CN102869368A - β2m蛋白的治疗用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及β2-微球蛋白(β2m)作为活性成分的用途,特别是在期望用于治疗自身免疫疾病的药物组合物中的用途。
Description
本专利申请涉及医学领域,特别是自身免疫疾病的治疗。
更具体地,本发明涉及β2-微球蛋白(β2m)作为活性成分、特别是在意欲用于治疗自身免疫疾病例如多发性硬化或克罗恩病(Crohn′sdisease)的药物组合物中的用途。
前言
β2m蛋白是具有大约11.6kDa的平均分子量、一般由99个氨基酸形成的蛋白,其参与构成主要组织相容性复合体(MHC I或HLA I)[Cunningham B.A.等人The complete amino acid sequence ofbeta-2-microglobulin(1973)Biochemistry 12:4811-4821]。
已知,MHC I组织相容性复合体在免疫系统对于“自我”和“非我”的识别中发挥重要作用。这些复合体存在于除了红细胞以外的大多数人类细胞的表面。在它们的表面,它们呈现大量的抗原,基于此T淋巴细胞(CD8)能够将个体的细胞与对于该个体而言为外源的细胞、病态的细胞或正经历肿瘤转化过程的细胞区分开。
MHC I复合体由大约44kDa的糖基化的重链(HC)和轻链β2m组成,所述轻链β2m与重链的细胞外结构域非共价结合。MHC I的α链由3个细胞外结构域(α1、α2和α3)以及跨膜束(transmembranesegment)组成,如图1A所示。β2m与位于这样的区域中的氨基酸序列结合,在所述区域中,HC中的α1结构域的末端与α3结构域的起始点邻近[Gussov,D.等人(1987),The human beta-2-microglobulingene:primary structure and definition of transcriptional unit(1987)Journal of Immunology 39:3132-3138]。编码MHC I分子的基因按照它们被发现的顺序来编号,并归类为组(A、B和C)和复合体(D、H和G)。
抗原呈递细胞(APC)使用MHC I型复合体作为向免疫系统的T细胞(CD8)的抗原呈递者。由MHC I呈递的这些抗原一般是由多种具有8至10个氨基酸的多肽(来自于内源蛋白被蛋白酶体的裂解)组成的。这些抗原在它们于内质网中形成的过程中被载入存在于MHC I复合体的亚基(HC和β2m)的表面上的肽腔(peptide cavity)。一旦抗原被载入,MHC复合体被输出至细胞表面。然后,位于α3结构域的重链的跨膜结构域提供MHC I复合体与质膜的锚定。
β2m蛋白形成的亚基与重链的区别在于:β2m的序列几乎不可变并且其多肽链不是糖基化的。
虽然β2m蛋白的生理学功能尚未被完全阐释,但是已经表明,β2m蛋白对于形成MHC I复合体的另一蛋白具有重要作用:一个方面,在MHC I/抗原复合体组装之后[Androlewicz MJ.,等人(1994)MHCclass I/β2-microglobulin complexes associate with TAP transportersbefore peptide binding,Nature 368,864-867],其中β2m蛋白特异性结合TAP-1蛋白[Corr等人1992.Endogenous peptides of a solublemajor histocompatibility complex class I molecule H-2Lds:sequencemotif,quantitative binding and molecular modeling of the complex,JEM,176(6):1981-92],这使得可以确保抗原结合位点的构象得以维持[Ljunggren,H-G(1990)Empty MHC class I molecules come out in thecold.Nature.346,476-480];另一方面,当MHC I/抗原复合体被输出到细胞表明时。β2m参与重链的折叠,并且也被发现参与抗原向T细胞(CD8)的呈递。β2m还对于MHC-I/抗原复合体的稳定性起作用[Neefjes,F.F.等人(1993)Selective and ATP-dependenttranslocation of peptides by the MHC-encoded transporter.Science.261(5122):769-771]。
缺失任何β2m的转基因动物被证明是可存活的,但是呈现出减弱的免疫应答,使得它们对于病毒和寄生虫感染更加易感。这些动物中的免疫应答的减少似乎与下列事实相关:就它们的MHC I复合体而言,它们的细胞呈递非常少的抗原;并且它们的多数T淋巴细胞是无功能的[Pereira P.,等人(1992)Blockade of transgenic gamma deltaT cell development in beta 2-microglobulin deficient mice.EMBOJournal 11:25-31]。
β2m蛋白也被描述为参与重链的高尔基体中的糖基化[Sege等人(1981)Role of beta2-microglobulin in the intracellular processing ofHLA antigens.Biochemistry.20(16),pp 4523-4530]。
β2m蛋白还参与其它现象,例如细胞间信号传导以及关键蛋白例如HFE(人血色素沉着症蛋白,其调节细胞中的离子的流动)的正确折叠的调节。
另外,从20世纪80年代末以来,已经确认了β2m可以有利地改善抗原应答,并用作疫苗佐剂以刺激与T淋巴细胞(CD8)相关的免疫应答。
众多文献表明:因此,β2m可以与具有诱导免疫反应任务的分子、例如特殊病毒或肿瘤抗原组合而被掺入疫苗组合物中。
在这样的疫苗组合物中,β2m可以以不同形式存在:纯化的或重组的。因此,已经描述了这样的遗传构建体:其中编码β2m的基因与编码免疫原性肽的基因序列融合,旨在表达融合蛋白以期在体内引发特异性免疫反应[WO 99/64957]。
β2m蛋白本身免疫原性非常弱,因为其不是糖基化的。因此,在上述疫苗组合物中,β2m总是被用作佐剂,而不是被用作活性成分。
毫无疑问,这是由于下列原因:到目前为止还未观察到能够证明其在药物组合物中的应用的β2m的治疗性效应。
除了在疫苗中以外,一些现有技术文献表明治疗性组合物中的非活化形式或修饰形式的β2m蛋白。
因此,国际申请WO 02/102840描述了被赋予非功能性、想要形成非活性MHC I复合体的β2m,其不再能够激活CD8 T淋巴细胞。这样形成的MHC复合体被用作免疫系统的“诱饵”,目的在于获得免疫抑制效应。
另一项国际申请WO 02/24929描述了这样的治疗性组合物,其中β2m缀合至用作载体的HFE蛋白,以将药物(那些组合物的活性成分)递送至细胞内隔室。
应当注意,在这些类型的申请中,β2m蛋白不是以其野生型功能形式作为活性成分使用,而是作为药物支持物或载体(在存在不是靶向MHC的活性成分的情况下)。
此外,与任何治疗性应用不同的是,β2m蛋白经常被用作不同病症的标志物,特别是作为诊断方法。
因此,在AIDS病中的免疫缺陷综合征(可能在感染HIV之后很多年才显示出来)之前,存在血液中的β2m浓度的突然升高。
一些公开物[Wu C.H.等人(2001)Oncogene 20:7006-20]强调:β2m浓度的升高与某些癌症、特别是骨癌和前列腺癌的发展相关,并且可能参与其中[Gross M.等人(2007)Clin.Cancer Res.,13:1979-1986]。对于其它癌症例如在结肠癌中,观察到β2m血清浓度的下降[Kaklamanis L.等人(1992)Int.J.Cancer 57:379-385]。
血液(更具体而言,血清)、脑脊髓液或唾液中的β2m的剂量经常被用于诊断某些传染性或寄生虫疾病,但是主要也用于诊断肾、淋巴系统的某些疾病、风湿病、炎性疾病和神经系统疾病,例如阿尔茨海默病和额颞痴呆[Davidsson P.等人(2002),Proteome analysis ofcerebrospinal fluid proteins in Alzheimer patients ClinicalNeuroscience and Pathology 13:611-615;Hansson S.F.等人(2004),Validation of a prefractionation method followed by two-dimensionalelectrophoresis-Applied to cerebrospinal fluid protein fromfrontotemporal dementia patients Proteome Science 2:1-11]。
