CN102666863A

CN102666863A - 从稀的水溶液中回收有机组分的方法

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Publication number: CN102666863A
Application number: CN2010800569008A
Authority: CN
Inventors: 弗朗茨·尼尔利希; 沃尔特·伯格-克利; 伊利娅·米肯伯格; 伯恩哈德·克奈塞尔
Original assignee: Stratley AG
Current assignee: Stratley AG
Priority date: 2009-12-15
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2012-09-12
Also published as: WO2011073250A2; CA2783432A1; JP2013513394A; KR20120120203A; EP2513321A2; US20130017587A1; BR112012014699A2; WO2011073250A3

Abstract

本发明涉及一种从例如发酵肉汤的水培养基中回收有机组分的方法，所述水培养基含有产所述有机组分的微生物。该方法包括通过增加培养基中导致该有机组分盐析的至少一种亲水溶质的浓度来增强水培养基中的有机组分的活性。与未改造的相应微生物相比，该微生物被基因改造成能够耐受培养基中更高的浓度。

Description

从稀的水溶液中回收有机组分的方法

技术领域

本发明涉及一种从例如发酵肉汤的水培养基中回收有机组分的方法，所述水培养基含有产所述有机组分的微生物。该方法包括通过增加培养基中导致该有机组分盐析的至少一种亲水溶质的浓度来增强水培养基中的有机组分的活性。与未改造的相应微生物相比，该微生物被基因改造成能够耐受培养基中更高浓度的亲水溶质。

背景技术

本发明的方法使得发酵具有改进的容积效率，并且实现了对发酵产物的回收。由于同时进行的发酵和回收过程增加了发酵产物的浓度，同样量的发酵肉汤所产生和回收的发酵产物的量得到增加，本发明方法还能够降低在生产中所使用的能源。因此，本发明实现了在少量的资金和降低的生产成本下进行发酵产物的生产和回收。

控制发酵过程的经济表现的关键参数是产物浓度和容积效率。

在某些情况下，发酵肉汤中高浓度的发酵产物可能对微生物具有某些毒性作用和/或抑制进一步的发酵过程，从而导致非常稀释的产物以及低的容积效率。

低的有效产物浓度和容积效率对于产物的经济状况的多个方面具有负面影响，包括设备尺寸和效用成本。随着发酵肉汤中产物浓度的降低，水溶液的回收体积增加，从而导致更高的资金成本和在生产设备中加工更大体积的材料。

回收过程的利用使得发酵产物在生产的同时被移除，因此增加的产物容积效率和浓度可能强有力地影响产物的经济状况。例如，对于大型工业发酵设备，每完成两次发酵，其容积效率将节省几乎50%的发酵罐成本。该发酵罐的资金成本和尺寸的下降降低了设备的折旧和生产成本。

同样地，回收过程使得在该过程中形成产物富集相，水富集相被隔离以及丢弃，发酵肉汤体积中的水负载在下游回收中处理，纯化设备大大减少。例如，对于给定的产品产量，回收相中产物浓度的加倍几乎使待处理的水量减半，降低了生产和资金成本。

许多科技方法已被开发用于从水基发酵培养基中同时移除发酵产物，包括液/液萃取，薄膜分离（例如，全蒸发），吸附法以及吸收法。在如上所述的情况中，当发酵罐流中的发酵产物浓度较低时，这些方法对于操作和资金成本具有重大影响，由于较高的能量损耗以及昂贵的设备使得任何商业性生产均不能独立生存。

例如，目前，在工业水平执行的最广泛使用的原位（in sito）回收技术是液/液萃取。在该过程中，一种萃取剂被混入该发酵肉汤中。发酵产物被萃取进入该萃取剂中，并通过反萃取进入另一种萃取剂或者通过蒸馏法得到回收。除了上面所述的缺点之外，还有多种问题与液/液萃取相关联，例如对细胞的毒性，乳状液的形成，昂贵萃取剂的消耗，以及微生物细胞在萃取剂与发酵肉汤界面处的累积。

