CN102959089A - 涉及鉴定参与疼痛的化合物的方法和用途以及诊断痛觉的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴定参与疼痛的化合物的方法、Lrrfip1核酸或Lrrfip1蛋白用于鉴定参与疼痛的化合物的用途以及涉及Lrrfip1核酸或Lrrfip1蛋白的诊断痛觉的方法。

Description

涉及鉴定参与疼痛的化合物的方法和用途以及诊断痛觉的方法
本发明涉及一种鉴定参与疼痛的化合物的方法、Lrrfip1核酸或Lrrfip1蛋白用于鉴定参与疼痛的化合物的用途以及涉及Lrrfip1核酸或Lrrfip1蛋白的诊断痛觉的方法。
身体疼痛是一种典型的感觉经历，其可被描述为有害刺激或身体伤害的不愉快的意识。个体通过多种日常伤害和疼痛以及有时通过更严重的损伤或疾病来经历疼痛。为了科学和临床目的，疼痛由国际疼痛研究协会(IASP)定义为“与实际或潜在的组织损伤有关或者就这样的损伤描述的不愉快的感觉和情感经历”。
任何类型的疼痛在美国都是医生会诊的最常见原因，每年促使半数美国人寻找医疗护理。其在许多医学病况中是主要的症状，显著干扰人的生活质量和一般机能。诊断是基于以不同的方式表征疼痛，根据持续时间、强度、类型(钝痛、灼痛、跳痛或刺痛)、来源或身体中的位置。通常不需要处理或者响应于简单措施(例如休息或吃镇痛药)疼痛就停止，因此这称为“急性”疼痛。但其亦可变成难治的并发展为称为慢性疼痛的病况，其中疼痛不再被认为是症状而是疾病本身。近年来，疼痛的研究已吸引了许多不同的领域，例如药理学、神经生物学、护理学、牙科学、物理治疗和心理学。
疼痛是身体防御系统的一部分，引起反射反应以从疼痛刺激中收缩，并帮助调节行为以在未来加大避免该特定有害情况。
疼痛的医学管理在急性疼痛和慢性疼痛之间已引起区别。急性疼痛是“正常的”疼痛，当弄伤脚趾、骨折、患有牙痛或在大量外科手术后步行时会感受到。慢性疼痛是一种“疼痛病”，日复一日，月复一月，都会感受到，并似乎不可能痊愈。
通常，医生更舒适地治疗急性疼痛，除其他原因外，其通常由软组织损伤、感染和/或炎症引起。通常用药物(一般是镇痛药)或用于移除原因和用于控制疼痛感觉的适当技术同时治疗。在一些情况下，急性疼痛治疗失败相当地可引起慢性疼痛。
用于治疗疼痛的一系列药物是已知的。然而，副作用和抗性是与已知镇痛药相关的常见问题。因此，美国成人的调查发现疼痛是人们使用辅助和备选药物的最常见原因也就不足为奇了。
这证明，仍需要用于疼痛治疗的新方法和靶标。
出乎意料地，现已发现Lrrfip1参与疼痛。在用于鉴定参与疼痛的基因的筛查测定中，研究了疼痛敏感性不同的三种不同的近交小鼠品系。多种基因的表达与小鼠品系的疼痛敏感性相关。在这些基因中，在疼痛敏感性和表达之间显示最相关的是Lrrfip1 (参见实施例)。因此，Lrrfip1是用于鉴定参与疼痛的化合物和用于诊断痛觉的引人关注的靶标。
因此，本发明在第一和第二方面提供一种鉴定参与疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 提供包含Lrrfip1核酸或者Lrrfip1蛋白或其功能活性变体的测试系统，
b) 将测试系统与测试化合物接触，和
c) 测定测试化合物对测试系统的作用，
其中，当相对于对照检测到测试化合物对测试系统的显著作用时，所述测试化合物被鉴定为参与疼痛的化合物。
本发明的第一方面涉及一种包含Lrrfip1核酸的测试系统，第二方面涉及一种包含Lrrfip1蛋白或其功能活性变体的测试系统。
可使用本发明的测试系统以便阐明参与疼痛的机制。特别地，测试系统可用于开发、鉴定和/或表征参与疼痛的物质，其与Lrrfip1核酸或蛋白相互作用，特别地激活或灭活Lrrfip1核酸或蛋白。鉴定的物质可为引人关注的治疗药物，其可用于治疗疼痛，尤其是神经性疼痛。备选地，Lrrfip1可用于诊断痛觉。
多种测试设计是本领域已知的，其可适合于本发明的测试系统。关于例示性测试的进一步详述在本发明的方法中提供。可使用测试系统以便测定测试化合物对测试系统的作用。技术人员将能够设计适用于特定目的测试方法的测试系统，例如通过加入与通行方法有关的所需要的另外物质。
除了Lrrfip1核酸或者蛋白或其功能活性变体外，本发明的测试系统还可包含一种或多种另外的组分。取决于测试设计和检测方法，测试系统可包含，例如已知的Lrrfip1配体、Lrrfip1信号转导的组分、用于检测的工具等。技术人员将能够使测试系统适应于研究设计，即能够选择合适的缓冲剂、辅因子、底物、一种或多种不同的抗体、标记物、酶或任何其他必需物质。测试系统可呈细胞系统或无细胞系统内，视主要条件而定。
在本发明方法的第一步中，提供包含Lrrfip1核酸(例如Lrrfip1基因或Lrrfip1 cDNA或Lrrfip1 mRNA或Lrrfip1启动子)或蛋白的测试系统。
Lrrfip1基因或同义的GCF2、TRIP或Flap基因编码转录阻遏蛋白Lrrfip1。Lrrfip1也称为富含亮氨酸重复无飞行能力相互作用蛋白1、LRR FLII相互作用蛋白1、TAR RNA相互作用蛋白、GC结合因子2、富含GC序列DNA结合因子、FLI-LRR相关蛋白1或短的Flap-1、H186 FLAP、tcf-9、tcf9、转录因子9或NEDD8缀合酶。
Lrrfip1蛋白属于LRRFIP家族。它是所知甚少的蛋白，与公认的转录因子家族几乎没有同源性。先前已将其鉴定为与黑腹果蝇的无飞行能力I的人直向同源物相互作用的蛋白。该蛋白作为转录阻遏蛋白起作用，其优先与富含GC的共有序列5'-AGCCCCCGGCG-3' (SEQ ID NO: 7)结合。已表明其调节TNF、EGFR和PDGFA的表达。因此，已报道Lrrfip1是TNF-α阻遏蛋白，其占据不产生TNF-α的细胞中TNT-α启动子的核苷酸308处的多态启动子位点。TNF-α 308启动子多态性是G→A转换，其与多种自身免疫病症统计上相关。一些研究已发现，其可在一些情况下直接介导TNF-α的转录增加。此外，Lrrfip1蛋白是NF-κB活性的正调节剂。已表明，其在动脉损伤后通过PDGFA阻遏来控制平滑肌细胞增殖，并与双链RNA结合。它也可与FLII相互作用。在Lrrfip1与乳腺肿瘤和成胶质细胞瘤之间似乎存在关联。Lrrfip1遍在地表达，并位于胞质和细胞核中。
人Lrrfip1由808个氨基酸组成(参见UniProtKB/Swiss-Prot Q32MZ4 (LRRF1_人; SEQ ID NO: 1)。氨基酸485-584构成DNA结合结构域，氨基酸128-250构成卷曲螺旋结构域，而氨基酸567-593代表富含Lys的结构域。
Figure 2011800152687100002DEST_PATH_IMAGE001
Figure 882931DEST_PATH_IMAGE002
在蛋白中存在若干氨基酸修饰。氨基酸16、115、116、120、124、521、581、618、638、713、714和733是磷酸丝氨酸残基，而氨基酸123、295、676和711是磷酸苏氨酸残基。
已报道这些同种型由可变剪接产生。同种型1 (标识符：Q32MZ4-1)如SEQ ID NO: 1所示，同种型2 (标识符：Q32MZ4-2) 与同种型1的不同在于缺失氨基酸137-160，而同种型3 (标识符：Q32MZ4-3)与同种型1的不同在于缺失氨基酸52-83和137-160。
已报道了一系列的天然变体，即，乳腺癌样品中的68 S → C (VAR_036037)、275 Q → R (VAR_027291) dbSNP、418 N → S (VAR_027292) dbSNP、609 E → K (VAR_027293) dbSNP、633 K → E (VAR_056111) dbSNP、645 P → L (VAR_027294) dbSNP、779 R → G (VAR_027295) dbSNP和783 H → D (VAR_027296) dbSNP。
人基因Lrrfip1定位于染色体2的2q37.3。
小鼠Lrrfip1由729个氨基酸组成(参见UniProtKB/Swiss-Prot Q3UZ39 (LRRF1_小鼠; SEQ ID NO: 2)。氨基酸序列465-567构成DNA结合结构域，氨基酸94-194构成卷曲螺旋结构域，而氨基酸530-563代表富含Lys的结构域。
Figure 2011800152687100002DEST_PATH_IMAGE003
在蛋白内存在若干氨基酸修饰。氨基酸16、83、84、88、92、302、501、614和658是磷酸丝氨酸残基，氨基酸91和239是磷酸苏氨酸残基。
已报道由可变剪接产生的三种同种型：同种型1 (标识符：Q3UZ39-1)如SEQ ID NO: 2所示，同种型2 (标识符：Q3UZ39-2)与同种型1的不同在于：
－氨基酸51 (E)被置换为
Figure 737754DEST_PATH_IMAGE004
－氨基酸104 (I)被置换为
Figure 2011800152687100002DEST_PATH_IMAGE005
－氨基酸193 (E)被置换为
Figure 392858DEST_PATH_IMAGE006
－氨基酸241-394 (GKA…IDK)被置换为
Figure 2011800152687100002DEST_PATH_IMAGE007
－且缺失氨基酸395-729。