在被认为是健康状态的人中,血液中的β2m的平均浓度保持相对恒定,低于或等于2mg/l,这与上述疾病中的情况是不同的,在上述疾病中,该浓度可达到高达4.0mg/l的数值。
对于某些病症,血清β2m的升高可由β2m的增加的“脱落”(细胞表面蛋白的释放)而引起[Bellotti V.,等人(1999)Cell.Mol.LifeSci.,55-977-991]。
血液中循环的血浆β2m正常在肾中由肾小球过滤,然后在肾小管中重吸收和分解代谢。
研究已表明:一半的血浆β2m(β2m的游离形式),每日更新,更特别的是来自于MHC-I复合体的回收。因此,这种更新本身似乎对于平均体重的人贡献大约150mg/24h的高产量的血清β2m。然而,“代谢回转(turn-over)”似乎将使血清浓度稳定在2mg/l。
在进行透析的人中(其β2m不由肾排除),β2m在体液中的积累具有有害的结果。特别地,其通过在某些结缔组织(神经和关节)中形成淀粉样蛋白斑而诱导关节病和神经病[Ohshi K.,等人Pathogenesis of beta2-microglobulin amyloidosis(2001)Pathol.Int.51:1-10]。
在骨关节炎(关节病)中,β2m被描述为对于软骨细胞的增殖具有抑制效应,其结果是加剧软骨的破坏[WO 2004/020586]。
在某些自身免疫疾病的情况下,例如多发性硬化(MS),通常会监视患者的β2m浓度变化,以预测炎性发作的启动[Bagnato,F.,(2003),beta-2 microglobulin and neopterin as markers of disease activityin multiple sclerosis Neurol.Sci.24:51301-51304]。然后,优选测定脑脊髓液中的β2m的浓度,因为血液中的β2m的浓度被认为变化太大[Caudie C.等人(2005),Valeurs usuelles et utilitédiagnostique de laβ2-microglobuline dans le liquide céphalorachidien Ann.Biol.Clin.63(6):631-637;Ryu O.H.,等人(2006)Rheumatology,45:1077-1086]。
β2m在自身免疫疾病中的参与仍然是未明的,并且值得进一步研究。
自身免疫疾病是一大类疾病,其症状可归因于免疫系统的机能亢进,其中存在或不存在针对通常存在于体内的物质或组织的自身抗体。
肯定的是,自身免疫疾病中针对“自身”的免疫应答产生自经由MHC系统的T淋巴细胞的激活,有数种机制可引起这一点。
在免疫系统中:
—使用T细胞诱导自身抗体,这是通过呈递所述自身抗体已知的抗原。在系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、多发性硬化(MS)、胰岛素依赖性糖尿病(I型)等中是这种情况。
在细胞中:
—通过特异于病毒抗原的T细胞的激活诱导自身免疫应答;
—APC-MHC-I/TcR(T细胞受体)识别的变化以及激活的T淋巴细胞的信号级联的变化;
—MHC-I系统的成分中的APC的不正确的组装;
—调节细胞的运行上的缺陷;
在分子水平:
—分子拟态或耐受;
—MHC I作为自身抗原;
自身免疫疾病一般被认为是起因于遗传易感性与传染发作(在该过程中身体对其自身抗原产生免疫反应)的结合。然而,这些疾病的确切起因尚未被准确鉴定。
最广泛传播的自身免疫疾病是类风湿性多关节炎、干燥综合征、桥本甲状腺炎、阿狄森病、系统性红斑狼疮、硬皮病、纤维肌痛、肌炎、强直性脊柱炎、I型胰岛素依赖性糖尿病、克罗恩病、乳糜泻和多发性硬化(MS)。
在被称作“罕见疾病(orphan disease)”的疾病中,有很多怀疑是自身免疫疾病的其它病症。肌萎缩侧索硬化(ALS)是这些疾病之一,目前对其尚无有效治疗。
应该区分2种类型的自身免疫疾病:特异性自身免疫疾病和非特异性自身免疫疾病。
在非特异性自身免疫疾病中,不同的器官受到影响,引起系统性疾病,例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征和硬皮病。
特异性疾病特别地限于某些器官。最常见的是胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺疾病、阿狄森病、肾脏、肺、消化系统的一些疾病,特别是多发性硬化。
目前的治疗法包括多种方法:有抗炎剂,也有免疫抑制剂,还有抗代谢剂和抗癌药物。举例而言,使用了下列:非甾类抗炎药物(NSAID)、糖皮质激素、抗代谢剂(甲氨蝶呤、硫唑嘌呤)、环磷酰胺、柳氮磺胺吡啶、金盐(gold salt)、环孢素A、麦考酚酯和来氟米特。
最近,已推荐干扰素β用于MS,推荐氯喹(用于抗疟疾)的衍生物用于治疗红斑狼疮和类风湿性多关节炎。
用于治疗其它疾病的这些治疗法适应性不是特别好,具有多种不希望的副作用,特别是当它们被长期使用时。另外,虽然它们能够使这些疾病的症状至少部分减弱,但是它们不能消除患有的疾病。
本发明的发明人对于患有明显不同的自身免疫疾病的4位患者的情况特别感兴趣:
—第1位患者(P1)患有非特异性自身免疫疾病,即不影响特定器官;还患有桥本甲状腺炎和原发性干燥综合征;
—第2位患者(P2)最初患有MS,随后患有十二指肠淋巴细胞浸润;
—第3位患者(P3)患有乳糜泻;
—第4位患者(P4)患有桥本甲状腺炎和乳糜泻。
对于这些患者,本发明人试图建立使用如下文所述的常规方法分离自患者血液的淋巴细胞中的HC(MHC-ABC)/β2m的量的比例。
令人惊奇的是,在这4位患者中,该HC/β2m比例被证明相对于对照供体升高,而血清β2m浓度是平均的,大约为:对于P1是1.9mg/l,对于P2是1.8mg/l,对于P3是1.1mg/l,对于P4是1.1mg/l(见表1)。
表1:患有自身免疫疾病的患者中的不同形式的β2m的测定
HC:MHC I的重链
(a)以mg/l表示的β2m的浓度;
(b)从总淋巴细胞蛋白计算而来的HC/β2m;
(c)从分离自纯化的淋巴细胞级分的质膜计算而来的HC/β2m;
上表1的结果显示HC/β2m比例的不平衡。这些结果揭示了预料不到的情况,其中这4位患者中存在的MHC-I膜复合体明显显著缺乏β2m(相对于HC浓度),没有此,增加血液中的游离β2m的浓度。
将这些观察与健康状况良好的人(其显示1左右的HC/β2m比例)中的对照进行比较。不同的是,β2m似乎在患有自身免疫疾病的患者中的细胞内隔室内被捕获。
这些结果使本发明人感到惊讶,并促使本发明人提出以下假设:影响患者的4种自身免疫疾病可能具有膜MHC-I复合体中的β2m的缺乏,作为共同起因。更一般地,MHC复合体中的HC/β2m不平衡似乎导致多种自身免疫疾病中遇见的病症的出现。
根据下文阐述的该假设,在4位患者患有的病症的情况下,自身免疫应答明显不是血液中游离β2m的一般性增加的结果,相反,起源于膜MHC-I复合体中的局部β2m的缺乏,这易于改变抗原向T细胞(CD8)的呈递。
应该注意:如本领域已经描述的那样,该假设不以任何方式排除β2m在T淋巴细胞激活和炎性过程中的参与。
鉴于这些初步的观察,本发明人进行了存在于患有MS或克罗恩并的其它患者中的总淋巴细胞蛋白中的HC/β2m的分析,并且能够发现来自这些患者的淋巴细胞的HC/β2m比例也高于对照患者。
基于这些结果,本发明人已经开发了主要活性成分为功能形式的β2m蛋白的药物组合物。
这些组合物的目的是缓解患有自身免疫疾病的患者中的膜MHC-I复合体中β2m的缺乏。
图1:I型MHC复合体在平面(A)和空间(B)的的示意图。重链(HC)由3个细胞外结构域(α1、α2和α3)和1个跨膜结构域组成。轻链(β2m)为细胞外的,其插入于膜和以下位置之间:重链的α1与α3二者邻近的位置。图B显示重链呈递的肽(抗原)的位置。
图2:放置为与根据本发明的脂质体接触的淋巴细胞的照片(X630)。根据实施例2描述的透析方法制备脂质体。脂质体(浅色斑点)被吸附于淋巴细胞(HLA-ABC)的膜上。细胞核是完整的(灰色)。
