酶链式反应
在Genbank上查找小鼠Cam、caveolin-1、eNOS及β-actin的mRNA序列，取其保守区，使用primer 5.0软件对引物进行设计，引物序列为：
  
Figure 607325DEST_PATH_IMAGE001
反应体系如下：
2×Taq酶PCR反应混合液 12.5 μl
引物1(20 μmol/L) 1.5 μl
引物2(20 μmol/L) 1.5 μl
cDNA模板 2.0 μl
ddH2O 7.5 μl
反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸时间30 s，30～35 个循环，72 ℃延伸10 min；
4）电泳及观察分析
PCR产物采用10 V/cm的电压，在1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳完成后, 采用凝胶电泳成像分析系统观察、拍照，用Quantity-One软件分析目的基因和内参基因，即β-actin的灰度，以目的基因/β-actin的比值表示目的基因的相对表达量。
所述eNOS、Cam和小窝蛋白-1三种蛋白量的检测，包括如下步骤： 
1）选择刚刚死亡的ERβ缺陷型动物和正常动物，取部分阴茎中段组织，裂解液裂解阴茎组织, 提取总蛋白,蛋白核酸测定仪测各组蛋白浓度后进行蛋白定量, 定量后的总蛋白加入6倍的上样缓冲液混匀后沸水浴煮沸5 min；
2）制备SDS-PAGE, 每泳道加总蛋白30 mg, 在电泳缓冲液存在的情况下进行70V恒压电泳，待样品进入分离胶后，将电压调至90V, 当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源；接着，在转移缓冲液存在的情况下经湿转转移到PVDF膜上， eNOS、Cam、小窝蛋白-1的转膜条件分别为：350mA、150min；350mA、45min；350mA、65min ；50 g/L脱脂奶粉37℃下封闭1 h，1∶200稀释的一抗，即兔抗小鼠β-actin多克隆抗体、兔抗小鼠Cam多克隆抗体、兔抗小鼠小窝蛋白-1多克隆抗体、兔抗小鼠eNOS多克隆抗体，分别 4℃孵育过夜，次日封闭液洗膜5 min, 共3次, 再以TBST洗膜5 min, 共3次，加1∶800稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗37℃下封闭1h，封闭液洗膜5 min,共3次,再以TBST洗膜5 min, 共3次；
3）DAB显色约1 min, 蒸馏水终止显色反应, 实验结果拍照，用Quantity-One软件分析每个条带的灰度值, 以目的条带与β-actin条带灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。
所述电泳缓冲液配制方法为：称取3.0g Tris，甘氨酸14.4g，溶于900ml纯水中，充分混匀，溶解后加入10%SDS 10ml，定容至1000ml，混匀后室温保存备用。 
所述转移缓冲液配制方法为：称取Tris2.4g，甘氨酸11.5g，溶于700ml纯水中，充分溶解后，加入甲醇200ml，定容到1000ml，室温保存备用。 
所述6倍的上样缓冲液配制方法为：6ml上层胶缓冲液 Tris-HCl, 1.2gSDS, 少许溴酚兰，加热充分融解，加4ml甘油，加DTT 0.9255g充分混匀后分装，-20℃保存备用。 
所述裂解液为RIPA裂解液，配制方法为50mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl,1%NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，溶解混匀后于4℃保存备用，临用前加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，即PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。 
所述TBST配制方法为：先配制10×TBS缓冲液：NaCl 8 g,KCl 0.2 g,Tris 3 g, 800 mL ddH2O溶解，然后定容到1L；取1000mL TBS，加1mL Tween-20，混匀后即可使用，现配现用，4℃保存。 
所述封闭液配制方法为：脱脂奶粉5g，TBST 100mL，混匀。 
本发明所述的检测方法可检测出eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量及相关蛋白量的变化，进而可以检测ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响。 
附图说明
图1为内参β-actin、eNOS、小窝蛋白-1和Cam相关mRNA表达结果； 
图2 eNOS  mRNA表达定量结果；
图3小窝蛋白-1 mRNA表达定量结果；
图4 Cam  mRNA表达定量结果；
图5为内参β-actin、eNOS、小窝蛋白-1和Cam蛋白各分子显色结果； 
图6为为eNOS蛋白定量结果；
图7为小窝蛋白-1蛋白定量结果；
图8为Cam蛋白定量结果；
其中1为正常动物组，2为ERβ缺陷型动物组。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明进行详细说明。 
实施例1 
一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，包括检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量，和检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1三种蛋白量。
所述eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量的检测，包括如下步骤： 
1) 组织总RNA的提取:
A. 选择刚刚死亡的ERβ缺陷型动物和正常动物，取部分阴茎中段组织冻存于液氮中，检测时从液氮中取冻存的阴茎组织，加入0.5 ml TRIzol试剂和液氮，充分研磨，直至阴茎组织成粉末状，最后补加0.5 ml TRIzol试剂，室温下静置5 min，保证样品体积不应超过TRIzol体积的10％，然后于4 ℃，12000×g离心15 min；
B. 取上清液置另一EP管中，每管加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15 s混匀；
C. 将匀浆的样品在室温下放置2～3 min，使核酸蛋白复合物完全分离，然后于 4 ℃，12000 ×g离心15 min；
D. 经离心后的样品分为三层，底层为黄色的有机相，上层为无色的水相和一个中间层，RNA主要存在于水相中，将水相转移到新的EP管中，加入等体积的异丙醇沉淀水相中的RNA，混匀并于室温放置10 min；
E. 于4 ℃，12000 ×g离心10 min，离心管底部会出现胶状RNA沉淀；
F. 移去上清，每管加入1 ml 75% 的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，于4 ℃，7600×g离心5 min；
G. 移去上清，沉淀在室温下干燥10 min，用适量的DEPC水溶解RNA沉淀, 用分光光度计测其浓度及纯度，取适量总RNA稀释后测定A260和A280的比值，计算RNA的浓度；
H. 取8 μl RNA样品用1.0%琼脂糖进行电泳，观察RNA的完整性；
2）反转录
使用Fermentas第一链cDNA合成试剂盒进行反转录反应，反应体系如下：
 5×Reaction buffer 4.0 μl
10 mmol/L dNTP 2.0 μl
Olig(dT)18引物 1.0 μl
RNA酶抑制剂 1.0 μl
M-MuLV反转录酶(200 U /μl) 1.0 μl
RNA模板 1 μg
无核酶水 补至20 μl
反应条件为：42 ℃反应60 min，70 ℃ 5 min 灭活，产物于-20 ℃保存待用；
3）聚合酶链式反应
在Genbank上查找小鼠Cam、caveolin-1、eNOS及β-actin的mRNA序列，取其保守区，使用primer 5.0软件对引物进行设计，引物序列为：
 
