CN102839192A - miRNA吸收载体、其制备及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miRNA吸收载体、其制备及用途。具体而言，本发明提供了一种miRNA吸收载体，其携带从5’至3’依次包含如下元件的表达盒：(a)II型启动子；(b)指示蛋白编码序列；以及(c)目的miRNA的吸收序列；(d)任选的增强子序列。本发明还提供了包含本发明吸收载体的慢病毒颗粒、转基因动物及它们的制备方法。本发明的miRNA吸收载体可有效地下调相应家族miRNA的功能，在细胞内或体内起到类似于基因敲减的作用，具有广泛的应用前景。

Description

miRNA吸收载体、其制备及用途

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种新型miRNA吸收载体的构建方法及其应用。 

背景技术

MicroRNA(miRNA)是长约20～24nt、非编码的微小RNA，通过其种子区域与靶基因mRNA 3’UTR区部分互补从而介导30％左右的哺乳动物基因的转录后调控(Lewis，B.P.等，Cell.2005，120：15-20)。 

MiRNA参与了诸多生命过程关键步骤的调控，包括特定组织或细胞的分化、凋亡、增殖和维持。此外，miRNA表达水平失调与肿瘤等疾病也密切相关【Lu，J.等，Nature.2005，435：834-838；Li，Q.J.等，Cell.2007，129：147-161；Cheng，H.Y.等，Neuron.2007，54：813-829；Chang，T.C.等，Mol Cell.2007，26：745-752；He，L.等，Nature.2005，435：828-833；Care，A.等，Nat Med.2007，13：613-618】。 

但迄今为止，在培养细胞和动物模型中，已被实验证实的miRNA-mRNA相互作用的例子还相对较少，大多数miRNA的功能也尚未明确。鉴于miRNA行使其功能时，其生理性的浓度至关重要，故外源性地高表达某个miRNA时，会导致其浓度过高而容易出现某些实验假象。因此，确定某个miRNA功能的最好方式是敲减或者敲除这个目的miRNA。但是，由于单个miRNA可能由基因组上多个位置的基因转录而来，且同一家族的miRNA具有相同的种子序列从而功能上是互补的，所以用传统基因敲除的方法制备miRNA敲除模型非常困难。找到一种能在体、内外抑制一组功能类似的miRNA的方法受到普遍的关注。 

目前，化学修饰的反义寡核苷酸是沉默内源性miRNA功能的主要策略，这些寡核苷酸一般被2’甲氧基修饰(核糖核酸的2位羟基被甲氧基取代)、LNA修饰(核糖核酸五碳环上的羟基被桥联形成锁核酸)或肽核酸修饰(假肽骨架取代糖骨架)。为增强寡核苷酸进入特定组织或细胞的能力，也可以在寡核苷酸链的3’ 羟基末端接上吗啡啉或者胆固醇【Medina，P.P.和Slack，F.J.，Nat Methods2009，6：37-38】。这些寡核苷酸通过与miRNA成熟体互补而降解或者扣押之，从而抑制miRNA的功能。通过基因转移手段，转移足够量的寡核苷酸进入细胞，可以中和胞浆内所有的miRNA，从而可达到类似于基因敲除类似的效果。 

前面的研究已经证实，通过强启动子可高表达miRNA的靶，如果这些人为的靶达到足够的浓度，其功能也可以类似于miRNA的抑制剂，甚至强于已有的商业化的抑制剂【Ebert，M.S.等，Nat Method.2007，4：721-726；Ebert，M.S.和Sharp，P.A.，RNA.2010，16：2043-2050；Gentner，B.，G.等，Nat Methods.2009，6：63-66；Haraguchi，T.等，Nucleic Acids Res.2009，37：e43】。 

为了增强这些诱饵靶对目的miRNA的亲和力，多个miRNA的结合位点被插入到靶的3’UTR区。通过设计带有膨起的miRNA结合靶序列(一般是在Argobaute 2剪切的位点设计膨起序列)，这些靶序列能够稳定地结合或吸收带有目的miRNA的微核糖核蛋白复合体。这些靶RNA的序列可以瞬时地从转染的质粒或者稳定插入染色体的序列表达而来。由于诱饵mRNA与miRNA的结合主要靠miRNA 2～8位的种子序列碱基互补配对，所以一个诱饵mRNA可以与同一种子序列的所有miRNA结合(一般同一家族的miRNA具有相同的种子序列)。 

诱饵靶mRNA，也被称为miRNA吸收序列，相对于商业化的miRNA寡核苷酸抑制剂，它具有以下优点：首先，它可以制成miRNA吸收载体，从而具有载体共有的优势，比如，可以制备成病毒载体而转染难以转染的细胞，甚至在体内高表达该载体；可以用于制备稳转细胞系或者转基因动物模型；可以通过更换细胞特异性的启动子而使其特异性表达；其次，由于它可以同时吸收同一家族的miNRA，故比只能吸收完全互补的某一个miRNA的寡核苷酸抑制剂更加强大，更能避免miRNA的功能冗余现象；并且，吸收载体较化学修饰的miRNA而言价格相对低廉、且稳定性强。 

同时，相对于传统的基因敲除技术，miRNA吸收技术具有以下优势：首先，miRNA吸收载体的转基因模型，操作简单、耗时短、费用低，且有相对较广的动物模型和细胞系的适用范围；其次，很多miRNA的家族成员在基因座上位置不同，考虑到其功能冗余性，如要制备基因敲除模型，必须对单个miRNA位点敲除后再将动物模型杂交后筛选全家族敲除的模型，这对于某型miRNA家族如 let-7家族(有8个成员)几乎是不可能完成的事情，而miRNA吸收载体的转基因动物模型只要能表达足够量的诱饵mRNA，就可以很轻易地吸收全家族的miRNA；第三，有些miRNA是成簇转录的，其同一簇内的miRNA距离相隔很近，故单独敲除一个miRNA而不影响其余miRNA的加工过程是很困难的，而miRNA吸收序列只针对miRNA成熟体，它们的作用不会影响到同一簇内的其余miRNA。 

MiRNA吸收载体可以实现miRNA在细胞系或者活体内长期的功能抑制。通过骨髓移植和肿瘤细胞异位移植技术，很多研究小组已成功做到在体内稳定地表达miRNA吸收序列【Scherr，M.等，Nucleic Acids Res.2007，35：e149；Bonci，D.等，Nat Med.2008，14：1271-1277；Huang，J.等，Stem Cells.2010，28：357-364；Valastyan，S.等，Cell.2009，137：1032-1046；Barbato，C.等，J Neurochem.2010，113：591-600；Gottwein，E.等，J Virol.2010，84：5229-5237；Ma，L.等，Nat Biotechnol.2010，28：341-347；Ma，L.等，Nat Cell Biol.2010，12：247-256；Papapetrou，E.P.等，Stem Cells.2010，28：287-296；Starczynowski，D.T.等，Nat Med.2010，16：49-58；Gatt，M.E.等，Ebert，M.S.和Sharp，P.A.，RNA.2010，16：2043-2050】。第一个miRNA吸收载体的转基因生物是拟南芥【Franco-Zorrilla，J.M.等，Nat Genet.2007，39：1033-1037】，通过插入单个的含miRNA吸收序列的载体，可以表现出与对应miRNA高表达植物完全相反的表型。稳定的、组织特异性的表达miRNA吸收载体的动物模型是果蝇【Loya，C.M.等，Nat Methods.2009，6：897-903】，通过Ga14-UAS系统，成功实现了在特定细胞中达到与基因敲除类似的表型。 

然而，表达miRNA吸收序列的转基因脊椎动物尚未有文献报道，如果能通过miRNA吸收载体在小鼠体内实现相应miRNA的功能敲减，将会为miRNA体内研究提供更为便利的工具。 