图3:放置为与根据本发明的包含白蛋白的脂质体接触的淋巴细胞的照片(X630)。使用DAPI赋予蛋白(白蛋白)荧光。其形成更深色的斑点,通过免疫荧光检出,穿透较浅的淋巴细胞(HLA-ABC阳性)。
图4:使用挤出方法(绿色)制备的并包含荧光β2m(TRITC)的脂质体的照片(X630)。A:脂质体中包含的荧光脂质NBD-PC-Oleyl发射的荧光。B:偶联于β2m的荧光体(异硫氰酸酯若丹明B)发射的荧光。C:两种荧光A和B的重叠。
图5:从患者(P1)纯化而来、并以根据挤出方法制备的、包含荧光β2m(TRITC)的脂质体温育的淋巴细胞的照片(X630)。A:Hoechst 33342标志物发射的荧光,其将淋巴细胞的细胞核染成蓝色。B:偶联于β2m的荧光体(异硫氰酸酯若丹明B)发射的荧光。该标记显示β2m掺入已变为红色的淋巴细胞。C:脂质体中包含的绿色荧光脂质NBD-PC-Oleyl发射的荧光。该标记显示脂质体与淋巴细胞的结合。D:B和C标记的重叠(黄色)——比例尺:10μm。
图6:在两个不同的温度(25℃和37℃)储存30天之后,通过含有白蛋白的脂质体的荧光进行的显微检查(TRITC)。通过观察,无法区别不同类型的制备和储存之间的主要差别。A和B:批次30(30mg蛋白/150ml)。C和D:批次60(60mg蛋白/150ml)。底端:脂质体中包含的荧光脂质NBD-PC-Oleyl发射的荧光。顶端:与白蛋白偶联的荧光团(异硫氰酸酯若丹明B)发射的荧光。比例尺:200nm。放大倍数:630。
图7:包含白蛋白的脂质体根据时间(2、30和60天)和储存温度(25℃和37℃)的尺寸大小分布(%)(<50nm,50至100nm之间,>100nm)。A和B:批次30(30mg蛋白/150ml),C和D:批次60(30mg蛋白/150ml)。
图8:包含高浓度的β2m(批次80mg蛋白/150ml)的脂质体根据在25℃时的储存时间(6和40天)的尺寸大小分布(%)(<50nm,50至100nm之间,>100nm)。
图9:纯的或脂质体包被的β2m被患者的血清或健康供体的血清随着时间的降解图。A和B:纯的β2m/β2m的脂质体制剂(血清患者1:51岁的妇女,患有桥本氏疾病)。C和D:纯的β2m/β2m的脂质体制剂(血清患者2:73岁的妇女,类风湿性多关节炎)。E和F:对照患者,健康的62岁男性。
图10:蛋白的凝胶电泳,显示出β2m(脂质体制剂)与纯化自患者的淋巴细胞的细胞表面上的MHC-I的重链之间的结合。A:在存在戊二醛的情况下,在55kDa处见到HLA-β2m复合体,在12kDa处见到游离β2m。泳道上无戊二醛的12kDa处的带代表细胞β2m(泳道3)。B:定量β2m在膜上的表达。该对照使得可以验证戊二醛对于制备HLA-β2m复合体的用途。C:在用β2m的脂质体制剂温育90分钟之后,来自患有多发性硬化的患者(39岁妇女)的淋巴细胞与来自健康供体(67岁男性)的淋巴细胞的比较。相对于对照,脂质体中包含的β2m更多地结合于来自患者的淋巴细胞(在存在戊二醛的情况下)之上。
图11:游离β2m或脂质体中的β2m对于人肝细胞和肾细胞的“体外”毒性测定。
A、C和E:在暴露24、48和72小时后对于HH肝细胞的测定。B、D和F:在暴露24、48和72小时后对于HREpic肾细胞的测定。1:对照。2:对照和非载入的脂质体。3:3μg游离β2m。4:3μg在脂质体形式中的β2m(批次66μg/150ml)。5:6μg游离β2m。6:6μg在脂质体形式中的β2m(批次132μg/150ml)。通过BCA方法估计总蛋白含量。
图12:游离β2m或脂质体中的β2m对于人肝细胞和肾细胞的“体外”毒性测定。标记与图11中的相同。MTT测定细胞存活性的结果。
详细描述
因此本发明涉及β2m蛋白作为活性成分的用途,特别是用于制备药物的用途。
β2m蛋白优选是蛋白的人类形式,纯化的或重组的,其参考多肽序列以及遗传决定簇描述于GENEBANK数据库中,登记号为CAG33347。
如果其为纯化的,则β2m可获自健康供体的血清。
也可以考虑到依赖化学合成,因为该蛋白可以以非糖基化形式使用。
本发明的β2m的治疗用途延伸至该蛋白的功能变体,也就是说其同种型、该蛋白的突变的拷贝或片段,其特征在于它们具有与野生型蛋白相同的功能,也就是说具有如本申请描述的相同的治疗效应,然而该效应相对于所述野生型蛋白而言强度可能降低或增加。
功能变体更具体地代表能够与存在于细胞表面上的MHC复合体结合的多肽,其多肽序列与人β2m蛋白的多肽序列至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、更优选至少95%同一(序列的比较通过例如ClustalW软件应用来进行)。
β2m的功能变体优选由β2m蛋白的片段组成,其呈现相同的治疗性效应,或甚至相同的生物活性。
此类功能变体也可通过克隆于表达载体或基因治疗载体中的核苷酸序列的表达来产生。
多个出版物描述了例如β2m的同种型在啮齿类[Goding J.W.and Walker I.D.Allelic forms of β2-microglobulin in mouse(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:7395-7399]和人类[Davidsson P.等人,Proteome analysis of cerebrospinal fluid proteins in Alzheimerpatients(2002)Clinical Neuroscience and Pathology 13:611-615;Hansson S.F.等人,Validation of a prefractionation method followedby two-dimensional electrophoresis-Applied to cerebrospinal fluidprotein from frontotemporal dementia patients(2004)ProteomeScience 2:1-11]中的存在。其区别更具体地为不同的等电点(pI)的这些同种型,被认为是β2m的功能变体。
相对于纯化的人蛋白,此类功能变体可具有产物或其制剂的有效性上的某些优势(溶解性、更大的稳定性、减小的蛋白水解降解)。本发明涉及包含β2m或β2m的一种或多种功能变体作为活性成分的药物组合物。
优选地,β2m或其功能变体形成所述组合物的唯一的活性成分。
在本发明的意义内,活性成分是进入药物的组合物中且负责其药效或治疗性质的物质。在本发明的意义内,佐剂不被认为是活性成分。
更优选地,本发明涉及由包含于药学上可接受的载体或介质中的β2m或β2m的功能变体组成的药物组合物,所述药学上可接受的载体或介质优选为脂质体。
根据本发明的优选方面,根据调节推荐和要求,使用所述药学上可接受的载体或生理溶液单独施用β2m。
根据本发明,β2m更特别地由于其恢复患者中的膜MHC-I复合体内的正常HC/β2m比例的能力而被应用。
HC/β2m优选针对淋巴细胞特别是B细胞而处理。HC/β2m对应于纯化的MHC I复合体中的HC与β2m亚基的摩尔比。
优选地,该比例恢复至与不患有疾病的人中的比例相当的水平。更优选,使用β2m旨在降低患者中的HC/β2m比例以达到接近1的摩尔比。
本发明更具体地涉及预防在患有自身免疫疾病的患者中的MHC-I复合体中发生β2m缺乏。
因此根据本发明的β2m的用途更具体是旨在治疗自身免疫疾病。
本发明人已经能够确定:在患有自身免疫疾病的某些患者中,细胞内或膜β2m的缺乏可以引起HC/β2m比例大于1或甚至2。因此本发明涉及使所述HC/β2m恢复至接近生理值的数值,即优选小于2,更优选小于1.5,更优选小于1.2。
除了自身免疫疾病之外,本发明当然可以应用于与MHC I复合体中的HC/β2m比例失调相关的任何疾病。
在本发明的意义内,与器官移植或移植排斥相关的病症不被认为是自身免疫疾病,也不被认为是由于免疫系统对于“非自身”的识别缺陷而引起的疾病。更准确地说,移植排斥在本文中被认为是由于免疫系统对于“非自身”的识别引起的而非对于“自身”的识别缺陷。
本发明人在不同患者中进行的分析表明:至少可在如下疾病中观察到基于总淋巴蛋白计算的大于1.2的HC/β2m比例:类风湿性多关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、硬皮病、纤维肌痛、肌炎、强直性脊柱炎、I型胰岛素依赖性糖尿病、桥本甲状腺炎、阿狄森病、克罗恩病、乳糜泻、肌萎缩侧索硬化(ALS)和多发性硬化(MS)。虽然科学界仍有争议,但是根据所获得的结果,ALS被比作自身免疫疾病。
