CN102716206B - 温经通络方在制备防治奥沙利铂致周围神经毒性副作用药物中的应用 - Google Patents
温经通络方在制备防治奥沙利铂致周围神经毒性副作用药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
奥沙利铂是第3代铂类抗肿瘤药物，目前为胃肠道肿瘤化疗方案的基础用药。奥沙利铂有着高效、低毒的特性，受到临床医生青睐。但该药有一定的副作用，其治疗中所产生的外周感觉神经毒较为明显，可累及感觉神经末梢，故限制了奥沙利铂临床疗效的进一步发挥。累积用药剂量越多，感觉障碍持续时间越长，故严重的神经毒性反应常常使患者面临减低化疗药物剂量甚至停药的困境，同时对患者的心理、生理和生活质量都可能产生损害。因此如何预防和减轻OXA的神经毒性已引起广泛关注。本发明将温经通络方用于治疗奥沙利铂致周围神经毒性副作用，本发明温经通络方的原料药组成按重量比为当归1200份、桂枝1000份、细辛500份、芍药900份、地龙1500份、甘草600份。
Description
【技术领域】
本发明属于运用传统中药经方来治疗和减轻西药尤其是抗肿瘤化疗药物的毒副作用，具体为预防和减轻胃肠道肿瘤常用化疗药物奥沙利铂神经毒性。
【背景技术】
奥沙利铂（oxaliplatin，OXA）是第3代铂类抗肿瘤药物，继顺铂、卡铂之后，目前作为胃肠道肿瘤化疗方案的基础用药之一。奥沙利铂有着高效、低毒的特性，受到临床医生的青睐。但该药有一定的副作用，主要靶器官在骨髓、外周神经及胃肠道。其治疗中所产生的外周感觉神经毒（Chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN）较为明显，可累及感觉神经末梢，故限制了奥沙利铂临床疗效的进一步发挥。初始时主要表现为肢体感觉障碍持续不退，随后可出现震荡感受降低、本体感受迟钝、精细分辨力减退、书写及扣钮扣等精细动作有困难等表现。但其与急性神经毒性不同，症状在冷刺激后不会加重。累积用药剂量越多，感觉障碍持续时间越长，故严重的神经毒性反应常常使患者面临减低化疗药物剂量甚至停药的困境，同时对患者的心理、生理和生活质量都可能产生损害。因此如何预防和减轻OXA的神经毒性已引起广泛关注。
【发明内容】
本发明通过观察CIPN大鼠疼痛行为学变化、脊髓背角与背根神经节NR2B和pNF-H的表达，探讨温经通络方对奥沙利铂致CIPN的防治作用。
本发明采用的技术方案为：采用温经通络方来防治奥沙利铂致周围神经毒性副作用，温经通络方的原料药组成按重量比为当归1200份、桂枝1000份、细辛500份、芍药900份、地龙1500份、甘草600份。
选用52只成年WISTAR雌性大鼠随机分为五组，空白组、模型组、对照组、温经通络方低剂量组和高剂量组。预防性给药7天后，除空白组（n=8）第8天予以腹腔注射5%葡萄糖注射液5ml/kg外，其余4组(n=11)按照4mg/kg予以腹腔注射奥沙利铂，每周2次。同时空白组、模型组及对照组予0.9%NaCl溶液灌胃(1ml/次)，每日1次；温经通络方组予以温经通络方高低剂量煎剂(5ml/kg)灌胃，每日1次；对照组腹腔注射给药甲钴胺104ug/kg，每周两次；持续性给药至d50。每3日称体重，每日观察大鼠给药后反应、饮食、大便；每周MWT测定，热辐射仪对大鼠尾部热痛觉潜伏期的测定。D50解剖每组大鼠，取脊髓、L5背根神经节，用RT-PCR及Western-blot方法检测不同浓度温经通络方对L4-6脊髓NR2B蛋白表达情况的影响；用免疫组化方法观察不同浓度温经通络方对背根神经节（DRG）NF-H蛋白表达情况的影响。
【附图说明】。
图2-1 体重变化图表。
图2-2 大鼠机械性缩足阈值变化。
图2-3 热辐射甩尾反应时间。
图2-4 大鼠脊髓NR2B mRNA的相对表达量RQ。
图2-5 大鼠DRG pNF-H的表达：显微照片（A、B、C、D，100×）PNF-H的神经元胞体染色（↑），神经节神经纤维（←）。图A：空白组；图B：模型组；图C：低剂量组；图D：高剂量组。