本领域迫切需要能有效地吸收内源性miRNA的吸收载体，并可以开发出可高效介导基因转移和表达的基因转移载体，最好还能实现在哺乳动物体内长期稳定的高表达miRNA吸收序列。 

发明内容

本发明的目的之一正是提供了一种miRNA吸收载体，其能有效地吸收内源性miRNA，其对具有相同种子序列的全家族miRNA均有效，抑制功能可强于商业化的寡核苷酸抑制剂。本发明的另一目的是提供一种可高表达本发明miRNA吸收载体的慢病毒，从而实现在较难转染的原代细胞中抑制内源性miRNA的功能，并可用于骨髓移植前造血干细胞的基因修饰。本发明的又一目的是提供miRNA吸收载体的转基因小鼠的制备方法和策略，可通过在体内抑制目的miRNA的功能而研究特定miRNA的生理病理功能或对miRNA相关疾病进行治疗或预防。 

在本发明的第一方面中，提供了一种miRNA吸收载体，其携带从5’至3’依次包含如下元件的表达盒： 

(a)II型启动子；(b)指示蛋白编码序列；(c)目的miRNA的吸收序列，所述吸收序列是2～10次重复的、与目的miRNA部分互补或完全互补的序列；(d)任选的增强子序列。 

在一个优选例中，所述II型启动子是组成型启动子或诱导性启动子，优选组成型启动子。 

在本发明的一个实施方式中，所述II型启动子优选：UBC、CAG、PGK、CMV启动子。在一个优选例中，所述UBC启动子优选为Human Ubiquitin C序列(SEQ ID NO：18)或其同源序列。在另一个优选例中，所述启动子是细胞特异性启动子或广泛表达的启动子。 

在本发明的另一个实施方式中，所述指示蛋白选自：荧光蛋白、萤光素酶或者表达标签。 

在一个优选例中，所述指示蛋白选自：绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白RFP、萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、表达标签HA或Flag，优选绿色荧光蛋白GFP，其激发波长为488nm，发射波长为509nm。 

在另一个优选例中，所述的指示蛋白为增强型绿色萤光蛋白eGFP。 

在另一个优选例中，所述指示蛋白的分子量为8～60kD，优选15～30kD。 

在本发明的另一个实施方式中，所述目的miRNA选自下组：miR-29、miR-21和miR-146。 

在一个优选例中，所述miRNA可为任何miRNA，优选对生命过程有重要调 控作用的miRNA。 

在本发明的另一个实施方式中，所述吸收序列与目的miRNA的互补比例为78％～84％。 

在一个优选例中，所述吸收序列与目的miRNA的9～12位碱基不互补，而与其它碱基均互补。 

在另一个优选例中，所述吸收序列同时与一组miRNA部分或完全互补。 

在另一个优选例中，miR-29吸收序列的重复次数为4～10次，优选7次。 

在另一个优选例中，所述吸收序列选自下组：如SEQ ID NO：3所示的序列；由SEQ ID NO：3所示序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸、且具有预防或治疗miR-29过表达相关疾病和/或征状的活性的序列；或它们的互补序列。 

在本发明的另一个实施方式中，所述表达盒自5’至3’依次包括：UBC启动子、绿色荧光蛋白eGFP序列以及miRNA吸收序列。 

在一个优选例中，所述miRNA吸收载体中还含有选自下组的其它调控元件：增强子、操纵子或定位序列。 

在本发明的另一个实施方式中，所述吸收载体选自：质粒、噬菌体或病毒。 

在一个优选例中，所述吸收载体是病毒载体，优选慢病毒、腺病毒、逆转录病毒载体。 

在本发明的另一个实施方式中，所述载体是慢病毒载体，其特征在于，该慢病毒载体还包含慢病毒的包装所必须的序列。 

在本发明的第二方面中，提供了一种制备慢病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：(i)制备含本发明表达盒的慢病毒穿梭载体；(ii)包装所述穿梭载体，并获得慢病毒颗粒；(iii)任选的通过检测指示蛋白的表达确定病毒滴度。 

在一个优选例中，所述穿梭载体是通过分子克隆的方法制备的。 

在另一个优选例中，所述穿梭载体用于在原核生物与真核生物之间穿梭。 

在另一个优选例中，所述包装是通过转染载体混合物入包装细胞如HEK293T中进行的。 

在另一个优选例中，提供了一种慢病毒表达系统，其包含：慢病毒表达载体(穿梭载体)，慢病毒包装载体(骨架载体和被膜载体)，以及慢病毒包装细胞系(如293T细胞、293FT细胞或293TN细胞)。 

在另一优选例中，所述慢病毒表达系统选自：基于人免疫缺陷病毒HIV的慢病毒表达系统、基于猴免疫缺陷病毒SIV的慢病毒表达系统或基于猫免疫缺陷病毒的FIV的慢病毒表达系统，优选基于猫免疫缺陷病毒的FIV的慢病毒表达系统(SBI公司的新型pCDF载体系统，货号为CD111B-1和LV100A-1)。 

在本发明的第三方面中，提供了一种慢病毒介导目的基因在T细胞中高表达的方法，其特征在于，所述方法包括用本发明的慢病毒感染T细胞，以使得感染后的T细胞高表达目的miRNA吸收序列的步骤。 

在本发明的第四方面中，提供了一种产生转基因小鼠的方法，所述方法包括：(a)提供本发明的miRNA吸收载体；(b)用该miRNA吸收载体显微注射小鼠受精卵，并将其分别移植到假孕母鼠输卵管；(c)待所述母鼠生产小鼠后，检验并获得转基因小鼠；(d)任选使所述转基因小鼠与其它小鼠配对以产生转基因后代。 

在本发明的另一方面中，提供了一种转基因小鼠，体内大部分组织均高表达目的miRNA吸收序列，内源性目的miRNA的功能被显著抑制，并显示出与敲除目的miRNA类似的表型。 

在本发明的第五方面中，提供了用本发明的miRNA吸收载体、用本发明的方法制备的慢病毒载体、用本发明的方法生产的转基因小鼠在miRNA相关疾病的预防或治疗中的应用。 

在一个实施方式中，所述miRNA相关疾病选自：肿瘤、血液造血系统疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、循环系统疾病、自身免疫病、风湿病、糖尿病、系统性硬化病、皮肤病、病毒感染、细菌感染以及骨分化、肌肉分化和肌肉相关疾病，优选细菌感染相关疾病和/或征状。 

在本发明的另一个方面中，提供了一种验证本发明吸收载体功能的方法，该方法包括构建含有目的miRNA的结合位点的携带报告基因的载体。 

在一个优选例中，所述报告基因是萤火虫萤光素酶报告基因。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1：pGS29载体的设计与制备。图1A为miR-29a，b，c的同源性比较以及miR-29吸收(miR-29 sponge)序列设计；图1B为pGS29载体设计图，UBC为启动子，GFP primer和GS-29 primer为鉴定引物，Tth111 I为线性化酶切位点；图1C为pGS29载体和其对照载体转染HEK293T细胞后RT-PCR鉴定GFP和GS-29序列的表达情况。 

图2：HEK293T细胞中鉴定pGS29载体的作用。图2A为对照载体、miR-29抑制剂和pGS29载体转染后，人TTP 3’UTR报告基因载体的相对萤光素酶活性；图2B为pGS29载体转染后，野生型人TTP 3’UTR和突变miR-29结合位点的人TTP 3’UTR的报告基因载体的相对萤光素酶活性图；图2C为对照载体、miR-29抑制剂和pGS29载体转染后，含有7个miR-29a调控位点的AM1473’UTR报告基因载体的相对萤光素酶活性(“*”，P＜0.05；“**”，P＜0.01)。 