同种型3 (标识符：Q3UZ39-3)与同种型1的不同在于，缺失氨基酸1-239，且氨基酸240 (L)被置换为M。
还已知Lrrfip1蛋白的另一种同种型，其可以登录号NP_001104782.1得自NCBI (美国国家生物技术信息中心(National Centre for Biotechnology Information); National Library of Medicine 38A, Bethesda, MD20894, USA; www.ncbi.nih.gov; 对应核酸序列：NM_001111312.1)。该同种型在实施例中被鉴定，并因此优选用于小鼠。
此外，例示出以下物种变体：
Figure 224285DEST_PATH_IMAGE008
因此，术语Lrrfip1亦涵盖天然存在的变体。
非天然存在的变体可通过有限数量的氨基酸缺失、插入和/或取代而获得，特别是缺失、插入和/或取代至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。
应该指出的是，本发明的Lrrfip1变体是功能活性变体，因为变体维持其生物学功能，例如其参与疼痛(例如作为疼痛表型“机械痛觉过敏”的表现)或补体经典途径。优选地，维持生物学功能被定义为具有天然存在的Lrrfip1活性的至少50%，优选至少60%，更优选至少70%、80%或90%，更加优选95%。可测定生物活性，如同技术人员所已知的。例如，疼痛表型“机械痛觉过敏”的表现可如实施例和Persson 等, 2009, Molecular Pain 5:7中的详述所测定。
变体可被修饰以便包含另外的组分。因此，变体可为具有由如本文详述的天然存在的Lrrfip1蛋白或其变体组成的结构域和至少一种另外的组分的分子。在一个优选实施方案中，变体可为包含(i) Lrrfip1蛋白或功能活性变体和(ii) 另外的蛋白组分的融合蛋白。例如，蛋白可与标记物偶联，标记物例如用于纯化目的的标签(例如，6 His (或HexaHis)标签、Strep标签、HA标签、c-myc标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签)。如果例如将需要高度纯化的Lrrfip1蛋白或变体，那么可使用两种或多种标记物(例如上文标记物或标签的组合)。在这种情况下，在两个或多个分离色谱步骤中纯化蛋白，在每种情况下使用第一标签的亲和力和然后使用第二标签的亲和力。这样的双标签或串联标签的实例是GST-His标签 (与多组氨酸标签融合的谷胱甘肽S-转移酶)、6xHis-Strep标签 (与Strep标签融合的6个组氨酸残基)、6xHis-标签100标签 (与哺乳动物MAP激酶2的12个氨基酸的蛋白融合的6个组氨酸残基)、8xHis-HA标签 (与血细胞凝集素表位标签融合的8个组氨酸残基)、His-MBP (与麦芽糖结合蛋白融合的His标签)、FLAG-HA标签 (与血细胞凝集素表位标签融合的FLAG标签)和FLAG-Strep标签。可使用标记物以便检测加标签的蛋白，其中可使用特异性抗体。合适的抗体包括抗-HA (例如12CA5或3F10)、抗-6 His、抗-c-myc和抗-GST。此外，Lrrfip1蛋白可与使得能够检测Lrrfip1的不同种类的标记物连接，例如荧光标记物或放射性标记物。在另一个实施方案中，Lrrfip1可为融合蛋白的一部分，其中第二部分可用于检测，例如具有酶促活性的蛋白组分。
在本发明的另一个实施方案中，Lrrfip1变体可为Lrrfip1片段，其中该片段仍是功能活性的。其可包括具有短的内部和/或C端和/或N端缺失的Lrrfip1蛋白(例如缺失至多20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸)。此外，Lrrfip1片段可如上文关于Lrrfip1蛋白的详述被进一步修饰。
备选地或另外地，如上文所述的Lrrfip1蛋白或其变体可包含一个或多个氨基酸取代。然而，优选半保守氨基酸取代并尤其优选保守氨基酸取代，其中氨基酸被化学相关的氨基酸取代。典型的取代在脂族氨基酸之间、在具有脂族羟基侧链的氨基酸之间、在具有酸性残基的氨基酸之间、在酰胺衍生物之间、在具有碱性残基的氨基酸之间或具有芳香族残基的氨基酸之间。典型的半保守和保守取代是：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
如果新的半胱氨酸仍为游离巯基，那么从A、F、H、I、L、M、P、V、W或Y变化为C是半保守的。此外，技术人员将认识到，立体苛求位置上的甘氨酸不应该被取代和P不应该被引入到具有α螺旋和β折叠结构的蛋白部分中。
具有取代的Lrrfip1蛋白或片段或变体可如上文关于Lrrfip1蛋白或片段或变体的详述被修饰。除非另有说明，否则在本发明的下述说明书中，关于Lrrfip1蛋白所提供的所有详述亦涉及其功能活性变体。
应该指出的是，可组合Lrrfip1蛋白的上述修饰。本发明的变体可为例如具有与其融合的标记物的Lrrfip1片段，或包含一个或多个氨基酸取代的Lrrfip1蛋白片段。
然而，最优选地，Lrrfip1蛋白是如上文详述的天然存在的Lrrfip1蛋白，仍更优选地，是天然存在的人Lrrfip1蛋白(例如SEQ ID NO: 1)。
术语Lrrfip1核酸涵盖编码上文Lrrfip1蛋白以及其天然存在和非天然存在的变体(如本文定义)的核酸。优选地，该术语涉及Lrrfip1基因的编码或非编码区，其中这些部分具有相关的尺寸以便对该基因特异。那些区的实例是内含子、外显子或调节元件(例如Lrrfip1启动子)。
最优选的Lrrfip1核酸编码如上文详述的天然存在的Lrrfip1蛋白，仍更优选地，编码天然存在的人Lrrfip1蛋白(例如SEQ ID NO: 1)。核酸可为由携带遗传信息的单体核苷酸链组成的任何大分子或形成细胞内结构。最常见的(并因此优选的)核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。最优选地，术语Lrrfip1核酸涉及Lrrfip1基因、启动子、DNA、cDNA或mRNA。
人工核酸包括肽核酸(PNA)、吗啉代核酸和锁定核酸(LNA)以及甘醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些中的每一个与天然存在的DNA或RNA的区分在于分子骨架的改变。
在本发明方法的第二步中，将包含Lrrfip1核酸或者蛋白或其功能活性变体的测试系统与物质或测试化合物在适合于对测试系统具有作用和检测该作用的条件下接触一定的时间。
合适的条件包括适宜的温度和溶液以避免例如所涉及的蛋白变性或以维持活细胞(如果存在)。合适的条件将取决于所选择的具体测试系统，且技术人员将能够基于他的一般知识来选择。孵育步骤可变化于约5秒至数小时，优选从约5分钟至约24小时。然而，孵育时间将取决于测定形式、标记物、溶液体积、浓度等。虽然测定可在温度范围内(例如10℃-40℃)进行，但是通常将在周围温度下进行测定。
用本发明的测试系统测试的物质可为具有任何化学性质的任何测试物质或测试化合物。它可已知为用于疾病的药物或药剂。备选地，它在另一实施方案中可为尚不知具有治疗作用的已知化合物，化合物可为新的或迄今为止未知的化合物。该物质亦可为测试物质或测试化合物的混合物。
在本发明筛查方法的一个实施方案中，测试物质以化合物文库的形式提供。化合物文库包括多种化合物，并已从任何多种来源(包括化学合成的分子或天然产物)组装(assemble)或已通过组合化学技术产生。它们尤其适用于高通量筛查，并可由特定结构的化合物或特定生物体(例如植物)的化合物组成。在本发明的上下文中，化合物文库优选为包含蛋白和多肽或小的有机分子的文库。优选地，小的有机分子大小小于500道尔顿，特别是可溶性非低聚物有机化合物。
在本发明方法的第三步中，检测测试化合物对测试系统的作用。在下文，将更详细地描述一系列不同的检测系统。然而，应该理解，这些是例示性的且其他测试系统和方法亦可是合适的。
如果测试化合物对测试系统具有明确和显著的作用，那么该测试化合物被鉴定为参与疼痛的化合物。为此，将测试化合物的作用与对照(特别是阴性对照)比较。
对照是测试方法的一部分，因为它们可排除或最小化意想不到的影响(例如背景信号)。使用对照实验以研究变量对特定系统的作用。在一个对照实验中，已(或被认为)改变了一组样品，而另一组样品预期显示没有变化(阴性对照)或预期显示确定的变化(阳性对照)。可在一次测试运行中与测试物质一起测定对照。它可在测定测试化合物的作用之前或之后来测定，或者它可为已知值。
对测试系统具有作用的测试化合物可引起测试系统的信号的改变、增加或下降。在本发明的上下文中，如果与测试化合物接触的测试系统产生明显低于或高于对照(例如不与测试化合物接触的测试系统)信号的信号，那么测试化合物与对照相比具有作用。本领域的技术人员知道评估是否两个值彼此显著不同的统计方法，例如“学生”t检验或卡方检验。此外，技术人员知道如何选择合适的对照。
在一个优选实施方案中，测试系统的信号被测试化合物改变对照(阳性或阴性)的至少10%、优选至少25%、更优选至少50%、更加优选至少75%和最优选至少90%。
对于本发明的方法，可使用任何合适的检测方法。可视测试系统的性质和待测试的物质选择合适的方法。
方法可为多相或均相测定。本文使用的多相测定是包括一个或多个洗涤步骤的测定，而在均相测定中不需要这样的洗涤步骤。仅混合和测量试剂与化合物。