图1 NR2B/NR1-NMDA受体的拓扑结构和调节位点。
【具体实施方式】。
实施例
1.实验材料
1.1 实验动物及分组
雌性WISTAR大鼠52只，体质量（190±10）g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物中心，并饲养于江苏省中医药研究所SPF级实验动物房。以随机数字法均分为空白组、模型组、对照组、温经通络方低剂量组和高剂量组共5组，正常组8只，其余每组11只。动物饲养于安静、通风和空气过滤系统的环境中，保持室温20-25℃，相对湿度40%-60%，自由进食和饮水。为保持动物昼夜生物节律，实验室每日8：00至20：00开灯，20：00至次日8：00熄灯。本实验严格按照国际疼痛学会(IASP)关于应用清醒动物进行疼痛实验研究纲要的要求实施和完成。
1.2 实验药物
温经通络方（当归12g、桂枝10g、细辛5g、芍药9g、地龙15g、甘草6g）成人处方生药量为61g(生药低剂量含量5.59g/ml，高剂量22.36g/ml），中药均购自江苏省中西医结合医院药房，4℃保存备用；奥沙利铂（艾恒）注射液，50mg，批号：11032111，江苏恒瑞医药股份有限公司；甲钴胺（弥可保）注射液，500ug：1ml，批号：110470A，海南斯达制药有限公司。
1.3 主要试剂及仪器
上下流引物RatNR2B-F、RatNR2B-R（购自上海英骏生物技术有限公司）；抗NMDAR2B(D15B3)Rabbit mAb抗体（购自Cell Signaling Technology公司）；抗p-NF-H(RT97)Mouse IgG抗体（购自Santa Cruz 公司）；Von frey hairs疼痛触觉测试套件（购自美国Stoelting公司）；Tail-Flick Analgesla Meter(购自Harvard公司，OMIC433，USA)。
2.实验方法
2.1 动物分组及奥沙利铂致CIPN模型建立
将52只健康雌性Wistar大鼠适应性喂养5天后称重，随机分为空白组(n=8)、模型组(n=11)、对照组(n=11)、温经通络方低剂量组(n=11)、高剂量组(n=11)。预防性给药7天后，参照Yuki Mihara[[i]]等的造模方法，除空白组第8天予以腹腔注射5%葡萄糖注射液5ml/kg外，其余4组按照4mg/kg予以腹腔注射奥沙利铂。将奥沙利铂200mg溶于50ml的5%葡萄糖溶液中，终浓度为4g/L，现配现用。腹腔注射给药奥沙利铂4mg/kg d8/9/15/16/22/23/29/30（根据实验动物与人的药物剂量换算方法，20 mg/kg 的大鼠应用剂量近似于的120mg/m2的人体应用剂量，与130mg/m2的奥沙利铂临床单药推荐剂量接近；实验组腹腔注射奥沙利铂30mg/kg，大于临床单药推荐剂量，近似180mg/m2的人体应用剂量)。
2.2 给药
空白组、模型组及对照组予0.9%NaCl溶液灌胃(1ml/次)，每日1次；温经通络方组予以温经通络方高低剂量煎剂(5ml/kg)灌胃，每日1次；对照组腹腔注射给药甲钴胺104ug/kg，每周两次；持续性给药至d50。大鼠每3日称体重，每日观察大鼠给药后反应、饮食、大便；每周MWT测定，热辐射仪对大鼠尾部热痛觉潜伏期的测定。
2.3 痛觉行为测试
机械性痛觉超敏：参照Chaplan等的方法，以机械性缩足阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)来评估小鼠的机械性痛觉超敏。方法是用von Frey纤维细丝(折力梯度分别为1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0g)以up—down法推算缩足阈值：将一有机玻璃箱(22×12×22)cm。