本发明更具体地涉及开发以下药物,其用于增加血液β2m的比例至2.5至12mg/l、优选3至8mg/l、更优选3至5mg/l的浓度,以缓解膜MHC-I复合体的HC/β2m缺乏。
如下文所述,在本发明的实验部分中,根据本发明的药物可以由包含β2m或其功能变体的脂质体制剂组成。可使用本领域技术人员已知的不同技术制备脂质体,例如在本发明的实施例中例示的那些。可使用构成脂质体的不同脂质[Medical Application of Liposomes(1986)Kunio Yagi编著,Japan Scientific Societies Press,Tokyo,Karger]。
该方面的本发明的优选药物由载入了β2m的脂质体组成。
优选地,β2m或该蛋白的功能变体仅构成所述脂质体制剂中包含的活性成分。
有利地是使用根据本发明的脂质体作为药物,因为其能够保护β2m免于可能发生的蛋白水解攻击,并且由于其能够使β2m按照靶向方式被递送至MHC-I复合体,特别是通过脂质体与磷脂(磷脂构成细胞膜)的融合。
根据本发明的另一方面,编码β2m或其功能变体之一的基因治疗载体用于在体内合成蛋白,尤其是在MHC复合体的环境下。此类基因治疗载体可包含于脂质体中。
因此本发明还涉及基因治疗方法,包括体内或离体表达β2m或其功能变体作为活性成分的步骤。文献中描述的不同类型的病毒或非病毒载体可适于为此目的表达β2m蛋白[Urnov等人(2005)Highlyefficient endogenous human gene correction using designedzinc-finger nucleases,Nature,435:577-579]。优选地,根据本发明的基因治疗载体能够在人体内表达β2m蛋白(或其功能变体),任何其它活性成分、优选任何其它多肽除外。
根据本发明的方面,可通过灌注包含β2m的脂质体的溶液或表达该蛋白的载体或通过输注预先与β2m接触的来自患者的淋巴细胞来治疗患者。这种接触可通过“离体”温育提取自血液样品的淋巴细胞来进行,所述血液之前采自于同一患者。
根据本发明的优选方面,以盐水形式制备包含β2m的药物。制备药物的优选方法在于:离体温育盐水形式的β2m,与预期接受该药物的患者的血清接触。
上文描述的根据本发明的药物组合物可采用本领域技术人员已知的用于口服施用、通过注射、灌注或吸入施用的任何合适的形式。
本发明的另一方面涉及自身免疫疾病的诊断,更具体是上文所列疾病的诊断,其是通过体内或体外测定MHC I复合体的HC/β2m比例。
根据本发明的诊断方法优选包含一个或多个下列步骤:
i)从待筛选自身免疫疾病的患者提取细胞,优选淋巴细胞;
ii)如果必要,从那些细胞提取MHC I复合体;
iii)测定所述复合体中包含的HC和β2m的各自的量;
iv)建立HC/β2m摩尔比;和
v)将所获得的HC/β2m比例与之前从其它患者获得的结果进行比较。
可以建立全部细胞的HC/β2m比例(HC/β2m细胞比例),或优选可建立膜的HC/β2m比例(膜MHC I复合体的HC/β2m比例)。优选地,根据本发明的诊断方法包括将HC/β2m比例与对照进行比较的步骤,或在监视患者的情况下,与其它之前测定的比例进行比较。
HC和β2m的蛋白的各自的量可根据本领域技术人员已知的方法以标准方式测定,例如通过定量免疫检测(例如ELISA、免疫斑点分析(Immunodot)、″蛋白质印迹″、自身抗原微阵列等)。MHC-I复合体的提取根据已知的提取细胞和膜蛋白的程序进行。
可以在治疗性监控患有各种自身免疫疾病的患者的情况下实施根据本发明的诊断方法。
以下实施例是为了补充本发明的描述,不是限制其范围。
实施例
1.患有自身免疫疾病的患者中的淋巴细胞的HLA-I膜复合体的成分分析
不被理论所限,本发明人提出了下列工作假设:HC/β2m比例的升高可引起自身免疫类型的反应。特别地,本发明人已考虑到:在MHC-I复合体的水平,HC的过量、β2m的降低,或二者同时发生,可引起“自身”向TcR“过度暴露”的现象。注意β2m保护HC的某些区域并特异性确定“非自身”向CD 8 T细胞的呈递[Hill,D.M.等人(2003),A dominant negative mutant β2-microgobulin blocks theextracellular folding of major histocompatibility complex class Iheavy chain.JBC.278:5630-5638]。
为了验证该假设,进行了第一个分析以确定从4位患者的淋巴细胞提取的MHC I复合体中的HC和β2m的摩尔数量。这些分析的结果显示于表1中,在上文有评述。
根据Lightbody J.[Manual of Clinical Immunology,Rose NR.,Friedman H.Editors American Society for Microbiology Washington(DC),1976,pages 851-857]的方法、按照Hofman F.M.等人[Ann.J.Clin.Pathol.(1982)77:710-716]的修改从健康供体和患者的血液分离淋巴细胞。在完整淋巴细胞或在根据Warley A.等人[Biochim.Biophys-Acta(1973),323:55-66]的方法、稍许修改而制备的质膜上检测到了MHC-I复合体。根据以下进行MHC-I的蛋白成分检测:通过根据Laemmli U.K.[Nature(1970)227:680-685]的电泳(SDS-PAGE系统),然后根据Towbin H.等人[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76:4350-4354]的方法电转移至PVDF膜上并进行免疫印迹分析。通过偶联于碱性磷酸酶的二抗,使用NBT-DCIP混合物进行显色。
通过分离质膜和使用与戊二醛结合的方法(下文描述)验证了过量的重链确实是来源于膜。
如上文所述,另外4例MS和2例克罗恩病显示出HC/β2m的细胞比例大于1。这些观察促使申请人开发了实验方法使得能够使HC/β2m(MHC-I)恢复平衡,特别是使用脂质体。
2.载入了β2m的脂质体的制备
2.1待递送至患者的β2m的量的评估
为了使淋巴细胞表面上的β2m过量,其在血液中的浓度应该在“合理”的限度内增加,以便不激发具有繁殖潜力的细胞上的信号传导通道。
鉴于β2m脱离膜并在血液和肾系统中循环的便利性,应该使血液β2m浓度为3mg/l至8mg/l(正常浓度在大约2mg/l血液左右变化)。该升高使得β2m在细胞表面被吸收。
注意I型主要组织相容性复合体由摩尔/摩尔的重链(MW≈43kDa)和β2m(MW≈12kDa)构成。因此复合体(MW≈55kDa)由按重量计79%的重链和21%的轻链构成。
淋巴细胞的平均蛋白含量是650x 10-12g,其质膜的蛋白含量仅为其总含量的1%,即6.5x 10-12g。如果认为MHC-I仅代表静止淋巴细胞的膜蛋白总含量的至多1%,因此β2m的含量为大约1.4x 10-14g/淋巴细胞。
取平均生理参数,2x 106淋巴细胞/ml血液和5升血液/个体,总MHC-I/个体的“重量”的范围(考虑淋巴细胞)将是1.4x 10-6g至1.8x10-6g的淋巴细胞β2m。这些数字是最大数字:本发明人的第一个评估显示患者中的数值平均主要处于0.2x 10-9至500x 10-9g的范围。由于血液中的平均数量是10mg β2m/个体,即远大于存在于淋巴细胞表面上的数量,所以在正常条件下显示出:基本上小于1的比例已经存在于膜β2m与血清β2m之间。因此,增大血液循环中的β2m的比例(增加其渗透分压)以补偿缺乏β2m的膜不是不合理的。
β2m的施用可以以两种方式进行:
(1)施用载入了β2m的脂质体。这种类型的药物载体目前用于施用肽、抗体、遗传材料等。脂质体(“人工”或合成膜)的使用促进细胞表面与活性成分之间的接触;
(2)在施用之前将盐水形式的活性成分用患者的血清温育。该温育的目的是血清的脂蛋白以脂质体的方式作为载体。
通过方法1或2引入淋巴细胞的β2m的程度可与对照施用进行比较;在后一种情况下,β2m盐水灌注以0.10mg/ml(总体积150ml)施用,这提供3mg β2m/升血液(15mg β2m/150ml脂质体溶液的批次,其被称作″批次15″)。
2.2脂质体的配制