图3：HEK293T细胞中通过含有7个miR-29a调控位点的AM147报告基因载体的相对萤光素酶活性验证pGS29载体吸收miR-29的功能（“**”，P＜0.01)。 

图4：IFN-γ3’UTR含有保守的miR-29结合位点。图4A为各哺乳动物IFN-γ3’UTR中miR-29结合位点非常保守；图4B为HEK293T细胞中通过小鼠IFN-γ3’UTR报告基因载体及其突变载体验证pGS29载体的功能，并证明鼠IFN-γmRNA是miR-29的靶标(“**”，P＜0.01)。 

图5：HEK293T细胞和小鼠淋巴瘤细胞EL4中验证pGS29载体的功能。图5A为HEK293T细胞中转入不同量的GS29载体后小鼠IFN-γ3’UTR报告基因载体的相对萤光素酶活性值；图5B为EL4细胞中转入不同剂量的GS29载体后，在24h，48h，72h后ELISA检测EL4细胞上清中的IFN-γ的分泌水平(“*”，P＜0.05；“**”，P＜0.01)。 

图6：原代T细胞中鉴定miR-29吸收序列的功能。图6A为T细胞中用慢病毒正常表达或高表达miR-29吸收序列后培养72h，提取RNA定量PCR检测IFN-γ的mRNA水平；图6B、6C分别为CD4⁺T，CD8⁺T细胞中用慢病毒正常表达或高表达miR-29吸收序列后培养72h，ELISA检测上清中的IFN-γ的分泌水平(“*”，P＜0.05；“**”，P＜0.01)。 

图7：miR-29吸收序列(GS29)转基因小鼠的设计和鉴定。图7A为GS29转基因小鼠的设计图；图7B为GS29转基因小鼠的首建鼠和F1代小鼠的RT-PCR的 鉴定结果；图7C为GS29转基因小鼠腹腔巨噬细胞和CD4+T细胞的RT-PCR和定量PCR的鉴定结果；图7D为野生型或GS29转基因小鼠腹腔巨噬细胞中转染各种报告基因载体后，以相对萤光值ELISA检测GS29转基因小鼠中内源性miR-29的功能敲减情况(“**”，P＜0.01)。 

图8：李斯特菌(LM)感染小鼠模型验证miR-29吸收载体的功能。图8A为LM感染野生型小鼠或GS29小鼠指定天数后的存活率(Wilcoxon test，P＜0.05)。图8B为LM感染野生型小鼠或GS29小鼠2d后脾脏、肝脏中的细菌负荷量。 

图9：结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠模型验证miR-29吸收载体的功能。图9A为H37Rv感染野生型小鼠或GS29转基因小鼠指定天数后，小鼠的存活率(Wilcoxon test，P＜0.05)。图9B为H37Rv感染野生型小鼠或GS29转基因小鼠21天后，肺脏中H37Rv的菌落计数结果(“**”，P＜0.01)。 

图10：构建miRNA吸收载体的启动子选择及验证。图10A为II型启动子与III型启动子介导miR-29吸收序列在HEK293T细胞中的表达，24小时后检测AM147-3’UTR报告基因载体的相对萤光值。图10B为UBC启动子介导的miR-29吸收载体在转基因小鼠的各器官和免疫细胞中GS-29mRNA(即GFP以及miR-29吸收序列，GS-29引物扩增片段见图1及其附图说明)的表达水平，RT-PCR检测结果。 

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，成功构建了能在体外显著抑制miR-29功能的新型miRNA吸收载体。发明人还将miR-29的吸收序列亚克隆至第三代慢病毒载体，包装成慢病毒，感染难以转染的原代细胞(如T细胞)后成功高表达miR-29吸收序列。并且，发明人还通过转基因技术将miR-29的吸收载体线性化后插入小鼠基因组中，成功实现体内敲减miR-29的功能。 

因此，新型miRNA吸收载体可以有效地在体内、体外抑制内源性目的miRNA的功能，既可以作为miRNA的抑制剂而应用于科学研究，又可以治疗某些由于miRNA高表达引起的疾病。 

为实现有效地吸收内源性的miRNA并成功制备小鼠miRNA吸收载体的转基因模型，必须做到以下几点：首先，确定miRNA吸收序列，即设计好吸收序列中有哪几个碱基与miRNA成熟体不互补会比较好，因为互补太多或位置不恰 当，会导致吸收序列降解，而互补太少，会导致不能特异地吸收目的miRNA。关于miRNA与其靶基因的互补程度与位置对靶基因降解的影响已有多篇文献报道，例如可参见【He，L.等，Nat Rev Genet.2004，5：522-531；Bartel，D.P.，Cell.2004，116：281-297】；其次，确定合适的miRNA吸收序列的重复次数，重复次数太多，不利于转录，而重复次数太少，含有的miRNA的结合位点少，故吸收内源性miRNA的能力差；第三且对本发明具有重要意义的是，选择合适的启动子，既要保证启动子足够强，能大量表达吸收序列，又要确保该启动子适合制备转基因模型，不会被体内的反馈机制沉默而失活。 

本发明人通过深入研究，通过长期的实验对以上因素的选择和组合，构建了稳定、高效表达吸收序列载体，成功制得了转基因脊椎动物(小鼠)，并证实了本发明miRNA吸收载体的优异效果。在此基础上，本发明人完成了本发明。 

miRNA吸收序列与miRNA吸收载体

如本文所用，术语“种子序列”是指miRNA的第2～8位核苷酸。 

如本文所用，术语“miRNA吸收序列”包括所有与已知的miRNA部分互补或完全互补的、四至十次重复的人工合成序列，可被称为miRNA sponge序列或者miRNA decoy序列，这些序列的共有特征是能吸收内源性的miRNA而减少其与真正靶基因的结合机会，从而抑制miRNA的功能，即miRNA吸收序列的功能类似于竞争性抑制剂。代表性的例子包括但不限于miR-29吸收序列(如SEQ ID NO：2所示)。 

适用于本发明的miRNA吸收序列，可以是与已知的任一种miRNA部分互补或者完全互补的核酸序列。较佳地，是与已知miRNA部分互补的4～10次重复序列。互补性太好或者互补位置不恰当，可根据现有技术文献中的互补原则设计吸收序列并用实验优化之，例如参见【Franco-Zorrila，J.M.等，Nat Genet.2007，39：1033-1037】，会导致吸收序列编码的RNA被内源性miRNA降解而导致吸收效果不好；重复序列太短，包含的miRNA结合位点少，不利于充分吸收内源性miRNA；而重复序列太长，增加吸收载体制备难度，同时影响吸收载体的转录效率，产生的转录本较少同样不利于吸收内源性miRNA。本发明中以4～10次重复的吸收序列为佳。 

miRNA的序列可从www.microRNA.org网站数据库获得，miRNA吸收序列根据miRNA成熟体的序列设计并需实验优化。设计原则为：人工合成或PCR扩增四至十次重复的、与目的miRNA部分互补的序列(一般是与miRNA的第9～12位核苷酸不互补，其余部分完全互补)，然后可采用例如含靶基因3’UTR的萤光素酶报告基因载体对miRNA吸收载体进行优化。 

本发明所涉及的miRNA吸收序列可以全部人工合成，也可以通过部分合成在PCR扩增后获得。 

如本文所用，术语“miRNA吸收载体”指的是所有能在细胞内或者体内有效地表达miRNA吸收序列从而抑制内源性miRNA功能的载体，其作用一般优于商业化的化学合成的寡核苷酸序列。在本发明中，miRNA吸收载体的核心部分从5’至3’依次包括：II型启动子、任选的指示蛋白以及目的miRNA的吸收序列。 

miRNA吸收载体中的启动子选择至关重要，因为它直接决定了miRNA吸收序列的表达量、表达特异性或者表达时间，进而对内源性miRNA进行时空和效率上进行调控。某些启动子在体内还会被某些反馈机制修饰而沉默掉，而不利于miRNA吸收序列的长期稳定表达。所以启动子的优化是miRNA吸收载体制备过程中必要的一环。 

