CN102827843A - 一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA及其应用，其碱基序列如SEQ IDNo.1所示。该shRNA针对的靶序列如SEQ IDNo.2所示。该shRNA通过如SEQ IDNo.3或4所示的DNA寡核苷酸链转录生成。这段shRNA能够通过RNA干扰途径（RNAi），特异性降低人肝癌细胞系（HepG2）中基因Orai1的表达，从而显著抑制HepG2细胞的增殖和转移。该发夹小RNA可以应用于抑制肿瘤细胞增殖和转移的药物中。

Description

一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域,涉及一个能通过RNA干扰途径特异降低细胞内Orai1基因表达量的发夹型小干扰RNA（Orai1 shRNA）的序列；以及利用这种发夹型小干扰RNA（shRNA）对Orai1基因进行特异性干扰后抑制细胞增殖和转移的作用，尤其是抑制肝癌细胞系（HepG2）增殖和转移的作用。

背景技术

肿瘤的增殖、侵袭、转移是一个复杂的过程，包括肿瘤细胞本身的自律性，及其与细胞外环境包括基质和细胞的相互作用。肿瘤细胞针对细胞外刺激产生的应答通过信号转导过程来调节，进而影响细胞的生命活动。许多信号转导通路都有一个共同的调节点：细胞内Ca²⁺调控。细胞内Ca²⁺的升高可以作为外界信号传递到细胞内的标志。大量实验表明Ca²⁺参与了细胞的增殖、侵袭、转移过程。在肿瘤细胞的运动、粘附过程中，都伴随有细胞内Ca²⁺的升高，因而调控细胞内Ca²⁺浓度的分子可能在肿瘤细胞的侵袭转移过程中发挥重要作用。

在各种不同的细胞中，受体调控细胞内钙库释放钙离子之后，都会随之引起细胞膜上钙离子的内流，这种现象被称为钙离子释放激活钙内流(CRAC)。钙离子释放激活钙内流(CRAC)通道是位于非兴奋性细胞质膜上的重要钙离子通道，是非兴奋性细胞(尤其淋巴细胞和肿瘤细胞)中胞外钙离子进入细胞内的主要途径，但是CRAC通道的分子机制目前还不清楚。

Orai1是一个新近发现的基因，是组成CRAC通道至关重要的亚单位。Orai1是位于细胞质膜上的，由4个跨膜片段构成的跨膜蛋白，其N端和C端都位于细胞内。其第1个和第3个跨膜片段上存在钙离子结合位点，靠近N端的区域是脯氨酸富集区，具有跨膜转移钙离子的能力，因此其他离子很难从该通道进入细胞，决定了由Orai1蛋白组成的CRAC通道具有钙离子选择性。内质网中充满Ca²⁺时，Orail蛋白以单体形式游离在细胞质膜上，CRAC通道处于关闭状态。当细胞受到外界刺激时，细胞质中IP3浓度升高，引起细胞内Ca²⁺浓度轻微升高，质膜上的Orail蛋白自发的组装成四聚体，从而激活CRAC通道，使得胞外Ca²⁺进入细胞内。最近的研究结果表明，Orai1在促进肿瘤细胞增殖和黏附侵袭的过程中发挥重要作用。因此，抑制Orai1基因的转录和表达可能是抑制肿瘤细胞增殖和转移的有效方法。

shRNA（short hairpin RNA）是“短发夹RNA”，shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由pol Ⅲ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。利用shRNA干涉基因可以克服siRNA作用时间短暂的缺点，是一种稳定沉默基因的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA及其应用，该shRNA可以特异性抑制人Orai1基因表达。

本发明的技术解决方案是：一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，其碱基序列如SEQ IDNo.1所示，即：

5’-CACCGCUCACUGGUUAGCCAUAAGAUUCAAGAGAUCUUAUGGCUAACCAGUGAGCUUUUUUG-3’。

一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，其针对的靶序列如SEQ IDNo.2所示，即GCUCACUGGUUAGCCAUAAGA。

一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，该shRNA通过如SEQ IDNo.3或4所示的DNA寡核苷酸链转录生成，即