脂质体的制备(1ml的):在氮气下使包含成分的二氯甲烷(CH2Cl2)蒸发至干燥以后,形成了包含磷脂酰胆碱的膜,其中添加或不添加胆固醇,添加或不添加鞘磷脂,或添加胆固醇和鞘磷脂。对于3种化合物(磷脂酰胆碱、胆固醇和鞘磷脂),比例分别是10M、2M和1M-即对于1ml的最终溶液分别为7.60mg、0.76mg和0.38mg。向该膜中加入包含2mg β2m的1ml盐水溶液(PBS 10mM.pH=7.4;HANKS,Tris/甘氨酸或DMEM)。如果脂质体是从磷脂酰胆碱(10M)、从磷脂酰胆碱(10M)和胆固醇(2M)、从磷脂酰胆碱(10M)和鞘磷脂(1M)制备的,则对于每种化合物,摩尔浓度保持相同。然而,可使用脂质成分的其它摩尔浓度。蛋白质的量可以是不同的,pH可以视情况大于7.4。通过在20-37℃的温度搅拌最高达3小时进行脂质膜的分散。
通过所谓的“清洁剂/透析”方法或通过所谓的“挤出”方法形成脂质体。对于后者,使溶液(Lipofast,Sodexim S.A.,51140 Muizon,France)在69bar的压力下通过聚碳酸酯中的100nm的过滤膜41次。所获得的脂质体是均匀大小的。在该情况下,将脂质体在4℃下保持2天,并加入到淋巴细胞悬浮液(直径<100nm;图4)。在更大的规模时,使溶液(3l/hr;sodexim 2770;emulsifflex c3;sodexim s.a.)在450bar的压力下通过4次以获得SUV(小的单层囊泡)。
在″预试验″测定中,为了显示β2m在脂质体中的掺入,脂质体在细胞表面上的吸附和蛋白质从脂质体向细胞内的转移,本发明人产生了荧光脂质体。根据测定法,制备了在520nm或572nm发荧光的脂质体。为此,将0.5M NBD-PC(1-油基-2-(-6-(((7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基)已酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱)(在490nm激发,在520nm发射)或0.5M Liss Rhod PE(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺若丹明B磺酰基)(铵盐)(在541nm激发,在572nm发射)加入到脂质混合物中,然后进行蒸发并获得脂质膜(见上文)。
在预试验规模,通过清洁剂/透析方法产生脂质体。通过该技术,也获得了良好校正的和稳定的SUV。
简而言之,在20-37℃的温度搅拌最高达3小时之后,将胶束悬浮液针对包含β2m以及4μM(0.8mg/ml)正己基-βD-吡喃葡萄糖苷的盐水溶液在4℃在微透析装置中透析12小时。透析膜具有3.5kDa的截留值,正己基-βD-吡喃葡萄糖苷(清洁剂)在最终的溶液中被稀释至至少1ppm。
获得的脂质体具有大约200nm直径的尺寸。它们在环境温度在至少3个月的时间内是稳定的,并包含至少0.1mg(β2m)/ml最初溶液。
2.3将测试脂质体应用至“离体”维持在培养物中的淋巴细胞上
为了显示为了靶向淋巴细胞的MHC复合体的目的而配制脂质体悬浮液形式的β2m蛋白的意义,将淋巴细胞用载入了白蛋白的脂质体温育,白蛋白是可以使用相对简单的技术通过荧光检测的蛋白。
离体检测蛋白质向脂质体中的掺入和根据上文所述的方法产生的脂质体(基于磷酯酰胆碱,使用Liss Rhod PE)的应用。
通过使用荧光胺来制备而使蛋白质有荧光,荧光胺是一种其荧光与DAPI(二氨基苯基吲哚;在372nm激发,在456nm发射)的荧光相当的化合物。使用Hames B.D.等人[Gel Electrophoresis ofProteins,a practical approach,Hames BD.and Rickwood D.eds.Thepractical Approach Series,2nd Edition.IRL Press,Oxford,New York,Tokyo.p.67]描述的方法,通过荧光胺在蛋白质的N末端的共价结合,赋予从牛血清结晶的白蛋白荧光,与Hames B.D.的方法的区别在于是在不含去污剂(SDS)的Tris-Hcl(25mM)/甘氨酸(192mM)(pH=8.3)缓冲液中进行制备。如上文所述,所形成的脂质体包含2mg荧光白蛋白/毫升脂质体溶液。
接下来,将包含250 000淋巴细胞的0.2ml的淋巴细胞悬浮液(Hank′s/0.5mM EDTA,pH=7.4)用0.2ml所形成的包含白蛋白的脂质体(缓冲液25mM Tris-Hcl/192mM甘氨酸,pH=8.3)在37℃在用CO2(5%)饱和潮湿空气下温育1小时。
最后,使用如Rakotoarivelo C等人[Receptors to steroidhormones and aromatase are expressed by cultured motoneurons butnot by glial cells derived from rat embryo spinal cord(2004)Neuroendocrinology 80:284-297]描述的方法,使对照脂质体(200μl)、对照淋巴细胞(200μl)和以载入了蛋白质的脂质体处理的淋巴细胞(200μl)在经聚赖氨酸和层粘连蛋白处理和覆盖的盖玻片上沉降。
通过表面荧光显微镜(Axiovert;Zeiss,Germany)直接观察制剂,或以4%(plv)多聚甲醛水溶液固定30分钟,将盖玻片以PBS冲洗3次(160mM,pH=7.2)。使用在PBS中制备的0.1%Triton X-100(v/v)轻轻地使制剂可渗透5分钟。
使用抗HLA-ABC一抗标记细胞。在某些情况下,使用Hoechst(荧光450nm蓝色发射,DAPI)标记细胞核。在兔中产生的一抗与用于″蛋白质印迹″的一抗是相同的。稀释一抗至1/50,稀释结合于FITC(绿色荧光)并在山羊中产生的二抗至1/160。在含有2%牛血清白蛋白的PBS中进行抗体的温育。对于x63镜头,使用Fluorsave(Calbiochem,USA)安装盖玻片。
图2和3的照片显示脂质体吸附于淋巴细胞的表面,包含于脂质体中的标记的蛋白沉积于所述淋巴细胞的膜的表面。
结果清楚地证明本发明人提出的恢复HC/β2m膜平衡的实验方法的可行性。
根据挤出方法也产生具有绿色荧光的其他脂质体,其包含从尿中纯化的人β2m(Sigma,USA),浓度为0.6mg/ml。以异硫氰酸酯若丹明B标记β2m,其具有红色荧光(激发:540nm,荧光:625nm)。使用Riggs等人[(1958)Am.J.Pathol.34:1081-1097]描述的方法,使β2m与若丹明B结合。结合之后,将蛋白在Sephadex柱(Pharmacia,Sweden;G-10:珠体积9ml;柱内部直径0.7mm)中纯化。柱在PBS(Bio-rad,10mM磷酸盐,150mM NaCl,pH=8.3)中水合。在以milli-Q H2O 1:1稀释的PBS中洗脱蛋白(4.5-7.0ml)。在类似的柱(2.5-6.5ml)中纯化形成的脂质体(图4),并使用rotovapor(Buchi,Switserland)浓缩2次。分离自患者P1血液的淋巴细胞按照之前的描述温育90分钟,并在荧光显微镜下观察。结果显示89%的淋巴细胞掺入β2m(图5)。2.4脂质体的稳定性(图6-8)
在多种条件下测试如上所获得的包含白蛋白的“测试”脂质体以评估它们随时间的稳定性。
测试了批次30(对应于30mg白蛋白/150ml脂质体)和批次60(对应于60mg白蛋白/150ml脂质体)随时间和温育温度的稳定性。
构成脂质体的脂质由636nmol PC和31.8nmol NBD-PC-Oleyl组成。在氮气流下蒸发至干燥之后,使用含有200或400μg白蛋白(Sigma,USA)的1ml PBS(pH调节至7.2)(分别是批次30和60)在强烈搅拌下逐滴溶解脂质混合物。接下来,使用Liposofast-basic system(Sodexim,France)通过机械挤出获得脂质体。然后在Sephadex G10柱中纯化每个批次。在设定的时间,将50μl每个批次沉积于聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白涂覆的盖玻片并在37℃温育12小时。接下来,通过使用戊二醛在4℃下结合生物材料持续30。使用Axiovert 200(Zeiss)表面荧光显微镜获得图像(储存一个月的稳定性,图6),并使用Axion vision软件应用来记录。关于统计学研究(图7),使用Serf软件(http://www.org/serf)测定脂质体的直径。对于每个批次的研究,将脂质体群体分为3类:直径<50nm,50至100nm,和直径>100nm。直方图的高度代表每个大小的亚群体的百分率。保持在37℃的批次60显示出60天储存时间内的最大稳定性:95%的脂质体具有<100nm的直径,这对于蛋白向细胞表面的转移是理想的直径。