全蒸发是一种薄膜基工艺，通过使用一种可选的薄膜被用于将溶剂从发酵肉汤中移除。该液体或溶剂扩散穿过固体薄膜，而将营养物，糖，和微生物细胞留下。通常与全蒸发相关联的一个问题在于经济地提供和维持穿过薄膜的化学位梯度。那些使用真空泵或冷凝器以提供必需的化学位梯度的全蒸发工艺属于能源密集型，因此操作昂贵。随着有机化合物在原料流中的浓度降低为低水平，渗透流中可蒸发的有机化合物的分压必须被保持更低以用于渗透从而产生分离。如果真空泵被用于维持与液体原料流保持平衡的有机化合物的分压与蒸汽相渗透中可蒸发的有机化合物的分压之间的差别，该泵则必须维持非常高的真空度，从而导致高的资金和操作成本。同样地，如果使用冷凝器，必须要维持极低的温度，从而要求昂贵的以及复杂的制冷系统。

因此，对于商业性生产，需要一种低成本的方法，该方法能够使发酵产物在产生的同时被移除，以阻止有毒的发酵产物的浓度超过培养物的耐受水平，从而提高容积效率，同样需要一种回收该发酵产物的方法，该方法使用相分离以降低工艺用水体积。

现有技术US 2009/0171129 A1描述了一种从例如发酵肉汤的稀的水溶液中回收C₃-C₆醇类（下文也表示为C_3-6-醇类）的方法，包括：a.增加C_3-6-醇类在发酵肉汤的一部分中的活性至C_3-6-醇类在该部分中至少饱和；b.从该发酵肉汤的该部分中形成富含C_3-6-醇的液相和富含水的液相；以及c.将富含C_3-6-醇的相从富含水的相中分离。该C_3-6-醇的活性可通过例如盐析来增加，即，将一种亲水溶质加入该水溶液中。

现有技术中所描述的方法具有缺陷：被用于发酵的微生物通常不能耐受理想组分的盐析所要求的亲水溶质的浓度。因此，如果不是对现有技术的方法的功能不利的话，这些方法的容积效率和成本效率至少大体上下降。

发明内容

因此，本发明所解决的技术问题就是进一步改进现有技术如US2009/0171129A1中描述的方法。

上述技术问题的解决方案通过权利要求中所描述的本发明的实施方式提供。

本发明涉及一种分离方法，用于从例如发酵肉汤的稀的水溶液中对有机组分的回收。该方法使得发酵具有改进的容积效率，并且实现了对发酵产物的回收。由于同时进行的发酵和回收过程增加了发酵产物的浓度，同样量的发酵肉汤所产生和回收的发酵产物的量得到增加，本发明方法还能够降低在生产中所使用的能源。因此，本发明实现了在少量的资金和降低的生产成本下进行发酵产物的生产和回收。

特别是，本发明提供了一种从例如发酵肉汤的水培养基中回收有机组分的方法，该水培养基中含有产该有机组分的微生物，包括以下步骤：

（a）增加至少一种亲水溶质在该水培养基的至少一部分中的浓度，从而使该有机组分在该水培养基的该部分中的活性增加至该有机组分在该部分中至少饱和；

（b）从该部分中形成富含有机组分的液相和液体的富含水的相；以及

（c）将富含有机组分的液相从富含水的相中分离；

其中，该微生物被基因改造成与未改造的微生物相比能够耐受水培养基的该部分中更高浓度的至少一种亲水溶质。

本发明进一步的主题涉及一种生产有机组分的方法，包括步骤：

（A）在发酵培养基中培养微生物使所述微生物生产该有机组分；

（B）采用此处限定的从水溶液中回收有机组分的方法，从发酵培养基的至少一部分中回收由该微生物释放到发酵培养基中的有机产物。

迄今为止，采用盐析在发酵产物产生的同时移除发酵产物的工艺结合采用具有耐受高盐的细胞和有机体的发酵工艺从未被报道。

具体实施方式

术语“发酵”或“发酵工艺”被定义为一种微生物在含有例如原料（feedstock）和营养物的原材料的培养基中进行培养的工艺，其中该微生物将例如原料的原材料转化成产物。

