CN102813927B - 骨形成蛋白-4在筛选抗心肌肥厚、抗心衰或抗心脏纤维化的药物中的用途 - Google Patents
骨形成蛋白-4在筛选抗心肌肥厚、抗心衰或抗心脏纤维化的药物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了骨形成蛋白-4在筛选抗心肌肥厚、抗心衰、抗心脏纤维化的药物中的用途，属于生物医药领域。筛选药物类型包括：骨形成蛋白-4生成抑制药、骨形成蛋白-4拮抗药、骨形成蛋白-4受体阻断药及骨形成蛋白-4下游信号拮抗药。本发明还涉及所述药物在制备抗心肌肥厚、抗心衰、抗心律失常的药物中的用途。研究发现，骨形成蛋白-4能够诱发心肌细胞肥厚、凋亡和心脏成纤维细胞胶原分泌增加，导致心肌肥厚和心脏纤维化、心衰、心律失常的发生，而拮抗骨形成蛋白-4及其细胞信号通路的药物的使用可抑制心肌肥厚发生、抑制心脏纤维化、减少心肌细胞死亡和心律失常的发生。本发明为实现高通量的药物筛选提供了理论基础，具有实践指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白的新用途，特别涉及骨形成蛋白-4（bone morphogeneticprotein-4）及其细胞信号通路作为筛选抗心肌肥厚、抗心衰、抗心脏纤维化的药物中的用途，本发明还涉及骨形成蛋白-4的拮抗剂及\或骨形成蛋白-4信号通路阻断剂及其在制备抗心肌肥厚、抗心衰、抗心脏纤维化的药物中的用途。本发明属于生物医药领域。
背景技术
心肌肥厚、心衰、心律失常是危害严重的心脏疾病，可导致猝死发生。发展中国家大约2%成年人患心衰，超过65岁后，此比例可增加到6-10%。目前用于心肌肥厚、心衰长期治疗的药物主要有利尿药、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素1型受体拮抗剂、beta-肾上腺素受体拮抗剂、血管扩张剂等；用于心律失常治疗的药物主要有钠通道阻断剂、钙通道阻断剂、钾通道阻断剂、beta-肾上腺素受体阻断剂等。这些药物主要是改善心衰症状而不能抑制心衰进程，改善心律失常症状而不能彻底治愈心律失常，因此需要开发新型的能够抑制心肌肥厚、心衰、心律失常发生发展的药物。
发明内容
本发明的目的之一是提供骨形成蛋白-4在筛选抗心肌肥厚、抗心衰或抗心脏纤维化的药物中的用途；
本发明的目的之二是是提供一种含有骨形成蛋白-4的拮抗药及\或生成抑制药及\或骨形成蛋白-4的信号阻断药的药物组合物；
本发明的目的之三是提供所述的药物组合物在制备抗心肌肥厚、抗心衰或抗心脏纤维化的药物中的用途。
为了达到以上目的本发明采用了以下技术手段：
本发明通过研究发现了骨形成蛋白-4（bone morphogenetic protein-4）及其细胞信号通路与心肌肥厚、心衰、心律失常病症的相关性，因此提出了骨形成蛋白-4在筛选抗心肌肥厚、抗心衰或抗心脏纤维化的药物中的用途。
在本发明中，优选的，所述的骨形成蛋白-4（Bone morphogenetic protein 4[Homosapiens]），其GenBank登录号为AAH20546.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，可用于筛选的药物包括：骨形成蛋白-4的生成抑制药、骨形成蛋白-4的拮抗药、骨形成蛋白-4的受体阻断药或骨形成蛋白-4的下游信号拮抗药。
进一步的，本发明还提供了一种抗心肌肥厚、抗心衰、抗心脏纤维化的药物组合物，其特征在于所述药物组合物中含有选自以下药物中一种或几种：骨形成蛋白-4的生成抑制药、骨形成蛋白-4的拮抗药、骨形成蛋白-4的受体阻断药或骨形成蛋白-4的下游信号拮抗药。
骨形成蛋白-4是一种蛋白，能够抑制骨形成蛋白-4转录过程、翻译过程且能够作为抗心肌肥厚、抗心衰或抗心脏纤维化的药物均为在本发明权利要求书的保护范围之内。