置于金属筛网上，待大鼠在有机玻璃箱中适应15 min后处于静止时，用von Frey纤维细丝垂直刺激大鼠一侧后肢足底中部，持续时间≤4S，大鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。测定时首先从折力2.0g开始，当该力度的刺激不能引起阳性反应时，则给予相邻大一级力度的刺激；若出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激，如此连续进行，直至出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，每个折力的von Frey纤维细丝均连续测定5次，每次刺激间隔30S，5次当中有3次或3次以上的阳性反应视为有机械痛敏，最大力度为15g，大于此值时记为15g。折合成(4.08、4.17、4.31、4.56、4.74、4.93、5.07、5.18）计算统计。
辐射热测痛仪（tail-flick analgesia meter，Harvard公司，OMIC433，USA）：由24V、250W聚光灯泡制成，光线经外罩上的聚光漏斗集中照射于鼠尾，漏斗外口直径为3mm，测痛时外口紧贴鼠尾，当鼠尾产生突然抽搐时，即为甩尾反应阳性，借助秒表记录甩尾反应潜伏时间(以下简称痛阈) ，秒表记录最低限度为0.1 s。因各测痛部位之间痛阈无显著差异(P>0.05)，我们取尾尖部起始的2cm处测痛，反复测痛3次，取平均值。
2.4 免疫组织化学检测
2.4.1 脊根神经节取材和切片制备
D50天后，各组老鼠各取5只，心脏灌注200ml 4℃无菌生理盐水，然后用4%多聚甲醛100mL先快后慢灌注固定。取出L4-5背根神经节( dorsal root ganglia，DRG，因为L4-5 DRG是支配后肢初级感觉传入神经元聚集地之一) 并剥膜。L4-5DRG置于4%多聚甲醛中，4℃过夜后行脱水、浸蜡、包埋。DRG取横切面，厚度4um，37℃过夜，第2天60℃烘烤1h后， 行免疫组织化学步骤。
2.4.2 DRG pNF-H的免疫组织化学
连续切片中每隔5张取1张，每个标本取5张，严格按照试剂盒说明行非生物素二步法免疫组织化学检测pNF-H，滴加适当比例(1：100)稀释的抗p-NF-H Mouse IgG抗体，4℃过夜。加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。
2.4.3 pNF-H受体表达观察和分析
每只大鼠随机取5张切片，用Olympus显微系统观察，以胞浆内出现黄色或褐色颗粒为阳性细胞，可间接反映细胞NR2B蛋白表达水平。
2.5 RT-PCR
D50天后，各组老鼠各取6只，行脱椎处死，解剖，取出腰段脊髓( L2-4) 并剥除硬脊膜，分离后迅速移至-80℃冰箱保存。取100 mg 组织样本采用Trizol（Invitrogen US)法抽提RNA，1 ugRNA用于cDNA第一链的合成，第一链合成用maxima First strand cDNA synthesis 试剂盒（Fermentas， us)。按照 Maxima SYBR Green qPCR 试剂盒（Fermentas US) 配制20ul 反应体系，PCR引物序列如下：上流引物RatNR2B-F：TACGGGAGGGATAGGGC，下流引物RatNR2B-R：GCGAGGGAGGAGAAATG。PCR在ABI 7500 PCR仪上进行，反应程序如下：50℃ 预处理（2min），95℃预变性（10min），95℃变性（15s）和60℃退火（60s）共40循环。扩增结果采用ΔΔCT法进行分析。
2.6 WESTERN BLOT分析
