CN102688247A - Nestorone在制备治疗帕金森氏病的药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种Nestorone（16-亚甲基-17α-乙酰氧基-19-失碳-孕甾-4-烯-3,20-二酮，Nes）在制备改善和治疗帕金森氏病的神经保护药物中的应用。本发明所制备的药物含有制剂允许的药物赋形剂或载体。药物的制剂形式包括液体制剂、颗粒剂、缓释剂、冲剂、片剂或胶丸。本发明在细胞层面上对Nestorone作为改善和治疗帕金森氏病的神经保护药物及其应用作了论证，与孕酮相比，本发明在改善和治疗帕金森氏病方面的疗效更强，且在神经系统的毒副作用更小。

Description

Nestorone在制备治疗帕金森氏病的药物用途

技术领域

本发明属于神经学和药理学领域，涉及Nestorone(16-亚甲基-17α-乙酰氧基-19-失碳-孕甾-4-烯-3，20-二酮，Nes)在制备治疗帕金森氏病的药物中的用途。

背景技术

帕金森氏病(Parkinson′s disease，PD)的发病率也呈上升趋势，是目前公认的第二大老年中枢神经系统退行性疾病。帕金森氏病的主要病理改变是中脑黑质致密部多巴胺(dopamine，DA)能神经元进行性变性和坏死，引起黑质-纹状体通路神经递质多巴胺水平显著降低。流行病学研究、病理学分析和生化鉴定表明95％的帕金森氏病是散发性、迟发性的[Tanner CM.Adv Neurol 2003，91：133-142]。另外病理学和神经放射学研究证明[TanseyMG，et al.Front Biosci 2008，13：709-717]帕金森氏病患者在明显的神经元丢失前若干年已有一定程度的神经变性改变。帕金森氏病患者中，男性比例多于女性；如果女性提早停经，帕金森氏病患病率会升高[Ragonese P，et al.Neurology 2004，62(11)：2010-2014]。

Nestorone(16-methylene-17-α-acetoxy-19 norpregn-4-ene，3，20-dioneo，Nes)(16-亚甲基-17α-乙酰氧基-19-失碳-孕甾-4-烯-3，20-二酮，Nes)是一种新型人工合成的19-去甲黄体酮衍生物，不与性激素结合球蛋白结合，对孕激素受体亲和力高，不与雌激素受体结合，对雄激素受体的作用可忽略，并且无糖皮质激素活性[Schindler AE，et al.Maturitas.2008；61(1-2)：171-180.]。Nestorone是目前国内外新投入使用的避孕药物，孕激素效应特异性更强，虽然Nestorone与孕酮的部分代谢通路相同，但Nestorone在不同脑区产生效应的差异更明显[Lenzi E，et al.J Steroid Biochem Mol Biol，2009；116(1-2)：15-20.]。抗卵巢水平的Nestorone水平不会改变雌激素对情绪和行为等的有益作用，并对抗海马神经元中的谷氨酸毒性[Liu L，et al.Endocrinology 2010；151(12)：5782-94.]，还剂量依赖性地促进神经髓鞘的形成[Ghoumari A，et al.40th Annual Meeting of the Society for Neuroscience，Chicago，IL，October20；2009.Abstract(640.11/R18).]。所以Nestorone对神经系统作用的特异性更强，引起的毒副作用可能会更小。但除本研究所外尚未见有关Nestorone与帕金森氏病的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种Nestorone(16-亚甲基-17α-乙酰氧基-19-失碳-孕甾-4-烯-3，20-二酮，Nes)在改善和治疗帕金森氏病的神经保护药物中的应用。主要是以1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)建立帕金森氏病小鼠模型，皮下注射Nestorone进行造模前预处理合并造模后干预，通过爬杆实验观测小鼠的行为学变化，用免疫组织化学法检测酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acdic protein，GFAP)的表达情况，用高效液相色谱-电化学检测(highperformance liquid chromatography-electrochemical detection，HPLC-ECD)法检测纹状体多巴胺的含量，酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测黑质肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。

本发明在细胞层面上对Nestorone作为改善和治疗帕金森氏病的神经保护药物及其应用作了论证。

本发明的有益之处：(1)与孕酮相比，Nestorone在改善和治疗帕金森氏病方面疗效更强。(2)与孕酮相比，Nestorone在神经系统的毒副作用更小。

附图说明

图1是帕金森氏病小鼠黑质多巴胺能神经元TH的表达。上排从左到右依次为Con、Mod、Veh组，下排从左到右依次为Pro L、Pro H、Nes L、Nes H组(×100)。