同时，能够拮抗（中和）骨形成蛋白-4或阻断骨形成蛋白-4与其受体结合或阻断骨形成蛋白-4有关信号通路且能够作为抗心肌肥厚、抗心衰或抗心脏纤维化的药物均为在本发明权利要求书的保护范围之内。
在本发明的一个具体实施例中，优选的，所述的药物组合物中含有的骨形成蛋白-4的拮抗药为Noggin蛋白。
在本发明的一个具体实施例中，更优选的，所述的Noggin蛋白[Homo sapiens]其GenBank登录号为AAA83259.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
Noggin蛋白是人NOG基因编码蛋白，本发明通过研究发现，其具有中和骨形成蛋白-4，抑制心脏离子通道重构、抑制心房纤颤及室性心律失常的作用。
在本发明的另一个具体实施例中，优选的，所述的药物组合物中含有的骨形成蛋白-4拮抗药为4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉或以其为基础进行改造后的，仍具有骨形成蛋白-4拮抗功能的类似物，其中4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉的化学结构式如式I所示：
本发明通过研究发现，4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉（DD,式I所示）具有纠正心脏离子通道重构、抑制心房纤颤及室性心律失常的作用。
再进一步的，本发明还提供了所述的药物组合物在制备抗心肌肥厚、抗心衰或抗心脏纤维化的药物中的用途。
通过研究，本发明发现在压力负荷诱导的体内心肌肥厚中，在血管紧张素II和低氧诱导的体外心肌肥厚中，BMP4均表达增加（见图1）。而应用BMP4处理后，心肌细胞出现肥大和凋亡（见图2a,b,c,d），心脏成纤维细胞出现胶原分泌增加和向肌型成纤维细胞转化（见图3），说明BMP4可诱导心肌肥厚、心衰和心脏纤维化。
本发明发现在心肌细胞中采用慢病毒过表达BMP4,心肌细胞出现肥大和凋亡现象（见图4）。
本发明还发现心衰病人血浆中BMP4含量增加，当病人心衰治愈出院时，血浆BMP4水平恢复，说明BMP4与心衰密切相关，是心衰的特征指标（见图6）。
进一步的，本发明发现采用主动脉缩窄（TAC）造成心脏压力负荷增加引起小鼠心肌肥厚，体内持续给与4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉(式I化合物)四周，可显著抑制压力负荷引起的心脏重量指数（HW/BW）和左心室重量指数（LW/BW），纤维化和胶原分泌增加，说明化合物4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉具有体内抗心肌肥厚作用（见图5）。
心肌肥厚及心衰时，心肌细胞Kv4.3钾通道下降，ICa(T)(T-型电压依赖性钾通道)增加，而Kv4.3钾通道下降和ICa(T)增加可加重或诱发心律失常及房颤的发生。本发明发现骨形成蛋白-4的拮抗剂Noggin蛋白和4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉可纠正心肌肥厚及心衰时Kv4.3钾通道下降和ICa(T)钾通道增加，具有抗心律失常及抗房颤作用（见图7，图8）。
附图说明
图1为在压力负荷诱导的体内心肌肥厚中，在血管紧张素II和低氧诱导的体外心肌肥厚中，BMP4的表达情况；
(a)表明正常对照组与假手术组BMP4蛋白的表达量无差异；(b)表明压力负荷2周和4周后诱发心肌肥厚，此时心肌BMP4蛋白表达量显著增加，（c）为统计数据；(d)表明压力负荷2周和4周后心肌BMP4mRNA表达水平显著增加；（e）表明血管紧张素II诱导心肌细胞BMP4mRNA表达水平增加；(f)表明血管紧张素II诱导心肌细胞BMP4蛋白表达量增加；(g)表明低氧诱导心肌细胞BMP4mRNA表达水平增加；(h)表明低氧诱导心肌细胞BMP4蛋白表达量增加；
图2为BMP4诱导心肌细胞肥大和凋亡的照片及统计数据结果；