对于批次80(80mg β2m;图8),测试了在25℃(以使污染和蒸发最小化)储存6和40天。制备方法与上述对于批次30和60(白蛋白)是相同的,除了以下不同之处:使用非荧光的β2m(533μg/ml PBS),并且是通过透析盒进行纯化(具有20kDa截留值的膜,ThermoScientific,USA)。图8的直方图清楚地显示在该储存阶段,98%的脂质体保持对于β2m转移至淋巴细胞的理想尺寸(即直径<100nm),其持续长达40天。
2.5脂质体保护外源β2m免于被人血清蛋白水解降解(图9)
从健康供体和患有自身免疫疾病(桥本甲状腺炎、类风湿性多关节炎)的供体获得血清。将这些血清(90μl)在25℃在存在2μg纯β2m(Sigma-Aldrich,USA)或存在脂质体形式的β2m(批次30脂质体,对应于30mg β2m/150ml脂质体)的情况下温育15天。总反应体积是130μl,如果需要,以PBS(磷酸钠10mM,氯化钠150mM,pH=7.2)补齐。在第0、1、2、3、6、10和15天,连续从该反应介质取出10μl(对应于150ng),以含有6M尿素的变性缓冲液(SDS-PAGE,Laemmli)补齐至30μl。将这些样品保持在-20℃直至进行分析。
收集所有样品之后,将它们在50℃温育1小时。然后通过SDS-PAGE在含有4M尿素的12%的丙烯酰胺凝胶(%T=12,%C=2.6)上分离蛋白。
在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上电洗脱之后,通过免疫印迹检测β2m的存在,使用ImageJ(NIH,USA)定量对应的带的强度。通过使用标准曲线,将由此获得的象素数目转化为β2m的皮摩尔数(10-12摩尔)。图9A-F中显示的图像代表获得的结果的实例,并表示β2m(以皮摩尔计)随时间的量。可以注意到在患有自身免疫疾病的人中,添加到血清中的游离β2m随着时间被降解,而在对照中不是如此。
总之,自身免疫疾病患者的血清对于游离β2m具有逐渐和显著的降解,而在对照中未发现。另一方面,当β2m封装于脂质体中时未发现这种降解。准确而言,脂质体似乎保护β2m免于被血清降解,因为未观察到数量上的显著降低。
结论是,脂质体保护β2m免于被血清降解。
2.6脂质体中包含的β2m与位于膜表面上的HLA I重链结合(图10)
在健康人中和在生理条件下,淋巴细胞表面上表达的β2m分子按照1:1的比例与HLA重链非共价结合。
为了显示和定量这些蛋白结合,本发明人开发了能够使这些蛋白(其中HLA-β2m二聚体)共价连接在一起的技术。
该技术的开发需要精确计算膜HC/β2m比例并显示添加脂质体形式的β2m特异性结合HLA-I的重链。
为此,本发明人利用了二醛,戊二醛,通过其两个醛基与蛋白质的胺基结合的能力。这些醛基通过3个亚甲基的柔性链连接在一起,使得戊二醛统计学上交联来自两个相互作用的蛋白质的2个胺基(Sun,T.T.,等人(1974)Protein-protein proximity in the association ofribosomal subunits of Escherichia coli:crosslinking of 30S protein S16to 50S proteins by glutaraldehyde or formaldehyde.J.Mol.Biol.87(3):509-22)。
根据该程序,使用PBS(pH=7.2)洗涤通过MSL纯化的5,000,000个淋巴细胞一次,以除掉可能的痕量的游离胺,然后通过在10,000g离心10分钟而沉淀,除掉上清液体。然后将细胞在环境温度在包含0.25%戊二醛的1ml PBS中温育5分钟。在该温育过程中,将管倒转几次。
通过加入100μl tris 1M(pH=7.2)使反应终止,Tris缓冲液提供的过量的胺基中和戊二醛。通过在10,000g离心10分钟回收淋巴细胞,然后在1ml PBS中洗涤以除掉痕量的戊二醛。离心之后,在含有4M尿素、包含抗蛋白酶(Roche Diagnostics GmBH,Germany)和5%β-巯基乙醇的400μl Laemmli缓冲液中回收沉淀,然后保持在-20℃直至进行分析。
为了确保细胞的裂解,使样品进行3个冷冻-解冻循环并充分涡旋。然后将样品在95℃温育5分钟并在4000g离心10分钟以除去任何不溶性残留物。在含有4M尿素的10%的丙烯酰胺凝胶(%T=10,%C=2.6)上通过SDS-PAGE在恒定电压(120V)分离蛋白(10μl匀浆物,对应于125,000个淋巴细胞)。将由此分离的蛋白在13V下在存在具有10%甲醇的tris-甘油的情况下半干燥转移持续40分钟至预先以甲醇活化的PVDF膜上。
通过使用稀释至1/600的抗-β2m一抗(DakoCytomation,Denmark)在环境温度温育1小时、然后再使用偶联于碱性磷酸酶并稀释至1/20000的抗-兔二抗(Sigma-Aldrich,USA)温育1小时来检测β2m。使用ImageJ软件应用(NIH,USA)进行所获得的带的强度的定量。
图10A显示了所获得的凝胶的照片。在存在戊二醛的情况下,除了可见12kDa处的常规带之外,可以在55kDa见到带。55kDa处的带对应于HLA-β2m复合体,分子量对应于β2m分子与重链的分子量之和:12+43kDa=55kDa。在同一个泳道,12kDa处的带对应于游离的非复合的β2m。定量了每个带的强度之后,检查发现12和55kDa处的这两个带的累积强度对应于“无戊二醛”的泳道中的12kDa处的带的强度,并对应于总β2m。在含有和不含戊二醛的两个泳道中,沉积了相同量的总蛋白,其对应于相同数目的淋巴细胞。
为了提供证据证明55kDa处的带的定量的确提供了淋巴细胞表面上存在的HLA-β2m复合体的量,平行使用了一项技术以从淋巴细胞纯化质膜。该技术特别允许本发明人研究淋巴细胞质膜的蛋白质。测定了膜β2m的存在并进行了定量(见图10B)。所获得的结果与55kDa处的带的定量是相当的,这确认了该带的确对应于膜HLA-β2m复合体。此外,膜β2m相对于总β2m的比例(图10B)等于55kDa带/12kDa带的总β2m的强度的比例(图10A)。
由此验证的戊二醛技术被用于显示并定量分离自人血液的淋巴细胞中通过脂质体运输而掺入的β2m的程度。
选择了2个供体,一个是健康的,用作对照;另一个是患有多发性硬化的。第二个供体的选择是基于其膜β2m相对于HLA-I的重链的缺乏。该患者的膜HC/β2m比例等于1.7,这意味着淋巴细胞膜包含的β2m比重链多69%。
来自两个供体的淋巴细胞(25ml血液)分成2个批次,每批4ml;向4ml淋巴细胞中加入含有浓度为40mg/150ml的β2m的2ml脂质体(批次40)。立即收集T0淋巴细胞并以PBS洗涤。将T90时取样的淋巴细胞用脂质体在37℃温育90分钟,然后收集并以PBS洗涤以除掉过量的未反应的脂质体。
在两种条件中的每一种之中,本发明人分离了使用或未使用戊二醛处理的淋巴细胞的两个群体(见上文的程序)。
通过SDS-PAGE分离每种条件下的总蛋白,然后通过蛋白质印迹显示。所获得的结果显示于图10C,本发明人发现在定量之后,与对照不同的是,在存在戊二醛的情况下,55kDa带(代表HLA-β2m复合体)的强度在T90时相对于T0增加55%。
该增加与该患者中β2m的缺乏是一致的,该缺乏引起淋巴细胞表面上存在游离HLA-1链。因此重链的确与脂质体提供的外源β2m结合。
所采用的实验方法使得能够证明本发明的治疗概念,即:
可以通过向淋巴细胞表面添加脂质体形式的外源性β2m重新建立HLA-β2m平衡。
具有β2m缺陷的患者可引入比无需β2m的对照更多的β2m。
引入的β2m的确与游离的HLA分子结合以形成HLA-β2m二聚体。
总之,所获得的实验数据确认了可以使用β2m的脂质体制剂靶向呈递游离重链的淋巴细胞(HC/β2m>1),以重新建立接近生理正常值即接近1的HC/β2m比例。
3.包含β2m的脂质体组合物的毒性分析
“体外”测试了脂质体形式的β2m对于人类来源的肝、肾、骨骼肌和心脏细胞的培养物的可能的毒性。
3.1测试的细胞类型
所测试的细胞和培养基购自Sciencell Research Laboratories(6076 Corte Del Cedro,Carlsbad,California)。