5’-CACCGCTCACTGGTTAGCCATAAGATTCAAGAGATCTTATGGCTAACCAGTGAGCTTTTTTG-3’，或

5’-GATCCAAAAAAGCTCACTGGTTAGCCATAAGATCTCTTGAATCTTATGGCTAACCAGTGAGC-3’。

一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，该shRNA通过包含如SEQ IDNo.3或4所示的DNA寡核苷酸链的质粒转录生成。

一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，该shRNA在制备抑制肿瘤细胞增殖和转移的药物中的应用。

将本发明发夹型干扰RNA（Orai1 shRNA）转染入人肝癌细胞系后，Orai1基因和蛋白的表达量明显降低，并能抑制细胞增殖能力，黏附能力和侵袭能力，能降低细胞明胶酶分泌水平，具有潜在的治疗肿瘤的价值。这段shRNA能够通过RNA干扰途径（RNAi），特异性降低人肝癌细胞系（HepG2）中基因Orai1的表达，从而显著抑制HepG2细胞的增殖和转移。该发夹小RNA可以应用于抑制肿瘤细胞增殖和转移的药物中。

附图说明

图1是RT-PCR，Western-blot检测Orai1基因shRNA转染人肝癌细胞系HepG2，Orai1基因基因的蛋白表达水平（A）为RT-PCR结果，Orai1 shRNA为转染Orai1 shRNA的细胞，control shRNA为转染无关序列shRNA的细胞。（B）为Western-blot结果。

图2是细胞计数检测Orai1基因shRNA转染后，细胞增殖能力的变化。

图3是细胞黏附实验检测Orai1基因shRNA转染后，细胞黏附能力的变化。

图4是细胞侵袭实验检测Orai1基因shRNA转染后，细胞侵袭能力的变化。

图5是明胶酶谱实验检测Orai1基因shRNA转染后，细胞明胶酶分泌水平的变化。

具体实施方式

1.针对Orai1基因shRNA的设计与合成：根据Orai1基因全长mRNA序列，经分析设计，我们选择了Orai1基因全长mRNA序列(NM_032790.3)第969～990碱基处，共21个核苷酸为靶向干涉的序列，被识别的具体序列如SEQ IDNo.2所示，即：GCUCACUGGUUAGCCAUAAGA。针对该序列我们设计合成了一段高特异性的shRNA，该shRNA通过如SEQ IDNo.3或4所示的DNA寡核苷酸链转录生成，即

5’-CACCGCTCACTGGTTAGCCATAAGATTCAAGAGATCTTATGGCTAACCAGTGAGCTTTTTTG-3’，

5’-GATCCAAAAAAGCTCACTGGTTAGCCATAAGATCTCTTGAATCTTATGGCTAACCAGTGAGC-3’。转录后的shRNA碱基序列如SEQ IDNo.1所示，即：

5’-CACCGCUCACUGGUUAGCCAUAAGAUUCAAGAGAUCUUAUGGCUAACCAGUGAGCUUUUUUG-3’。

2.Orai1基因shRNA表达载体的的设计与合成：将该shRNA连接入真核表达载体pGPU6/GFP/Neo,并进行测序,以确保正确的连接。测序结果表明Orai1 shRNA已正确连接入真核表达载体pGPU6/GFP/Neo。

3.Orai1基因shRNA表达载体转染人肝癌细胞HepG2：细胞培养至50-70%融合后，将shRNA表达载体与经1640培养基稀释的脂质体lipfectamine2000混匀后，室温孵育20分钟，加到接种的细胞中。转染24小时后，提取细胞总RNA经RT-PCR分析Orai1 mRNA量。提取总蛋白经Western-blot检测Orai1蛋白量。结果表明，Orai1 shRNA表达载体转染人肝癌细胞后，Orai1基因的mRNA明显降低，Orai1蛋白的表达量也显著降低（参见图1）。

4.Orai1 shRNA抑制肝癌细胞增殖实验：将转染Orai1 shRNA表达载体的HepG2细胞与转染无关序列shRNA表达载体的HepG2细胞接种于6孔板中，在不同时间点对活细胞计数，并绘制成细胞增殖曲线，比较细胞增殖速率。结果表明，Orai1 shRNA表达载体转染人肝癌细胞，可明显抑制细胞的增殖能力（参见图2）。