(a)为BMP4体外诱导心肌细胞肥大的照片及细胞面积统计数据；(b)表明了BMP4诱导心肌细胞肥大的指标ANP，BNP beta-MHC增加；(c)表明BMP4能够降低心肌细胞活力；(d)表明BMP4诱导心肌细胞凋亡，表现为caspase-3活性增加；(e)表明Noggin和4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉（DD，结构如式I所示）能够抑制血管紧张素II诱导的心肌细胞肥大；
图3为BMP4诱导心脏成纤维细胞出现胶原分泌增加和向肌型成纤维细胞转化；
(a)表明BMP4不影响心脏成纤维细胞活力；(b)表明BMP4增加心脏成纤维细胞胶原生成；(c)表明BMP4增加心脏成纤维细胞BMP4的蛋白表达；(d,e)表明BMP4诱导心脏成纤维细胞向肌型成纤维细胞转化；Alpha-SMA是肌型成纤维细胞的标志蛋白；(f，g)表明血管紧张素II诱导心脏成纤维细胞BMP4蛋白表达增加和胶原生成增加；(h,i)表明BMP4诱导心脏成纤维细胞向肌型成纤维细胞转化，但可被noggin和4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉（DD，结构如式I所示）所抑制；
图4为在心肌细胞中采用慢病毒过表达BMP4，心肌细胞出现肥大和凋亡的情况；
(a)为慢病毒过表达BMP4诱导心肌细胞肥大的照片及细胞面积统计数据；（b）为慢病毒过表达BMP4诱导心肌细胞凋亡的照片及统计数据；TUNEL阳性为凋亡细胞；
图5为采用主动脉缩窄（TAC）造成心脏压力负荷增加引起小鼠心肌肥厚，体内持续给与4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉（DD，结构如式I所示）四周后心脏指数的变化情况，表明了4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉可显著抑制压力负荷引起的心脏重量指数（HW/BW）和左心室重量指数（LW/BW），心肌细胞横截面积，纤维化和胶原分泌增加，说明其具有体内抗心肌肥厚和抗纤维化作用；
图6为心衰病人血浆BMP4水平与正常对照组及治愈组的比较情况；
(a)表明了与正常对照组比较，心衰病人血浆BMP4水平增加；（b）表明了同批病人中，心衰治愈出院后血浆BMP4水平与入院时比较，显著下降；
图7为压力负荷诱导心肌肥厚时，心肌Kv4.3钾通道蛋白以及心肌BMP4蛋白的表达情况；
(A)表明压力负荷诱导心肌肥厚时，心肌Kv4.3钾通道蛋白表达下降；Sham:假手术组；TAC:压力负荷模型组；(B)表明压力负荷诱导心肌肥厚时，心肌BMP4蛋白表达增加；Sham:假手术组；TAC:压力负荷模型组；(C)表明BMP4抑制心肌细胞Kv4.3钾通道蛋白表达，此作用可被Noggin蛋白和式I化合物纠正；**P<0.01vssham;##P<0.01vs BMP4组；
图8为BMP4与HL-1(心房肌细胞系)细胞ICa(T)钾通道（Cav3.1）mRNA表达水平的关系；
表明了BMP4能够增加HL-1(心房肌细胞系)细胞ICa(T)钾通道（Cav3.1）mRNA表达，此作用可被Noggin蛋白和4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉（DD，结构如式I所示）纠正；**P<0.01vs sham;##P<0.01vs BMP4组。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明具体实施例中所涉及材料或药品的来源：