取腰段脊髓( L2-4) 并剥除硬脊膜，冷RIPA裂解液冰上研磨5分钟，1000prm 4℃离心5分钟，吸取上清液。测每组蛋白样品浓度，加入上样缓冲液，将蛋白浓度调整相等，100℃煮5分钟，使蛋白完全变性。分别灌制分离胶和浓缩胶，根据待测蛋白分子量大小选择分离胶的浓度。样品在浓缩胶中用80V电压，然后改用100V电压在分离胶中分离，卸胶。PVDF膜在甲醇中浸泡15秒，在双蒸水中浸泡2分钟，并和滤纸一起在转膜缓冲液中浸泡5分钟；胶在转膜缓冲液中浸泡半小时后，按滤纸（两层）——胶——PVDF膜——滤纸（两层）的顺序放入转膜装置，排除气泡。100V转膜，根据蛋白分子量调整转膜时间，一般1.5小时。将膜放入含1% BSA的TBST中室温封闭2小时，用TBST洗去封闭液。一抗室温孵育2小时，TBST洗3次，每次5分钟。用和一抗对应的二抗室温孵育1小时，TBST洗3次，每次5分钟。将膜置于暗示曝光显影，对照Marker记录实验结果。
2.7 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件包进行数据统计学分析，多组间比较采用One-Way ANOVA方差分析，两组间比较用t检验，以P<0.05表示具有统计学意义，P<0.01表示具有显著性统计学意义。
3. 实验结果
3.1 体重变化测定
空白组体重随时间平稳上升，开始造模D8后其余各组与空白组相比差异有统计学意义（P<0.01），模型组与用药组差别有显著意义（P<0.05），D35之后，温经通络方组高低剂量组均体重上升，而模型组继续下降，有显著差别（P<0.01）。随药物浓度变化，各用药组之间有差异（P<0.01）。见表2-1，图2-1。
表2-1 大鼠体重变化表（g）(ˉx ±s)
| D1 | D8 | D14 | D21 | D28 | D35 | D43 | D49 | |
| 空白组(n=8) | 193.13±11.13 | 205.00±11.33 | 208.38±12.93 | 217.12±12.47 | 222.63±12.58 | 233.38±14.54 | 241.13±14.88 | 243.25±15.57 |
| 模型组(n=11) | 186.45±8.00 | 199.45±7.74 | 194.09±9.55* | 189.45±9.75* | 193.45±11.32 * | 192.64±11.84 * | 202.64±11.20 * | 197.09±13.23 * |
| 对照组(n=11) | 192.91±9.93 | 206.64±12.32 | 201.18±11.57 *△ | 192.91±11.65 *△ | 194.45±6.65*△ | 195.45±7.90*△ | 202.45±10.44 *△ | 206.82±11.84 *△△ |
| 低剂量组(n=8) | 187.00±8.11 | 199.25±8.56 | 199.25±10.01 *△ | 198.38±6.05*△ | 196.13±12.12 *△ | 199.38±10.99 *△ | 211.25±12.43 *△△ | 216.00±14.83 *△△ |
| 高剂量组(n=9) | 189.22±8.29 | 199.11±13.05 | 196.89±9.09*△ | 194.00±9.92*△ | 195.78±9.72*△ | 195.44±10.92 *△ | 206.22±9.55*△△ | 208.56±10.97 *△△ |
与空白组相比，*P<0.01；与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01；
3.2 机械性缩足阈值测量
空白组的机械性缩足阈值趋于稳定。开始造模D10后各组出现明显触诱发痛，表现为机械性缩足阈值与基础值和空白组相比明显下降( P<0.05)，其余各组与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05），D34前，用药组之间无显著差异（P>0.05），D34后，温经通络方组与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。见表2-2，图2-2。
表2-2 大鼠机械性缩足阈值变化(ˉx ±s)
