CN102952846A - 一种油藏内源微生物原位采集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种油藏内源微生物原位采集的方法；包括：井矿数据分析：收集并整理目标井基础数据；数值模拟：基于所需的微生物强化采油具体设计方案，确定拟采集微生物的环境适应性要求；通过井矿分析数据，确定取样的埋深；原位采集：现场采集所需内源微生物资源，依据数值模拟结果，通过PVT仪采特定油藏目的埋深处的油样或油水样流体；后续微生物多样性分析及筛选；本方法适用于各类温度、压力、pH、矿化度、埋藏深度油藏地质条件下的内源微生物采集；特别适用于高温高压油藏的深井微生物采集，对油藏有害微生物的跟踪监测，微生物强化采油作用前后内/外源微生物多样性分析等其用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种井下取样装置(压力-温度-体积测试仪，PVT)在微生物强化采油相关微生物资源的分析检测及开发利用中的应用。
背景技术
微生物强化采油(Microbial Enhanced Oil Recovery，微生物强化采油)的重点之一在于了解油/气藏复杂环境中微生物群落的整体信息。油/气藏是一种独特的极端生态环境，其蕴含着丰富的微生物类群；在经历漫长的遗传进化及环境胁迫后，此类微生物及其代谢产物通常具有独特的生理生化性质；目前对此类极端微生物的研发还处于起步阶段，但可以预期其在石油行业及其他工业生产中具有着广泛的潜在用途。微生物强化采油是指将地面分离培养的微生物菌液和营养液注入油层，或单纯注入营养液激活油层内的微生物，使其在油层内生长繁殖，产生有利于提高采收率的代谢产物，以提高油田采收率的采油方法，俗称微生物采油。内源微生物是指存在于油藏中较为稳定的微生物群落，其中部分细菌在油藏形成过程中就已经存在，也有部分是在油田注水开发过程中由地表引入并逐步适应地层环境后保存下来的微生物。在环境胁迫下，内源微生物普遍经进化而具有嗜热、嗜压、嗜盐等独特的生理生化性质，因此在开发利用该部分资源中，必须要认真制定采集、筛选、分析、检测，以及后续开发利用的相应策略及措施，方可充分利用内源微生物的潜在资源。自然界中99％以上的微生物在目前的技术条件下是无法培养的，对于油藏这类极端环境下的微生物来说尤为明显。限于目前的微生物采样技术及后续开发手段的制约，目前可应用于微生物强化采油的微生物在环境适应性上存在应用瓶颈，如耐温性普遍低于80℃、在高压及高矿化度等特异油藏环境中无法发挥功能甚至无法生存，等。分析原因，可能的影响因素在于：石油行业微生物研究的取样方法，均是从地表或油水井口取样；而地下极端微生物经历由井筒到地面的运输过程，压力的释放和温度的改变使得一些嗜热、嗜盐、嗜压的极端微生物因环境改变而死亡，其可能残存的基因组资源也因环境降解等问题，难以通过现有的技术手段进行提取及分析。上述在采集样品过程中存在的技术瓶颈，严重制约了人们对极端微生物的认识，也在相当程度上阻碍了内源微生物资源的研发及应用。
PVT仪(压力-温度-体积测试仪)是一种用于油藏生产过程中的测试及采样工具，目前主要应用于测量油气藏压力及采集地层流体样品；其可通过外部机械控制及内部定时装置，由井口下入井下，在深井中采集油样及油水样样本。通常，PVT仪由动力模块、控制模块、探头模块及采样单元模块组成，并可依据具体需求(如稠油样品采集、超高温/高压样品采集、多样本采集，等)添加其它操控模块，如抽汲模块、压力缓冲模块、多样品模块。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于油藏内源微生物原位采集的方法。具体来说，是利用PVT仪进行内源微生物的原位采集，并在后续结合微生物学、分子生物学、宏基因组学及基因工程等生命科学技术手段，对油藏内源微生物强化采油的相关微生物资源进行分析检测及开发利用。
本发明的实施步骤包括井矿数据分析、数值模拟、原位采集，后续微生物多样性分析及筛选流程，等。该方法适用于各类温度、压力、pH、矿化度、埋藏深度等油藏地质条件下的内源微生物采集；特别适用于高温高压(HPHT)油藏的深井微生物采集。同时，除用于内源微生物采集之外，该方法还适用于对油藏有害微生物的跟踪监测、微生物强化采油作用前后内/外源微生物多样性分析等其它潜在用途。
本发明所涉及的内源微生物采集方法具体包括：