适用于本发明核心序列的启动子是II型启动子，其可以是组成型启动子或诱导性启动子，既可以要求细胞特异性也可以是广泛表达的启动子。较佳地，该启动子是组成型的强启动子，且制备转基因动物模型时不会被体内的反馈机制沉默而失活，如UBC、CAG等启动子是较佳的选择。启动子的强弱直接决定了目的miRNA吸收序列的表达量，进一步影响了敲减内源性miRNA的效率。当然，可以根据需要，选择诱导性启动子或者细胞特异性启动子。 

发明人的实验结果证明，聚合酶II型的启动子如CMV、CAG、UBC、PGK可介导吸收序列的高表达，而聚合酶III型的启动子如H1和U6介导的吸收序列表达效果显著弱于聚合酶II型的启动子。 

较佳地，UBC启动子是较符合在细胞或者小鼠体内稳定、高效并广泛表达miRNA吸收序列的强启动子，其效果通常优于其它启动子，这是发明人比较多种启动子后得出的结论。虽然，本发明实施例中采用的UBC启动子序列是人泛素C(human ubiquitin C，SEQ ID NO：18)启动子的部分序列，本领域普通技术人 员应理解可采用更长或者更短的序列，也可以改变部分碱基获得相似或者更适合的UBC启动子序列。 

适用于本发明核心序列的指示蛋白可以是任一种荧光蛋白、萤光素酶或者表达标签。较佳地，该指示蛋白分子量不要太大(范围为15～30kD为佳)，因为插入片段过长，会影响转录的效率，同时该指示蛋白必须方便检测，最好能用荧光显微镜、流式细胞仪或共聚焦显微镜清晰地观察现象。 

还可miRNA吸收载体中加入其它调控元件(如增强子、操纵子或定位序列)，以使得本发明的载体可更为有效的表达吸收序列。例如在miRNA吸收载体核心部分的miRNA吸收序列之后接上一段增强子序列，以使得miRNA吸收序列能在胞内或者体内更强地表达。优选用于本发明中的增强子可为SV-40增强子。 

载体的构建、包装、滴度测定及感染

可采用本领域中常用的介导基因表达的载体，例如慢病毒、腺病毒和逆转录病毒等病毒载体或质粒、噬菌体等非病毒载体，使得所述吸收序列在目标细胞内高效表达。 

可采用本领域中已知的方法来构建本发明的载体。例如，可参考王培堂等人翻译的《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2002)中所记载的方法、或采用市售试剂盒根据厂商的说明书进行操作。 

例如，慢病毒是目前介导目的基因高表达的最有效的方式，几乎可以感染所有哺乳动物细胞，包括非分裂细胞和大多数的模式生物。慢病毒载体可以作为普通载体通过一般的基因转染方式在常规细胞系内实现低度到中度地表达目的基因。然而，通过将慢病毒载体包装成慢病毒，可以实现在难转染的细胞中高效地转移基因，尤其是在原代细胞、干细胞和分化细胞中特别凸显其优势。表达载体与感染后的细胞基因组整合，从而长期稳定地表达靶基因。 

慢病毒表达系统主要有三个成分组成：慢病毒表达载体(穿梭载体)，慢病毒包装载体(骨架载体和被膜载体)，以及慢病毒包装细胞系(如293T细胞、293FT细胞或293TN细胞)。 

本发明中所采用的慢病毒系统可选自(但不限于)：基于人免疫缺陷病毒HIV的慢病毒表达系统、基于猴免疫缺陷病毒SIV的慢病毒表达系统或基于猫免疫 缺陷病毒的FIV的慢病毒表达系统，优选基于猫免疫缺陷病毒的FIV的慢病毒表达系统(例如SBI公司的新型pCDF载体系统，货号为CD111B-1和LV100A-1)。 

以由猫免疫缺陷病毒改造而来的新型pCDF载体为例，其3’LTR的U3区域缺失，故自体失活；一旦慢病毒整合到基因组后，其5’LTR的启动子失活，阻止了病毒颗粒的复制成分的形成。慢病毒载体在包装细胞内表达后，CMV/FIV5’LTR驱动病毒骨架成分蛋白和必要的功能蛋白转录本的表达(如Psi，RRE和cPPT)，当病毒的被膜蛋白在293T细胞中共表达时，pCDF转录本被有效地包装入假病毒颗粒中。分离这些病毒颗粒后，pCDF的表达盒以RNA的形式可以被有效地转导入哺乳动物靶细胞中。转导后，表达盒被逆转录并整合入细胞的基因组中。本发明的pCDF慢病毒载体含有EF1α启动子介导的eGFP基因，便于病毒感染细胞的筛选。关于该病毒成分的具体信息和操作见SBI公司的试剂说明书(pCDF1-MCS2-EF1-copGFP，货号CD111B-1)。 

目前的慢病毒载体主要指第二代和第三代慢病毒载体，其主要区别为是否具有单独启动子的5’LTR。对于人免疫缺陷病毒为基础的慢病毒载体，其第二代慢病毒载体为三质粒系统，其第三代慢病毒载体为四质粒系统。本发明中优选使用的慢病毒载体以猫免疫缺陷病毒为基础，是三质粒系统的第三代慢病毒载体。无论是哪种免疫缺陷病毒为基础的慢病毒载体，均最大限度地考虑了其安全性，即3’LTR的U3区缺失及5’LTR上游的CMV启动子保证其自体失活和复制缺陷。 

本发明将GFP基因及其下游的miR-29吸收序列克隆至pCDF的多克隆位点处，经测序验证后的穿梭载体连同骨架载体、被膜载体共转入293T细胞，超速离心收集病毒颗粒。溶解病毒颗粒后倍比稀释在293T细胞中根据GFP细胞的比例测定病毒滴度。 

已知滴度的病毒颗粒按照MOI约1∶1～100∶1，优选10∶1的浓度感染靶细胞(10个病毒：1个细胞)，感染效率可达40％～60％。由此，通过采用慢病毒颗粒成功实现在原代的难转染细胞中高表达miRNA吸收序列，并可对高表达细胞筛选后与其余对照细胞进行对比，探讨该miRNA吸收序列的功能。 

本发明优选第三代慢病毒载体，并带上独立启动子介导的荧光蛋白，插入目的miRNA吸收序列后而抑制miRNA功能。 

应理解，本领域普通技术人员在阅读了本发明的说明书以及具体的实施例之后，可根据需要选择适当的表达载体或系统或者采用本领域中的常识和常规技术手段对该表达载体或系统进行适当的改造，例如采用各种指示蛋白或启动子、加入其它调控序列(如增强子和定位序列)等。 

miRNA吸收载体的转基因小鼠的制备

本发明提供了一种通过转基因技术在体内广泛高表达miRNA吸收序列的转基因小鼠。转基因小鼠是研究miRNA体内功能的有效策略，且本发明提供的转基因小鼠实现了内源性miRNA的功能抑制，更接近于在生理浓度下研究目的miRNA的功能，实验结果明显优于miRNA体内高表达的模型。 

本发明的方法包括：提供miRNA吸收载体；用该miRNA吸收载体显微注射小鼠受精卵，并将其分别移植到假孕母鼠输卵管；待所述母鼠生产小鼠后，检验并获得转基因阳性小鼠；任选使所述转基因阳性小鼠与其它小鼠配对以产生后代。转基因小鼠制备可通过例如委托专业公司(如上海南方模式生物科技发展有限公司)或根据本领域中已知的方法进行。 