| D1 | D10 | D13 | D20 | D27 | D34 | D42 | D48 | |
| 空白组(n=8) | 5.06±0.09 | 5.10±0.05 | 5.03±0.09 | 5.06±0.12 | 5.03±0.09 | 5.06±0.09 | 5.06±0.09 | 5.10±0.05 |
| 模型组(n=11) | 5.10±0.10 | 5.13±0.06 | 4.98±0.14 * | 4.78±0.16 * | 4.63±0.22 * | 4.52±0.21 * | 4.40±0.16 * | 4.32±0.14 * |
| 对照组(n=11) | 5.12±0.06 | 5.12±0.06 | 5.13±0.06△△ | 4.93±0.18△△ | 4.88±0.21△△ | 4.73±0.23△△ | 4.57±0.19△△ | 4.67±0.24△△ |
| 低剂量(n=8) | 5.09±0.09 | 5.12±0.09 | 5.13±0.06△ | 4.96±0.16△ | 4.92±0.24△ | 4.75±0.26△ | 4.78±0.22△⊿ | 4.90±0.23△⊿ |
| 高剂量(n=9) | 5.06±0.10 | 5.11±0.10 | 5.13±0.06△ | 4.98±0.12△ | 4.90±0.13△ | 4.75±0.25△ | 4.72±0.30△⊿ | 4.84±0.20△⊿ |
与空白组相比，*P<0.05；与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01；与对照组相比，⊿P<0.05
3.3 热辐射甩尾反应时间
空白组的热辐射甩尾反应时间趋于稳定。开始造模D10后模型组出现明显痛敏化，表现为热辐射甩尾反应时间较其他组基础值相比下降( P>0.05)，其余各组与模型组相比差异无统计学意义（P>0.05），用药过程中各组之间无显著差异（P>0.05），各组随用药时间变化热辐射甩尾反应时间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2-3，图2-3。
表2-3 热辐射甩尾反应时间（s）
| d11 | d13 | d20 | d27 | d34 | d42 | |
| 空白组 | 13.90188 | 12.445 | 12.67375 | 13.6975 | 13.8875 | 13.4475 |
| 模型组 | 12.292 | 11.9825 | 11.98818 | 12.78818 | 14.58727 | 11.04889 |
| 对照组 | 11.58682 | 13.15045 | 12.79909 | 13.301 | 12.69455 | 14.365 |
| 低剂量组 | 10.77125 | 14.395 | 13.565 | 14.42857 | 15.2175 | 13.1625 |
| 高剂量组 | 12.52813 | 13.98333 | 15.92 | 14.66667 | 13.1775 | 13.47444 |
3.4 NR2B mRNA的相对表达量
使用OXA后模型组NR2B的mRNA在大鼠脊髓中表达与空白组比较差异有统计学意义（P<0.01），对照组与模型组比较NR2B表达上调。温经通络方NR2B表达下调，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），随药物浓度变化，高剂量组较低剂量组NR2B表达上调。与大鼠机械性缩足阈值明显负相关。见表2-4，图2-5。
表2-4 不同剂量温经通络方防治奥沙利铂致CIPN的作用比较
| 组 别 | 动物数（只） | 相对定量RQ | RQ Min | RQ Max |
| 空白组 | 6 | 0.091 | 0.08 | 0.102 |
| 模型组 | 6 | 1 | 0.431 | 2.318 |
| 对照组 | 6 | 1.101 | 0.772 | 1.569 |