图2是帕金森氏病小鼠黑质星形胶质细胞GFAP的表达。上排从左到右依次为Con、Mod、Veh组，下排从左到右依次为Pro L、Pro H、Nes L、Nes H组(×100)。

具体实例方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。此外应理解，下面的优选具体实施方案仅仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：以MPTP建立帕金森氏病小鼠模型，皮下注射Nestorone进行造模前预处理合并造模后干预

84只C57小鼠，体重18g-25g，随机分为7组。正常对照组(Con)：每日两次皮下注射生理盐水(0.01ml·g^-1)共11d，第6d另外腹腔注射生理盐水(0.01ml·g^-1)4次；模型组(Mod)：每日两次皮下注射生理盐水(0.01ml·g^-1)共11d，第6d腹腔注射MPTP；溶剂组(Veh)：每日两次皮下注射10％乙醇(0.01ml·g^-1)共11d，第6d腹腔注射MPTP；Nestorone低剂量组(0.08mg·kg^-1·d^-1，Nes L)：每日两次皮下注射Nestorone 0.04mg·kg^-1共11d，第6d腹腔注射MPTP；Nestorone高剂量组(0.2mg·kg^-1·d^-1，Nes H)：每日两次皮下注射Nestorone0.1mg·kg^-1共11d，第6天腹腔注射MPTP。第6天11AM开始，除Con组腹腔注射生理盐水外，其余组均进行腹腔注射MPTP 15mg·kg^-1，间隔2h，共注射4次。

结果表明，给予MPTP 3-5min后，小鼠出现逐渐加重的运动减少、弓背、竖毛、立尾、后肢张力减弱、步态不稳、易激惹、偶然震颤等急性异常表现，个别出现癫痫样发作，约30-60min后症状逐渐减轻；但随着给药次数的增加，这些表现渐进性加重，视为模型成功。

实施例2：爬杆实验检测小鼠的运动协调能力

分别于造模前、给药五天造模后和继续给药五天后自制高50cm、直径1cm、表面粗糙的金属爬杆，垂直固定于底座上，杆顶端有一直径2.5cm的小木球，金属杆和小球外面紧裹纱布以防止小鼠打滑。根据其中描述的方法并加以改进，于给药前1d、给予MPTP后1d、给药结束后1d测定将小鼠头水平置于杆顶的小球上，前肢开始接触杆体至前肢接触地面的时间。

结果表明，造模后，Mod组和Veh组的爬杆时间比Con组明显延长，预防性给予孕激素的4组小鼠，其爬杆时间比Mod组缩短，但仍长于Con组，其中Nes L组的保护作用最大；继续治疗后，Nes L组与Con比较无统计学意义。(见表1)

表1 各组小鼠三次平均爬杆时间(秒，n＝6，

)

注：与Con组比较，*P＜0.01，两两比较，#P＜0.01，与Mod组比较，☆P＜0.01，与ProH组比较，△P＜0.01。

实施例3：免疫组织化学法检测小鼠黑质TH和GFAP的表达情况

先按照实施例4给予造模，按照实施例5在第12天爬杆测试后，腹腔注射0.01ml·g^-18％(W/V)水合氯醛麻醉各组小鼠。随机取6只小鼠待意识消失后开胸，经左心室-主动脉插管，用生理盐水、4％多聚甲醛(4℃)灌注，见小鼠肝脏发白，四肢僵直为灌注成功，取脑浸泡于4％多聚甲醛中后固定，石蜡包埋、切片。脑组织切片常规脱蜡至水后，PBS浸泡；枸橼酸修复液中高压热修复组织抗原；PBS冲洗；3％过氧化氢封闭20min；PBS冲洗；加入TH抗体(1∶1000，PBS稀释)或GFAP抗体(1∶100，PBS稀释)，37℃孵育2h，PBS冲洗；加入两步法免疫组化检测试剂，37℃孵育2h，PBS冲洗；DAB显色，苏木素复染5min，1％盐酸酒精分化；脱水、透明，中性树胶封片、晾干，镜检观察计数、拍照。每只动物均取在10×物镜下黑质最明显的3张切片。取一侧黑质密集阳性细胞的中央部分2个互不重叠的高倍视野(40×10)计数阳性细胞数，每个视野数两遍，取平均数；再按同样方法计数对侧黑质的阳性细胞数，双侧的平均数为一张切片的阳性细胞计数。3张脑片的平均数作为一只小鼠黑质TH或GFAP阳性细胞计数。