例如，在本发明的优选例中，所用的miRNA吸收载体核心部分依次为：UBC启动子，GFP指示蛋白和miRNA吸收序列，用Tth111I线性化并胶回收后显微注射小鼠受精卵。转基因小鼠制备委托上海南方模式生物科技发展有限公司进行。首建鼠和F1小鼠可以根据GFP序列或目的miRNA吸收序列设计引物，RT-PCR或者定量PCR鉴定之，也可以根据GFP蛋白的表达量鉴定之(用Western Blot、FACS或荧光显微镜)。 

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，所述的组合物含有有效量的本发明的吸收序列或吸收载体，以及药学上可接受的载体。 

在较佳的实施方案中，所述药物组合物可用于治疗与现有技术中已知可治疗或预防可通过抑制miRNA而得到预防、缓解或治疗的相关疾病，例如：结核、感染和肿瘤。例如，本发明的miRNA吸收载体或序列可用于治疗细菌感染性疾病，例如细菌感染后导致的败血症、脑膜炎、脓毒性流产；过度的炎症和继发的组织损伤；细菌的过度增殖导致的菌血症、多器官功能衰竭；肺结核或者其 它器官的结核征状。 

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。 

如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。 

如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。 

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。 

在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。 

本发明的组合物中吸收载体或吸收序列有效成分占组合物总重量的0.001～99.9wt％；优选为组合物总重量的1～95wt％，较优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。 

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。 

在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中吸收载体或吸收序列的含量为0.01～2000mg/剂，优选0.1～1500mg/剂，更优选1～1000mg/剂。在本发明的另一个优选例中，每天施用1～6剂本发明的组合物，优选施用1～3剂；最优选的，每天服用的剂量为1剂。 

应理解，所用吸收载体或吸收序列的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。 

本发明的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌 下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可采用：(1)直接裸DNA注射法；(2)将吸收载体或吸收序列与转铁蛋白/多聚L-赖氨酸复合物连接，以增强其生物效应；(3)吸收载体或吸收序列与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(4)用脂质体包裹吸收载体或吸收序列后介导进入细胞，既有利于大分子的顺利进入又免受细胞外各种酶的水解作用；(5)吸收载体或吸收序列与胆固醇结合使其胞浆保持时间增加10倍；(6)用免疫脂质体转运吸收载体或吸收序列可使其特异性转运至靶组织和靶细胞；(7)将吸收载体或吸收序列体外转染给转载细胞(如成纤维细胞)也可较好地将吸收载体或吸收序列相关药物载入靶细胞内；(8)电打孔(electroporation)，即借助于电流将吸收载体或吸收序列导入靶细胞。 

本发明的吸收载体或吸收序列相互间可以联合应用，还可以与其它药物和治疗手段联合。 

本发明的优点

本发明的优点主要在于： 

(a)本发明的miRNA吸收载体能够有效地表达miRNA吸收序列，对内源性的miRNA的功能有显著的抑制作用，miRNA吸收载体的功能强于商业化的化学修饰的寡核苷酸的作用，并克服了商业化寡核苷酸以下的缺点：(1)难以同时抑制具有相同种子序列的同家族miRNA，消除这些miRNA的功能冗余现象；(2)难以实现在体内或者细胞内长期稳定地抑制目的miRNA的功能；(3)很难转染大部分原代细胞，也很难应用于体内实验；(4)不够稳定，大量使用费用昂贵。 

(b)本发明的miRNA吸收载体可改装并带上诸如慢病毒等包装序列，从而可通过慢病毒体系实现在难转染的细胞中高表达miRNA吸收序列，并可通过对造血干细胞的修饰或者肿瘤细胞的修饰制备骨髓重建和肿瘤异位移植模型实现体内高表达miRNA吸收序列； 

(c)本发明的miRNA吸收载体可以用于制备转基因小鼠，实现体内敲减目的miRNA的功能，并在以下几个方面优于传统的基因敲除技术：(1)miRNA吸收序列针对的是miRNA成熟体，可抑制具有相同种子序列的所有miRNA的功能，而传统的基因敲除技术很难将这些miRNA的所有基因同时敲除掉；(2)miRNA吸收载体的转基因技术不会影响到内源性miRNA的表达，而传统的miRNA敲除技术 很难做到不影响邻近的非目的miRNA的表达，尤其是成簇表达的miRNA；(3)miRNA吸收载体的转基因小鼠制备操作简单、周期短、费用低、成功率高，而传统的基因敲除技术技术难度大、周期长、且耗费大量的人力物力；(4)miRNA吸收序列对内源性miRNA的功能敲减更能模拟体内生理情况，而非传统基因敲除技术的完全缺失miRNA；(5)miRNA吸收载体可以通过更换细胞特异性的启动子实现在特定组织和细胞内敲减目的miRNA的功能。 

实施例 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如王培堂等人翻译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002；基本细胞操作均参照王培堂等人翻译的《细胞培养实验指南》第一版，科学出版社，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 

实施例1：pGS29载体的设计和制备

本实验所用的限制性内切酶、Taq酶和pMD19-T载体均购自Takara公司。 

含有7个重复的miR-29sponge插入片段(图1A-B)用以下两个化学合成的片段经过PCR反应后获得： 

片段1(SEQ ID NO：1)： 

5’-TAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTA-3’； 

片段2(SEQ ID NO：2)： 

5’-TAGCACCAAGAAAATCGGTTATAGCACCAAGAAAATCGGTTATAGCACCAAGAAAATCGGTTATAGCACCAAGAAAATCGGTTATAGCA-3’ 

所得miR-29sponge插入片段共147bp，其序列(SEQ ID NO：3)如下： 

TAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTA 

反应体系为：加入2μl的100μM的片段1和片段2，以及PCR反应所需的premix Ex Taq(Takara，cat no.D332A)。 

反应条件如下：98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 15s，5个循环后再用72℃延伸10min。胶回收PCR产物插入pMD19-T载体成为pMD19T-miR-29sponge载体(TA克隆法，即PCR产物末端带A，而pMD19-T载体带有T的粘端，连接PCR产物和pMD19-T片段即可)。 

pIRES 2-EGFP购自Clontech公司。 

1.pUBC-IRES2-EGFP的制备

首先将其CMV启动子换成UBC启动子(human ubiquitin-C promoter)，用以下引物在HEK293T细胞cDNA中用高保真酶PrimerSTAR(Takara，cat no.DR010S)扩增UBC启动子： 

上游引物(SEQ ID NO：4)： 

5’-TAGTTATTAATGTCTAACAAAAAAGCC-3’ 

下游引物(SEQ ID NO：5) 

5’-GAAGATCTGGCCTCCGCGCCGGGTT-3’ 

划下划线处为酶切位点和保护碱基； 

反应体系为：PCR反应体系为25μl，其中5×PrimerSTAR缓冲液5μl，dNTP混合物2μl；模板cDNA 0.2μg，PrimerSTAR HS DNA聚合酶0.25μl，上、下游引物各0.5μl，加入ddH₂O补齐至25μl。 

反应参数为：98℃ 10s，56℃ 10s，72℃ 75s，40个循环后72℃延伸10min。上、下游引物分别引入pShB I和Bgl II酶切位点。胶回收以上PCR产物、用pShB I和Bgl II双酶切之并连入经过同样双酶切的pIRES2-EGFP载体中。 

至此，该载体改造为pUBC-IRES2-EGFP。 

2.pUBC-EGFP-IRES2-EGFP的制备

用高保真酶PrimerSTAR(Takara，cat no.DR010S)扩增pIRES2-EGFP中的GFP片段： 

上游引物(SEQ ID NO：6)： 

5’-CGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’ 

下游引物(SEQ ID NO：7)： 

5’-CGGGATCCCATGGACGAGCTGTACAAGCC-3’ 