1)井矿数据分析：收集并整理目标井基础数据，包括开发时间、开采方式、岩层属性、油藏埋深、井下温度及温度落差(一般为2-5℃/100m)、pH、矿化度、粘度、原油成份组成；
2)数值模拟：基于所需的微生物强化采油具体设计方案，包括稠油降粘、调剖堵水、清防蜡、激活内源微生物、周期性处理，确定拟采集微生物的环境适应性要求(可适应温度、压力、pH、矿化度)；通过井矿分析数据，确定取样的埋深；
3)原位采集：现场操作以采集所需内源微生物资源，依据数值模拟结果进行特定油藏的目的埋深处的一次性采集，或通过多个PVT仪或具有多次采集功能的PVT仪对多个埋深处的油样及油水样进行多次采集；现场操作所需设备包括作业车、PVT仪、井上无菌微生物收集系统、微生物分筛所需设备仪器；首先基于数值模拟结果，根据采样所需的埋藏深度结合PVT所连钢缆的下放速度，调节PVT仪上的开启时间(需留有一定的富余以保证PVT在开启前到达指定埋深)；待PVT完成开启、收集、关闭程序后，由作业车在制定时间内收回钢缆取出PVT仪；在地面无菌操作间迅速开启PVT仪以采集样品；
4)后续微生物多样性分析及筛选流程：利用微生物学及分子生物学对所采集样品进行分离筛选及多样性分析，寻找目的微生物强化采油菌株及其功能性代谢产物。
采集步骤(1)所述目标井类型包括，水平井、直井、裸眼井、海洋钻井，采油井、注水井、勘探井，自喷井、稠油井、气井、凝析气井。
采集步骤(3)所述PVT仪，基本型由动力模块、控制模块、探头模块及采样单元模块组成，或依据需求添加抽汲模块、压力缓冲模块、多样品模块。
采集步骤(3)所述采集方法，收集及储存系统选择具有可调节温度和压力的采集系统。
采集步骤(4)所述多样性分析方法包括，核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析、变形梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳链构象多态性分析、末端限制性片段长度多态性分析、随机扩增片段长度多态性分析、扩增片段长度多态性分析。
本方法的主要优势如下：
1)适用于各类油藏环境，不受温度、压力、pH、矿化度、埋藏深度等油藏地质条件的限制；
2)采集样品针对性强，基于预期优选采样埋藏深度及原油物性指标，做到有的放矢，采集样品中可最大程度反映内源目的微生物强化采油微生物的分布特征，由其中获得的微生物资源可更好的通过后期开发进行应用；
3)采集的流体组分可进一步用于分析原油物性及地质相关指标，提供所采集微生物的准确环境信息；
4)PVT采集及运送过程中，内部压力与采集埋深处保持一致，可最大程度保持微生物群落的环境特征；同时由于在井道中PVT下放和提升速度可控，依据安全指标可控制在100m/mins以上，因此内部温度同样可与采集埋深处基本保持一致或接近；而pH、矿化度、原油组分等指标，因PVT仪的密封效果，同样可最大限度的反映采集埋深的环境特征；
5)通过周期性指定埋深的取样及检测，可用于检测内源微生物强化采油微生物群落及有害微生物群落的分布变化动态，为微生物强化采油施工作业及质量监控提供依据；
6)PVT仪的应用属于油藏勘探及检测常用方法，具有操作流程规范及应用方式灵活等诸多优势，同时整个流程历时短，全部过程可在1-2小时内完成；
7)依据具体需求，PVT仪本身可添加各种辅助组件，如抽汲模块、压力缓冲模块、多样品模块；因此可针对具体的实际要求，灵活选择PVT仪的种类，并可依据自身要求对PVT仪做适当的结构优化，赋予其更广泛的应用范畴。
本发明主要针对油/气藏复杂环境中内源极端微生物的采集，与常规的微生物采集方法相比，本发明通过利用油藏勘探及质量检测中常用的PVT设备，实现真实的指定埋深、指定环境下的内源微生物原位采集，因此能够在最大程度上反映油/气藏复杂环境中微生物分布的真实情况。
由本发明所提供的方法入手，基于后续的微生物学、分子生物学、宏基因组学以及基因工程的技术手段，可以大大缩短微生物菌种及代谢产物的开发周期，提高对内源微生物的认识，在微生物及功能分子筛筛选过程中做到有的放矢。
就本发明自身而言，与常规微生物采集相比，具有所采集微生物保留程度高、取样环境指标可测且不受运输等因素干扰、操作本身可重复性高、所获样本无偏好、同时避免了地表及井下环境微生物干扰，等诸多优势。