Figure 37169DEST_PATH_IMAGE001
 
反应体系如下：
2×Taq酶PCR反应混合液 12.5 μl
引物1(20 μmol/L) 1.5 μl
引物2(20 μmol/L) 1.5 μl
cDNA模板 2.0 μl
ddH2O 7.5 μl
反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸时间30 s，30～35 个循环，72 ℃延伸10 min；
4）电泳及观察分析
PCR产物采用10 V/cm的电压，在1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳完成后, 采用凝胶电泳成像分析系统观察、拍照，用Quantity-One软件分析目的基因和内参基因，即β-actin的灰度，以目的基因/β-actin的比值表示目的基因的相对表达量。
所述eNOS、Cam和小窝蛋白-1三种蛋白量的检测，包括如下步骤： 
1）选择刚刚死亡的ERβ缺陷型动物和正常动物，取部分阴茎中段组织，裂解液裂解阴茎组织, 提取总蛋白,蛋白核酸测定仪测各组蛋白浓度后进行蛋白定量, 定量后的总蛋白加入6倍的上样缓冲液混匀后沸水浴煮沸5 min；
2）制备SDS-PAGE, 每泳道加总蛋白30 mg, 在电泳缓冲液存在的情况下进行70V恒压电泳，待样品进入分离胶后，将电压调至90V, 当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源；接着，在转移缓冲液存在的情况下经湿转转移到PVDF膜上， eNOS、Cam、小窝蛋白-1的转膜条件分别为：350mA、150min；350mA、45min；350mA、65min ；50 g/L脱脂奶粉37℃下封闭1 h，1∶200稀释的一抗，即兔抗小鼠β-actin多克隆抗体、兔抗小鼠Cam多克隆抗体、兔抗小鼠小窝蛋白-1多克隆抗体、兔抗小鼠eNOS多克隆抗体，分别 4℃孵育过夜，次日封闭液洗膜5 min, 共3次, 再以TBST洗膜5 min, 共3次，加1∶800稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗37℃下封闭1h，封闭液洗膜5 min,共3次,再以TBST洗膜5 min, 共3次；
3）DAB显色约1 min, 蒸馏水终止显色反应, 实验结果拍照，用Quantity-One软件分析每个条带的灰度值, 以目的条带与β-actin条带灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。
所述电泳缓冲液配制方法为：称取3.0g Tris，甘氨酸14.4g，溶于900ml纯水中，充分混匀，溶解后加入10%SDS 10ml，定容至1000ml，混匀后室温保存备用。 
所述转移缓冲液配制方法为：称取Tris2.4g，甘氨酸11.5g，溶于700ml纯水中，充分溶解后，加入甲醇200ml，定容到1000ml，室温保存备用。 
所述6倍的上样缓冲液配制方法为：6ml上层胶缓冲液 Tris-HCl, 1.2gSDS, 少许溴酚兰，加热充分融解，加4ml甘油，加DTT 0.9255g充分混匀后分装，-20℃保存备用。 
所述裂解液为RIPA裂解液，配制方法为50mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl,1%NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，溶解混匀后于4℃保存备用，临用前加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，即PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。 
所述TBST配制方法为：先配制10×TBS缓冲液：NaCl 8 g,KCl 0.2 g,Tris 3 g, 800 mL ddH2O溶解，然后定容到1L；取1000mL TBS，加1mL Tween-20，混匀后即可使用，现配现用，4℃保存。 
所述封闭液配制方法为：脱脂奶粉5g,TBST 100mL,混匀。 