划下划线处为酶切位点和保护碱基。 

反应体系为：PCR反应体系为25μl，其中5×PrimerSTAR缓冲液5μl，dNTP混合物2μl；模板cDNA 0.2μg，PrimerSTAR HS DNA聚合酶0.25μl，上、下游引物各0.5μl，ddH₂O补齐至25μl。 

反应参数为：98℃ 10s，55℃ 10s，72℃ 45s，40个循环后72℃延伸10min。上、下游引物分别引入EcoR I和BamH I酶切位点。胶回收以上PCR产物、用EcoR I和BamH I双酶切之并连入经过同样双酶切的pUBC-IRES2-EGFP载体中。 

至此，该载体改造为pUBC-EGFP-IRES2-EGFP。 

用高保真酶PrimerSTAR(Takara，cat no.DR010S)、以以下引物在pMD19-miR-29sponge载体中扩增miR-29 sponge七重复片段： 

上游引物(SEQ ID NO：8) 

5’-CGGGATCCATGACTTGCATGCCTGCAGGTCGACG-3’ 

下游引物(SEQ ID NO：9)： 

5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCC-3’ 

划下划线处为酶切位点和保护碱基。 

反应体系为：PCR反应体系为25μl，其中5×PrimerSTAR缓冲液5μl，dNTP混合物2μl；模板cDNA 0.2μg，PrimerSTAR HS DNA聚合酶0.25μl，上、下游引物各0.5μl，ddH₂O补齐至25μl。 

反应参数为：98℃ 10s，58℃ 10s，72℃ 30s，40个循环后72℃延伸10min。上、下游引物分别引入BamH I和Not I酶切点位。胶回收以上PCR产物、用BamH I和Not I双酶切之并连入经过同样双酶切的pUBC-EGFP-IRES2-EGFP 载体中(此时已将EGFP-IRES2切除，并留出粘端以连接miR-29 sponge重复序列)。 

至此pGS29载体改造完毕，其特征为UBC启动子后带有GFP表达序列，并在GFP基因的3’UTR区带有7个miR-29 sponge的重复片段。 

将pGS29载体或其对照载体pUBC-IRES2-EGFP转入HEK293T细胞，24h后用GFP和GS-29引物，qRT-PCR检测GFP基因和miR-29 sponge序列的表达情况说明pGS29载体构建成功(图1C)，其中鉴定引物分别为： 

GFP primer上游引物(SEQ ID NO：10)： 

5’-GTGACCACCCTGACCTACGG-3’ 

下游引物(SEQ ID NO：11)： 

5’-CTGCTTGTCGGCCATGATAT-3’ 

GS-29 primer上游引物(SEQ ID NO：12)： 

5’-GAGCAAAGACCCCAACGAGAAG-3’ 

GS-29 primer下游引物(SEQ ID NO：13)： 

5’-TCTACAAATGTGGTATGGCTGAT-3’。 

实施例2：HEK293T细胞中的报告基因实验验证pGS29载体的功能

本实验所用的限制性内切酶、用高保真酶PrimerSTAR购自Takara公司。 

PGL3-promoter载体购自Promega公司(Cat no.E1761)；pMIR-报告荧光素酶载体购自Ambion公司(Cat no.AM5795)。 

扩增人TTP基因的3’UTR全长序列(Pubmed Gene ID：7538)，Xba I酶切后插入经过同样酶切后的PGL3-promoter载体中，经测序验证构建成功hTTP 3’UTR报告基因载体。 

将hTTP 3’UTR报告基因载体中的miR-29结合位点“5’-TGGTGCT-3’”突变成“5’-TCGAGGT-3’”(重组PCR定点诱变法，即设计含有突变序列的引物扩增上下两端产物后再退火)，使之不能被miR-29调控，该载体即为mu-hTTP-3’UTR报告基因载体。 

扩增pMD19-miR-29sponge载体中的miR-29 sponge七重复片段，两端引入Mlu I和Spe I酶切位点。用Mlu I和Spe I双酶切PCR产物后插入经同样酶切后的pMIR-报告荧光素酶载体中，经测序验证构建成功AM147报告基因载体。 

将pGS29载体(或其对照载体pUBC-IRES2-EGFP)或miR-29a的寡核苷酸抑制剂，购自上海吉玛制药技术有限公司，其序列为5’UAACCGAUUUCAGAUGGUGCUA-3’，SEQ ID NO：14)、hTTP 3’UTR报告基因载体(mu-hTTP 3’UTR报告基因载体或AM147报告基因载体)、TK载体(购自Promega公司，其功能为内参萤光素酶载体，用于消除转染效率带来的萤光素酶活性差异)转染入HEK293T细胞，转染后24小时后检测细胞中萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶活性(双萤光报告基因检测试剂Dual-Luciferase Reporter Assay System购自Promega公司)，图中数值以萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性表示。 

结果表明pGS29载体转染组能明显上调hTTP 3’UTR报告基因和AM1473’UTR报告基因的相对萤光素酶活性，且作用明显优于商业化地寡核苷酸抑制剂(图2)；pGS29转染后的HEK293T细胞中，内源性miR-29对hTTP 3’UTR报告基因的抑制作用被逆转，达到miR-29结合位点突变后的报告基因的相对萤光素酶活性类似的水平(图2B)。miR-29a已被报道能靶向TTP基因的3’UTR(Gebeshuber，C.A.等，EMBO Rep.2009，10：400-405)，AM147 3’UTR是针对miR-29a设计的报告基因，所以结合以上实验结果说明pGS29载体能部分吸收内源性的miR-29a而抑制miR-29a的功能。 

实施例3：AM147-3’UTR报告基因载体验证pGS29载体能吸收整个miR-29家族

在实施例2中已经证实pGS29载体能部分吸收内源性的miR-29a而下调miR-29a的功能，由于miR-29a、b、c相互之间只有几个碱基的差异而第2至7位的“种子区域”碱基完全一致，故推测pGS29载体除了吸收miR-29a，也能吸收miR-29b和miR-29c。用miRNA模拟物(Ctrl(SEQ ID NO：14)：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，miR-29a(SEQ ID NO：15)：5’- UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3’，miR-29b(SEQ ID NO：16)：5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’或miR-29c(SEQ ID NO：17：5’-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3’)、AM 1473’UTR报告基因载体、TK载体和pGS29载体(或其对照载体pUBC-IRES2-EGFP)共转染HEK293T细胞(转染试剂Jet-Endo购自Polyplus公司)。转染后48小时检测各组细胞中萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶活性(双萤光报告基因检测试剂Dual-Luciferase Reporter Assay System购自Promega公司)，图中数值以萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性表示。 

结果表明miR-29a、miR-29b、miR-29c均能下调AM 1473’UTR报告基因的相对萤光素酶活性。而无论在Ctrl转染组还是miR-29a，miR-29b，miR-29c转染组，pGS29载体转染组均能明显上调AM147报告基因的相对萤光素酶活性，说明pGS29载体能吸收整个miR-29家族(图3)。 

实施例4：pGS29载体能上调IFN-γ3’UTR报告基因活性

PCR扩增人IFN-γ基因的3’UTR全长序列(Pubmed Gene ID：15978)，Xba I酶切后插入经过同样酶切后的PGL3-promoter载体中，经测序验证构建成功IFN-γ3’UTR报告基因载体。将IFN-γ 3’UTR报告基因载体中的miR-29结合位点“5’-TGGTGCT-3’”突变成“5’-TCGAGGT-3’”(同实施例2)，使之不能被miR-29调控，该载体即为mu-IFN-γ-3’UTR报告基因载体。 