术语“有机组分”可以是由微生物生产的并且出现在例如发酵肉汤中的水溶液中的任何有机化合物。

该有机组分可以是醇类。优选地，该醇类是一种C₃-C₆-的一元醇或二元醇，特别是丙醇，丁醇，戊醇，或己醇，或相应的二元醇，例如丙二醇，丁二醇，戊二醇，或己二醇。在一些实施例中，该丙醇可以是1-丙醇或2-丙醇。在一些实施例中，该丁醇可以是1-丁醇，2-丁醇，叔丁醇（2-甲基-2-丙醇），或异丁醇（2-甲基-1-丙醇）。在一些实施例中，该戊醇可以是1-戊醇，2-戊醇，3-戊醇，2-甲基-1-丁醇，3-甲基-1-丁醇，2-甲基-2-丁醇，3-甲基-2-丁醇，或2,2-二甲基-1-丙醇。在一些实施例中，该己醇可以是1-己醇，2-己醇，3-己醇，2-甲基-1-戊醇，3-甲基-1-戊醇，4-甲基-1-戊醇，2-甲基-2-戊醇，3-甲基-2-戊醇，4-甲基-2-戊醇，2-甲基-3-戊醇，3-甲基-3-戊醇，3,3-二甲基-1-丁醇，2,2-二甲基-1-丁醇，2,3-二甲基-1-丁醇，2,3-二甲基-2-丁醇，3,3-二甲基-2-丁醇，或2-乙基-1-丁醇。在其他优选的实施例中，该二元醇可以选自1,2-丙二醇，1,3-丙二醇，1,2-丁二醇，1,3-丁二醇，2,3-丁二醇以及1,4-丁二醇。

在一些实施例中该有机组分可以是醛类。

根据本发明，一种例如氯化钠的亲水溶质被以足够引起盐析的量加入水溶液（例如发酵肉汤）中，盐析是指溶液分离成两不互溶的相；一个相是水的氯化钠溶液，另一个相是有机发酵产物溶液。这两不互溶的相通过物理分离（例如，通过重力），以获得仅含较小比例的有机组分的主要是亲水溶质的水溶液，以及仅含较小比例的水的主要是有机组分的溶液。

该亲水溶质优选被加入到发酵罐中的整个发酵肉汤中以在发酵产物产生的同时移除该发酵产物，从而阻止有毒的发酵产物的浓度超过培养物的耐受水平。各种盐（例如，氯化钠，或其他溶解的组分）的存在能够强烈地抑制暴露于这种条件的有机体的生长。在例如酵母或细菌的有机体中，高盐的培养基能够引起细胞脱水，同时干扰新陈代谢，导致生长抑制或细胞破坏。因此提供耐盐的有机体对于实现有机体在不利条件下生长是有用的，该不利条件通常不支持有用水平的生长，或根本不支持生长。

根据本发明的一个实施例，增强有机组分的活性可能包括向该水溶液中加入一种亲水溶质。在一些实施例中，其中该水溶液是发酵肉汤，亲水溶质优选被加入到发酵罐中的整个发酵肉汤中。关于加入亲水溶质，指的是增加已存在于该溶液的该部分中的亲水溶质的浓度，或者指的是加入先前不存在于该溶液中的亲水溶质。这些浓度的增加可以是通过外部的添加完成。作为选择地，或附加地，增加浓度也可以通过对溶液的原位处理进行，比如通过水解已经存在于该溶液中的溶质，例如，水解蛋白质以将氨基酸加入到该溶液中，水解淀粉或纤维素以将乳糖加入到溶液和/或水解半纤维素以将戊糖加入到溶液中。根据另一优选实施例，该亲水溶质可以是具有营养价值并且可选地以发酵副产物流流出，比如酒糟及可溶物（distillers dried grains andsolubles,DDGS）。此外或者可选地，该亲水溶质可以是可发酵的，并且可与富含水的液相转移至该发酵罐中。通常地，该亲水溶质选自盐，氨基酸，水溶性的溶剂，糖及其组合。