本实施例所述方法所检测的eNOS-NO通路相关分子mRNA表达情况如图1-4所示，与1组相比, 2组eNOS、Cam表达减少,小窝蛋白-1表达上调, 差异具有统计学意义，即均P<0.05；本实施例所述方法所检测的eNOS-NO通路相关分子蛋白表达情况如图5-8所示，内参β-actin、eNOS、小窝蛋白-1和Cam蛋白分子量分别为42 000、133 000、22 000、16 000,结果显示：与1组相比, 2组eNOS、Cam表达减少, 小窝蛋白-1表达上调, 差异具有统计学意义，即P<0.05，本结果表明, ERβ基因缺失能够促进小窝蛋白-1的表达, eNOS-小窝蛋白-1复合物增多, 从而抑制eNOS的活性; 另外, 由于阴茎中以ERβ表达为主, ERβ基因的缺失导致雌激素参与Cam激活的途径受到抑制, 用于置换小窝蛋白-1的Cam减少, 从而eNOS减少。由此可见, ERβ基因缺失可引起eNOS表达减少, eNOS-NO通路表达下调, 即本发明可以检测ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响。 

Claims (9)

1.一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，包括检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量，和检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1三种蛋白量。
2.根据权利要求1所述的ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，其特征在于：所述eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量的检测，包括如下步骤：
1) 组织总RNA的提取：
A. 选择刚刚死亡的ERβ缺陷型动物和正常动物，取部分阴茎中段组织冻存于液氮中，检测时从液氮中取冻存的阴茎组织，加入0.5 ml TRIzol试剂和液氮，充分研磨，直至阴茎组织成粉末状，最后补加0.5 ml TRIzol试剂，室温下静置5 min，保证样品体积不应超过TRIzol体积的10％，然后于4 ℃，12000×g离心15 min；
B. 取上清液置另一EP管中，每管加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15 s混匀；
C. 将匀浆的样品在室温下放置2～3 min，使核酸蛋白复合物完全分离，然后于 4 ℃，12000 ×g离心15 min；
D. 经离心后的样品分为三层，底层为黄色的有机相，上层为无色的水相和一个中间层，RNA主要存在于水相中，将水相转移到新的EP管中，加入等体积的异丙醇沉淀水相中的RNA，混匀并于室温放置10 min；
E. 于4 ℃，12000 ×g离心10 min，离心管底部会出现胶状RNA沉淀；
F. 移去上清，每管加入1 ml 75% 的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，于4 ℃，7600×g离心5 min；
G. 移去上清，沉淀在室温下干燥10 min，用适量的DEPC水溶解RNA沉淀, 用分光光度计测其浓度及纯度，取适量总RNA稀释后测定A260和A280的比值，计算RNA的浓度；
H. 取8 μl RNA样品用1.0%琼脂糖进行电泳，观察RNA的完整性；
2）反转录：
使用Fermentas第一链cDNA合成试剂盒进行反转录反应，反应体系如下：
 5×Reaction buffer 4.0 μl 10 mmol/L dNTP 2.0 μl Olig(dT)18引物 1.0 μl RNA酶抑制剂 1.0 μl M-MuLV反转录酶(200 U /μl) 1.0 μl RNA模板 1 μg 无核酶水 补至20 μl
反应条件为：42 ℃反应60 min，70 ℃ 5 min 灭活，产物于-20 ℃保存待用；
3）聚合酶链式反应
在Genbank上查找小鼠Cam、caveolin-1、eNOS及β-actin的mRNA序列，取其保守区，使用primer 5.0软件对引物进行设计，引物序列为：
Figure 2012105115479100001DEST_PATH_IMAGE001
 
