CN102812358A - 生物分子和生物分子复合物(bmc)的检测和分析方法及其在研究和医疗诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请是关于生物样品(或系统)中生物分子的检测方法。尤其是本文中实施例使得可以检测生物分子复合物。实施例使得首次可以阐明生物分子复合物对于特定疾病状态的重要意义，它们使得可以基于特定生物样品中某种生物分子复合物的种类和复合水平对疾病状态做出诊断。

Description

生物分子和生物分子复合物(BMC)的检测和分析方法及其在研究和医疗诊断中的应用

相关申请的交叉参考

本申请根据美国法典第35篇第119条(35USC 119)要求2010年1月14日提交的美国专利申请第61/294,877号和2010年10月27日提交的美国专利申请第61/407,038号的优先权。

引言

生物分子的相互作用，如蛋白质-蛋白质、和蛋白质-DNA相互作用，在几乎所有细胞的功能中发挥着关键的作用。许多细胞内的生化过程都是由生物分子集合所触发，其中包括有蛋白质、DNA和RNA，形成生物分子复合物(BMC)，该现象提供了一种控制无数生化过程的方法，从而有效地管理关键生物反应。对这些生物分子复合物的检测和分析不仅是了解发病机制的关键，同时也提供了疾病诊断和治疗的新方法和新手段。

虽然目前已存在大量检测和分析个别生物分子浓度的生物分析技术，但是用于研究生物分子的相互作用和生物分子复合物检测和分析的技术都相当有限，尚不能满足生物分子研究和临床诊断的需求和挑战。许多传统技术，如免疫共沉淀、免疫亲和层析和酵母双杂交测定等，涉及复杂的检测程序，需要大量样品(100sμL)，并且需要几个小时到几天来取得结果。此外，这些传统的技术只能识别结合对象，不能提供动态结合信息。较为新近的技术，如基于荧光的技术和表面等离子体共振(SPR)，可以同时对生物分子的相互作用和和复合物形成进行检测和动态结合研究，但有也有局限性，如标记，可能影响或破坏生物分子的结构和结合活性，且SPR需要使用以固相为基础的技术(而不是基于液相的分析)，并且其成本较高。

附图说明

图1显示了一个目标分子检测系统的第一个实施例的原理图。

图2显示一个目标分子检测系统的第二个实施例的原理图。

图3显示一个目标分子检测系统的第三个实施例的原理图。

图4.(A)来自一种细胞核提取物的蛋白值复合物检测和结合对象分析图解。该检测包括两个步骤：第一步，将单个目标蛋白的金纳米粒子(AuNP)免疫探针，此处为表皮生长因子受体(EGFR)，与样品溶液混合。监测因EGFR蛋白质结合或蛋白质复合物与AuNP探针的结合所造成的粒子体积增加。待结合事件到达终点后，将分析溶液分为多分和单分，向检测溶液中加入各怀疑蛋白结合对象的多克隆抗体。然后监测检测溶液的粒子体积增加，并用于识别结合对象。(B)使用来自胰腺癌细胞株，Panc-1核提取物的EGFR蛋白及其复合物进行的EGFR-AuNP探针动态结合分析(或使用小鼠IgG1-AuNP探针作为EGFR-AuNP探针的阴性同型对照)。(C)和(D)蛋白复合物结合对象分析，将多克隆抗-Stat3、抗-Src或抗-EGFR抗体或非特异性家兔IgG(阴性对照)添加到经抗-EGFR-AuNP探针(C)或非特异性小鼠IgG1-AuNP探针(阴性对照)(D)制备的分析溶液中。数据代表了4项独立的研究。

图5(A)金纳米粒子免疫探针因与蛋白质复合物结合或聚集形成集群图解。(B)根据非线性的剂量反应曲线，确定出现大幅GAPDH蛋白聚集的浓度。(C)和(D)GAPDH分析溶液分别为25和50μg/mL时的粒子大小分布曲线。