该方法进一步包括形成富含有机组分的相，例如从该水溶液的该部分中形成富含C_3-6-醇的液相和富含水的液相，该水溶液的该部分已被处理增加了有机组分（例如，C_3-6-醇）的活性。正如使用于此的一样，术语“富含有机组分的相”（例如，富含醇的液相）指的是一种液相，其中该有机组分与水的比例大于起始水溶液的该比例。术语“富含水的液相”指的是一种液相，其中水与有机组分的比例大于富含有机组分的液相中的该比例。该富含水的相也可称为缺乏有机组分的相（organic component-lean phase），例如缺乏醇的相。形成两相的步骤可以是主动的。例如，在一些实施例中，该形成步骤可以包括冷凝蒸馏的蒸汽相，以在冷凝之后形成两相。可选地或此外，冷冻或冷却该水溶液的被处理的部分可导致两相的形成。用于积极形成两相的其他步骤包括使用适合于促进相分离的设备。相分离可在各种单元操作包括液-液分离器中完成，该液-液分离器包括利用相与水箱（a water boot）之间的特定的比重区别，如离心机中的重力分离的液/液分离器，或者离心式的液-液分离器。沉降器同样适用，例如用于溶剂萃取工艺的混合沉降器。在一些实施例中，该形成步骤是被动的，并且可能简单地只是由于在先前的步骤中增加了有机组分（优选为C_3-6-醇）的活性到至少饱和的自然结果。

因此，在富含有机组分的液相中，该有机组分的浓度与水的比例有效高于在起始部分中的该比例。在富含水的相中，该有机组分的浓度与水的比例有效低于在富含有机组分的液相中的该比例。该富含水的相也可以被称为缺乏有机组分的相（例如缺乏醇的相）。

本发明的优选实施例涉及从稀的水溶液中对C_3-6-醇类的回收，该水溶液中含有产此处定义的醇的微生物。关于具体的C_3-6-醇类，在富含醇的相中的典型浓度可给出为如下所示：在一些实施例中，该醇是丙醇，在富含醇的相中丙醇与水的重量比约大于0.2，约大于0.5，或约大于1。在其他实施例中，C_3-6-醇是丁醇，在富含醇的相中丁醇与水的比率约大于1，约大于2，或约大于8。在其他实施例中，C_3-6-醇是戊醇，在富含醇的相中戊醇与水的比率约大于4，约大于6，或约大于10。

对于给定相的浓缩因子或富集因子，可被表示为在该相中有机化合物（例如，醇）与水的比率除以在稀的水溶液中有机组分与水的比率。因此，例如，对于富含有机组分的相的浓缩因子或富集因子，可被表示为在该富含有机组分的相中有机组分/水的比率除以在水的稀溶液中有机组分/水的比率。在一优选实施例中，在该富含有机组分的相中有机组分（例如C_3-6-醇）/水的比率大于起始水溶液（例如发酵肉汤）中有机组分（例如C_3-6-醇）/水的比率，至少约5倍，至少约25倍，至少约50倍，至少约100倍，或至少约300倍。

本发明的方法进一步包括将富含有机组分的液相（例如，富含C_3-6-醇的相）从富含水的相中分离。该两相的分离指的是该两相的物理分离，可包括移除，撇去浮沫，倾倒，倾析或相反，将一个相从另一个相中转移，并且可以采用本领域中已知的用于分离液相的任何手段完成。

根据本发明的优选实施例，该有机组分（例如醇，优选上面概述的C₃-C₆-一元醇或二元醇）进一步从步骤（c）中获得的富含有机组分的液相中纯化（下文也表示为步骤（d））。在多个实施例中，该步骤（d）可以包含步骤：蒸馏，透析，水吸附，采用溶剂萃取进行有机组分的萃取，与烃类液体接触或与亲水化合物接触，该烃类液体与水不互溶。该步骤可以产生两相，包括含有该有机化合物（例如C_3-6-醇）和水的第一相和含有该有机组分（例如C_3-6-醇）的第二相，其中第二相中的水与有机组分（例如C_3-6-醇）的比率小于第一相中的水与有机组分（例如C_3-6-醇）的比率。在多个实施例中，第二相可以含有至少约90wt%的醇，至少约95wt%的醇，或至少约99wt%的醇。

蒸馏法是一种进一步将该有机组分从步骤（c）中富含有机组分的液相中纯化出来的优选措施。在一些实施例中，蒸馏是在低于大气压以及约20-95°C的温度下进行。在一些实施例中，蒸馏步骤在大约0.025-10bar的压力下进行。根据本发明的优选实施例，加工富含理想的有机组分（例如C_3-6-醇）的液相的步骤可以包含从富含C_3-6-醇的相中蒸馏出基本上纯的C_3-6-醇。在一些实施例中，加工可以包含从富含C_3-6-醇的相中蒸馏出C_3-6-醇的共沸混合物。在一些实施例中，加工可以进一步包含将富含C_3-6-醇的相与C_3-6-醇选择性吸附剂接触。在一些实施例中，加工可以包含将富含C_3-6-醇的相中的C_3- ₆-醇转化成烯烃。在一些实施例中，加工可以包含将富含C_3-6-醇的相与烃类液体相结合，该烃类液体与水不互溶。在一些实施例中，该结合可以形成单一的均匀相。在一些实施例中，该结合可以形成一轻相和一重相，轻相中醇与水的比率可能大于重相中的该比率。