根据数据库预测得IFN-γ3’UTR中包含miR-29的调控位点，且在哺乳动物各物种中高度保守(图4A)，故推测IFN-γ可能是miR-29的靶标。将IFN-γ3’UTR报告基因载体(或其突变载体)、TK载体和pGS29载体(或其对照载体)共转入HEK293T细胞(转染试剂JetPei购自Polyplus公司)，转染后24小时检测各组细胞中萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶活性(双萤光报告基因检测试剂Dual-Luciferase Reporter Assay System购自Promega公司)，图中数值以萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性表示。 

结果表明pGS29载体转染组能明显上调IFN-γ3’UTR报告基因，而对其突变 载体mu-IFN-γ3’UTR报告基因无作用(图4B)，即说明IFN-γ可能是miR-29的靶标，而pGS29载体能吸收内源性的miR-29从而促进IFN-γ的表达。 

实施例5：HEK293T细胞和小鼠淋巴瘤细胞EL4中pGS29载体上调IFN-γ的功能

在实施例4中已提示IFN-γ可能是miR-29的靶标，为进一步确认此结论且证明pGS29的功能，我们首先再次用将IFN-γ3’UTR报告基因载体和不同剂量的pGS29载体共转入HEK293T细胞。转染后24h检测各组细胞中萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶活性(双萤光报告基因检测试剂Dual-Luciferase Reporter Assay System购自Promega公司)，图中数值以萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性表示。 

结果表明随着pGS29载体剂量的增加，IFN-γ3’UTR报告基因相对萤光活性逐渐上调(图5A)。由于T-bet转染后的EL4细胞在PMA/伊屋诺霉素(ionomycin)刺激下能分泌大量的IFN-γ(Szabo，S.J.等，Cell.2000，100：655-669)，故我们利用此模型来证实pGS29载体促进IFN-γ表达的功能。 

用电穿孔的方法将T-bet表达载体(该载体为根据常规方法构建的小鼠T-bet基因ORF全长的表达载体，基于pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司)构建，T-bet基因ORF的pubmed Gene ID：57765)和不同剂量的pGS29载体共转入小鼠淋巴瘤细胞系EL4细胞(核转试剂Kit L购自Lonza公司；EL4细胞系购自ATCC)。12h后换液并用25ng/ml的PMA和500ng/ml的伊屋诺霉素刺激这些细胞(PMA和伊屋诺霉素购自Sigma公司)，分别在刺激24h、48h和72h后收集上清，ELISA检测上清中IFN-γ表达量(IFN-γ的ELISA检测试剂盒购自R&D公司)。 

结果表明随着pGS29载体剂量的增加，EL4细胞分泌上清中IFN-γ分泌量逐渐上调(图5B)。该实施例进一步说明IFN-γ可能是miR-29的靶标，且pGS29载体能吸收内源性的miR-29而促进IFN-γ的表达。 

实施例6：原代T细胞中验证pGS29载体上调IFN-γ的功能

用EcoR I和Not I双酶切pGS29载体，胶回收分子量较小的片段(含有GFP基因及7个miR-29 sponge重复序列)，连入经过同样酶切的 pCDF1-MCS2-EF1-copGFP慢病毒载体(该慢病毒载体购自SBI公司，cat no.CD111B-1)，经测序验证pLV-GS29载体构建成功。 

简述之，转染前一天在10cm培养皿中铺3×10⁶个的293T细胞，过夜培养后用8ml 37℃预热培养基换液。将10μg包装载体混合物(pFIV-34N∶pVSV-G摩尔比为1∶1，购自SBI公司，货号为LV100A-1)及4μg带有目的基因的穿梭载体(LV-Ctrl或LV-29sponge，前者为pCDF1载体，购自SBI公司，货号为CD111B-1；后者为：在pCDF1载体的多克隆插入位点(BamH I和Not I)中插入了七次重复的miR-29吸收序列)加入到1ml OMEM中，混合均匀，加入线性25kDa PEI 50μl充分混匀后室温静置15min(具体步骤可参见Polyscience Incorporation的Linear PEI说明书，#23966-2)。 

将质粒和PEI的混合溶液均匀地加入到293T细胞，8小时后换液，加入10ml新鲜DMEM培养基。再48～72小时后先低速离心3000rpm 5min去除细胞碎片，0.45μm滤器过滤后25,000rpm，2h，4℃超速速离心收获病毒沉淀，用100μl无血清培养基重悬沉淀，重悬过程为每隔15min，4℃晃动离心管一次，2h左右彻底溶解病毒沉淀。分装病毒于-80℃保存，并取一小部分测定滴度。(慢病毒详细包装说明见System Biosciences公司的“Lentivector Expression Systems：Guide to Packaging and Transduction of Target Cells”)。 

感染靶细胞时，按病毒颗粒数与靶细胞数(新鲜分离的CD4⁺T或者CD8⁺T细胞)10∶1(MOI＝10∶1)比例加入靶细胞培养皿中并加入polybrene，使其终浓度为6μg/ml，12h后更换培养基去除polybrene及游离的病毒颗粒，再过36～48h后(具体时间视细胞状态而定：当细胞密度过大或者有大量细胞浮起，即可停止病毒产生过程，通常情况为48h左右)，提取靶细胞RNA并检测靶细胞上清中的IFN-γ。 

结果表明随着LV-29sponge在CD4⁺T或者CD8⁺T细胞中高表达后，IFN-γmRNA水平显著下降(图6A)。CD4⁺T或者CD8⁺T细胞上清中，IFN-γ的量在LV-29sponge感染组较高(图6B)。该实施例说明miR-29吸收序列能在原代T细胞中吸收内源性的miR-29而促进IFN-γ的表达。 

实施例7：miR-29吸收序列(GS29)转基因小鼠的设计和鉴定

GS29小鼠作用原理如图7A所示，内切酶Tth111 I线性化并回收DNA后委托上海南方模式生物科技发展有限公司进行胚胎显微注射，简述之，转基因小鼠是通过外源基因的受精卵雄原核注射获得，供体受精卵取自C57BL/6J(♀)与 

的杂交一代。在此次转基因小鼠制备过程中，我们共获得385枚注射卵，这些卵分别移植到15只假孕母鼠的输卵管中，其中14只母鼠怀孕，移植成功率为93.33％，小鼠出生总数119只，经基因组DNA的PCR检测，其中5只小鼠为阳性，阳性率为4.20％。这些转基因阳性小鼠被称作Founder，即首建鼠。阳性Founder小鼠和1只野生型小鼠再次剪尾抽提基因组DNA，双盲法再次进行PCR检测，确认5只为转基因阳性小鼠，编号依次为#26，#34，#56，#68，#85。 

使所述Founder小鼠与野生型C57BL/6J配对后产出F1代，部分小鼠经PCR鉴定为GS-29primer阳性(图7B)。取野生型小鼠和GS29小鼠的原代腹腔巨噬细胞和CD4⁺T细胞提取RNA后进一步用RT-PCR和定量PCR检测GFP基因，GS29小鼠细胞中含大量GFP mRNA(图7C)。 

将如图示的报告基因载体、TK载体用核转的方式共转入野生型小鼠或者GS29小鼠的腹腔巨噬细胞(原代巨噬细胞转染用小鼠巨噬细胞核转试剂盒，程序为Amaxa，Y-001。具体的核转步骤参见Lonza公司相关试剂盒的说明书)，转染后24h检测各组细胞中萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶活性(双萤光报告基因检测试剂Dual-Luciferase Reporter Assay System购自Promega公司)，图中数值以萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性表示。 

结果表明GS29小鼠腹腔巨噬细胞中能明显上调含miR-29结合位点的报告基因(AM147-3’UTR，hTTP-3’UTR和IFN-γ3’UTR)，而突变miR-29结合位点后，GS29小鼠腹腔巨噬细胞中不能上调这些报告基因的萤光素酶活性(mu-hTTP-3’UTR和mu-IFN-γ3’UTR)，同时无miR-29结合位点的IL-103’UTR报告基因在野生型或者GS-29腹腔巨噬细胞中亦无差异(图7D)。 