5.Orai1 shRNA抑制肝癌细胞黏附实验：96孔培养板包被Matrigel(5μg/ml)。预先用含有2%BSA的PBS室温封闭30min。分别将转染Orai1 shRNA表达载体的HepG2细胞与转染无关序列shRNA表达载体的HepG2细胞，接种于封闭好的培养板（2×10⁴细胞/孔），置5%CO₂培养箱37℃培养30-60min。每孔加入50μl 0.2%Cristal violet，流水冲洗，空气干燥。加入100μl细胞裂解液37℃放置20min，酶标仪（540nm波长）下读数。结果表明，Orai1 shRNA转染人肝癌细胞，可明显抑制细胞的黏附能力（参见图3）。

6.Orai1 shRNA抑制肝癌细胞侵袭实验：将培养小室置于24孔板上，小室外部空间加入600μl 0.5%胎牛血清作为化学趋化剂。培养小室聚碳酸酯膜上包被Matrigel(5μg/ml)形成一连续薄层，称为“人工基底膜”。分别将1×10⁵个转染Orai1 shRNA表达载体的HepG2细胞与转染无关序列shRNA表达载体的HepG2细胞加入培养小室内，置5%CO₂培养箱培养24-72h。检测穿过Matrigel的细胞数。结果表明，Orai1 shRNA表达载体转染人肝癌细胞，可明显抑制细胞的侵袭能力（参见图4）。

7.Orai1 shRNA抑制肝癌细胞明胶酶分泌实验：分别收集转染Orai1 shRNA表达载体的HepG2细胞与转染无关序列shRNA表达载体的HepG2细胞的无血清培养上清，经含0.1%明胶粉的凝胶电泳后，加入明胶酶孵育，染色进行灰度扫描比较。结果表明，Orai1 shRNA表达载体转染人肝癌细胞，可明显抑制细胞的明胶酶分泌能力（参见图5）。

序列表

<110>陈志南

<120>一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA及其应用

<160>4

<210>1

<211>62

<212>RNA

<213>智人（Homo Sapiens）

<400>1

caccgcucac ugguuagcca uaagauucaa gagaucuuau ggcuaaccag ugagcuuuuu60

ug                                                               62

<210>2

<211>21

<212>RNA

<213>智人（Homo Sapiens）

<400>2

gcucacuggu uagccauaag a 21

<210>3

<211>62

<212>DNA

<213>智人（Homo Sapiens）

<400>3

caccgctcac tggttagcca taagattcaa gagatcttat ggctaaccag tgagcttttt60

tg                                                               62

<210>4

<211>62

<212>DNA

<213>智人（Homo Sapiens）

<400>4

gatccaaaaa agctcactgg ttagccataa gatctcttga atcttatggc taaccagtga60

gc                                                               62

Claims (5)

1.一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNo.1所示，即：

5’-CACCGCUCACUGGUUAGCCAUAAGAUUCAAGAGAUCUUAUGGCUAACCAGUGAGCUUUUUUG-3’。

2.根据权利要求1所述的一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，其特征在于：其针对的靶序列如SEQ IDNo.2所示，即GCUCACUGGUUAGCCAUAAGA。

3.根据权利要求1或2所述的一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，其特征在于：该shRNA通过如SEQ IDNo.3或4所示的DNA寡核苷酸链转录生成，即

5’-CACCGCTCACTGGTTAGCCATAAGATTCAAGAGATCTTATGGCTAACCAGTGAGCTTTTTTG-3’，或

5’-GATCCAAAAAAGCTCACTGGTTAGCCATAAGATCTCTTGAATCTTATGGCTAACCAGTGAGC-3’。

4.根据权利要求1或2所述的一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA,其特征在于：该shRNA通过包含如SEQ IDNo.3或4所示的DNA寡核苷酸链的质粒转录生成。

5.一种权利要求1所述的一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA的用途，其特征在于：该shRNA在制备抑制肿瘤细胞增殖和转移的药物中的应用。

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