图6(A)来自正常的前列腺癌、前列腺癌和良性前列腺增生(BPH)组织裂解样品的分析溶液大小分布曲线。各图形中的数据均为十次测量的分析溶液强度分布曲线。(B)各样品分析溶液的多分散指数(PdI)。前列腺癌样本数据上方的数字是组织的Gleason总和得分。这里展示的所有数据都是十次测量的平均值。

图7小鼠血清蛋白吸附研究和目标蛋白质分析。数据为以下分析溶液的粒子大小增加：(A)未稀释的小鼠血清吸附到AuNP；(B)经10倍稀释的小鼠血清的IgG检测；(B)10倍稀释的小鼠血清VEGF检测。每项检测均将40μL AuNP溶液与2μL血清样品混合。经过一段时间的培养后，在分析溶液中加入适量的抗小鼠IgG或抗-VEGF，分析吸附到AuNP上的IgG或VEGF水平。

图8来自癌症和非癌症捐献者的10倍稀释(A)和未稀释(B)人血清样品的VEGF检测结果。非癌症捐献者包括正常和BPH患者。将40μL AuNP溶液与2μL血清样品混合。经过一段时间的培养后，加入2μL抗血管内皮生长因子-VEGF溶液(0.5mg/mL)。粒子大小增加是指加入抗体前后所测得的大小差异。在A中，部分样品的小图例表示前列腺癌的分期，如T1c。癌症分期T2c或以上的样品标记为青绿色。所有的癌症样本减去六个早期癌症样本的平均粒子大小变化是零。

发明详述

本专利申请公布了几种生物分子复合物(BMC)的检测和分析新方法，及其在医疗诊断中的应用。在本申请中，生物分子复合物是指一种生物分子亚基，如蛋白质、DNA、RNA、碳水化合物，通过共价或非共价化学键与其它生物分子相结合。单个生物分子或生物分子亚基称为单体。此外，两种类型的生物分子复合物具体说明如下：一种是由一个生物分子和至少另一个不同的生物分子构成的异构复合物，第二种有至少两个相同的生物分子或生物分子亚基构成的同质复合物。另外，在本申请中，复合物的每个组成分子称为“结合对象”。本申请主要使用蛋白质作为生物分子示例，但是，所公布的方法可以应用于任何其它类型的生物分子复合物，如蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、DNA-DNA、DNA-RNA复合物。当然，本文公布的实施例也可用于检测非符合或聚集的生物分子。

在本申请中，申请中的纳米粒子是指直径从1nm至10,000纳米的粒子，优选1-1000nm本文中公布的新方法和系统实施例延续了2009年1月5日提交的PCT/US09/30087号专利中公布的创新性成果。

应当注意，本专利申请中提及的纳米粒子并不仅限于金属纳米粒子。本申请中的粒子大小检测技术并不仅限于动态光散射技术。此外，在下文所述的一些实施例中，可采用其它检测技术测量因生物分子复合物间相互作用引起的纳米粒子聚集。

可以采用本文中传授的方法测试的生物样品包括但不局限于，组织、组织裂解液、组织液、细胞、细胞裂解产物、细胞培养基、血液、尿液、粪便、精液、乳腺分泌液体、唾液、痰或循环肿瘤细胞；和/或以上生物样品经化学、物理或生物处理得到的衍生产物。本文中参考患病或未患病样本分别是指来自或衍生自处于疾病状态或非疾病状态患者的生物样品。