| 温经通络方低剂量组 | 6 | 0.068△ | 0.057 | 0.108 |
| 温经通络方高剂量组 | 6 | 0.087△ | 0.057 | 0.132 |
与模型组相比，*P<0.05，△P<0.01
RQ=2^-ΔΔCT
见图2-4 大鼠脊髓NR2B mRNA的相对表达量RQ。
3.5 DRG pNF-H的表达
显微镜下可见模型组pNF-H免疫反应阳性细胞或产物在DRGL4-5数量减少，用药组pNF-H免疫反应阳性细胞或产物在DRGL4-5数量增加，胞体肥大，染色加深，呈多角形或圆形。模型组与中药组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与大鼠机械性缩足阈值明显正相关。
4、讨论
化疗致周围神经病变(Chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN)是在化疗中非常常见的毒副反应，可致患者发生疼痛、麻木等不能耐受的症状而中断治疗，对其预后产生较大的影响。然而根据前人及导师的临床实践及大量研究显示无论是预防性还是对症治疗均未显示出有确切的疗效。新一代抗肿瘤铂类药物——奥沙利铂可用于多种肿瘤的治疗，且显示出较好的效果。但OXA所致的CIPN使某些患者不得不减低化疗药物的剂量甚至面临停药的困境，故针对CIPN寻找出有效的防治方法显得尤为紧迫和重要。目前临床上大多使用甲钴胺口服或注射治疗，但效果一般。有研究表明中医药治疗是一条可取的途径，效果良好，因此近年来越来越引起临床医生的重视。
4.1 温经通络方有效
从多个指标来看，温经通络方对OXA致CIPN有效。在造模结束后体重和痛觉行为测试提示各组之间差别不明显，故本实验在造模结束后连续多使用中药治疗两周，渐发现用药组与对照组区别明显。撤用OXA后，温经通络方组高低剂量组大鼠体重均上升，而模型组继续下降，有显著差别（P<0.01）。随药物浓度变化，各用药组之间有差异（P<0.01）。说明温经通络方对大鼠生活质量有影响，才致体重较单纯用OXA增多。使用OXA后，各用药组与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05），使用过程中用药组之间无显著差异（P>0.05），而撤用OXA后温经通络方组MWT值上升幅度较大，与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。在使用奥沙利铂化疗后，其NR2B受体表达量上升显著，而应用温经通络方治疗后，NR2B受体表达量下降明显，降至正常水平。在运用免疫组化法测定pNF-H蛋白表达时发现使用化疗后，可使其蛋白表达减少，温经通络方治疗后表达量增加。目前关于中药对CIPN大鼠模型的防治作用中临床研究较多，但实验研究鲜有报道，我们根据临床经验及辩证论治的结果选用了温经通络方这一经方进行研究，本实验结果示：在OXA致CIPN大鼠的脊髓背角和L4 DRG中NR2B mRNA表达均有增加，且与行为学的表现有明显的相关性，故本实验表明温经通络方对防治CIPN有确切的效果，为中药防治CIPN提供了实验依据。
4.2 NR2B和CIPN关系
本实验通过DRG和脊髓背角NR2B mRNA的表达水平观察中药对其的影响。DRG为痛觉传入的第一级神经元，脊髓背角是痛觉信号传入以及处理的初级中枢。背根神经节(dorsal root ganglion，DRG) 中的神经元有外周突和中枢突，外周突末梢直接接受伤害性刺激，可致持续兴奋性冲动，并通过Aδ纤维和C纤维传递至脊髓背角浅层的中枢突末梢，释放神经递质(如谷氨酸、天冬氨酸、SP和CGRP等)，谷氨酸结合到NMDA受体和AMPA受体，使中枢痛信息传递神经元的兴奋性增高，增强其敏感性，这一状态被称为中枢敏化。触诱发痛即是中枢敏化的结果。故NMDA受体参与脊髓神经元的兴奋性突触传递及中枢敏化等生理和病理过程，NR2B蛋白先由DRG合成，然后分布于脊髓背角浅层的突触前膜。由于Mg2+ 阻断了NMDA受体离子通道，只有AMPA受体被激活，AMPA受体持续激活使Na+ 流入细胞，导致膜的去极化，消除了Mg2+ 对通道的阻断，增加Ca2+ 通透性，大量进入细胞内的Ca2+ 激活了Ca2+ 依赖的PKC，PKC磷酸化NMDA受体，改变不同NMDA受体亚型的表达比例，同时使NMDA受体的沉默突触转化为有功能的突触。