关于步骤（a）-（c）以及，可选地（d），现有技术中可以找到其进一步的常规指导，特别是对于C_3-6-醇，例如，在US 2009/0171129A1的各个部分中，相应内容通过引用全部合并于本说明书中。

本发明使得微生物通过发酵产具有有限的水溶性的有机产物。该微生物包括导致其对亲水溶质的耐受度增强的基因改造，该亲水溶质被用于增强微生物所产的有机组分的活性。与未进行基因改造的细胞（即，相对于这种改造的未改造微生物）相比，该基因改造优选引起细胞质中的至少一种小分子（渗压剂）的细胞内累积以中和外部的渗透压。本发明的宿主细胞可以自然产发酵产物，或被设计成通过设计的代谢途径产发酵产物。

这种基因改造以及产生的渗透压的耐受度可在多种不同细胞中获得。任何适当的宿主细胞可被用于本发明的实践中。例如，该宿主细胞可以是基因改造的宿主细胞，其中核酸分子被插入，删除或改造（即，突变；例如，通过一个或多个核苷酸的插入，删除，替换，和/或反向）。适用于本发明的方法的有用的典型微生物是细菌和酵母。

适用于本发明的情况的细菌微生物的例子包括但不限于：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacines），产氨短杆菌（Brevibacterium ammoniagenes），Brevibacterium immariophilum，Clostridium beigerinckii，丙酮丁醇梭杆菌（Clostridium acetobutylicum），丁酸杆菌（Clostridium butylicum），阪崎氏肠杆菌（Enterobacter sakazakii），大肠杆菌（Escherichia coli），乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），百脉根根瘤菌（Mesorhizobium loti），绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），Pseudomonas mevalonii，Pseudomonas pudica，Rhodobacter capsulatus，球形红菌（Rhodobacter sphaeroides），深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum），肠道沙门氏菌（Salmonella enterica），伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi），Salmonella typhimurium，痢疾志贺菌（Shigella dysenteriae），弗氏志贺菌（Shigella flexneri），索氏志贺菌（Shigella sonnei），金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，等等。

适用于本发明的情况的酵母微生物的例子包括但不限于：构巢曲霉（Aspergillus nidulans），黑曲霉（Aspergillus niger），米曲霉（Aspergillusoryzae），白色念珠菌（Candida albicans），Chrysosporium lucknowense，禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum），镰孢霉（Fusarium venenatum），乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis），粗糙脉孢菌（Neurospora crassa），安格斯毕赤酵母（Pichia angusta），Pichia finlandica，Pichia kodamae，膜醭毕赤氏酵母（Pichia membranaefaciens），Pichia methanolica，Pichiaopuntiae，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），Pichia pijperi，Pichiaquercuum，Pichia salictaria，Pichia thermotolerans,Pichia trehalophila，Pichia stipitis，产二素链霉菌（Streptomyces ambofaciens），金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens），Streptomyces aureus，贝酵母（Saccharomyces bayan us），Saccharomyces boulardi，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），Streptomyces fungicidicus，Streptomycesgriseochromogenes，灰色链霉菌（Streptomyces griseus），变铅青链霉菌（Streptomyces lividans），Streptomyces olivogriseus，枝链霉菌（Streptomyces rameus），Streptomyces tanashiensis,Streptomyces vinaceus，以及瑞氏木霉（Trichoderma reesei）。