图1-3提供三个生物分子检测实施例原理图。在一个实施例中(图1)，本发明涉及一种带有一层“诱饵”生物分子涂层的纳米粒子(优选金或银纳米粒子)。本文中“诱饵分子”是指一种可以通过非共价的化学相互作用与其它生物分子特异性结合的分子。比如抗体就是一个“诱饵分子”。单链DNA是“诱饵分子”的另一个例子。诱饵分子将会与样品中的特定目标分子X相结合。带有诱饵分子涂层的纳米粒子在本文中称为“纳米粒子探针”。通过使纳米粒子探针溶液与样品溶液接触，目标分子X及其复合物将会与纳米粒子探针相结合，导致纳米粒子探针大小增加或纳米粒子聚集。分析溶液中这种纳米粒子大小的变换可以通过动态光散射或其它粒子大小分析技术测定，从而显示了在样品溶液中是否存在目标蛋白质或蛋白质复合物。对大小的测量可以持续进行，以显示结合动力学特征，具体如图1中图形所示。通过使用Langmuir方程将结合曲线拟合成Langmuir吸附模型，可以得到诱饵分子和目标分子或复合物之间的结合常数或结合能量。当结合达到饱和状态时，可以通过平均粒子大小变化或粒子大小分布变化反映目标分子X及其复合物的大小。可以通过粒子大小的变化获得样品溶液中分子X的浓度。此外，通过设计实验时使得分子X和纳米粒子探针之间的结合达到饱和，可以使结合达到饱和时粒子大小的净增加等于目标分子X直径的两倍(2D)。从该分析中可以获得分子X的大小。如果目标分子X与其生物分子形成复合物，则纳米粒子大小的增加将超过X的2D值。在这种情况下，可以使用所获得的分子X大小信息来推断分子X的复合状态和水平。

作为本实施例的一项变化，相同的纳米粒子可以包含多个诱饵分子，用于不同的目标分子。例如，针对X和A的诱饵分子均可固定在纳米粒子上，且这种纳米粒子可以与来自相同样品溶液中的多个目标分子类型相结合。

此外，通过在检测中加入第二个步骤，可以通过筛查分析进一步发现生物分子复合物的结合对象。检测的第一步完成后，在检测溶液中加入一种可以与目标结合对象分子A特异性结合的诱饵分子溶液。进行检测第二步骤前，可能需要或不需要将纳米粒子从其余部分检测溶液中分离。如果目标潜在结合对象A在纳米粒子上出现，目标分子A诱饵分子与纳米粒子的结合将导致纳米粒子的大小或纳米聚集的形成进一步增加，从而证实分子A和分子X之间形成了生物分子复合物。

可替换性地，该方法也可以包括将检测溶液持续暴露于目标分子A的纳米探针之下，在暴露于纳米粒子探针后无需对生物样品进行粒子分析。基于粒子的特性，可以判断目标分子A的诱饵分子是否与纳米粒子探针相结合，而据推测后者已经具备了预期相结合的目标分子X。由此，可以推断，生物分子复合物包括与目标分子A相复合的目标分子X。

在第二个实施例中(图2)，检测在设计上使相同或不同的纳米粒子探针在不同的复合物位点上与生物分子复合物相结合，形成纳米粒子聚集。图解中展示了用于两个生物分子X和A的两种纳米粒子探针。在图解中，所展示的复合物是一种两个分子的复合物，但是复合物可以包括尽可能多的分子。两个纳米探针可同时或先后与样品溶液混合。同时使用时，如果样品溶液中存在生物分子复合物XA，检测将形成纳米粒子二聚体或聚集。平均粒子大小和/或粒子大小分布将提供关于XA复合水平的定量信息。复合水平可以同时反映复合物XA的浓度和复合物的大小。例如，存在大生物分子复合物时，将导致粒子大小分布曲线显著增宽。先后使用时，两种纳米粒子探针均可首先与样品溶液混合，使来自复合物的第一种生物分子与纳米粒子探针相结合。然后加入第二种探针，检测复合物中的第二种生物分子。可以在检测溶液中加入更多的纳米粒子探针，以检测复合物中的其它结合对象。

第二个实施例中的一个特别之处在于，目标分子的X和A是相同的。在这种情况下，生物分子复合物的XA也可以称为生物分子聚集(或也可称为同质复合物)。较大的聚集可能导致样品溶液与至少一种纳米粒子探针溶液接触后，粒子大小增加和/或粒子大小分布曲线增宽幅度更大。

参考粒子分析可包括，但不局限于，确定粒子大小的变化(包括单个粒子的大小变化)、平均粒子大小变化、粒子大小分布变化、大小分布的多分散变化或测量与测量之间的粒子大小差异，或以上的组合。在一个具体的实施例中，粒子分析是通过DLS进行的。