结果显示，Con组可见大量棕褐色TH免疫染色阳性细胞，胞质丰富，突起丰富；Mod组免疫染色阳性细胞明显减少，轴突断裂；Nes L组的TH阳性细胞数增加最多(参见图1)。与Con比较，Mod组小鼠黑质中GFAP阳性神经元数目明显增加；与Mod组比较，各孕激素治疗组的GFAP阳性神经元数目均减少，改善程度从大到小依次为Nes L组与Nes H组(参见图2)。

实施例4：HPLC-ECD法检测纹状体多巴胺含量

先按照实施例4给予造模，按照实例施5在第12天爬杆测试后，腹腔注射0.01ml·g^-18％(W/V)水合氯醛麻醉各组小鼠。各组的其余6只小鼠意识消失后，断头取脑，用4℃的冰盐水冲洗后滤纸吸干，在冰浴的培养皿上迅速剥离出双侧纹状体，液氮速冻，-80℃保存。在4℃将冻存的纹状体组织(6mg-40mg)称重，眼科剪迅速剪碎，加入0.1mol·L^-1高氯酸配制的匀浆液400μl，进行超声破碎。于4℃，15000rpm离心15min，取上清液，经0.22μm水相滤膜过滤后-20℃保存，测定前4℃放置；沉淀物中加入400μl 1mol·L^-1氢氧化钠，混匀、室温静置40min，3000rpm离心15min，取上清存于-20℃，用于蛋白浓度的测定。根据文献[7]的方法并加以改进，进行HPLC-ECD检验。色谱条件：HPLC仪、515泵、717自动进样器、温度控制模块、464电化学检测器、玻璃碳工作电极均为美国Waters公司产品；Hypersil C18反相色谱柱(ODS25μm 4.6mm×250mm)；检测电压为0.65V，流速：1.0ml·min^-1，柱温为25℃；流动相组成为50mmol·L^-1乙酸钠·3H₂O、0.13mmol·L^-1 EDTA-2Na、3mmol·L^-1辛烷磺酸钠、62ml·L^-1乙腈、131mmol·L^-1冰醋酸，调节pH为4.2，脱气后使用。以保留时间定性，峰面积定量。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的步骤测定纹状体组织蛋白浓度。

结果显示，与Con组比较，Mod组的多巴胺含量明显降低，Nes L组无统计学意义；与Mod组比较，Nes L组的多巴胺含量回升最显著，Nes H组次之(见表2)。

表2 各组小鼠纹状体多巴胺含量(ng·mg^-1，n＝6，

)

实施例4：Elisa法检测黑质TNF-α水平

先按照实施例4给予造模，按照实施例5在第12天爬杆测试后，腹腔注射0.01ml·g^-18％(W/V)水合氯醛麻醉各组小鼠。用与实施例7相同的小鼠，在冰浴的培养皿上迅速切割中脑，液氮速冻，-80℃保存。将冻存的黑质组织称重；按1∶39(mg：μl)加入冰的PBS液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆；4℃，3000rpm离心15min，取上清液，按照试剂盒说明书步骤操作，用Curveexpert 1.3软件进行曲线拟合，根据OD值对浓度的拟合方程计算出样品的TNF-α的浓度。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的步骤测定黑质组织蛋白浓度。

结果显示，Mod组和Veh组的TNF-α含量比Con组显著升高，4个孕激素治疗组的TNF-α含量回降但仍高于Con组；与Mod组比较，4个孕激素治疗组都有统计学意义；Nes L组与Nes H组比较有统计学意义(参见表3)。

表3 Elisa检测各组小鼠黑质TNF含量(pg·mg^-1，n＝6，

)

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度的应用本发明。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种16-亚甲基-17α-乙酰氧基-19-失碳-孕甾-4-烯-3,20-二酮在制备改善和治疗帕金森氏病的神经保护药物中的应用，所制备的药物含有制剂允许的药物赋形剂或载体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式为液体制剂、颗粒剂、缓释剂、冲剂、片剂或胶丸。

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