4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉购于Sigma-Aldrich公司；Angiotensin Ⅱ购于Sigma公司(sigma-Aldrich)，.Anti-GAPDH购于kangcheng公司(China),anti-actin购于santa cruz公司；BMP-4,noggin购于R&D Systems公司.rBMP4lentiviral packaging购于3DBiopharm Co Ltd公司(Shanghai,China);小鼠（购于上海斯莱克实验动物有限公司）；anti-Kv4.3抗体购于Alomone公司；Caspase-3试剂盒购于中国Beyotime Institute of Biotechnology；血浆BMP4检测试剂盒购于美国Abcam Inc(产品号ab99982)；微渗透泵购于美国Alza(Alzet model2004)。
实施例1BMP4与心肌肥厚、心衰和心脏纤维化的关系
1、建立压力负荷诱导的心肌肥厚模型
小鼠用戊巴比妥钠65mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧于鼠板固定，无菌条件下,实施气管插管手术并连接呼吸机。胸前正中切口（1～2cm），暴露并分离主动脉弓。26-gauge针头紧贴胸主动脉平行放置，用7.0号线将二者结扎，结扎后抽出针头。逐层缝合胸部切口、关胸。术后青霉素钠肌注3d抗感染。4周后，小鼠戊巴比妥钠麻醉，称取体重（BW）后处死小鼠。称量心脏重量(HW)和左心室重量(LVW)。组织分别冻存和固定。冻存用液氮，组织固定用4%多聚甲醛。采用Westernblot技术测定BMP4蛋白含量，采用Masson染色测定心脏纤维化。
2、血管紧张素II和低氧诱导培养心肌细胞肥厚
分离培养出生1-3天的乳鼠心肌细胞，采用10nmol/L血管紧张素II处理48小时，每24小时更换一次含血管紧张素II的培养液。低氧采用10%O2,85％N2和5%CO2进行24小时诱导。采用Westernblot技术测定BMP4蛋白含量。
3、BMP4诱导培养心肌细胞肥厚
分离培养出生1-3天的乳鼠心肌细胞，采用50ng/ml BMP4处理48小时，采用免疫染色法进行心肌细胞特异染色，细胞面积采用Image-Pro Plus Version(5.0.1)进行分析。采用实时定量PCR技术测定ANP，BNP，β-MHC的含量，采用MTT法测定细胞活力，采用Caspase-3试剂盒测定Caspase-3活性。
4、BMP4诱导培养心脏成纤维细胞纤维化
分离培养出生1-3天的乳鼠心脏成纤维细胞，采用50ng/ml BMP4和10ng/ml血管紧张素II处理24小时，采用MTT法测定细胞活力，采用Westernblot技术测定α-SMA蛋白含量。
5、慢病毒过表达BMP4诱导心肌细胞肥大和凋亡
慢病毒转染心肌细胞过表达BMP4,心肌细胞出现肥大和凋亡现象。细胞面积采用Image-Pro Plus Version(5.0.1)进行分析，TUNEL染色确定细胞凋亡。
6、实验结果
本发明发现在压力负荷诱导的体内心肌肥厚中，在血管紧张素II和低氧诱导的体外心肌肥厚中，BMP4均表达增加（见图1）。而应用BMP4处理后，心肌细胞出现肥大和凋亡（见图2a,b,c,d），心脏成纤维细胞出现胶原分泌增加和向肌型成纤维细胞转化（见图3），说明BMP4可诱导心肌肥厚、心衰和心脏纤维化。
本发明发现在心肌细胞中采用慢病毒过表达BMP4,心肌细胞出现肥大和凋亡现象（见图4）。
本发明发现心衰病人血浆中BMP4含量增加，当病人心衰治愈出院时，血浆BMP4水平恢复，说明BMP4与心衰密切相关，是心衰的特征指标（见图6）。
实施例2Noggin蛋白在抗心肌肥厚、抗心肌细胞凋亡、抗心脏纤维化中的作用
如图2e所示，采用血管紧张素II诱导体外培养心肌细胞肥厚，给与Noggin蛋白可显著抑制血管紧张素II诱导的心肌细胞肥大。如图2d所示，在培养的心肌细胞中，BMP4诱导Caspase-3活性增高，给与Noggin蛋白可显著抑制BMP4诱导的心肌细胞Caspase-3活性增高，说明Noggin蛋白可抑制心肌细胞凋亡。如图3h,i所示，在培养的心肌成纤维细胞，采用血管紧张素II诱导成纤维细胞转化，给与Noggin蛋白可显著抑制血管紧张素II诱导的成纤维细胞转化，说明Noggin蛋白具有抗心脏纤维化作用。