测试方法可为连续测定或不连续测定。连续测定提供反应速率，而无需进一步工作。有许多不同种类的连续测定。在分光光度计测定中，通过测量吸光度的变化来跟踪反应过程。荧光是当一个分子在吸收一种波长的光后所发射的不同波长的光。荧光测定使用底物与产物的荧光差异以测量酶反应。这些测定通常比分光光度计测定灵敏得多，但当暴露于光时会受到由杂质和许多荧光化合物的不稳定性所引起的干扰。量热法是由化学反应释放或吸收的热量的测量。这些测定是非常普遍的，因为许多反应涉及热量中的一些变化并使用微量热计，而不需要很多的酶或底物。这些测定可用于测量不能以任何其他方法来测定的反应。化学发光是由化学反应所发射的光。一些酶反应产生光并可测量该光以检测产物形成。这些类型的测定可为极其灵敏的，因为产生的光可被感光胶片捕获几天或几个月，但可能难以定量，因为不是所有的由反应释放的光将被检测。静态光散射测量重量平均摩尔质量的产物和溶液中的大分子浓度。鉴于一个或多个物类在测量时间内的固定总浓度，散射信号是溶液的重量平均摩尔质量的直接测量，随着复合物形成或解离其可不同。因此，该测量定量复合物的化学计量学以及动力学。蛋白动力学的光散射测定是非常普遍的技术，其不需要酶。
不连续测定是，每隔一段时间从酶反应中取样品并在这些样品中测量产物产生或底物消耗的量。放射测定测量放射性到底物中的掺入或其从底物中的释放。在这些测定中使用最频繁的放射性同位素是14C、32P、35S和125I。因为放射性同位素可允许底物的单个原子的特异性标记，所以这些测定是极其灵敏和特异的。它们被频繁地用于生物化学且经常是测量粗提取物中的特异性反应的唯一方法。色谱测定通过由色谱将反应混合物分离为其组分来测量产物形成。这通常由高效液相色谱(HPLC)完成，但亦可使用较简单的薄层色谱技术。虽然该方法可需要许多材料，但是通过用放射性标签或荧光标签标记底物/产物可增加其灵敏度。
根据本发明，测试化合物的作用可能是通过与Lrrfip1核酸或蛋白的相互作用。因此，可通过检测(i) Lrrfip1核酸或蛋白与(ii) 测试化合物的复合物来测定测试化合物与Lrrfip1核酸或蛋白的相互作用/结合。下文详述检测两种或多种组分的复合物的合适方法。
备选地，可间接检测测试化合物的作用(例如结合)和对Lrrfip1核酸或蛋白的影响。为此，可检测Lrrfip1核酸或蛋白下游的作用。例如，可测定对涉及Lrrfip1的转录和翻译的作用。在一个实施方案中，检测Lrrfip1 mRNA或Lrrfip1蛋白的量。
设计来测量特定蛋白或其他核酸的存在情况或量的许多已知检测方法依赖于标签、标记物和标记的使用。可以多种方式标记测试系统或测试化合物的组分以使能够充分检测或纯化。在一个优选实施方案中，使用可检测的标记物以便检测对测试系统的作用。为此，可用至少一种可检测的标记物标记(i) 核酸或Lrrfip1蛋白、(ii) 测试化合物和/或 (iii) 测试系统的另外组分。
常见的标记方法可用于标记组分的一种或多种官能团。对于蛋白，这些官能团可为例如伯氨基，存在于各多肽链的N端和赖氨酸残基的侧链；巯基，存在于通过用还原剂处理二硫键或通过用试剂(例如琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA))修饰赖氨酸残基使之可用的半胱氨酸残基上；或碳水化合物基，通常位于抗体的Fc区，其可被氧化以产生用于偶联的活性醛。组分或化合物可用一系列不同物质标记，例如生物素(用于抗生物素蛋白-生物素化学)、酶、用于标记胺、巯基或其他官能团的活化荧光染料，例如FITC、荧光素、罗丹明、Cy染料或Alexa荧光素(Alexa fluos)。亦可使用放射性标记(例如3H、32P、35S、125I或14C)以及常见的酶标记(包括青霉素酶、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)。
在本发明一个实施方案中，标记物为放射性标记，特别是3H、32P、33P、35S、125I或14C。
在另一个实施方案中，标记物是一种或多种荧光标记物。合适的荧光标记物在本发明方法的上下文中描述。
在这些方法中特别有用的是使用靶特异性探针，探针可经由化学标签、标记物或标记检测。抗体是最常见的探针类型；其对特定抗原的结合亲和力使得那些靶标被“发现”并在复合物样品中被检测。然而，抗体自身是蛋白，除非它们被可视化标记或用被标记的另一分子辅助探测，否则它们在测定系统中不是可明确检测的。
标记物(或标签或标记)是能够指示另一物质或物质的复合物存在的任何种类的物质。标记物可为与被检测的物质连接或在被检测的物质中导入的物质。在分子生物学和生物技术中使用可检测的标记物以检测例如蛋白、酶促反应的产物、第二信使、DNA、分子的相互作用等。合适标记物或标签的实例包括荧光团、发色团、放射性标记、金属胶体、酶或化学发光分子或生物发光分子。荧光团的实例包括荧光素、罗丹明和璜基吲哚花青(sulfoindocyanine)染料Cy5。放射性标记的实例包括3H、14C、32P、33P、35S、99mTc或125I。酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和脲酶。本文详述另外的实例和优选的实施方案。
通过多种方法可将不同类型的化学标记或标签与第二或第一抗体以及其他分子缀合以促进其可视化(即检测和测量)。放射性同位素在过去被广泛使用，但它们是昂贵的、具有短的贮藏寿命、在信噪比中未提供改进并需要特殊操作和处理。酶和荧光团已在很大程度上取代放射性同位素作为用于测定的可检测标签。试剂和检测仪器中的许多进步使得这些较新的技术更加通用和强大。酶标签(例如辣根过氧化物酶(HRP))最常用于印迹法、免疫测定法和免疫组化法。荧光标签主要用于细胞成像、核酸扩增和测序以及微阵列；然而，荧光技术正在迅速发展以应用于所有类型的测定。
蛋白的检测经常涉及使用特异性抗体。因此，Lrrfip1蛋白或其变体的检测可包括特异性Lrrfip1抗体。抗Lrrfip1的抗体从商业供应商处可得(例如产品目录号: sc-66677或sc-66677 P，来自Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA；或者产品目录号： ab77598，来自Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)。备选地，可使用充分建立的用制备形式的抗原免疫动物的技术来产生抗体。辅助抗体生产和纯化的多种试剂是可得的，且多个公司专注于抗体生产服务。取决于待进行的应用，在供应的第一抗体中需要不同水平的纯度和不同类型的特异性。仅列举一些参数，抗体可为单克隆或多克隆的，作为抗血清或亲和纯化的溶液提供，和验证用于天然蛋白或变性蛋白检测。
识别靶抗原(本文中为Lrrfip1或其片段)的抗体称为“第一抗体”。如果该抗体用标签标记，那么可直接检测抗原。通常，然而，第一抗体不被标记用于直接检测。反而在第二步中应用用可检测的标签标记的“第二抗体”来探测与靶抗原结合的第一抗体。如此，抗原被间接地检测。另一种形式的间接检测涉及使用用亲和标签(例如生物素)标记的第一或第二抗体。然后第二(或第三)探针(例如用可检测的酶或荧光团标签标记的链霉亲和素)可用于探测生物素标签以产生可检测的信号。存在这些探测和检测策略的若干变化。然而，每一个取决于特异性探针(例如，第一抗体)，其存在情况与某种可测量标签(例如，在与其底物反应时其活性可产生有色产物的酶)直接或间接关联。
通常，在测定方法中需要不具有可检测标签的第一抗体和某种第二(间接)检测方法。然而，如果需要，几乎任何抗体可被生物素、HRP酶或几个荧光团之一标记。大多数第一抗体在小鼠、兔或几个其他物种之一中生产。几乎所有的这些抗体是IgG类的抗体。因此，生产和供应用于大多数应用和检测系统的即用型、标记的第二抗体对制造商而言是相对容易和经济的。即便如此，数百个选择仍是可得的，它们在纯度水平、IgG特异性和物种特异性以及检测标记方面不同。第二抗体的选择取决于其中产生第一抗体的动物种类(宿主种类)。例如，如果第一抗体是小鼠单克隆抗体，那么第二抗体必须是从非小鼠宿主获得的抗-小鼠抗体。
用生物素结合蛋白作为探针，生物素与抗生物素蛋白或链霉亲和素蛋白之间的高特异性亲和相互作用是多种检测和亲和纯化方法的基础。生物素非常小(244 道尔顿)，所以其与抗体或其他探针的共价连接很少干扰其功能。不过，其作为探针上标记的存在仍允许用抗生物素蛋白或链霉亲和素有效和特异的间接检测。用使在多种测定系统中能够检测的酶或荧光标签标记的纯化形式的两种生物素结合蛋白均是可得的。
酶标记是在印迹和免疫测定中用于检测的最常用的第二抗体(或链霉亲和素)标签。酶经由其活性提供可检测的信号；与特异性底物化学反应物质产生有色、光发射或荧光产物。虽然报告酶像β-半乳糖苷酶和荧光素酶已被成功用于制备探针，但是碱性磷酸酶(AP)和辣根过氧化物酶(HRP)是作为用于蛋白检测的标记最广泛使用的两种酶。用于与任一酶一起使用的生色、荧光和化学发光底物的阵列是可得的。
碱性磷酸酶通常分离自小牛肠道，是一种大的(140 kDa)蛋白，其催化来自底物分子的磷酸基水解，产生有色或荧光产物，或者作为反应的副产品释放光。AP在碱性pH (pH 8-10)时具有最佳酶促活性，可被氰化物、砷酸盐、无机磷酸盐和二价阳离子螯合剂(例如EDTA)抑制。作为用于蛋白质印迹的标记，AP提供超过其他酶的显著优势。因为其反应速率保持线性的，所以检测灵敏度可通过仅使反应进行较长的时间段来提高。