a.HCF:原代人心脏成纤维细胞,批次号2136
培养基:FM(成纤维细胞培养基),批次号5673+成纤维细胞生长溶液,批次号5863+FBS 10%+青霉素溶液(100U/ml)-链霉素(100μg/ml),批次号5917
b.HREpiC:原代人肾上皮细胞,批次号0546
培养基:上皮细胞培养基,批次号5967+上皮细胞生长溶液,批次号5855+FBS 10%+PS
c.HH:原代人肝细胞,批次号4607
培养基:HM(肝细胞培养基),批次号5933+肝细胞生长溶液,批次号5722+FBS 10%+PS
d.HSkMC:原代人骨骼肌细胞,批次号5606
培养基:骨骼肌细胞培养基+SkMGS+FBS 10%+PS
将培养瓶或培养皿置于37℃,5%CO2和饱和湿度的温育箱(Sanyo)中(含以0.22μm Nanopure,Thermo-Fisher过滤的超纯水的水浴)。
用于原代人细胞的培养基底是以2μg/cm2聚-L-赖氨酸在温育箱中过夜温育的细胞培养物处理的塑料(TPP,Switzerland)(Clinisciences;Sciencell Research Laboratories,批次号5826,溶液:10mg/ml),在接种前以无菌超纯水冲洗2次。
3.2细胞层的脱离和分离
细胞层的脱离这样进行:从培养瓶中除去制备的培养基,然后以无菌PBS(SIGMA,批次号088K2356)冲洗层,然后以0.05%胰蛋白酶(SIGMA Trypsin Ref T-1426,批次号020M7354),EDTA 0.2g,NaCl8g,KCl 0.4g,NaHCO3 0.58g,葡萄糖1g(SIGMA),qs 1升超纯水的溶液,以0.22μ孔隙率的膜过滤(PES)除菌的溶液(CML批次号668919)进行处理,根据培养瓶的类型调节胰蛋白酶溶液的体积(例如,对于25cm2的培养瓶为1ml),然后将培养瓶置于37℃(Sanyo温育箱)中3至4分钟。
当细胞从其基底脱离时,在存在含有通过移液管(5至10ml,取决于细胞类型)递送的血清(抑制胰蛋白酶的酶作用)的培养基的情况下进行分离。
3.3毒性测试
使用Thoma cell(Thermo Fisher)在光学显微镜(Nikon)下计数细胞,并以在200μl的它们各自的培养基中5000个细胞/孔的数量接种于具有96孔细胞培养物处理的塑料的平底培养皿(NUNC,批次号114754)中,准备好之后,将培养皿置于温育箱中24小时。将待测物质的多个稀释物浓缩3次于不含抗生素的100μl培养基中,然后将其添加至200μl每个孔中以进行处理(总体积:300μl)。在24h、48h和72h,针对蛋白剂量(Ref 23227,BCA蛋白测定试剂盒;Pierce),根据MTT(溴化噻唑蓝四唑)[Liu Y.等人(1997)Mechanism of cellularMTT reduction.J,Neurochem.69:581-593]程序检测经处理的孔和对照孔,以评估细胞毒性:
加入MTT溶液至终浓度为25μg/mL
在37℃温育1小时
吸去培养基
加入100μL DMSO(如果饱和DO,则为200μL)
在490nm读取培养皿(Biorad)
使用Excel进行计算机处理
减掉使用空白孔(空白)的背景噪声
确定DO X孔/DO对照孔的比例
将该比例的曲线针对药物浓度作图
在处理24小时和48小时即t0+48h和t0+72h测定毒性。
图11和12清楚地显示:即使在高剂量(批次132),脂质体包被的β2m也不影响肝细胞和肾细胞的存活性,但是它们对于β2m是敏感的。对于心脏来源的细胞和骨骼肌细胞也是如此(结果未显示)。
Claims (21)
1.药物产品,特征在于其包含β2m或该蛋白的功能变体作为活性成分。
2.根据权利要求1的药物产品,特征在于其包含β2m或该蛋白的功能变体作为唯一的活性成分。
3.根据权利要求2的药物产品,特征在于其由在药学上可接受的载体中的β2m或该蛋白的功能变体组成。
4.根据权利要求1-3任一项的药物产品,其中所述活性成分是人β2m蛋白。
5.根据权利要求1-3任一项的药物产品,其中所述活性成分是β2m蛋白的功能变体,其与人β2m蛋白具有至少70%、优选80%、更优选90%的同一性。
6.根据权利要求1-5任一项的药物产品,用于治疗自身免疫疾病。
7.根据权利要求6的药物产品,特征在于所治疗的自身免疫疾病是类风湿性多关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、硬皮病、纤维肌痛、肌炎、强直性脊柱炎、I型胰岛素依赖性糖尿病、桥本甲状腺炎、阿狄森病、克罗恩病、乳糜泻、多发性硬化或肌萎缩侧索硬化。
8.根据权利要求1-7任一项的药物产品,用于治疗肌萎缩侧索硬化(ALT)。
9.根据权利要求1-7任一项的药物产品,用于治疗多发性硬化。
10.根据权利要求1-7任一项的药物产品,用于治疗克罗恩病。
11.根据权利要求1-7任一项的药物产品,用于治疗类风湿性多关节炎。
12.根据权利要求1-77任一项的药物产品,用于治疗I型胰岛素依赖性糖尿病。
13.根据权利要求1-12任一项的药物产品,用于增加血液β2m的比例至2.5至12mg/l、优选3至8mg/l、更优选3至5mg/l的浓度。
14.根据权利要求1-13任一项的药物产品,用于降低患者中的MHC-I复合体的HC/β2m的摩尔比例。
15.根据权利要求1-13任一项的药物产品,用于治疗患有MHC-I复合体中的β2m缺乏的患者。
16.根据权利要求1-13任一项的药物产品,特征在于其由载入了β2m或该蛋白的功能变体的脂质体组成。
17.根据权利要求1-15任一项的药物产品,特征在于其以盐水形式制备并预先离体与待治疗的患者的血液、血清或淋巴细胞接触而温育。
18.包含根据权利要求1-17任一项的药物产品的组合物。
19.诊断自身免疫疾病的方法,特征在于其包括测定患者中的MHC-I复合体的细胞内或膜HC/β2m比例的步骤。
20.根据权利要求19的诊断方法,特征在于MHC-I复合体的HC/β2m比例是膜比例。
21.根据权利要求20的方法,特征在于其包括以下步骤:
i)从待筛选自身免疫疾病的患者提取细胞,优选淋巴细胞;
ii)从那些细胞提取MHC-I复合体;
iii)测定所述MHC-I复合体中包含的HC和β2m的各自的量;
iv)建立所述MHC-I复合体的HC/β2m摩尔比;
v)将所获得的HC/β2m比例与对照样品的HC/β2m比例进行比较。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116515000A (zh) * | 2023-06-30 | 2023-08-01 | 迦进生物医药(上海)有限公司 | Hfe融合蛋白及其应用 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2374470A1 (fr) * | 2010-04-08 | 2011-10-12 | Beta Innov | Utilisation thérapeutique de la protéine Beta2m |
CN102716379A (zh) * | 2012-06-25 | 2012-10-10 | 毕建飞 | 一种治疗强直性脊柱炎的中药组合物 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07118163A (ja) * | 1993-10-21 | 1995-05-09 | Mitsui Toatsu Chem Inc | β2−ミクログロブリンを含有する組成物 |
WO2002024929A2 (en) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Ramot At Tel Aviv University Ltd | A SOLUBLE BETA 2 MICROGLOBULIN (β2M)/HFE MONOCHAIN FOR BIOTECHNOLOGICAL AND THERAPEUTIC APPLICATIONS |
WO2002102840A2 (en) * | 2001-06-20 | 2002-12-27 | Avidex Limited | Multiners of class i major histocompatibility complexes cantaining modified beta2-microglobulin proteins |