本发明涉及油藏勘探工程与微生物强化采油技术领域，由内源微生物微生物强化采油角度出发，针对特异性极端油藏环境进行特定埋深含有微生物的流体样品采集。所获的本源微生物资源信息对后续的微生物强化采油产品具有指导意义，并可通过革新式的深井采集方法实现超级嗜热嗜压耐矿化度的极端微生物的资源开发利用，非常具有在石油工业及微生物研究领域中推广及应用的机制。
依据PVT仪的作用原理，其应用完全可扩展到内源微生物的采集过程中。本发明基于井矿数模分析和现场采集操作实践，以及后续基于宏基因组技术的群落多样性分析及微生物筛选流程，建立了以PVT仪进行内源微生物采集及后续开发的应用策略及方法。本发明的意义在于：1)通过原位微生物采集，可获得不同地层环境中真实的微生物群落分布信息；2)基于高温、高压、高矿化度油藏的原位采集，可获得极端环境中微生物强化采油微生物资源；特别是对高温高压(HPHT)油藏。目前微生物强化采油所用微生物资源在环境适应性方面无法满足现场需要，通过深井微生物筛选及后续开发，有望获得高嗜热(耐受100-120℃以上)、高嗜压(耐受30MPa以上)、高嗜盐(耐受20x104mg/L以上)的极端内源微生物强化采油微生物资源；3)通过定期取样及后续分析，可监测微生物强化采油井下作业对油藏微生物群落分布的影响；4)通过定期取样及后续分析，可检测SRB等有害微生物的分布情况，为质量控制提供参考信息。
具体实施方式
实施例1选井依据及参数
由于分析目的不同，用于内源微生物研究的PVT取样与常规PVT取样选井原则略有不同。常规PVT取样井要求选择产水率小于5％的油气井。用于微生物研究的PVT取样为排除外来微生物的干扰，要求选择的油井是未注水层位的油井，或注水后间隔30天以上未再行注水的油井，对产水率没有要求。
通过严格筛选，确定在中石油某油田不同区块的A井和B井进行内源微生物PVT取样，基本油藏条件见表1。
表1试验井基本参数
实施例2取样步骤
现场操作设备包括作业车、PVT仪、井上无菌微生物收集系统、微生物分筛所需设备仪器，等。
设定取样埋深为4500m，下放速度100m/min；PVT自动开启及收集定时为1h，收集时间10分钟；待PVT完成开启、收集、关闭程序后提升线缆回收PVT仪；在地面无菌操作间迅速开启PVT以采集样品。
油藏内源微生物通过PVT进行取样，同时采集对应井的井口油样作为对照。PVT采集样品为淡黄色液体，含油量小于10％；井口样为暗褐色油水混合物，含油量40-50％。
由表观性状观察，可见深层区样品含水较高，而地表则相对含油增多；提示在井下到井口的运输过程中，除基本指标，如温度、压力等发生变化之外，原油成分变化同样存在，这些因素改变可能会造成微生物所处环境中矿化度、pH值等参数的改变，而水油相的差别还可能引起一些以石油烃为碳源的微生物环境适应问题。
实施例3从采集样品中提取微生物DNA
1)取大约100mL原油置于玻璃烧杯中，70℃水浴30分钟。
2)加入等体积30％乙醇和原油一半体积石油醚∶正己烷＝1∶1混合物，充分摇匀。
3)静止使油水相分层，用胶管抽取下层水相。用滤纸过滤掉水相中少量原油和其他杂质。
4)过滤后液体用0.22μm微孔滤膜真空抽滤，富集菌体于滤膜上。
5)将滤膜剪碎放入10mL离心管中，加入360μL溶菌酶(10mg/mL溶于10mMTris-HCl，pH8.0)，37℃水浴1h。
6)加入115μL 10％的SDS和25μL蛋白酶K(20mg/mL)，37℃水浴2h。
7)加入400μL的5M NaCl颠倒混匀，加入280μL 5％CTAB，65℃水浴20min。
8)冷却后吸出上清，碎膜用200μL无菌去离子水洗涤一次，吸出上清，将两次吸出的上清液体混合，加入等体积的氯仿∶异戊醇＝24∶1的混合物，颠倒混匀1min，静置2min。
9)12000rpm离心30min，吸出上清。加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃放置3h或放置过夜。
10)12000rpm离心20min，小心倒掉上清，沉淀加入1mL冷75％乙醇洗涤一次，凉至乙醇挥发殆尽，加入30μL无菌去离子水溶解。
实施例4基于宏基因组基础上的菌落鉴定及群落多样性分析
1)以所获宏基因组组份作为模板，模板加入量可依据实际丰度进行适当稀释。
2)使用细菌16S rDNA序列通用引物：8F(5’-TTTGATCCTGGCTCAG-3’)以及1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反应体系为25μL，反应条件为94℃变性4min；接下来进行30个循环反应：94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸90s；然后72℃再延伸10min，最后于4℃保存。
