连续梯度混合装置及其混合方法
技术领域:
本发明涉及一种生物领域的聚丙烯酰胺梯度凝胶的灌制生产混合装置,尤其涉及一种生产聚丙烯酰胺梯度凝胶及实验室灌制梯度凝胶的连续梯度混合装置及其混合方法。
背景技术:
梯度凝胶电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶,但不是在单一浓度(孔径)的凝胶上进行,而是形成梯度凝胶。从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化,如通常顶部凝胶浓度为5%,底部凝胶浓度为25%。
凝胶梯度是通过专用的梯度混合装置形成的,高浓度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中,而后溶液浓度呈梯度下降,因此在凝胶的顶部孔径较大,而在凝胶的底部孔径较小。梯度凝胶电泳也通常加入SDS(十二烷基硫酸钠),并有浓缩胶。电泳过程与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳基本类似。与单一浓度的凝胶相比,梯度凝胶有几个优点:
①首先,梯度凝胶比单一浓度凝胶的分离范围更宽,可以同时分离较大范围分子量的蛋白质。单一凝胶电泳对于分子量超过其分离范围的蛋白质,过大或过小,都不能分离。而梯度凝胶孔径范围比单一凝胶大,分子量较大的蛋白质可以在凝胶顶部大孔径部分得到分离,而分子量较小的蛋白质可以在凝胶底部小孔径部分得到分离,所以分子量较大和较小的蛋白质可以同时得到分离。例如用4%~30%的梯度胶可以分离分子量5万~200万的蛋白质。
②另一个优点是梯度凝胶可以分辨分子量相差较小、在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。电泳过程中,蛋白质在梯度凝胶中迁移,经过的孔径越来越小,直到凝胶的孔径不能通透,这样电泳过程中蛋白质就被浓缩,集中在一个很窄的区带中。而分子量略小的蛋白质可以迁移得更靠前一些,被集中在略前面的区带中。由于梯度凝胶孔径逐步变小,在蛋白质不能通透的孔径附近对蛋白有浓缩作用,所以电泳后形成很窄的区带,可以分辨出分子量相差较小的蛋白质。对于太稀的样品,在电泳过程中可以将样品分几次加样,大小不同的蛋白质分子最终都会滞留在其相应的凝胶孔径中而得到分离。
③可以直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解离为亚基,因此这一方法可以与SDS-PAGE测定分子量的方法互为补充。
梯度凝胶电泳主要适用于测定球蛋白的分子量,而对纤维蛋白将产生较大的误差。由于分子量的测定必须是在未知和标准蛋白质分子到达完全被阻止迁移的孔径时才能成立,因此电泳时要使用较高的电压,例如平板凝胶为0.5mm厚,使用600V电压,50mA电流,电泳时间约需2小时。
基于梯度凝胶相对于单一凝胶的优点,因此业内通常会采用专用的梯度混合装置来混合凝胶,通常采用的梯度混合装置可以参考申请名称为“梯度混合装置”的中国发明专利(申请号为200720062797.3),结合附图1,可以看出该专利公开了一种梯度混合装置,主体部分为有机玻璃混合器杯体,由带支撑足2的杯座1、A杯3和B杯4两个杯腔组成,支撑足2既起支撑作用又可以实现对梯度混合仪杯体局部高度的调节;杯间通道8上带有血管夹5,杯间通道8采用一次性输液管,易于清洗且更换方便;杯座上1带有长条形水平仪6,操作前用于检查杯座是否水平;B杯4内放有磁力搅拌棒7;蠕动泵9用于控制混合速度并将混合后的梯度凝胶泵至制胶板10。
具体操作时,先通过调节四个支撑足2的高度实现梯度混合仪杯体的水平,用血管夹5夹住杯间通道后同时向A杯3和B杯4中分别倒入配制好的稀胶溶液和浓胶溶液,松开血管夹5的同时开启蠕动泵9,混合后的胶液将通过蠕动泵9泵至制胶板10,这个混合过程依靠磁力搅拌棒7的作用混匀,混匀好的液体通过蠕动泵9流出,这样流出的液体从开始至结束浓度会呈梯度变化。它主要是利用重力作用使两种不同的液体进入同一个容器,再在机械搅拌的作用下混匀,这种方法的弊端在于液体在B杯中的混合不是完全线性的,混匀效果不够理想,得到的曲线如附图2上中偏离理论的曲线。因此本领域迫切希望能够提供一种能够混合曲线线性,混合效果均匀连续的连续梯度混合装置以及相应的混合方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种连续梯度混合装置,利用流体力学的基本原理使得液体在容器中即时混匀,混合效果均匀连续,为规模化的生产提供可靠的保障。