辣根过氧化物酶是40 kDa蛋白，其通过过氧化氢催化底物氧化，产生有色或荧光产物，或者作为反应的副产品释放光。HRP在接近中性pH最佳地起作用并可被氰化物、硫化物和叠氮化物抑制。关于酶和抗体两者的特异性活性，抗体-HRP缀合物优于抗体-AP缀合物。此外，其高周转率、良好稳定性、低成本和底物的广泛可得性使得HRP是用于大多数应用的酶选择。由于HRP酶的小的尺寸，通过使用多-HRP缀合的第二抗体可实现灵敏度的进一步增加，并对一些研究者而言可排除使用ABC型扩增系统的需要。
使用荧光显微术，用于检测的荧光标记过去被用于一小部分的细胞生物学应用，例如流式细胞术(FC)、荧光激活细胞分选术(FACS)和免疫组织化学(IHC)。直到最近，两种最常用的用于标记探针的荧光团是荧光素(异硫氰酸荧光素，FITC)和罗丹明(异硫氰酸四甲基罗丹明，TRITC)。其他标记包括荧光蛋白，例如多种形式的绿色荧光蛋白(GFP)和藻胆蛋白(别藻蓝蛋白、藻青蛋白、藻红蛋白和藻红蓝蛋白)。虽然具有产生用于检测的强烈荧光信号的能力，但是荧光蛋白可能难以优化用于缀合目的，并且可在结合测定中产生位阻或背景信号问题。
与使用酶标记相比，在印迹和免疫测定中使用荧光团缀合的探针需要较少的步骤，因为没进行有底物显色的步骤。虽然流程较短，但是荧光检测需要特殊设备且灵敏度没有用酶促化学发光系统可获得的灵敏度高。虽然没有与酶促检测一样灵敏，但是荧光检测法降低化学消耗并具有多重相容性的额外优势(在相同实验中使用超过一种荧光团)。
备选地或另外地，可使用两种标记物以便检测两种物质(例如测试化合物或已知Lrrfip1配体和Lrrfip1蛋白)的接近度。标记物可为例如一种放射性或荧光标记物和一种闪烁剂(例如用于闪烁接近测定)，或可使用两种荧光标记物(例如用于FRET)。在一个实例中，Lrrfip1蛋白和测试物质可用第一和第二标记物标记。假如测试物质与蛋白结合，那么标记因此非常接近，能量可从第一标记转移到第二标记，从而检测Lrrfip1蛋白与测试物质的相互作用。该测试可设计为竞争性结合测试，其中已知Lrrfip1配体携带标记之一。
合适的标记物组合的实例包括
- 放射性标记3H、33P、35S或14C、125I与闪烁剂(例如硅酸钇或聚乙烯基甲苯)组合，例如在微粒中区室化，或者
- 供体荧光标记物(例如荧光素、萤光黄、B-藻红蛋白、9-异硫氰酸吖啶、萤光黄VS、4-乙酰胺基-4'-异硫氰酰基茋-2，2'-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酰基苯基)-4-甲基香豆素、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯和4-乙酰胺基-4'-异硫氰酰基茋-2，2'-二磺酸衍生物)与受体荧光标记物(例如LC-Red 610、LC-Red 640、LC-Red 670、LC -Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、异硫氰酸四甲基罗丹明、罗丹明x异硫氰酸酯、异硫氰酸赤藓红、荧光素、二乙撑三胺五乙酸酯或镧系元素离子(例如铕或铽)的其他螯合物)组合。
作为通过抗体来检测的备选，可将本发明的方法设计为竞争性结合实验，其中研究测试物质取代已知Lrrfip1配体与Lrrfip1的结合。已知配体从该蛋白中的成功取代是对测试物质与蛋白结合的指示。在该方法中，标记已知的Lrrfip1配体是有利的，其使得能够方便测试(例如文库的)多种测试化合物，藉此不是每个测试化合物需要被标记。
配体是能够与生物分子(本文，例如Lrrfip1蛋白或核酸)结合并形成复合物的物质。其为通过分子间作用力(例如离子键、氢键和范德瓦尔斯力)与生物分子上的位点结合的分子。对接(docking)(结合)通常是可逆的(解离)。在生物系统中配体与其靶分子之间的实际不可逆共价结合是罕见的。与生物分子结合的配体可改变其活性，例如其激活下游信号转导的能力。配体包括抑制剂和激活剂。
抑制剂是与酶结合并减少其活性的分子。因为阻断酶的活性可调整代谢失衡，所以许多药物是酶抑制剂。不是所有与酶结合的分子都是抑制剂；酶激活剂与酶结合并增加其酶促活性。
抑制剂的结合可阻止结合配偶体与生物分子相互作用和/或阻碍生物分子成为活化的或激活的。抑制剂结合是可逆的或不可逆的。不可逆的抑制剂通常与生物分子反应并化学上改变它。这些抑制剂可例如改变对活性所需的关键氨基酸残基。与此相反，可逆抑制剂非共价地结合，并视这些抑制剂是否结合生物分子，产生不同类型的抑制。
选择性配体具有与非常有限类型的靶标(生物分子) (例如酶)结合的倾向，而非选择性配体与数种类型的靶标结合。这在药理学中起重要的作用，其中非选择性药物倾向于具有更多的有害作用，因为它们除了与产生所需作用的生物分子结合外还与若干其他生物分子结合。
对于竞争性结合实验，将已知配体用至少一种可检测的标记物标记并加入孵育步骤b)中。步骤b)后将结合的标记的配体与未结合的配体分开。可通过常见的分离步骤(例如过滤、离心、固定、相分离和移除液体等)进行分离。由该标记提供的信号量是对结合配体的量的指示，并因此亦是对与生物分子结合的测试化合物的量的指示，因为配体和测试化合物竞争结合生物分子。
在一个实施方案中，用于检测测试化合物作用的测定是SPA (闪烁接近测定)、FRET (荧光共振能量转移)测定、TR-FRET (时间分辨荧光共振能量转移)测定或FP (荧光偏振)测定。
SPA (闪烁接近测定)是一种用于生化筛查的技术类型，其允许在均相系统中进行广泛过程的生物学快速和灵敏的测量。参与SPA的珠子类型为微观尺寸，在珠子本身内存在受刺激时发射光的闪烁体。当放射性标记的分子与该珠子相互作用时刺激发生。该相互作用将引起珠子发射光，其可使用闪烁计数器来检测。
更详细地，当放射性标记的分子与珠子连接或非常接近时，光发射被刺激。然而，如果珠子保持不被放射性标记的分子结合，那么珠子将不被刺激以发射光。这由于，当离SPA珠子太远时，从未结合的放射性中释放的能量太分散，因此珠子不被刺激以产生信号。
氚被高度推荐，因为它非常适合SPA。这是由于1.5 µm的通过水的路径长度，其非常短。因此，当β-颗粒与闪烁体珠子在该1.5 µm的特定范围内时，有足够的能量以刺激闪烁体珠子来发射光。如果该距离介于超过1.5 µm，那么β-颗粒不能经过所要求的距离以刺激珠子，因为没有足够的能量。多种珠子涂层亦可得，其允许该方法应用于广泛的应用，例如酶测定和放射性免疫测定。
荧光共振能量转移(FRET)描述两个发色团之间的辐射自由能量转移。供体发色团在其激发状态可在非常接近时(通常<10 nm)通过非辐射长范围偶极-偶极偶联机制将能量转移至受体发色团。因为两种分子都是荧光的，所以能量转移经常被称为“荧光共振能量转移”，但是能量实际上不是通过荧光来转移。FRET是检测和定量蛋白-物质相互作用、蛋白-蛋白相互作用、蛋白-DNA相互作用以及蛋白构象变化的有用工具。对于监控蛋白与物质、一个蛋白与另一个蛋白或蛋白与DNA的结合，将一个分子用供体标记和另一个用受体标记，并将这些荧光团标记的分子混合。当它们以未结合状态存在时，在供体激发时检测到供体发射。在分子结合时，供体和受体被拉近，由于从供体到受体的分子间FRET，主要地观察到受体发射。用于FRET的合适伴侣是本领域已知的，且熟练的从业者将能够选择关于两种抗体的标记的合适组合。关于供体和相应的受体，本文使用的“相应的”指具有与供体激发谱重叠的发射谱的受体荧光部分。然而，两者信号应该可彼此分开。因此，受体发射谱的波长最大值应该比供体激发谱的波长最大值大优选至少30 nm、更优选至少50 nm (例如至少80 nm、至少100 nm或至少150 nm)。
可在FRET技术中与多种受体荧光部分一起使用的代表性的供体荧光部分包括荧光素、萤光黄、B-藻红蛋白、9-异硫氰酸吖啶、萤光黄VS、4-乙酰胺基-4'-异硫氰酰基茋-2，2'-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酰基苯基)-4-甲基香豆素、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯和4-乙酰胺基-4'-异硫氰酰基茋-2，2'-二磺酸衍生物。代表性的受体荧光部分，视使用的供体荧光部分，包括LC-Red 610、LC-Red 640、LC-Red 670、LC -Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、异硫氰酸四甲基罗丹明、罗丹明x异硫氰酸酯、异硫氰酸赤藓红、荧光素、二乙撑三胺五乙酸酯或镧系元素离子(例如铕或铽)的其他螯合物。可从例如Molecular Probes (Junction City, OR)或Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)获得供体和受体荧光部分。
备选地，时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)可用于本发明的测试系统。TR-FRET联合TRF (时间分辨荧光)和FRET原理。该组合结合TRF的低背景益处和FRET的均相测定形式。虽然上文已描述FRET，但是TRF利用镧系元素或任何其他具有长半寿期的供体的独特性质。用于TR-FRET的合适供体尤其包括镧系元素螯合物(穴状化合物)和一些其他金属配体复合物，其可具有在微秒-毫秒的时间范围内的荧光半寿期，因此其在微秒-毫秒测量时允许能量转移发生。荧光镧系元素螯合物在七十年代晚期已被用作能量供体。常用的镧系元素包括钐(Sm)、铕(Eu)、铽(Tb)和镝(Dy)。由于其特定的光物理和光谱性质，镧系元素的复合物对于生物学中的荧光应用而言相当引领关注。特别地，当与更传统的荧光团比较时，它们具有大的斯托克斯位移(stroke’s shift)和极其长的发射半寿期(微秒-毫秒)。