3)所获16S rDNA序列PCR产物经纯化后通过TA克隆连接于商品化或自制T载体中，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于相应抗性平板构建文库，并筛选阳性克隆。
4)挑选阳性克隆测定插入的16S rDNA部分序列，并与GenBank中已知序列进行同源性比较，确定对应微生物的种属。
5)所获宏基因组组份同样可为其他多样性分析技术手段提供微生物群落基础信息，下游相关技术包括，但不限于，核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA)、变形梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)链构象多态性分析(SS-CP)、末端限制性片段长度多态性分析(T-PFLP)、随机扩增片段长度多态性分析(RAPD)、扩增片段长度多态性分析(AFLP)，等。
表2为PVT取样与对应井口取样的多样性分析比较结果
对比结果显示：
1)序列比对结果显示PVT采集样品中的绝大多数微生物与已知的嗜热菌具有95％以上的同源性，经文献调研，理论上至少可耐受100度以上的高温；
2)非PVT取样的检测样本数与PVT取样组样本数基本一致，但从多样性方面看，井口取样组的多样性较PVT取样简单，且呈现优势菌群相对密集的现象，而在菌落分布方面，地表采集样本与PVT取样样本相比，菌落分布具有一定的差异，推测其原因在于极端微生物在环境参数(温度、压力等)改变的过程中，因不适应而造成活性降低甚至死亡所致；因此PVT样本可更直观的表现出高温高压环境下微生物的真实存在及分布情况。
Claims (5)
1.一种用于油藏内源微生物原位采集的方法，其特征在于：包括步骤：
1)井矿数据分析：收集并整理目标井基础数据，包括开发时间、开采方式、岩层属性、油藏埋深、井下温度及温度梯度、pH、矿化度、粘度、原油成份组成；
2)数值模拟：基于所需的微生物强化采油具体设计方案，包括稠油降粘、调剖堵水、清防蜡、激活内源微生物、周期性处理，确定拟采集微生物的环境适应性要求，包括适应温度、压力、pH、矿化度；通过井矿分析数据，确定取样的埋深；
3)原位采集：现场操作以采集所需内源微生物资源，依据数值模拟结果进行特定油藏的目的埋深处的一次性采集，或通过多个PVT仪或具有多次采集功能的PVT仪对多个埋深处的油样及油水样进行多次采集；现场操作所需设备包括作业车、PVT仪、井上无菌微生物收集系统、微生物分筛所需设备仪器；首先基于数值模拟结果，根据采样所需的埋藏深度结合PVT所连钢缆的下放速度，调节PVT仪上的开启时间；待PVT完成开启、收集、关闭程序后，由作业车在制定时间内收回钢缆取出PVT仪；在地面无菌操作间迅速开启PVT仪采集样品；
4)后续微生物多样性分析及筛选流程：利用微生物学及分子生物学对所采集样品进行分离筛选及多样性分析，寻找目的微生物强化采油菌株及其功能性代谢产物。
2.如权利要求1所述的内源微生物采集方法，其特征在于：采集步骤(1)所述目标井类型包括，水平井、直井、裸眼井、海洋钻井，采油井、注水井、勘探井，自喷井、稠油井、气井、凝析气井。
3.如权利要求1所述的内源微生物采集方法，其特征在于：采集步骤(3)所述PVT仪，基本型由动力模块、控制模块、探头模块及采样单元模块组成，或依据需求添加抽汲模块、压力缓冲模块、多样品模块。
4.如权利要求1所述的内源微生物采集方法，其特征在于：采集步骤(3)所述采集方法，收集及储存系统选择具有可调节温度和压力的采集系统。
5.如权利要求1所述的内源微生物采集方法，其特征在于：采集步骤(4)所述多样性分析方法包括，核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析、变形梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳链构象多态性分析、末端限制性片段长度多态性分析、随机扩增片段长度多态性分析、扩增片段长度多态性分析。
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