实施例8：GS29小鼠具有较强的抗李斯特菌感染的能力

李斯特菌毒力株(LM，ATCC 19111的单核增生性李斯特菌，由上海复祥生物科技有限公司代购)，在含5μg/mL红霉素的BHI培养基中培养。当细菌处于对 数生长期时，对培养基中的细菌原液进行10倍梯度倍比稀释后，涂于含有红霉素的BHI琼脂板，在37℃培养过夜后，通过克隆计数计算原液中的集落形成单位数(CFU)。每只小鼠腹腔注射5×10⁴CFU的LM，感染指定天数后，计数小鼠死亡率，计算生存曲线。取感染3d后小鼠脾脏在5ml 0.05％的Triton X-100中研磨、裂解，然后进行10倍梯度倍比稀释后，涂于含有红霉素的BHI琼脂板，在37℃培养过夜后，通过克隆计数计算脾脏和肝脏中LM的CFU。 

GS29小鼠在李斯特菌感染后，存活率明显高于野生型小鼠(图8A)，感染3天的小鼠中，GS29小鼠肝脏和脾脏中的李斯特菌菌落数量明显少于野生型小鼠(图8B)。 

以上结果说明，GS29小鼠具有较强的抗李斯特菌感染的能力，提示miR-29吸收序列能上调IFN-γ的表达而促进李斯特菌的清除能力，增强机体抗李斯特菌的感染能力。 

实施例9：GS29小鼠具有较强的抗结核分支杆菌H37Rv感染的能力

结核分支杆菌毒力株H37Rv(ATCC(#27294)，购自北京生物制品研究所)，在米德尔7H9培养基(Difco，Detroit，MI)中培养，当细菌处于对数生长期时，对培养基中的细菌原液进行10倍梯度倍比稀释后，涂于含有10％过氧化氢酶葡萄糖酸(Difco，Detroit，MI)和0.05％ Tween 80(上海生工生物工程有限公司)的米德尔7H9琼脂板。H37Rv感染时，将5×10⁵CFU的H37Rv溶于PBS后尾静脉注射到小鼠中。感染指定天数后，小鼠肺脏在0.05％的Tween 80中研磨、裂解，然后进行10倍梯度倍比稀释后，涂于米德尔7H9琼脂板，在37℃培养3周后，通过克隆计数计算肺脏中H37Rv的CFU。 

结果显示，H37Rv感染指定天数后，GS29小鼠的存活率较高(图9A)。H37Rv感染3周后，GS29小鼠肺脏中H37Rv的细菌残留量较小(图8C)。 

以上结果表明，miR-29吸收序列在体内高表达后能有效地促进结核分支杆菌H37Rv的清除能力，对肺结核这种人类重大疾病可能有治疗作用。 

实施例10.表达载体中启动子的选择和验证

为选择适合于构建本发明miR吸收载体的启动子序列，发明人比较了多种聚合酶II型的启动子(如CMV、CAG、UBC、PGK)和多种聚合酶III型的启动子(如 H1和U6)介导的miR-29吸收序列表达。 

构建含CMV、CAG、UBC、PGK、H1、U6启动子的miR-29吸收载体，构建方法类似于pGS29(以UBC为启动子的miR-29吸收载体)，不同之处即载体的启动子部分被替换成非UBC启动子。将AM-1473’UTR报告基因载体、TK载体以及其中一种上述miR-29吸收载体共转入HEK293T细胞中，转染后24h检测各组细胞中萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶活性(双萤光报告基因检测试剂Dual-Luciferase Reporter Assay System购自Promega公司)，图中数值以萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性表示。 

实验结果显示，聚合酶II型的启动子如CMV、CAG、UBC、PGK介导miR-29吸收序列高表达后的效果类似，表现为含有miR-29结合位点的AM-1473’UTR报告基因具有相近的相对萤光值。聚合酶III型的启动子如H1和U6介导的miR-29吸收序列高表达的效果显著弱于聚合酶II型的启动子(图10A)。 

发明人进一步检测了以UBC为启动子的pGS29载体制备成的转基因小鼠中各组织和免疫细胞中的miR-29吸收序列(GS-29)的表达情况。 

提取用pGS29载体制备的miR-29吸收载体转基因小鼠各脏器和各种免疫细胞的mRNA，用RT-PCR的方法检测miR-29吸收序列(GS-29)的表达情况，鉴定引物为GS-29 primer(见实施例1)。 

实验结果证实了，含UBC启动子的pGS29载体制备成转基因小鼠后，能介导miR-29吸收序列的mRNA在各组织器官及各免疫细胞中高表达(图10B)。 

以上结果表明，在本发明中采用II型启动子具有优势，其可确保吸收序列在体内、外的高表达。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (13)

1.一种miRNA吸收载体，其携带从5’至3’依次包含如下元件的表达盒：

(a)II型启动子；

(b)指示蛋白编码序列；以及

(c)目的miRNA的吸收序列，所述吸收序列是2～10次重复的、与目的miRNA部分互补或完全互补的序列；

(d)任选的增强子序列。

2.如权利要求1所述的miRNA吸收载体，其特征在于，所述II型启动子优选：UBC、CAG、PGK、CMV启动子。

3.如权利要求1所述的miRNA吸收载体，其特征在于，所述指示蛋白选自：荧光蛋白、萤光素酶或者表达标签。

4.如权利要求1所述的miRNA吸收载体，其特征在于，所述目的miRNA选自下组：miR-29、miR-21和miR-146。

5.如权利要求1所述的miRNA吸收载体，其特征在于，所述吸收序列与目的miRNA的互补比例为78％～84％。

6.如权利要求1所述的miRNA吸收载体，其特征在于，所述表达盒自5’至3’依次包括：UBC启动子、绿色荧光蛋白eGFP序列以及miRNA吸收序列。

7.如权利要求1所述的miRNA吸收载体，其特征在于，所述吸收载体选自：质粒、噬菌体或病毒。

8.如权利要求7所述的miRNA吸收载体，其特征在于，所述载体是慢病毒载体，其特征在于，该慢病毒载体还包含慢病毒的包装所必须的序列。

9.一种制备慢病毒颗粒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(i)制备含权利要求1-6任一项中所记载的表达盒的慢病毒穿梭载体；

(ii)包装所述穿梭载体，并获得慢病毒颗粒；

(iii)任选的通过检测指示蛋白的表达确定病毒滴度。

10.一种慢病毒介导目的基因在T细胞中高表达的方法，其特征在于，所述方法包括用权利要求9所述的慢病毒感染T细胞，以使得感染后的T细胞高表达目的miRNA吸收序列的步骤。

11.一种产生转基因小鼠的方法，所述方法包括：

(a)提供如权利要求1～8中任一项所述的miRNA吸收载体；

(b)用该miRNA吸收载体显微注射小鼠受精卵，并将其分别移植到假孕母鼠输卵管；

(c)待所述母鼠生产小鼠后，检验并获得转基因小鼠；

(d)任选使所述转基因小鼠与其它小鼠配对以产生转基因后代。

12.权利要求1～8中任一项所述的miRNA吸收载体、用权利要求9所述的方法制备的慢病毒载体、权利要求11所述的方法生产的转基因小鼠在miRNA相关疾病的预防或治疗中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述miRNA相关疾病选自：肿瘤、血液造血系统疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、循环系统疾病、自身免疫病、风湿病、糖尿病、系统性硬化病、皮肤病、病毒感染、细菌感染以及骨分化、肌肉分化和肌肉相关疾病，优选细菌感染相关疾病和/或征状。

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