CN1117148C (zh) * | 1995-06-30 | 2003-08-06 | 国家健康科学研究所 | 抗感染物疫苗,治疗和预防hiv感染的组合物 |
US20030194401A1 (en) * | 2002-04-12 | 2003-10-16 | Qing Yi | beta2-microglobulin (beta2m) and anti-beta2m binding agents as anti-cancer therapeutics |
CN1596311A (zh) * | 2001-09-28 | 2005-03-16 | 株式会社载体研究所 | 编码表位结合型β2m且感染哺乳动物细胞的病毒载体及其应用 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL91664A (en) * | 1988-09-28 | 1993-05-13 | Yissum Res Dev Co | Ammonium transmembrane gradient system for efficient loading of liposomes with amphipathic drugs and their controlled release |
DK0531401T3 (da) * | 1990-05-10 | 1997-07-28 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Forøgelse af associationen af exogene peptider med MHC klasse I molekyler til immunsystemets celler. |
US6100891A (en) | 1998-06-09 | 2000-08-08 | Teledirect International, Inc. | Call center agent interface and development tool |
ES2270870T3 (es) * | 1999-09-08 | 2007-04-16 | Transgene S.A. | Peptidos derivados de muc-1. |
US20040127445A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-07-01 | Chondrogene Limited | Beta-2 microglobulin (B2M) and B2M related gene products for the regulation of osteoarthritis pathogenesis and chondrocyte proliferation |
JP4740531B2 (ja) * | 2003-09-30 | 2011-08-03 | 雪印乳業株式会社 | 骨吸収抑制剤 |
NZ584473A (en) | 2003-09-30 | 2011-07-29 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | Agent for promoting osteogenesis and/or inhibiting bone resorption |
EP2374470A1 (fr) * | 2010-04-08 | 2011-10-12 | Beta Innov | Utilisation thérapeutique de la protéine Beta2m |
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2017
- 2017-12-27 JP JP2017250624A patent/JP6703973B2/ja active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07118163A (ja) * | 1993-10-21 | 1995-05-09 | Mitsui Toatsu Chem Inc | β2−ミクログロブリンを含有する組成物 |
CN1117148C (zh) * | 1995-06-30 | 2003-08-06 | 国家健康科学研究所 | 抗感染物疫苗,治疗和预防hiv感染的组合物 |
WO2002024929A2 (en) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Ramot At Tel Aviv University Ltd | A SOLUBLE BETA 2 MICROGLOBULIN (β2M)/HFE MONOCHAIN FOR BIOTECHNOLOGICAL AND THERAPEUTIC APPLICATIONS |
WO2002102840A2 (en) * | 2001-06-20 | 2002-12-27 | Avidex Limited | Multiners of class i major histocompatibility complexes cantaining modified beta2-microglobulin proteins |
CN1596311A (zh) * | 2001-09-28 | 2005-03-16 | 株式会社载体研究所 | 编码表位结合型β2m且感染哺乳动物细胞的病毒载体及其应用 |
US20030194401A1 (en) * | 2002-04-12 | 2003-10-16 | Qing Yi | beta2-microglobulin (beta2m) and anti-beta2m binding agents as anti-cancer therapeutics |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
GLICK MEIR ET AL.,: "Structure based design of mutated beta-2 microglobulin as a novel selective protein drug", 《ABSTRACTS OF PAPERS AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》 * |
KOCHANSKA-DZIUROWICZ ALEKSANDRA ET AL.,: "Estimation of the value of serum beta-2-microglobulin concentration in the diagnosis of Hashimoto’s disease", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 * |
KREJSEK J ET AL.,: "Elevation of serum soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1) and beta-2-microglobulin in Sjogren’s syndrome", 《CLINICAL RHEUMATOLOGY》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116515000A (zh) * | 2023-06-30 | 2023-08-01 | 迦进生物医药(上海)有限公司 | Hfe融合蛋白及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101889564B1 (ko) | 2018-08-17 |
HUE030420T2 (en) | 2017-05-29 |
ES2588710T3 (es) | 2016-11-04 |
JP2016145208A (ja) | 2016-08-12 |
EP2374470A1 (fr) | 2011-10-12 |
JP2013523808A (ja) | 2013-06-17 |
CN108159398A (zh) | 2018-06-15 |
JP2018076356A (ja) | 2018-05-17 |
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