在第三个实施例中，将一种表面未附着特定诱饵分子的纳米粒子与样品溶液混合。来自样品溶液中的蛋白质和/或其它生物分子将非特异性地吸附到纳米粒子上，形成了生物分子的“日冕”。金或银纳米粒子带有电荷，使其能够非特异性地吸附生物分子。这种生物分子日冕的大小可使用动态光散射或其它适宜的粒子大小分析技术确定。该日冕的大小可以用来分析生物过程，确定疾病状态或揭示样品捐献者的其它生理状态。此外，还可以进行第二步检测，以揭示和量化在生物分子日冕中出现的个体生物分子。如果在日冕上有目标分子X出现，在检测溶液中加入分子X的抗体或诱饵分子将进一步增加粒子的大小，或导致粒子聚集的形成。这种粒子大小的变化可对应于样品溶液中分子X的浓度或大小。X的浓度和/或大小信息可以用来分析生物过程，确定疾病状态或揭示样品捐赠者的其它生理状况。另外，如果目标分子D未吸附到纳米粒子上，在检测溶液中加入D的诱饵分子则不会导致纳米粒子的大小或纳米聚集发生显著变化。

实施例

下文中对于上述每个实施例均给出了三个示例。此外，本文还用第四个示例说明了我们的研究中所发现的生物分子复合物如何用于诊断。

1.检测胰腺癌细胞株Panc-1细胞中咋杂络物EGFR/Stat3/Src

采用第一个实施例(图1)，我们近期通过研究顺利地将信号传导分子与促进信号传导的复合物相结合。又尤其是，该项新发明使得可以检测由以下三种蛋白质形成的一种迄今未知的杂络物：表皮生长因子受体(EGFR)、Stat3和胰腺癌细胞株Panc-1细胞核中Src。EGFR是一种重要的细胞反应调节因子，包括细胞的生长和存活。生物分子研究者对于EGFR蛋白给予了极大的关注，部分原因是由于目前还难以理解参与该通路的关键分子对象及其如何在总体相关细胞反应中发挥作用。从分子和生物的观点，EGFR参与了大量支持细胞反应的复杂事件。EGFR在细胞质膜、细胞质和细胞核中均有发现。全面掌握EGFR蛋白质的各个方面是开发一种与该通路在总体生物表型中功能性作用相关的有效模型的关键，包括它的表达水平，以及活性调节、移位、结构变化以及与其它蛋白质的相互作用。J.Turkson等研究发现EGFR、Stat3和Src等三种蛋白质共同存在的靶向作用能够加强对于胰腺癌的疗效。根据他们的研究假设认为EGFR、Stat3和Scr有可能在Panc-1细胞核中形成了一种杂络物，且这一复合物具有转录因子功能，能够调节Panc-1细胞的生长。基于第一个实施例的所有检测均证实了Panc-1细胞核中存在此类复合物。

将一种小鼠单克隆抗体—抗EGFR与AuNP结合，形成EGFR-AuNP探针。

当这种探针溶液与Panc-1核溶解产物混合时，粒子体积迅速从大约60nm增加至140nm，而一种非特异性同型对照小鼠IgG1-结合AuNP在检测后仅表现出大约10nm的体积增加(图4B)。纳米粒子探针的体积随着靶蛋白EGFR与探针的特异性结合而迅速增加，而小鼠IgG1-AuNP探针的缓慢和少量增加则说明为非特异性相互作用。

减去因非特异性相互作用引起的体积增加后，抗-EGFR-AuNP探针的净增加值约为70nm。由此表明经抗-EGFR-AuNP探针检测得到的EGFR蛋白复合物大小约为35nm。EGFR蛋白的分子量为170kDa。EGFR蛋白质本身的大小因介于10-15nm之间。因此，图4B所示数据表明纳米粒子探针检测到EGFR极有可能为复合物形式。在检测第二步中，在检测溶液中加入一种多克隆抗-Stat3或抗-Scr，纳米粒子的体积再次增加30-35nm；而加入同型对照家兔IgG和抗-EGFR引起的纳米粒子体积增加幅度要小得多(图4C)。加入抗-Stat3和抗-Src后引起相当的体积增加表明Stat3和Src是EGFR复合物中的结合对象。加入抗-EGFR探针时检测溶液中体积增加幅度小是因为复合物中Stat3和Src屏蔽了抗-EGFR与纳米粒子-结合EGFR蛋白质结合的位点。EGFR/Stat3/Src复合物得到了免疫印迹后免疫共沉淀和和激光共聚焦扫描显微镜分析的进一步确认。