通常，有机发色团被用作受体。它们包括别藻蓝蛋白(APC)。对TR-FRET以及受体的合适详述描述于WO 98/15830。
基于荧光偏振(FP)的测定是使用偏振光以激发溶液中的荧光底物的测定。这些荧光底物在溶液中是游离的并翻滚，引起发射的光变得去偏振化。当底物与较大的分子(即酰基)结合时，大幅度降低其翻滚速率，且发射的光保持高度偏振化。
备选地，可使用质谱。术语“质谱”指使用电离源以在表面上产生来自样品的气相离子并用质谱仪检测气相离子。术语“激光解吸质谱”指使用激光作为电离源以在表面上产生来自样品的气相离子并用质谱仪检测气相离子。用于生物分子(例如酰基化酰基受体)的一种优选质谱方法是基质辅助激光解吸/电离质谱或MALDI。在MALDI中，分析物通常与基质材料混合，在干燥时基质材料与分析物共结晶。基质材料吸收来自能量源的能量，否则能量可使不稳定的生物分子或分析物成为碎片。另一种优选方法是表面增强激光解吸/电离质谱或SELDI。在SELDI中，装载分析物的表面在分析物捕获和/或解吸中起积极作用。在本发明的上下文中，样品包含可经历色谱或其他化学加工的生物样品和合适的基质底物。
在色谱中，“表观分子量”指被检测离子的分子量(道尔顿)比电荷值，m/z。表观分子量如何得到取决于所使用的质谱仪类型。对于飞行时间质谱仪，表观分子量是从电离到检测的时间的函数。术语“信号”指由研究中的生物分子产生的任何反应。例如，术语信号指由生物分子撞击质谱仪的检测器产生的反应。信号强度与生物分子的量或浓度相关。信号由两个值定义：如所述产生的表观分子量值和强度值。质量值是生物分子的基本特性，而强度值给予生物分子具体量或浓度以及相应的表观分子量值。因此，“信号”总是指生物分子的性质。
如上文详述，在第一方面鉴定参与疼痛的化合物的方法中，所述方法包括以下步骤：
a) 提供包含Lrrfip1核酸的测试系统，
b) 将测试系统与测试化合物接触，和
c) 测定测试化合物对测试系统的作用，
其中，当相对于对照检测到测试化合物对测试系统的显著作用时，所述测试化合物被鉴定为参与疼痛的化合物。
可在多种表达或信号转导水平上测定测试化合物对核酸的作用。
可将测试化合物设计为与Lrrfip1基因的调节序列或Lrrfip1基因本身结合。因此，测试化合物可对基因的表达具有影响。
因此，测试化合物与调节序列的结合可通过检测(i) 调节序列或基因和(ii) 测试化合物的复合物来测定。本文详述检测两种或更多种组分的复合物的合适方法。
调节序列是其中调节蛋白例如转录因子优先结合的DNA片段。这些调节蛋白与称为调节区的短的DNA序列段结合，调节区合适地位于基因组中，通常在被调节的基因 “上游的”很短距离。如此，这些调节蛋白可募集称为RNA聚合酶的另一蛋白复合物。它们以这种方式控制基因表达。调节序列包括启动子区，其通常与其他调节区(例如增强子、沉默子、边界元件/绝缘子)一起协作以指导给定基因的转录水平。
备选地，可间接检测测试化合物的作用(例如结合)和对基因转录的作用。为此，可检测Lrrfip1基因下游的作用。例如，可测定对涉及Lrrfip1的转录和翻译的作用。在一个实施方案中，检测Lrrfip1 mRNA或Lrrfip1蛋白的量。备选地，可测定与富含GC的共有序列的结合对TNF、EGFR或PDGFA表达或NF-αB信号转导的作用。
本文描述检测mRNA的合适方法，包括例如Northern印迹分析、核酸酶保护测定(NPA)、原位杂交和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。
对于Northern印迹步骤，首先在变性条件下在琼脂糖凝胶中经由电泳，通过大小分离RNA样品。然后将RNA转移到膜上，用标记的探针交联和杂交。可使用非同位素探针或高特异性活性放射性标记的探针，包括随机引发的、切口翻译的或PCR产生的DNA探针、体外转录的RNA探针和寡核苷酸。此外，仅具有部分同源性的序列(例如，来自不同物种的cDNA或者可能包含外显子的基因组DNA片段)可用作探针。
核酸酶保护测定(NPA)是一种用于检测和定量特异性mRNA的极其灵敏的方法。NPA的基础是反义探针(放射性标记的或非同位素的)与RNA样品的溶液杂交。杂交后，通过核酸酶降解单链未杂交的探针和RNA。例如在丙烯酰胺凝胶上分离残留的受保护片段。溶液杂交通常比基于膜的杂交更有效，且与印迹杂交的20-30 µg最大值相比，其可容纳多达100 µg的样品RNA。NPA亦比Northern分析对RNA样品降解的敏感性低，因为用探针仅在重叠区检测到切割(探针通常约100-400个碱基长度)。
在RT-PCR中，使用逆转录病毒逆转录酶将RNA模板拷贝到互补DNA (cDNA)中。然后通过PCR指数扩增cDNA。相对定量RT-PCR涉及与目标基因同时扩增内控。内控用于标准化样品。一旦标准化，可跨越样品进行特异性mRNA的相对丰度的直接比较。竞争性RT-PCR用于绝对定量。该技术涉及设计、合成和精确定量与内源性靶标可通过大小或序列中的小差异区分的竞争者RNA。将已知量的竞争者RNA加入实验样品中并进行RT-PCR。将来自内源性靶标的信号与来自竞争者的信号比较以测定样品中存在的靶标量。
上述方法可包括核酸标记。用于标记DNA、RNA或寡核苷酸的一系列技术是技术人员已知的。这些技术包括例如切口翻译标记、随机引物DNA标记、DNA探针的PCR标记和寡核苷酸3'/5'末端标记、RNA探针的转录标记、寡核苷酸3'/5'末端标记和寡核苷酸加尾。
切口翻译法是基于DNA酶I向DNA中引入随机分布切口的能力。使用缺口的3'-OH末端作为引物，DNA聚合酶I以5' → 3'方向合成与完整链互补的DNA。DNA聚合酶I的5' → 3'外切核酸活性在合成的方向上同时移除核苷酸。聚合酶活性顺序地用同位素标记的或半抗原标记的脱氧核糖核苷三磷酸取代移除的核苷酸。在低温下(15℃)，反应中未标记的DNA从而被新合成的标记DNA取代。常用的标记包括洋地黄毒苷标记、生物素标记或荧光染料(例如荧光素或四甲基罗丹明)。
“随机引发的”DNA标记法是基于标记DNA的所有可能六核苷酸的混合物的杂交。所有序列组合在六核苷酸引物混合物中出现，其使得引物与模板DNA以统计方式结合。因此保证沿着完整长度的模板DNA的同等程度的标记。使用Klenow酶(标记级)，从随机六核苷酸引物的3' OH末端合成互补链。反应中存在的修饰脱氧核糖核苷三磷酸(例如[32P]标记、[35S]标记、[3H]标记、[125I]标记、洋地黄毒苷或生物素标记)被参入到新合成的互补DNA链中。
聚合酶链式反应(PCR)允许扩增微量的DNA。仅有的前提是，靶序列的一些序列信息对合成合适的引物是已知的。标记与PCR的组合是用于分析PCR产物以及用于从少量的各自靶序列制备标记探针的强大工具。例如，洋地黄毒苷(一种类固醇半抗原)可用于标记用于杂交和随后颜色或发光检测的DNA、RNA或寡核苷酸。洋地黄毒苷通常与dUTP经由碱不稳定的酯键偶联。通过使用DNA聚合酶的酶促核酸合成，标记的dUTP可被容易地参入。
通过参入标记(例如单洋地黄毒苷标记的双脱氧尿苷三磷酸(DIG-ddUTP))或通过加入较长的核苷酸尾，寡核苷酸可在其3’-端用末端转移酶酶促标记。末端转移酶催化不依赖模板地加入脱氧和双脱氧核苷三磷酸至双链和单链DNA片段以及寡核苷酸的3’OH末端。末端转移酶参入洋地黄毒苷、生物素和荧光染料标记的脱氧和双脱氧核苷酸以及放射性标记的脱氧和双脱氧核苷酸。备选地或另外地，寡核苷酸可在5’-末端被标记，例如根据经典固相亚磷酰胺合成法，通过在终步骤用亚磷酰胺反应。通过该方法，产生5’-末端氨基官能团。用氨处理从支持物上释放寡核苷酸并切割保护基。在随后的步骤中，在5’-位置上引入洋地黄毒苷部分。
可用于上文标记方法的不同标记是已知的。部分标记包括其检测在下文例示地描述：
生物素标记的化合物可例如通过抗-生物素抗体或通过链霉亲和素缀合物检测。通过酶免疫测定与尼龙膜上的发光，抗-生物素抗体(例如与碱性磷酸酶(AP)缀合的单克隆抗-生物素抗体或Fab片段)可用于检测生物素标记的核酸。该检测方法可用于检测膜上(例如Southern印迹、斑点印迹)、细胞和组织中(例如原位杂交)的生物素标记的核酸、免疫印迹、免疫组织化学或ELISA。链霉亲和素缀合物用于检测生物素标记的物质(例如，生物素化的抗体)，其可用于数个免疫学检测系统。为此，链霉亲和素(例如来自Streptomyces avidinii)可与碱性磷酸酶或ß-过氧化物酶偶联。该检测方法可与免疫印迹、免疫组织化学或ELISA一起使用。
探针-靶标杂合体可用酶联免疫测定检测。该免疫化学检测步骤通常比放射性检测步骤更灵敏。在该测定中，膜可被封闭以防止抗体与滤器的非特异性相互作用。对洋地黄毒苷特异的碱性磷酸酶缀合的抗体识别标记的杂合体上的洋地黄毒苷分子。加入碱性磷酸酶底物允许杂合体的可视化。
对于化学发光检测，碱性磷酸酶的合适底物(例如3-(4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠或4-氯-3-(甲氧基螺){1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠)属于二氧杂环丁烷苯基磷酸盐组。在被碱性磷酸酶去磷酸化时，形成其分解引起光发射的中间体，光发射例如可在X射线胶片上记录。