因此，在多个实施例中，该细胞是一种可选自上面所概括的种属中的酵母细胞，优选是一种酵母属细胞，最优选是一种酿酒酵母细胞。同样地，如已概述如上，该细胞可以是来自细菌种属，优选是大肠杆菌。适用于本发明的情况的基因改造微生物的其他细菌种属来源于hydrocarbonoclastic bacteria(HCB)，食碱菌属（Alcanivorax）(例如，A.borkumensis)，解环菌属（Cycloclasticus），海杆菌属（Marinobacter），Neptunomonas，Oleiphilus，Oleispira以及Thalassolitus的代表菌。在优选实施例中，细胞培养物中的细胞优选以大量这种细胞存在。优选地，该细胞培养物是一种液体培养物。在优选实施例中，该细胞培养物是一种高密度细胞培养物。

有机溶质的累积是所有微生物渗透调节的先决条件：为了调节环境的较低的水活性，以及导致细胞质水的下降，微生物必须累积细胞内离子或有机溶质以恢复细胞渗透压和/或细胞体积，以及同时保持酶活性。

微生物对于渗透调节已发展出两种主要的策略。一种策略是依赖K+从环境中选择性地流入，有时是极端地，高水平的流入，且该策略被称作“盐在细胞质中（salt-in-the-cytoplasm）”型的渗透适应（osmotic adaptation）（Galinski E.A.,Advances in Microbial Physiology 37:272-328(1995);da Costa,M.S.et al.，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 61:117-153(1998);Roeβler,M.and Müller,V.,Environmental Microbiology 3:743-754(2001))。这种类型的渗透调节发生在盐杆菌科（Halobacteriaceae）家族的极其嗜盐的古生菌，Order Halanaerobiales (Oren,A.Microbiology and MolecularBiology Reviews 63:334-348(1999))的厌氧适度嗜盐的细菌，以及极度嗜盐细菌Salinibacter ruber(Anton,J.et al.,International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology 52:485-491(1999);Oren,A.and Mana,L.,Extremophiles 6:217–223(2002))。

然而，大部分微生物没有经历过广泛的作为适应盐环境的先决条件的基因改变，并且该细胞内的大分子通常对于高水平的无机离子是敏感的。这些生物体偏爱积累特定的小分子质量化合物，这种特定的小分子质量化合物被认为是兼容溶质或渗透剂(Brown,A.D.,Bacteriological Reviews 40:803-846(1976),Brown,A.D.,Microbial Water Stress Physiology:Principles andPerspectives.Chichester:John Wiley & Sons(1990);Ventosa,A.et al.,Microbiology and Molecular Biology Reviews 62:504-544(1998))。兼容溶质如果存在的话，也可以是从环境中取得，或者可以从头合成。微生物的最常见兼容溶质是中性的或者两性的，包含氨基酸和氨基酸衍生物，糖，糖的衍生物（量糖苷）和多元醇，甜菜碱和四氢嘧啶(da Costa,M.S.et al.,Advancesin Biochemical Engineering/Biotechnology 61:118–153(1998))。一些是普遍存在于微生物中，即海藻糖，甜菜碱和α-谷氨酸盐，而其他溶质则限于少数生物体内。例如，多元醇普遍存在于真菌和藻类，但是在细菌中非常稀有，以及在古生菌中未知。四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶（hydroxyectoine）均是仅在细菌中发现的兼容溶质的例子。

根据优选实施例，微生物累积的渗透剂可选自海藻糖，甜菜碱，脯氨酸，甘油，四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶（hydroxyectoine）。

这些渗透剂的增强的累积优选通过对微生物体内一种或多种用于产理想有机组分的生物途径进行基因改造获得。

根据本发明该微生物的基因改造依赖于参与渗透剂或一种或多种其前体细胞的生产和/或加工和/或细胞运输（输出，输入）的一种或多种蛋白。

通常，根据本发明该改造的微生物携带允许参与上述途径的一种或多种蛋白的（过）表达的基因或基因结构。用于组装基因工具（比如质粒，病毒），转染和理想结构的表达的分子生物学操作在现有技术中是已知的（例如，参见Ausubel et al.(eds.）Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley & Sons,New York,2001-2009）。