免疫共沉淀被视作生物样品源性蛋白质复合物检测的金标准。但是，此类分析需要相当大量的样品(100s μL)，并且分析过程需要数小时到数天才能完成。SPR技术每次分析也需要10s-100sμL样品。相比之下，我们的新检测方法只需要1-2μL溶解产物样品，且几分钟就能取得结果。更为重要的是，免疫共沉淀、荧光技术和SPR均不能体现EGFR-Stat3-Scr复合物的大小信息。该信息对于蛋白质复合物的分析尤其有帮助：它给出了一个蛋白质复合物存在的第一份证据，并且能够进一步展示一个蛋白质复合物中涉及有多少个结合对象。根据目前所获得的检测结果，我们认为该复合物仅涉及EGFR、Stat3和Src，因为根据各蛋白质的体积约为35nm，这种由三重成分组成的复合物的估计流体直径与检测观察直径相符。

2.蛋白质聚集检测和定量分析

蛋白质聚集形成时生物制药发展中一个显著和棘手的问题。要将蛋白质用作治疗药物，需要将其制成高浓度溶液剂型。遗憾的是，许多蛋白质在高浓度下都趋于聚集。蛋白质一旦聚集，可能因改变药物的药代动力学或诱导意外免疫原性，造成明显的不良作用。蛋白质聚集也与多种疾病密切相关，例如克雅氏病(CJD)中朊蛋白聚集和阿尔兹海默病中发现的淀粉样β蛋白质聚集。但是，目前直接检测和分析蛋白质聚集的技术极为有限，尤其是要检测来自复合物生物样品和存在非靶标蛋白质-生物分子和其它胶体粒子液体的蛋白质聚集。其中一种广泛使用的方法是荧光技术。荧光探针通过共价键与靶蛋白相结合。蛋白质聚集后，荧光探针分子也会聚集，导致荧光信号变化。荧光技术一大显著的劣势是需要对目标分子做一个荧光标记。其它常用的蛋白聚集检测技术包括体积排除色谱法(SEC)和分析超速离心法。这些技术只适用于纯蛋白质溶液研究，不适合检测直接来自真正的生物样品的蛋白聚合和复合物。

我们已经证明，第二个实施例(图2)所示的新检测方法可以用作蛋白质聚集高度敏感检测的无标签技术。在瑞利散射中，散射光的强度与粒子半径(I∝R⁶)的六次方成正比。如果蛋白质复合或聚集后在样品溶液中的体积分布不均匀，这些复合物/聚合体将形成大量的纳米粒子簇，如图5A所示。来自大的AuNP簇的散射光强度比单独的AuNP强上千至成百万倍(DLS对个体AuNP的检出限已经可以达到pM-aM范围)。通过放大AuNP探针，可以达到极高的蛋白质聚集检测灵敏度。图5B-D所示结果来自我们对酶GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶，一种免疫分析常规使用的载入对照蛋白)的研究。从分析中我们发现，这种蛋白质具有很强的倾向，形成浓度在10-25μg/mL左右的大聚团。蛋白质聚集形成导致纳米粒子体积在这一浓度附近非线性和异常增加(图5B)，并显著增宽或使体积分布曲线峰分裂(比较图5D和图5C)。