DIG标记探针的比色测定通常用形成氧化还原体系的无色底物进行。实例是像5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯和4-硝基蓝四唑氯化物。通过释放磷酸基，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯被碱性磷酸酶氧化成靛蓝。平行的，4-硝基蓝四唑氯化物被还原成二甲䐶。视膜的类型，反应产物形成水不溶的深蓝色至褐色沉淀。
可与检测抗体偶联以可视化特异性探针-靶标杂交的多种报道分子包括但不限于酶偶联抗体、荧光染料标记抗体(通过荧光显微镜和使由荧光染料发射的波长能够可视化的特殊滤器检测)和与胶体金偶联的抗体(在恒冷箱切片上通过电子显微镜检测)。
可通过使用洋地黄毒苷标记探针、生物素标记探针和荧光染料标记探针的组合进行多种同时杂交，以定位一个制备物中的不同染色体区或不同RNA序列。通过与抗体偶联的不同荧光染料的可用性，使这样的多探针实验成为可能。这些包括荧光素或FITC (异硫氰酸荧光素；黄色)、罗丹明或TRITC (异硫氰酸四甲基罗丹明；红色)和AMCA (氨基-甲基香豆素乙酸；蓝色)。
对调节序列的作用亦可通过将调节序列与报道基因连接并将产生的DNA构建体导入细胞或生物体中来检测。对于培养物中的细菌或真核细胞，其通常为称为质粒的环状DNA分子形式。使用不是在研究中的细胞或生物体中天然表达的报道基因是重要的，因为报道基因的表达正被用作用于成功摄取目标基因的标记物。诱导视觉可鉴定特性的常用报道基因通常涉及荧光和化学发光蛋白；实例包括编码以下蛋白的基因：引起表达它的细胞在蓝光下发出绿光的水母绿色荧光蛋白 (GFP)、催化具有荧光素的反应来产生光的酶荧光素酶和来自基因dsRed的红色荧光蛋白。细菌中的另一常见报道基因是lacZ基因，其编码蛋白β-半乳糖苷酶。当在包含底物类似物X-gal (在天然启动子下，还需要诱导分子例如IPTG)的培养基上培养时，该酶引起表达该基因的细菌呈现蓝色。细菌中的选择性标记物报道基因的实例是氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，其赋予对抗生素氯霉素的抗性。通过测定上述信号相对于对照的量，可检测测试化合物的影响。
如上文详述，在第二方面鉴定参与疼痛的化合物的方法中，所述方法包括以下步骤：
a) 提供包含Lrrfip1蛋白或其功能活性变体的测试系统，
b) 将测试系统与测试化合物接触，和
c) 测定测试化合物对测试系统的作用，
其中，当相对于对照检测到测试化合物对测试系统的显著作用时，所述测试化合物被鉴定为参与疼痛的化合物。
因此，可通过检测(i) Lrrfip1蛋白或其变体与(ii) 测试化合物的复合物来测定测试化合物与Lrrfip1蛋白或其变体的结合。上文和下文详述了检测两种或更多种组分的复合物的合适方法。
用于检测蛋白的合适方法描述在本文中，包括例如标记蛋白(例如包含可检测标记物、标签或酶组分的融合蛋白)的检测、蛋白免疫染色、蛋白免疫沉淀、免疫电泳、免疫印迹、蛋白质印迹、分光光度法、酶测定等。该方法可要求在检测前纯化蛋白，其可涉及蛋白分离(例如通过色谱方法、蛋白提取、蛋白溶解、凝胶电泳和电聚焦)。
蛋白免疫染色是检测样品中的特异性蛋白的基于抗体的方法。术语免疫染色最初用于指组织切片的免疫组织化学染色。然而现在，免疫染色涵盖组织学、细胞生物学和分子生物学中使用的多种技术，其使用基于抗体的染色方法。免疫组织-或-细胞化学的组织切片或细胞通过固定保存。
虽然最初的IHC染色使用荧光染料，但是使用酶(例如过氧化物酶和碱性磷酸酶)的非荧光法现在更经常地使用。这些酶能够催化提供有色产物的反应，有色产物为光学显微镜容易地检测。备选地，放射性元素可被用作标记，和免疫反应可通过放射自显影可视化。组织制备或固定对于保留细胞形态和组织构造是重要的。不合适或延长的固定可显著降低抗体结合能力。许多抗原可在福尔马林固定的石蜡包埋组织切片中成功地显示。固定方法和时间的优化、用封闭剂预处理、用高盐孵育抗体以及优化后抗体洗涤缓冲液和洗涤时间可对获得高质量免疫染色重要。
蛋白质印迹允许在任何纯化步骤之前或之后检测来自从细胞或组织中制备的提取物的特异性蛋白(天然的或变性的)。通常使用凝胶电泳通过尺寸分离蛋白后，经由干、半干或湿印迹法转移到合成膜(通常硝酸纤维素或PVDF)。然后使用类似于免疫组织化学但不需要固定的方法，使用抗体探测膜。通常使用过氧化物酶连接的抗体进行检测，以催化化学发光反应。蛋白质印迹是一种可用于半定量或定量地比较提取物之间蛋白水平的常规分子生物学方法。印迹之前的大小分离使得蛋白分子量被测定为与已知分子量标记物比较。蛋白质印迹是一种用于检测给定组织匀浆或提取物样品中的特异性蛋白的分析技术。它使用凝胶电泳以通过多肽的长度(变性条件)或通过蛋白的3-D结构(天然/非变性条件)分离蛋白。
酶联免疫吸附测定或ELISA是一种用于定量或半定量地测定来自多孔板形式(通常96孔/板)中的血浆、血清或细胞/组织提取物的蛋白浓度的诊断方法。概括地，溶液中的蛋白被吸附于ELISA板。对目标蛋白特异的抗体被用于探测该板。通过优化封闭和洗涤方法可使背景最小化(如关于IHC)，并经由阳性和阴性对照的存在保证特异性。检测方法通常基于比色或化学发光。
电子显微镜或EM可用于研究组织或细胞的详细微构造。免疫EM允许检测超薄组织切片中的特异性蛋白。用重金属颗粒(例如金)标记的抗体可使用透射电子显微镜直接可视化。虽然免疫EM在检测蛋白的亚细胞定位中强大，但是其可为技术上挑战的、昂贵的并需要严格优化组织固定和加工方法。
备选地，可间接检测测试化合物的作用(例如结合)和对Lrrfip1蛋白的影响。为此，可检测Lrrfip1蛋白下游的作用。例如，可测定对表型(例如痛觉表型的表现)的作用，
在本发明一个优选实施方案中，参与疼痛的化合物是天然参与Lrrfip1基因和/或Lrrfip1蛋白的信号转导途径的细胞化合物。
如上所详述，Lrrfip1作为转录阻遏蛋白起作用，其优先与富含GC的共有序列结合，并已表明其调节TNF、EGFR和PDGFA的表达。
然而，关于Lrrfip1在疼痛中的信号转导途径很少细节是已知的。因此，鉴定信号转导途径的组分是合意的。为此，可检测任选疑似涉及Lrrfip1信号转导的细胞组分。这些可为用于参与疼痛的药物的另外靶标。
在本发明一个优选实施方案中，参与疼痛的化合物改变Lrrfip1蛋白上游或下游的信号转导。另外地或备选地，参与疼痛的化合物改变Lrrfip1基因上游或下游的信号转导，特别地，其中所述化合物改变Lrrfip1基因的表达。
如上文已详述，可不仅在Lrrfip1蛋白或基因水平上，而且在上游或下游信号转导或表达水平上测定作用。实例包括Lrrfip1基因水平(Lrrfip1蛋白的上游)、mRNA水平(Lrrfip1蛋白的上游和Lrrfip1基因的下游)、蛋白水平(Lrrfip1基因的下游)和表型水平(Lrrfip1基因和蛋白的下游)。
在本发明一个优选实施方案中，参与疼痛的化合物与天然参与Lrrfip1基因和/或Lrrfip1蛋白的信号转导途径的细胞化合物结合，特别地，其中参与疼痛的化合物与Lrrfip1基因或Lrrfip1蛋白结合，尤其是与Lrrfip1蛋白结合。
明显地，化合物与天然参与Lrrfip1基因和/或Lrrfip1蛋白信号转导途径的细胞化合物的结合最可能对信号转导有作用。经常，人工化合物与天然参与信号转导途径的细胞化合物的结合导致该途径的抑制。然而，可将人工化合物设计为激活该途径。在两种情况下，结合对途径具有作用，使得可能改变疼痛敏感性。
在本发明一个优选实施方案中，参与疼痛的化合物抑制Lrrfip1基因上游或下游的信号转导，特别地，其中所述化合物抑制Lrrfip1基因的表达。在本发明一个优选实施方案中，其中所述参与疼痛的化合物抑制Lrrfip1蛋白上游或下游的信号转导，特别地，其中所述化合物与Lrrfip1蛋白结合。基于实施例的结果，预期那些化合物能够抑制或减少疼痛。因此，它们是优选的。
在本发明另一个优选实施方案中，测试系统在细胞内，例如动物细胞，特别是哺乳动物细胞，尤其是人细胞。
基于细胞的系统是有利的，因为它通过增殖细胞和细胞结构允许测试系统的容易扩增，细胞结构例如胰岛素下游或者Lrrfip1蛋白或基因下游或上游的的信号转导组分，因为这些可被使用以便检测对改变的细胞葡萄糖摄入有指示的信号。
适合本发明的上下文的细胞实例包括但不限于L6细胞、3T3脂肪细胞、HEK 293、745-A、A-431、心房肌细胞、BxPC3、C5N、Caco-2、Capan-1、CC531、CFPAC、CHO、CHO K1、COS-1、COS-7、CV-1、EAHY、EAHY 926、F98、GH3、GP&envAM12、H-295 R、H-4-II-E、HACAT、HACAT A131、HEK、HEL、HeLa、Hep G2、High Five、Hs 766T、HT29、HUV-EC R24、HUV-EC-C、IEC 17、IEC 18、Jurkat、K 562、KARPAS-299、L 929、LIN 175、MAt-LYLU、MCF-7、MNEL、MRC-5、MT4、N64、NCTC 2544、NDCK II、Neuro 2A、NIH 3T3、NT2/D1、P19、原代神经元细胞、原代树突细胞、原代人成肌细胞、原代角质形成细胞、SF9、SK-UT-1、ST、SW 480、SWU-2 OS、U-373、U-937和Y-1。其他合适的细胞是本领域技术人员已知的。