心肌肥厚及心衰时，心肌细胞Kv4.3钾通道下降，ICa(T)(T-型电压依赖性钾通道)增加，而Kv4.3钾通道下降和ICa(T)增加可加重或诱发心律失常及房颤的发生。本发明发现骨形成蛋白-4的拮抗剂Noggin蛋白可纠正心肌肥厚及心衰时Kv4.3钾通道下降和ICa(T)钾通道增加，具有抗心律失常及抗房颤作用（见图7，8）。
实施例34-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉（DD，结构如式I所示）在抗心肌肥厚、抗心肌细胞凋亡、抗心脏纤维化作用
如图2e所示，采用血管紧张素II诱导体外培养心肌细胞肥厚，给与4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉可显著抑制血管紧张素II诱导的心肌细胞肥大。如图2d所示，在培养的心肌细胞中，BMP4诱导Caspase-3活性增高，给与4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉可显著抑制BMP4诱导的心肌细胞Caspase-3活性增高，说明该化合物可抑制心肌细胞凋亡。如图3h,i所示，在培养的心肌成纤维细胞，采用血管紧张素II诱导成纤维细胞转化，给与该化合物可显著抑制血管紧张素II诱导的成纤维细胞转化，说明该化合物具有抗心脏纤维化作用。
如图5,采用主动脉缩窄（TAC）造成心脏压力负荷增加引起小鼠心肌肥厚，小鼠背部皮下埋置微渗透泵(Alzet model 2004;Alza)，药物释放速度2mg/kg/天，缓释DD四周可显著抑制压力负荷引起的心脏重量指数（HW/BW）和左心室重量指数（LW/BW），心肌细胞横截面积，纤维化和胶原分泌增加，说明化合物4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉具有体内抗心肌肥厚和抗纤维化作用。
心肌肥厚及心衰时，心肌细胞Kv4.3钾通道下降，ICa(T)(T-型电压依赖性钾通道)增加，而Kv4.3钾通道下降和ICa(T)增加可加重或诱发心律失常及房颤的发生。本发明发现4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉可纠正心肌肥厚及心衰时Kv4.3钾通道下降和ICa(T)钾通道增加，具有抗心律失常及抗房颤作用（见图7，8）。
Claims (5)
1.骨形成蛋白-4在筛选抗心肌肥厚、抗心衰或抗心脏纤维化的药物中的用途，所述的骨形成蛋白-4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物包括：骨形成蛋白-4的生成抑制药、骨形成蛋白-4的拮抗药、骨形成蛋白-4的受体阻断药或骨形成蛋白-4的下游信号拮抗药。
3.骨形成蛋白-4的拮抗药在制备抗心肌肥厚、抗心衰或抗心脏纤维化的药物中的用途，所述的骨形成蛋白-4的拮抗药为4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉，其中4-[6-（4-异丙氧基）吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉的化学结构式如式I所示：
4.骨形成蛋白-4的拮抗药在制备抗心肌肥厚、抗心衰或抗心脏纤维化的药物中的用途，所述的骨形成蛋白-4的拮抗药为Noggin蛋白。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的Noggin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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