此外，通过使用这种新的检测方法，我们发现一种癌生物标记蛋白，前列腺酸性磷酸酶(PAP)，在癌症组织比在正常和良性前列腺增生(BPH)组织中更多地以生物分子复合物的形式存在。该检测使用一种抗-PAP的抗体与AuNP相结合，制备纳米粒子免疫探针。如图6A所示，来自前列腺癌组织裂解分析液的粒子大小分布曲线实质上比BPH样品更宽，并且有明显量的大纳米粒子簇出现在数百100nm尺寸范围内。如此广泛的粒子体积分布和大型纳米粒子簇外观可以解释为存在大型生物分子复合物或聚合体形式的PAP蛋白。使用分散指数(PdI)可以定量表示粒子体积分布曲线的增宽水平。如图6B所示，获取自前列腺癌组织裂解检测溶液的PdI明显高于正常前列腺和BPH组织裂解液的检测溶液。有趣的是，BPH组织裂解检测溶液表现出比正常组织裂解液更窄的粒子体积分布，说明相比前列腺癌，BPH涉及不同的分子机制。此外，据显示，Gleason评分较高的更晚期前列腺癌将导致更高PAP蛋白符合水平。据我们所知，这是第一次在生物样品中发现此类分子特性差异及其与生物系统癌症状态之间的潜在关联性。

3.血清蛋白和蛋白复合物的检测和诊断特征描述

采用图3所示的第三个实施例，我们发现来自患有或未患有前列腺癌的小鼠模型和人类献血者血清样品之间存在一些非常有趣和值得关注的分子差异。前列腺癌是男性中最普遍的癌症类型之一。据估计，在2010年，将分别有217,730和32,050名男性被诊断和死于前列腺癌。虽然已经付出了巨大的研究努力，开展了大量的实验，由于多种复杂的因素，前列腺癌的早期发现和诊断在医学上仍然是一个巨大的挑战。PSA测试主要测量血液中前列腺特异性抗原的水平，近二十年前来在美国广泛应用于前列腺癌的初步筛查。但是，最近的几项研究导致了对PSA检测功效的严重怀疑。对低风险前列腺癌的过度诊断和治疗会引起严重和持久的副作用：接受根治性前列腺切除术治疗的患者中有33％患有勃起功能障碍，且伟哥等药物治疗无效。新的生物标记和测试方法能够可靠地区分前列腺癌和良性状况，生长缓慢的肿瘤和高风险癌症，因此对于前列腺癌的诊断和治疗有着巨大价值。

本研究使用了三个小鼠模型：一种是经原位注射快速生长前列腺癌细胞株PC3；一种注射生长缓慢的肿瘤细胞柱LnCaP；而第三组小鼠则只注射PBS生理盐水溶液作为对照。图7是小鼠血清样品的分析结果。首先，从血清中吸附到AuNP上的蛋白质或蛋白质复合物的“体积”存在显著差异(图7A)。来自带有大的和快速增长的PC3细胞肿瘤小鼠中的粒径在相当程度上小于正常健康小鼠和带有小的和生长缓慢的LnCaP细胞肿瘤的小鼠。将血清样品稀释10倍后进行检测，所报告的血清蛋白吸附结果显示，所有的样品表现出类似的粒径增加水平，均为15-18nm。

发明者之后根据图3所示检测流程分析了两种靶蛋白：一个是丰富的蛋白质，小鼠IgG，另一个是一种众所周知的肿瘤标志物蛋白，血管内皮生长因子(VEGF)。这两项检测也发现了一些值得关注的差异。在IgG检测中，带有LnCaP细胞生长得到的小肿瘤的小鼠IgG水平高于其它两组(图7B)。在VEGF检测中，正常健康小鼠AuNP-吸附VEGF水平明显高于前列腺癌患鼠(图7C)。受小鼠模型研究观察所得结果启发，我们研究了来自前列腺癌受试者的人血清样本。我们研究了三组人血清样本：正常健康献血者；诊断为良性前列腺增生(BPH)患者；和诊断为前列腺癌的患者(T1c至T3b期)。从VEGF检测中观察到癌症与非癌症样品之间具有相同的差异(正常献血者和BPH患者)(图8)：非癌症样品AuNP-吸附VEGF水平高于前列腺癌样本。对检测数据进行T-检验分析，稀释和未稀释的人血清样品p-值均为0.001，提示癌症和非癌症的样品之间的差异具有统计学显著性意义。此外，检测结果发现，AuNP-吸附VEGF水平也呈癌症阶段依赖性：较晚期前列腺癌相比早期前列腺癌VEGF水平更低。早期前列腺癌，如T1c期，显示出与健康献血者相类似的VEGF水平。总之，小鼠模型和人类献血者样本分析表明，AuNP-吸附VEGF的量在癌症血清样品中有所下降。这一发现可能会催生前列腺癌的检测精度较高的新血液测试方法。此外，经该检测方法筛查其它蛋白质或生物分子靶标，预期可以发现癌症和其它人类疾病特异性的其它蛋白质或生物分子标志物。我们在最近的工作中制定了这种新的检测方法，可作为发现血清蛋白生物标志物的一般性工具。