从动物或人中直接培养的细胞被称为原代细胞。除了来源于肿瘤的一些细胞系外，大多数原代细胞培养物具有有限的寿命。在特定数量的群体倍增后，细胞经历衰老的过程并停止分裂，但通常保留生存力。
确立细胞系或永生细胞系经过随机突变或故意改变(例如端粒酶基因的人工表达)已获得无限增殖的能力。有许多代表特定细胞类型的充分确立细胞系且选择合适的细胞系在技术人员的知识内。
因此，在本发明一个优选实施方案中，细胞是细胞系。细胞系是在其来源的培养物中增殖的细胞群，并因此基因上与单一共同祖先细胞相同。优选的细胞系是HEK 293细胞(原代人胚胎肾)、3T3细胞(鼠胚胎成纤维细胞)、CHO细胞(中国仓鼠卵巢)、COS-7细胞(非洲绿猴细胞系)、HeLa细胞(人上皮样宫颈癌)、JURKAT细胞(人T细胞白血病)、BHK 21细胞(仓鼠正常肾脏，成纤维细胞)和MCF-7细胞(人乳腺癌)。
细胞或细胞系可被基因修饰以包括检测作用所需的Lrrfip1或组分。特别优选的细胞系涵盖在已知启动子系统控制下编码Lrrfip1的基因。启动子系统可为可控制的，例如化学可诱导的或组成型活化的。那些启动子系统是技术人员公知的。
备选地，可使用细胞裂解物(粗的、分级的或纯化的)。用于产生这些的例示性方法是技术人员已知的并可包括破碎、离心和重悬。
在本发明一个优选实施方案中，该方法是高通量筛查法。
高通量筛查(HTS)是一种用于尤其在药物发现中使用以及与生物学和化学领域相关的科学实验的方法。使用例如机器人学、数据加工和控制软件、液体处理设备和灵敏的检测器，高通量筛查或HTS允许研究者快速进行数以千计或甚至数以百万计的生化、基因或药理测试。通过该方法，可迅速鉴定调节特定生物分子途径的活性化合物、抗体或基因。
通常，HTS使用自动操作以运行针对候选化合物文库的测定的筛查。典型的HTS筛查文库或“平台”可包含100,000至超过2,000,000个化合物。
更经常，HTS的主要测试容器是多孔板或微板。用于HTS的现代微板通常具有96、384、1536或3456个孔。这些都是96的倍数，表明最初的96孔微板具有8 × 12个9mm间隔的孔。大多数孔包含实验有用物质，经常是二甲基亚砜(DMSO)和一些其他化合物的水性溶液，后者对于跨越板的各孔是不同的。其他孔可为空的，旨在用作任选的实验对照。
为了准备测定，研究者将板的各孔用他或她希望进行实验所基于的一些生物实体填充。在本情况中，填充包含Lrrfip1核酸或蛋白的测试系统。在已经过一段孵育时间以允许生物物质与孔中的化合物吸附、结合或者以其他方式反应(或不能反应)后，手动或通过机器跨越所有板的孔进行测量。专门的自动化分析机器可在孔上面运行许多实验(例如，在它们上面照射偏振光并测量反射率，反射率可为蛋白结合的指示)。在该情况下，机器可将各实验的结果输出为网格数值，其中各数字映射到单孔中获得的值。高容量分析机器可像这样在几分钟内测量许多板，非常迅速地产生数以千计的实验数据点。
在本发明一个优选实施方案中，疼痛是神经性疼痛。神经痛或神经性疼痛可定义为非伤害性疼痛，或换言之，疼痛与身体任何部分中的疼痛受体细胞的激活不相关。据称，神经痛是由神经结构或功能的变化产生的疼痛。与伤害性疼痛不同，神经痛不具有连续伤害性输入而存在。神经痛分为两类：中枢神经痛和外周神经痛。该异常疼痛被认为与四种可能机制有联系：离子门功能失常、神经变得机械敏感并产生异位信号、大小纤维之间的信号交叉和归因于中枢处理器中的损伤的功能失常。
神经痛往往难以诊断，且大多数治疗显示很少或无效力。诊断通常涉及通过鉴定缺少的感觉或运动功能来定位损伤神经。这可涉及测试例如EMG测试或神经传导测试。神经痛比其他类型的疼痛难治疗，因为它对正常疼痛药物治疗反应不好。这证明，需要开发诊断和治疗该疼痛的新方法，因此Lrrfip1核酸和蛋白提供引人关注的靶标。
在第三方面，本发明提供Lrrfip1核酸用于鉴定参与疼痛的化合物的用途，和在第四方面，本发明提供Lrrfip1蛋白用于鉴定参与疼痛的化合物的用途。
关于术语“Lrrfip1核酸”、“Lrrfip1蛋白”和“鉴定参与疼痛的化合物”，它指在本发明方法的上下文中提供的定义。应该指出的是，上文所述的方法可用于鉴定。
在本发明第三或第四方面的一个优选实施方案中，化合物和/或疼痛如上文本发明方法的优选实施方案的情况中定义。
本发明鉴定的参与疼痛的化合物可用作药物。为了产生药物，鉴定的靶标或其药学上可接受的盐得为通常由成分的混合物组成的药物剂型，成分例如药学上可接受的载体或辅助物质，组合用以提供所需特性。
制剂包含至少一种合适的药学上可接受的载体或辅助物质。这样的物质的实例是去矿物质水、等渗盐水、林格氏溶液、缓冲液、有机或无机酸和碱以及它们的盐、氯化钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠或磷酸二钙、二元醇(例如丙二醇)、酯(例如油酸乙酯和月桂酸乙酯)、糖(例如葡萄糖、蔗糖和乳糖)、淀粉(例如玉米淀粉和马铃薯淀粉)、增溶剂和乳化剂(例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸卞酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺)、油(例如花生油、棉籽油、玉米油、大豆油、蓖麻油)、合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯、十四酸异丙酯)、聚合物佐药(例如明胶、葡聚糖、纤维素及其衍生物)、白蛋白、有机溶剂、络合剂(例如柠檬酸盐和尿素)、稳定剂(例如蛋白酶或核酸酶抑制剂，优选抑肽酶、ε-氨基己酸或抑胃酶肽A)、防腐剂(例如苯甲醇)、氧化抑制剂(例如亚硫酸钠、蜡)和稳定剂(例如EDTA)。着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂亦可存在于组合物中。生理缓冲溶液优选具有大约6.0-8.0的pH，特别是大约6.8-7.8的pH，尤其是大约7.4的pH，和/或大约200-400毫渗透压摩尔/升的摩尔渗透压浓度，优选大约290-310毫渗透压摩尔/升的摩尔渗透压浓度。使用合适的有机或无机缓冲液，例如优选使用磷酸盐缓冲液、tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4-(2-羟乙基)哌嗪子基]乙烷磺酸)或MOPS缓冲液(3-吗啉代-1-丙烷磺酸)，通常可调节药物的pH。各自缓冲液的选择通常取决于所需的缓冲液摩尔浓度。磷酸盐缓冲液是合适的，例如用于注射和输注溶液。用于配制药物的方法以及合适的药学上可接受的载体或辅助物质是本领域技术人员公知的。根据普遍的剂型和鉴定的化合物，可a.o.选择药学上可接受的载体和辅助物质。
药物组合物可被制造用于口服、鼻、直肠、胃肠外、阴道、局部或阴道给药。胃肠外给药包括皮下、皮内、肌内、静脉内或腹膜内给药。
药物可被配制为多种剂型，包括用于口服给药的固体剂型(例如胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂)、用于口服给药的液体剂型(例如药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂)、注射制剂(例如无菌注射水性或油性混悬剂)、用于直肠或阴道给药的组合物(优选栓剂)和用于局部或经皮给药的剂型(例如软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、散剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂或贴剂)。
用于任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括鉴定的化合物的活性、剂型、患者的年龄、体重和性别、治疗的持续时间等医学领域公知的因素。
以单剂量或分次剂量给予人或其他哺乳动物的本发明化合物的总每日剂量可以为例如约0.01-约50 mg/kg体重以上的量，优选约0.1-约25 mg/kg体重的量。单剂量组合物可包含这样的量或其约数以组成每日剂量。通常，本发明的治疗方案包括每天以单剂量或多剂量给予需要这样的治疗的患者约10 mg-约1000mg的本发明化合物。
在第五方面，本发明提供一种诊断痛觉的方法，其包括以下步骤：
a) 测定受试者的样品中的Lrrfip1基因的表达水平，和
b) 如果受试者的样品中的Lrrfip1基因的表达水平相对于对照是增加的，那么鉴定受试者为疼痛的。
如在实施例中所示，Lrrfip1基因的表达水平与痛觉相关。因此，表达水平可用于诊断Lrrfip1相关的痛觉。可在基因水平、mRNA水平或蛋白水平上检测基因的表达水平。
增加的表达水平可归因于Lrrfip1基因增加的拷贝数。归因于基因的拷贝数增加的一系列疾病是已知的。例如，乳腺癌的一个原因可为HER-2扩增。通过免疫组织化学(IHC)和银、生色或荧光原位杂交(SISH/CISH/FISH)，可测定基因扩增。