多项研究表明，抑制NR2B亚基具有神经保护作用。疼痛刺激后NR2B的激活所致通道开放及受体转录、翻译及翻译后修饰等变化被认为参与了疼痛的中枢敏化。蛋白激酶C活化导致的蛋白磷酸化和酪氨酸激酶信号级联反应是调节NR2B功能的主要因素。Wilson等[[iv]]通过免疫印迹法和免疫组化法对NMDA受体亚基进行分析，结果发现神经损伤后大鼠脊髓背角NR2B亚基的表达明显增加。实验表明，NMDA受体的NR2B亚基局限于脊髓背角，选择性的NR2B拮抗剂能减轻神经源性疼痛，并且没有运动功能的损害。利用麦菌凝集素逆行追踪技术和NR2B免疫组化技术发现，70%的C纤维和Aδ纤维传入末梢可表达NR2B，表明突触前膜的NMDA受体以NR2B型为主，见图1。因此，推测NR2B在脊髓水平痛觉信息传递中可能起到重要作用，故我们在实验中选用此指标。推测其机制可能为化疗药物OXA造成的外周神经损伤，兴奋性氨基酸如P物质(SP)和谷氨酸在受损部位释放逐渐增强，外周感觉纤维把疼痛刺激传入到DRG，同时调控DRG神经元合成NR2B蛋白，致脊髓背角的NMDA受体激活，从而引起中枢敏化。本实验显示中药复方温经通络方对神经有一定的保护作用，我们给予温经通络方干预后，NR2B在脊髓的水平减少，疼痛中枢敏化激活降低，痛觉较前不敏感。故在临床上化疗期间患者使用温经通络方可使NR2B蛋白合成速度降低，减缓神经损伤。
4.3 pNF-H和CIPN的关系
脊髓中分布NF-H蛋白，即神经丝三联体重链蛋白，为神经丝组成成分之一。神经丝是神经组织中间丝的一种。哺乳动物的神经丝是由不同分子量的NF-H(200 000) 、NF-M(145 000) 和NF-L(68 000)组成，对神经元的抗张强度及分子和细胞器在轴突内转运起着关键作用。NF-L蛋白组成了神经丝排列骨架，NF-H分布在外周与NF-L骨架相连，可能为神经丝之间以及神经丝和微管之间辐射状横桥主要成分。NF-H主要分布在神经组织并由发育所调控，也有报道在神经外组织中发现了神经丝，例如培养的皮肤成纤维细胞、心肌传导纤维、人上皮样肉瘤、大鼠胰岛瘤、鸡红细胞、甲状腺上皮肿瘤细胞和肾小管外周基质细胞等。pNF-H与神经丝构建有关，可保护神经元细胞受损，故我们在实验中选用此指标。有研究表明，PNF-H的免疫反应停留在背根神经节神经纤维，本实验观察OXA致CIPN的DRG变化与神经元发育形态结构变化的关系，镜下见pNF-H免疫反应阳性细胞或产物，且中药组较模型组数量增加，显示中药复方温经通络方对神经有一定保护作用，在化疗期间可减缓NF-H蛋白破坏水平。温经通络方使OXA致CIPN的DRG中NF-H增多，示一定的保护神经细胞，并有促神经细胞修复作用。
通过本实验证实，临床上应用温经通络方对防治OXA致CIPN有较好的治疗效果，并可为临床工作提供实验依据，为CIPN的患者减轻痛楚，提高患者的耐受能力，使不能耐受奥沙利铂致CIPN的患者完成治疗，提高患者的生活质量，增加治疗效果。本发明的温经通络方不仅仅限于本说明书所记载的成分和比例，所有对本发明的温经通络方中药物成分采取相同性质中药的简单置换和对各组成成分比例的简单加减均落入本发明的保护范围。
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1.温经通络方在制备防治奥沙利铂致周围神经毒性副作用药物中的应用，其特征为该组合物原料药组成按重量比为当归1200份、桂枝1000份、细辛500份、芍药900份、地龙1500份、甘草600份。
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