4.使用生物分子复合物作为诊断应用的生物标志物

目前已确定有几种类型的生物标志物可用于前列腺癌的检测和诊断，特别是鉴别前列腺癌和非恶性情况，如BPH：(1)组织和体液中PAP蛋白复合水平上升的组织和体液中的蛋白质水平；(2)血液样品中VEGF蛋白下降。该VEGF蛋白是指通过与血清中存在的其它蛋白或生物分子复合而吸附到纳米粒子上的VEGF蛋白；(3)生物样品中的生物分子非特异性吸附到纳米粒子上，于纳米粒子表面形成的生物分子日冕的体积。

对生物标记物的权利要求可以扩展到其它疾病和状况的检查和诊断：(1)生物样品中的生物分子非特异性吸附到纳米粒子上，于纳米粒子表面形成的生物分子日冕的体积；(2)生物样品中的生物分子特异性地与诱饵分子结合-纳米粒子相结合，于纳米粒子表面形成的生物分子日冕的体积；(3)生物样品中生物分子与患病和未患病样品之间存在显著差异的纳米粒子发生非特异性吸附或特异性结合后，纳米分子表面形成的生物分子日冕上个体生物分子组分或生物分子复合物。

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需要注意的是，所有专利、专利申请、专利出版物、技术出版物、科学出版物以及本文参考的其它参考文献均通过完整引用整合，包括与此处所教授内容不同之处。

引用特定的缓冲液、介质、试剂、细胞、培养条件以及类似内容，抑或相同的一些子类，并不受任何限制，而是应理解为包括所有此类相关的材料，本领域任何一名普通的工艺员均能识别其为本讨论所涉及对象或者在特定前提下具有价值。例如，通常可以将缓冲系统或培养基更换成其它，比如某种虽然不同的方法，但是对于在指导下使用建议方法、材料或成分的来说，却已知可以用于实现相同的目的。

在理解本发明时，重要的是应注意，此处使用的所有技术和科学术语，除非经本文定义，则与本领域普通工艺员通常所理解的含义相同。除非另行说明，本发明所采用的技术也与本领域普通工艺员所掌握的相同。为了便于更加清楚地理解本文所公布的发明和权利要求的内容，特给出以下定义。

本文中展示和描述了大量本发明实施例，但是此类实施例仅作为例子提供，并不表示存在任何限制。本领域技术人员可以进行各种变更、改动和替换，但是本质上均不会超出该发明范围。例如，本发明不必局限于本文所公开的最佳模式，因此其它应用同样可以从本发明所教授内容中受益于。此外，在权利要求中，方法加功能和步骤加功能条款分别用于阐述结构和行为，本文中描述成开展所列举的功能，不仅是结构等同或行为等同，而且还分别包括等同的结构或等同行为。因此，所有此类修订均包括在下述权利要求根据相关法律按照其解读所定义的本发明范围内。

Claims (27)

1.一种用于检测在生物样品中的目标分子的方法，所述方法包括，使用一种第一种纳米粒子探针与一种生物样品接触，获得一种第一种检测产物，所述第一种纳米粒子探针包括一种与第一种诱饵分子相结合的纳米粒子，诱饵分子特异于一种第一种感兴趣的目标分子；以及检测是否存在与所述第一种感兴趣的目标分子相结合的纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括对所述第一种检测产物进行粒子分析。