探针的原位杂交(ISH)在细胞或组织内发生。因为细胞结构在整个步骤中是维持的，所以ISH提供关于组织样品内mRNA位置的信息。通过将样品固定在例如中性缓冲的福尔马林中并在石蜡中包埋组织，开始该步骤。然后将样品切成薄切片并安放在显微镜载玻片上。(备选地，组织可被冷冻切片并在多聚甲醛中后固定。)在一系列洗涤以使切片脱蜡和再水化后，进行蛋白酶K消化以增加探针可接近性，然后将标记的探针与样品切片杂交。将放射性标记的探针用载玻片上干燥的液膜可视化，同时将非同位素标记的探针用比色试剂或荧光试剂合宜地检测。
备选地，通过隐性核型分析或比较基因组杂交，可检测基因扩增。用于经电脑模拟(in silico)从破裂的DNA产生高分辨率核型的平台已出现，例如阵列比较基因组杂交(阵列CGH)和SNP阵列。概念地，阵列由数以百计至数以百万计的探针组成，探针与基因组中的目标区互补。来自测试样品的破裂DNA被片段化、标记并与阵列杂交。各探针的杂交信号强度为专门的软件所用以产生阵列上各探针的测试/正常的log2比。知道阵列上的各探针的地址和基因组中的各探针的地址，该软件使探针以染色体次序排列并经电脑模拟重新构建基因组。
此外，许多基于PCR的方法学也已在上文描述。
备选地或另外地，亦可在mRNA或蛋白水平上检测Lrrfip1表达水平。在该情况下，检测mRNA或Lrrfip1蛋白的量。上文详述了用于检测mRNA或蛋白的合适方法。
本发明不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂，因为它们可变化。另外，本文使用的术语是仅用于描述特定实施方案的目的而不旨在限制本发明的范围。除非文中明确另外指示，否则如本文以及附属权利要求中使用的单数形式包括复数参照。类似地，措辞“包含”、“包括”和“涵盖”应理解为包涵性的而非排他性的。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语以及任何首字母缩写词具有与本发明领域的本领域技术人员通常理解的相同意思。虽然与本文所述的那些类似或等价的任何方法和材料可用于本发明的实践，但是本文描述优选的方法和材料。
通过下述附图和实施例进一步阐明本发明，但是应理解，除非另外明确指示，否则所包括的实施例仅用于例示的目的而不是旨在限制本发明的范围。
附图：
图1显示对于每只单独小鼠，其神经性疼痛表型分值(机械过敏性，X轴)和L5 DRG中的相应的Lrrfip1的基因调节(log比(Chung对Sham对照)，Y轴)。视使用的品系，将小鼠数据符号编码化。已进行Pearson相关分析并揭示了两个参数疼痛表型和log比基因调节的显著负相关。这意指，对于单只小鼠，在Chung-操作的神经性小鼠中， Lrrfip1的L5 DRG表达越低，如在行为测试中显示的机械痛觉过敏就越显著。
该显著相关表明Lrrfip1基因表达对于诱导神经性疼痛表型的因果关系(R(Pearson)= -0.684；p值= 0.00012；FDR= 0.026)。
图2显示L5 DRG的Lrrfip1的例示性强度数据(3d p.o.)。
实施例：
鉴定Lrrfip1为参与痛觉的蛋白
为了鉴定用于疼痛治疗的新靶标，进行用于鉴定基因的相关分析，该基因的调节有助于慢性神经性疼痛(亦参见Persson等, 2009, Molecular Pain 5:7)。总之，研究近交小鼠品系AKR/J (AKR)、C57BL/6J (C57/B6)和CBA/J (CBA)的背根神经节(DRG)的RNA样品。近交小鼠品系获自Jackson实验室(Bar Harbor, ME, USA)。使Chung-操作的(神经性疼痛的Chung模型(Kim 和 Chung, 1992, Pain 50: 355-363))和相应的sham-操作的对照动物的位置L5上的脊神经经受轴突切开术。将样品用Affymetrix微阵列(MOE430 2.0)分布(profile)。测试每组的至少5只动物。在移除DRG前在所有小鼠上测定疼痛表型的表现“机械痛觉过敏”(Persson 等,同上，特别是章节“行为测试(Behavioral testing)”)。3种小鼠品系在其表型方面不同。在CBA小鼠、C57/B6小鼠和AKR小鼠中，表型分别以低、中和高水平表现。
为了进行基因表达实验，开发了一种用于分离鼠DRG的总RNA的方法(Persson 等, 同上, 特别是章节“用于TaqMan 和微阵列分析的RNA提取(RNA extraction for TaqMan and microarray analysis)”)，其中该方法以充足量(> 300 ng)和质量提供RNA。在已从3种小鼠品系(Chung-操作的或sham-操作的对照动物)的L5 DRG中提取RNA后，将RNA探针在Affymetrix微阵列(MOE430 2.0)上杂交。
在相关分析前统计上分析和过滤Affymetrix基因表达数据。使用下述过滤规则：
-所有Chung-操作的动物的至少60%中的绝对(Abs.)倍数变化≥ 1.5或
-所有Chung-操作的动物的至少20%中的绝对倍数变化≥ 2.0 (每个相对于所有sham-操作的对照动物的平均值)和
- 至少5只动物中的基因表达强度> 50 (背景水平)。
将3种品系的单只小鼠的表型数据及其基因表达数据(表示成log比(Chung-操作的对sham-操作的))或Chung-操作的动物的表达强度用于相关分析。
对于满足上文过滤规则的各基因，计算基因表达数据和表型数据(机械痛觉过敏)的Pearson相关系数(Persson 等, 同上, 特别是章节“相关分析(Correlational analysis)”)。为了测定单个基因的相关系数的显著性，引入“错误发现率”(FDR) (Storey, J.D. (2002) J. R. Statist. Soc. 64, 第3部分, 479-498)。具有FDR > 0.05的基因的Pearson相关系数被认为显著。使用log比数据(Chung-操作的对sham-操作的)和表达强度，分别鉴定了74条序列和114个基因。这些序列/基因的数据显示，基因表达和表型数据的显著相关(FDR < 0.05)，且参与疼痛和痛觉过敏不是已知的。
对于表达和疼痛表型最相关的基因之一的Lrrfip1基因，log比数据与机械过敏性的相关分析产生的Pearson 相关系数为-0.684 (p值为0.00012)和FDR为0.026。
Figure IDA00002636548300011
Figure IDA00002636548300021
Figure IDA00002636548300031

Claims (15)

1. 一种鉴定参与疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 提供包含Lrrfip1核酸的测试系统，
b) 将测试系统与测试化合物接触，和
c) 测定测试化合物对测试系统的作用，
其中，当相对于对照检测到测试化合物对测试系统的显著作用时，所述测试化合物被鉴定为参与疼痛的化合物。
2. 一种鉴定参与疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 提供包含Lrrfip1蛋白或其功能活性变体的测试系统，
a) 将测试系统与测试化合物接触，和
b) 测定测试化合物对测试系统的作用，
其中，当相对于对照检测到测试化合物对测试系统的显著作用时，所述测试化合物被鉴定为参与疼痛的化合物。
3. 权利要求1或2中任一项的方法，其中参与疼痛的化合物是天然参与Lrrfip1基因和/或Lrrfip1蛋白的信号转导途径的细胞化合物。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中参与疼痛的化合物改变Lrrfip1蛋白上游或下游的信号转导。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中参与疼痛的化合物改变Lrrfip1基因上游或下游的信号转导，特别地，其中所述化合物改变Lrrfip1基因的表达。
6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中参与疼痛的化合物与天然参与Lrrfip1基因和/或Lrrfip1蛋白的信号转导途径的细胞化合物结合，特别地，其中参与疼痛的化合物与Lrrfip1核酸或Lrrfip1蛋白结合，尤其是与Lrrfip1蛋白结合。
7. 权利要求1-6中任一项的方法，其中参与疼痛的化合物抑制Lrrfip1基因上游或下游的信号转导，特别地，其中所述化合物抑制Lrrfip1基因的表达。
8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中参与疼痛的化合物抑制Lrrfip1蛋白上游或下游的信号转导，特别地，其中所述化合物与Lrrfip1蛋白结合。
9. 权利要求1-8中任一项的方法，其中测试系统在细胞内。
10. 权利要求1-9中任一项的方法，其中所述方法是高通量法。
11. 权利要求1-10中任一项的方法，其中疼痛是神经性疼痛。
12. Lrrfip1核酸用于鉴定参与疼痛的化合物的用途。
13. Lrrfip1蛋白用于鉴定参与疼痛的化合物的用途。
14. 权利要求12或13的用途，其中所述用途进一步定义为权利要求3-8和11中任一项的定义。
15. 一种诊断痛觉的方法，其包括以下步骤：
a) 测定受试者的样品中的Lrrfip1基因的表达水平，和
b) 如果受试者的样品中的Lrrfip1基因的表达水平相对于对照是增加的，那么鉴定受试者为疼痛的。
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