本发明的另一目的在于提供一种通过该连续梯度混合装置进行梯度混合的方法。
本发明是这样实现的:
一种连续梯度混合装置,包括盛放低浓度溶液的第一容器、盛放高浓度溶液的第二容器,盛放梯度混合液的第三容器,还包括设置有第一活塞的第一活塞缸体、设置有第二活塞的第二活塞缸体,所述第一活塞缸体的底端设置有一伸入到所述第一容器中的连通管道,所述第二活塞缸体的底端也设置有一伸入到所述第二容器中的连通管道以及一连通到所述第三容器的连通管道;所述连通管道上分别设有第一阀门、第二阀门、第三阀门;
所述第一活塞缸体与所述第二活塞缸体通过一单向连通管道导通,所述单向连通管道包括管道进口与管道出口以及设置在管道上的第四阀门,所述管道出口与垂直方向的夹角为0度~80度;所述第一阀门、第二阀门、第三阀门、第四阀门为单向阀。
本专利通过将第一活塞缸体中的低浓度溶液A流入到盛放高浓度溶液B的第二活塞缸体中并进行混合后流入到第三容器中从而实现梯度混合。相比较于现有技术而言,本专利采用活塞抽吸加压的方式来为低浓度溶液A与高浓度溶液B的混合提供动力,具体而言,第一活塞缸体与第一活塞以及延伸出来的连通管道就如同一个注射器,同理第二活塞缸体与第二活塞以及延伸出来的连通管道也如同一个注射器,当向上拉动活塞时,活塞缸体内产生瞬时负压,从而将容器中盛放的低浓度以及高浓度溶液B分别吸入到第一、第二活塞缸体中,当向下压迫活塞时,活塞缸体中产生瞬时高压,由于连通管道是单向的,这样第一活塞缸体中的低浓度溶液只能沿着单向连通管道流入到第二活塞缸体中与其中的高浓度溶液B混合,同时混合后的液体形成梯度混合流入到第三容器中。
进一步优选地,所述第一活塞与所述第二活塞通过一活塞支架固定连接,所述活塞支架上设置一活塞推杆。
本专利中第一活塞与第二活塞可以通过一个活塞支架固定后通过一个活塞推杆进行推拉,这样两个活塞相当于同进同出,便于控制。
进一步优选地,所述第一活塞上设有第一活塞推杆,所示第二活塞上设有第二活塞推杆。
本专利中的第一活塞与第二活塞也可以单独进行推拉控制。
进一步优选地,所述管道进口垂直插入在所述第一活塞上,所述管道出口插入到所述第二活塞上并与垂直方向的夹角为10-80度。
本专利中,可以将管道出口垂直插入到第二活塞上,也可以使管道出口与垂直方向呈一定的夹角。通过将管道出口与垂直方向设置为10-80度夹角,可以使得第一活塞缸体中的低浓度溶液A以一定角度进入到第二活塞缸体中后能够最快速的与其中的高浓度溶液B进行充分混合,并混合的更为均匀,而这是管道出口垂直插入到第二活塞上所无法做到的。
进一步优选地,所述管道进口与所述管道出口均为毛细管。
采用本专利的连续梯度混合装置进行梯度混合的方法如下:
(1)在第一容器中放入低浓度溶液,在第二容器中放入高浓度溶液;
(2)向上拉动活塞推杆,分别将第一容器中的低浓度溶液抽吸到第一活塞缸体中,第二容器中的高浓度溶液抽吸到第二活塞缸体中;
(3)向下压动活塞推杆,将第一活塞缸体中的低浓度溶液通过单向连通管道以一定角度流入到第二活塞缸体中与第二活塞缸体中的高浓度溶液混合,同时第二活塞缸体中的混合液体流入到第三容器中形成梯度混合溶液。
基于活塞推杆的设置不同,还可以有如下混合方法:
(1)在第一容器中放入低浓度溶液,在第二容器中放入高浓度溶液;
(2)向上分别同时拉动第一活塞推杆和第二活塞推杆,分别将第一容器中的低浓度溶液抽吸到第一活塞缸体中,第二容器中的高浓度溶液抽吸到第二活塞缸体中;
(3)向下分别同时压动第一活塞推杆和第二活塞推杆,将第一活塞缸体中的低浓度溶液通过单向连通管道以一定角度流入到第二活塞缸体中与第二活塞缸体中的高浓度溶液混合,同时第二活塞缸体中的混合液体流入到第三容器中形成梯度混合溶液。
本专利运用流体力学原理,使两种液体(低浓度溶液与高浓度溶液)在一个密闭空间(即第二活塞缸体)中实现连续的混合,并且浓度随时间连续线性变化。另外本专利采用了活塞推拉的方法代替传统技术中通过重力压迫液体移动的方法,提高了液体混合的效率和可靠性。
附图说明
图1为现有技术中梯度混合器的结构示意图。
图2为现有技术中梯度混合器中混合液体的混合曲线图。
图3为本发明实施例1的连续梯度混合器的结构示意图。