3.根据权利要求2所述的方法，其中粒子分析包括确定粒子体积变化、平均粒子体积变化、粒子体积分布变化、体积分布的多分散性变化或测量与测量之间的粒子体积变化，或以上的组合。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述粒子分析是通过动态光散射分析实现。

5.根据权利要求2所述的方法，其中粒子分析包括测定粒子体积随纳米粒子探针-样品培养时间或随首次靶分子浓度变化，用于获得第一个诱饵子和第一个靶分子之间的结合常数或结合能量。

6.根据权利要求5所述的方法，其中结合常数或结合能通过将结合数据拟合到Langmuir吸附模型中得到。

7.根据权利要求2所述的方法，还包括确定第一个目标分子是否是基于粒子分析的单体或生物分子复合物。

8.根据权利要求7所述的方法，还包括确定生物分子复合物的数量，数量是基于粒子分析的绝对或相对量；或基于粒子分析确定生物分子复合物的大小。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子是一种生物分子复合物。

10.根据权利要求8所述的方法，还包括利用生物分子复合物的量来分析一个生物过程，或用于疾病的检测、诊断和/或预后；或利用生物分子复合物的大小来分析一个生物过程，或用于经的检测、诊断和/或预后。

11.根据权利要求7所述的方法，其中所述的生物分子复合物是一种PAP复合物(前列腺酸性磷酸酶)。

12.根据权利要求10所述的方法，其中疾病为癌症。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物分子复合物包括至少一个第一种生物分子或与至少一个其它生物分子相关联的第一种生物分子亚单元。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的至少一个其它生物分子与第一种生物分子或第一种生物分子亚单元相同。

15.根据权利要求1所述的方法，还包括将第一种检测产物与特异于一种第二种感兴趣目标分子的第二种诱饵分子接触，从而产生一种第二种检测产物，并测定所述第二种检测产物中是否存在所述第二种感兴趣靶分子。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述检测包括对所述第二种检测产物进行粒子分析。

17.一个用于测定生物样品中的靶分子的方法，所述方法包括(a)通过使第一种生物样品与一种第一种纳米粒子探针接触，获得一种第一种检测产物，所述第一种纳米粒子探针包括一种与特异于一种第一种感兴趣的靶分子的一种第一种诱饵分子的纳米粒子；(b)使所述第一种检测产物与一种第二种纳米粒子探针反应，该粒子包括一种特异于一种第二种感兴趣靶分子的第二种诱饵分子，产生一种第二种检测产物；及(c)测定所述第二种检测产物中是否存在于所述第二种感兴趣靶分子相结合的第二种纳米粒子探针；和

18.根据权利要求17所述的方法，还包括测定(c)步骤之前所述第一种检测产物中是否存在与所述第一种感兴趣靶分子相结合的第一种纳米粒子探针。

19.一种测定生物样品中的至少一种生物分子的方法，所述方法包括使一种生物样品与纳米粒子接触，获得一种第一种检测产物，其中所述接触在纳米粒子表面形成一种生物分子日冕，并对第一种检测产物行粒子分析；并且还包括(一)使用生物分子日冕体积信息进行疾病的检测、诊断和/或预后，或(二)将所述第一种检测产物与特异性结合于感兴趣靶分子的诱饵分子接触，形成第二种检测产物，并通过粒子分析是否存在感兴趣靶分子和/或其数量。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述分析包括生物分子日冕的体积分析。

21.根据权利要求19所述的方法，其中患病生物样品的生物分子日冕体积与未患病生物样品不同。

22.根据权利要求19所述的方法，还包括将粒子分析信息与疾病状态相关联。

23.根据权利要求19所述的方法，其中粒子分子检测诱饵分子与生物分子日冕中靶分子相结合所致的粒子体积变化。

24.根据权利要求19所述的方法，还包括将存在靶分子和/或其数量与感兴趣疾病状态相关联，并且优选将所述关联用于疾病的检测、诊断和/或预后。

25.根据权利要求19所述的方法，其中疾病为癌症。

26.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶分子为血管内皮生长因子(VEGF)。

27.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一种诱饵分子和所述第二种诱饵分子相同。

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