术语“基因”或“基因改造”是指能够被作为特定蛋白表达的核酸片段，可选地包含在前的调控序列（5'非编码序列）和在后的编码序列（3'非编码序列）。“原生基因”（Native gene）是指被发现时天然具有其自身的调控序列的基因。“重组基因”是指不是原生基因的任何基因，包括天然地不能同时发现的调控和编码序列。因此，重组基因可能包括来自不同来源的调控序列和编码序列，或者来自同一来源的调控和编码序列，但是以不同于自然界发现的方式排列。“内生基因”（Endogenous gene）是指原生基因位于有机体的基因组中的天然位置。“外源”基因是指正常情况下不会在宿主有机体内发现的基因，但是通过基因转移被引入该宿主有机体中。外源基因可包括被插入非原生有机体的原生基因，或重组基因。“转基因”（transgene）是一种通过转化程序被引入该基因组的基因。

如使用于此，术语“表达”是指来自于本发明的核酸片段的正义（mRNA）或反义RNA的转录和持续累积。表达也可以是指mRNA翻译成多肽。

通常，描述于此的重组DNA技术中的命名和实验室程序为本领域技术人员熟知。标准技术被用于克隆，DNA和RNA分离，扩增和纯化。通常，涉及DNA连接酶，DNA聚合酶，限制性内切酶等等的酶反应根据制造商的说明书进行。这些技术以及多种其他技术通常根据Sambrook et al.,MolecularCloning--A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.(1989)进行。

适用于细菌培养物的日常维护和生长的材料和方法为本领域熟知。适用于以下例子的技术可以参考Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.Costilow,Eugene W.Nester,WillisA.Wood,Noel R.Krieg and G.Briggs Phillips,eds.),American Society forMicrobiology,Washington,D.C.(1994)。

使用于此的术语“转化”是指核酸片段转移进入宿主有机体，导致基因的稳定遗传。含有转化的核酸片段的宿主有机体是指“转基因”或“重组”，或“转化”有机体。对于许多应用，比如异源基因，编码序列，或调控序列的引入，通常有必要将核酸序列引入各个细胞中。许多这种方法是已知并且可被利用的，具体的选择取决于特定类型的细胞。

用于E.coli菌株转化的感受态细胞可如下制备：E.coli在SOB培养基(Sambrook,J.,Russel,D.W.Molecular Cloning,A Laboratory Manual.3 ed.2001,Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press)中生长至OD600约为0.6-0.8。该培养物浓缩100倍，冰冻的水洗涤一次，冰冻的10%甘油洗涤三次。然后将细胞在150μL的冰冻的10%甘油中重悬，平均分成每份50μL。这些小份可被立即用于标准转化或储存于-80°C。这些细胞通过电穿孔法转化理想质粒。电穿孔之后，SOC培养基(Sambrook,J.,Russel,D.W.Molecular Cloning,A Laboratory Manual.3ed.2001,Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press)被立即加入细胞中。在37°C下温育1小时。将该细胞涂平板至含有适当抗生素的LB平板上37°C温育过夜。

例如，通过将酵母细胞转移进原生质体实现酵母细胞的转化，例如，使用裂解酶，溶细胞酶，或蜗牛酶，接下来加入核酸和聚乙二醇（PEG）。该PEG处理过的原生质体通过在生长培养基中培养再生，例如，在选择性条件下(参见,例如，Beggs,Nature 275:104-108(1978);and Hinnen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929-1933(1978))培养。另一种方法并不涉及细胞壁的去除，而是使用氯化锂或醋酸盐和PEG进行处理，然后在选择性培养基中生长(参见,例如，Ito et al.,J.Bact.153:163-168(1983))。关于酵母转化，基因整合进入酵母基因组，以及酵母菌株的生长和筛选的种种方法在分子生物学技术（Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1 and 2,Ausubel et al.,eds.,JohnWiley & Sons,New York (1997)中已有描述。

术语“质粒”和“载体”是指通常携带不属于细胞中心代谢的基因的外源的染色体分子（element），通常以环状双链DNA片段形式出现。这些分子可以是来自于任何来源，单链或双链DNA或RNA的，线状或环状的，自主复制序列，基因组整合序列，噬菌体或核酸序列，其中若干核酸序列已被连接或重组进入唯一的结构，该结构能够将启动子片段和DNA序列与适当的3′未翻译序列一起引入细胞以形成选定的基因产物。“重组载体”是指特定的载体，该特定的载体含有外源基因和除了外源基因之外的能够有利于特定宿主细胞转化的分子。