图4为本发明实施例2的连续梯度混合器的结构示意图。
图5为本发明实施例1的梯度混合器中混合液体的混合曲线图。
图6为采用现有技术中的梯度混合器灌制的预制胶样品图;
图7为采用本发明的梯度混合器灌制的预制胶样品图。
具体实施方式:
为进一步说明本专利的技术内容,现通过具体实施方式对本专利进行说明:
实施例1:如图3所示,一种连续梯度混合装置,包括盛放低浓度溶液AA的第一容器21、盛放高浓度溶液BB的第二容器22,盛放梯度混合液的第三容器28,设置有第一活塞33的第一活塞缸体31、设置有第二活塞34的第二活塞缸体32,第一活塞缸体31的底端设置有一伸入到第一容器21中的连通管道23,第二活塞缸体32的底端也设置有一伸入到第二容器22中的连通管道24以及一连通到第三容器28的连通管道29;连通管道23、24、29上均设有第一阀门25、第二阀门26、第三阀门27;第一阀门25、第二阀门26、第三阀门27均为单向阀。
第一活塞缸体31与第二活塞缸体32通过一单向连通管道37导通,单向连通管道37包括管道进口35与管道出口36以及第四阀门38,管道进口35与管道出口36均为毛细管,管道进口35垂直插入在第一活塞33上,管道出口36与垂直方向呈一角度C,夹角C为0度~80度,当夹角C为0度时,即管道出口36垂直于第二活塞34,当夹角C大于0度并小于80度时,管道出口36与垂直方向呈一锐角,在实际操作中,10度~80度,更优的,30度~70度可以使得低浓度溶液A与高浓度溶液B更能快速均匀混合。第一活塞33与第二活塞34通过一活塞支架4固定连接,活塞支架4上设置一活塞推杆39,这样两个活塞相当于同进同出,便于控制。
具体混合方法为:
首先在第一容器21中放入低浓度溶液A,在第二容器22中放入高浓度溶液B;
向上提拉活塞推杆39,此时由于第一阀门25、第二阀门26、第三阀门29与第四阀门38均为单向阀,所以第一阀门25、第二阀门26导通,第三阀门29与第四阀门38关闭,当活塞推杆39上行时,分别将第一容器21中的低浓度溶液A抽吸到第一活塞缸体31中,第二容器22中的高浓度溶液B抽吸到第二活塞缸体32中;
到达预定量后,向下压动活塞推杆39,此时,第一阀门25、第二阀门26关闭,第三阀门29与第四阀门38导通,第一活塞缸体31中的低浓度溶液A通过单向连通管道37以一定角度流入到第二活塞缸体32中与第二活塞缸体32中的高浓度溶液B混合,同时第二活塞缸体32中的混合液体流入到第三容器28中形成梯度混合溶液,在第三容器28中混合液体的浓度呈高到低的线性变化,这种线性变化可以参考附图5中混合曲线示意图。
目前本专利装置主要应用于蛋白分离纯化梯度胶的灌胶装置。为了对比本专利装置与现有装置的区别,我们分别提供了图6与图7的样品对比图(样品为NEB protein Marker)。图6为采用现有技术中的梯度混合器灌制的预制胶样品图;图7为采用本发明的梯度混合器灌制的预制胶样品图。从图6、图7对比比较可以看出:现有的梯度混合装置混合后灌制的胶,条带整体偏下,大分子间距离过大,小分子距离偏小。而本专利的梯度混合器灌制的胶,条带分布均匀,条带之间的距离均匀,分辨率高于现有的梯度混合装置混合后灌制的胶。
实施例2:如图4所示,不同于实施例1之处在于第一活塞33上设有第一活塞推杆41,第二活塞34上设有第二活塞推杆42。第一活塞33通过第一活塞推杆41进行单独推拉控制,第二活塞34通过第二活塞推杆42单独进行推拉控制。
由于活塞推杆的设置不同,因此具体混合方法为:
首先在第一容器21中放入低浓度溶液A,在第二容器22中放入高浓度溶液B;
其次向上分别同时拉动第一活塞推杆41和第二活塞推杆42,此时,第一阀门25与第二阀门26导通,第三阀门27与第四阀门38关闭,分别将第一容器21中的低浓度溶液A抽吸到第一活塞缸体31中,第二容器22中的高浓度溶液B抽吸到第二活塞缸体32中;
然后,向下分别同时压动第一活塞推杆41和第二活塞推杆42,此时第一阀门25与第二阀门26关闭,第三阀门27与第四阀门38导通,第一活塞缸体31中的低浓度溶液A通过单向连通管道37以一定角度流入到第二活塞缸体32中与第二活塞缸体32中的高浓度溶液B混合,同时第二活塞缸体32中的混合液体流入到第三容器28中形成梯度混合溶液。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。