反应体系如下：
2×Taq酶PCR反应混合液 12.5 μl 引物1(20 μmol/L) 1.5 μl 引物2(20 μmol/L) 1.5 μl cDNA模板 2.0 μl ddH2O 7.5 μl
反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸时间30 s，30～35 个循环，72 ℃延伸10 min；
4）电泳及观察分析
PCR产物采用10 V/cm的电压，在1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳完成后, 采用凝胶电泳成像分析系统观察、拍照，用Quantity-One软件分析目的基因和内参基因，即β-actin的灰度，以目的基因/β-actin的比值表示目的基因的相对表达量。
3.根据权利要求1所述的ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，其特征在于：所述eNOS、Cam和小窝蛋白-1三种蛋白量的检测，包括如下步骤：
1）选择刚刚死亡的ERβ缺陷型动物和正常动物，取部分阴茎中段组织，裂解液裂解阴茎组织, 提取总蛋白,蛋白核酸测定仪测各组蛋白浓度后进行蛋白定量, 定量后的总蛋白加入6倍的上样缓冲液混匀后沸水浴煮沸5 min；
2）制备SDS-PAGE, 每泳道加总蛋白30 mg, 在电泳缓冲液存在的情况下进行70V恒压电泳，待样品进入分离胶后，将电压调至90V, 当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源；接着，在转移缓冲液存在的情况下经湿转转移到PVDF膜上， eNOS、Cam、小窝蛋白-1的转膜条件分别为：350mA、150min；350mA、45min；350mA、65min ；50 g/L脱脂奶粉37℃下封闭1 h，1∶200稀释的一抗，即兔抗小鼠β-actin多克隆抗体、兔抗小鼠Cam多克隆抗体、兔抗小鼠小窝蛋白-1多克隆抗体、兔抗小鼠eNOS多克隆抗体，分别 4℃孵育过夜，次日封闭液洗膜5 min, 共3次, 再以TBST洗膜5 min, 共3次，加1∶800稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗37℃下封闭1h，封闭液洗膜5 min,共3次,再以TBST洗膜5 min, 共3次；
3）DAB显色约1 min, 蒸馏水终止显色反应, 实验结果拍照，用Quantity-One软件分析每个条带的灰度值, 以目的条带与β-actin条带灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。
4.根据权利要求4所述的ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，其特征在于：所述电泳缓冲液配制方法为：称取3.0g Tris，甘氨酸14.4g，溶于900ml纯水中，充分混匀，溶解后加入10%SDS 10ml，定容至1000ml，混匀后室温保存备用。
5.根据权利要求4所述的ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，其特征在于：所述转移缓冲液配制方法为：称取Tris2.4g，甘氨酸11.5g，溶于700ml纯水中，充分溶解后，加入甲醇200ml，定容到1000ml，室温保存备用。
6.根据权利要求4所述的ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，其特征在于：所述6倍的上样缓冲液配制方法为：6ml上层胶缓冲液 Tris-HCl, 1.2gSDS, 少许溴酚兰，加热充分融解，加4ml甘油，加DTT 0.9255g充分混匀后分装，-20℃保存备用。
7.根据权利要求4所述的ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，其特征在于：所述裂解液为RIPA裂解液，配制方法为50mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl,1%NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，溶解混匀后于4℃保存备用，临用前加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，即PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
8.根据权利要求4所述的ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，其特征在于：所述TBST配制方法为：先配制10×TBS缓冲液：NaCl 8 g,KCl 0.2 g,Tris 3 g, 800 mL ddH2O溶解，然后定容到1L；取1000mL TBS，加1mL Tween-20，混匀后即可使用，现配现用，4℃保存。
9.根据权利要求4所述的ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，其特征在于：所述封闭液配制方法为：脱脂奶粉5g,TBST 100mL,混匀。
CN2012105115479A 2012-12-04 2012-12-04 一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法 Pending CN102965440A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012105115479A CN102965440A (zh) 2012-12-04 2012-12-04 一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012105115479A CN102965440A (zh) 2012-12-04 2012-12-04 一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102965440A true CN102965440A (zh) 2013-03-13

Family

ID=47795876

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012105115479A Pending CN102965440A (zh) 2012-12-04 2012-12-04 一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102965440A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101659994A (zh) * 2009-08-14 2010-03-03 中国人民解放军第四军医大学 一种雌激素受体拮抗剂类内分泌药物耐药性的预测方法
WO2010025736A2 (en) * 2008-09-05 2010-03-11 Aarhus Universitet Nuclear receptor sensor system in transgenic animal

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010025736A2 (en) * 2008-09-05 2010-03-11 Aarhus Universitet Nuclear receptor sensor system in transgenic animal
CN101659994A (zh) * 2009-08-14 2010-03-03 中国人民解放军第四军医大学 一种雌激素受体拮抗剂类内分泌药物耐药性的预测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
马洁桦等: "ERβ基因敲除对小鼠阴茎海绵体eNOS-NO通路基因表达的影响", 《生殖与避孕》 *
马洁桦等: "ERβ对小鼠阴茎海绵体血管内皮保护作用的实验研究", 《中华男科学杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Doghish et al. Circulating miR-148a-5p and miR-21-5p as novel diagnostic biomarkers in adult Egyptian male patients with metabolic syndrome
Ancarola et al. Cestode parasites release extracellular vesicles with microRNAs and immunodiagnostic protein cargo
Kruk et al. The multifunctional Ccr4–Not complex directly promotes transcription elongation
Suehiro et al. Genome-wide approaches reveal functional vascular endothelial growth factor (VEGF)-inducible nuclear factor of activated T cells (NFAT) c1 binding to angiogenesis-related genes in the endothelium
Chen et al. 17β-estradiol prevents cardiac diastolic dysfunction by stimulating mitochondrial function: a preclinical study in a mouse model of a human hypertrophic cardiomyopathy mutation
Chaniotou et al. Corticotropin-releasing factor regulates TLR4 expression in the colon and protects mice from colitis
Kim et al. Cinnamon subcritical water extract attenuates intestinal inflammation and enhances intestinal tight junction in a Caco-2 and RAW264. 7 co-culture model
Martos-Sitcha et al. Vasotocinergic and isotocinergic systems in the gilthead sea bream (Sparus aurata): an osmoregulatory story
Fang et al. Effect of endogenous galanin on glucose transporter 4 expression in cardiac muscle of type 2 diabetic rats
Feng et al. Protective effect of tanshinone IIA against cardiac hypertrophy in spontaneously hypertensive rats through inhibiting the Cys-C/Wnt signaling pathway
Čendula et al. Changes in STIM isoforms expression and gender-specific alterations in Orai expression in human heart failure
Tang et al. Tumor necrosis factor-alpha upregulated PHLPP1 through activating nuclear factor-kappa B during myocardial ischemia/reperfusion
Akhbari et al. Expression Level of Circulating miR-93 in Serum of Patients with Diabetic Nephropathy.
Cui et al. Effect of estrogen on the expression of GnRH and kisspeptin in the hypothalamus of rats during puberty
Magagnin et al. The mTOR target 4E‐BP1 contributes to differential protein expression during normoxia and hypoxia through changes in mRNA translation efficiency
Zhao et al. MiRNA-337 leads to podocyte injury in mice with diabetic nephropathy.
de Boer et al. Early expression of natriuretic peptides and SERCA in mild heart failure: association with severity of the disease
Dupont-Versteegden et al. Identification of cold-shock protein RBM3 as a possible regulator of skeletal muscle size through expression profiling
Zhao et al. Deficiency of S100 calcium binding protein A9 attenuates vascular dysfunction in aged mice
Tarabishi et al. Induction of Zf9 in the kidney following early ischemia/reperfusion
Vial et al. Lipid accumulation and mitochondrial abnormalities are associated with fiber atrophy in the skeletal muscle of rats with collagen-induced arthritis
CN106420791B (zh) miR-145-3p在制备预防或治疗多发性骨髓瘤疾病药物中的应用
CN102965440A (zh) 一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法
Zhang et al. Seasonal changes of androgen receptor, estrogen receptors and aromatase expression in the hippocampus of the wild male ground squirrels (Citellus dauricus Brandt)
Vijayalalitha et al. Role of long non-coding RNA in regulating ER stress response to the progression of diabetic complications

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130313