含有必要基因的重组有机体可使用本领域熟知的技术构建，该必要基因将编码酶催化途径，以将可发酵的碳源底物转化成理想的有机产物，该熟知技术例如参见US-A-20070092957,US-A-20090239275,US-A-20090155870,US-A-20090155870,WO-A-2009/103533,US-A-20090246842。

经过基因改造以增加海藻糖产量的本发明的酵母菌株提高了对不同盐的耐受度。菌株的耐受度可通过试验其在不同盐（包括氯化钠）的浓度下的生长进行评估，这些盐对于亲本菌株（基因改造之前）的生长有害。

本发明中使用的发酵培养基含有适当的碳源底物。适当的底物包含，但不局限于，单糖（例如葡萄糖和果糖），低聚糖（例如乳糖或蔗糖），多糖（例如淀粉或纤维素）或其混合物，以及可再生的原料的未纯化的混合物，该原料例如乳清培养基（cheese whey permeate）,玉米浆液，甜菜糖蜜，以及大麦芽。

除了一种合适的碳源，发酵培养基通常含有适当的矿物质，盐，辅因子，缓冲液以及其他本领域技术人员熟知的，适合于培养物的生长的，以及适合于促进生产理想的有机化合物的必须的酶催化途径的成分。

对于细胞培养，细胞通常是在合适的培养基中大约20-37°C范围内的温度下生长。对于本发明有用的适当的生长培养基可以是常见的商业制备的培养基，例如包含酵母氮源，硫酸铵和右旋糖（作为碳源/能源）的肉汤或YPD培养基，适用于大多数酿酒酵母菌株生长的最佳比例的蛋白胨，酵母提取物和右旋糖的混合物。其他限定的或合成的生长培养基也可以被使用，用于特定的微生物生长的合适培养基为微生物和/或发酵学科领域的技术人员所知。

发酵的适当pH范围通常在约3.0-7.5之间，其中初始条件的pH优选为约4.5-6.5之间。

产生于发酵培养基中的理想产物（例如乙醇）的量可使用本领域熟知的许多方法测量，例如，高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法(GC)。

US-A-7,005,291描述了一种适用于本发明的基因改造的例子，涉及一种从重组有机体中产甘油的方法，包括：将一表达盒（expression cassette）转化进入一适当的宿主细胞，该表达盒包括（a）编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）活性的蛋白质的基因，和/或，（b）编码具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因。该基因改造导致增强的甘油细胞内累积。相应改造的微生物的生产的细节参阅US-A-7,005,291。

术语“甘油-3-磷酸脱氢酶”和“G3PDH”是指具有催化磷酸二羟基丙酮（DHAP）转化成甘油-3-磷酸（G3P）的酶活的多肽。体内的G3PDH可以是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）；或依赖型FAD（FAD-dependent）。例如，该NADH-依赖型酶（EC 1.1.1.8）通过多个基因编码，包含：GPD1（GenBankZ74071x2），或GPD2(GenBank Z35169x1)，或GPD3(GenBank G984182)，或DAR1(GenBank Z74071x2)。该NADPH-依赖型酶（EC 1.1.1.94）通过gpsA(GenBank U321643,(cds 197911-196892)G466746和L45246)编码。该FAD-依赖型酶（EC 1.1.99.5）通过GUT2（GenBank Z47047x23)，或glpD（GenBank G147838)，或glpABC（GenBank M20938)编码。

术语“甘油-3-磷酸酶”，“sn-甘油-3-磷酸酶”或“d,1-甘油磷酸酶”和“G3P磷酸酶”是指具有催化甘油-3-磷酸和水转化成甘油和无机磷酸的酶活的多肽。例如，G3P磷酸通过GPP1(GenBank Z47047x125)，或GPP2(GenBankU18813x11)编码。

术语“GPP1”，“RHR2”和“YIL053W”可交换地使用，是指编码细胞质的甘油-3-磷酸酶（cytosolic glycerol-3-phosphatase）的基因，并且具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列。

术语“GPP2”，“HOR2”和“YER062C”可交换地使用，是指编码另一种细胞质的甘油-3-磷酸酶的基因，并且具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

适用于本发明的其他基因是参与海藻糖代谢的基因。例如，从酵母，特别是啤酒酵母（Sacharomyces cerevisiae）编码具有海藻糖-6-磷酸合成酶功能的蛋白（例如相应的酶）的基因。这些酶（以及他们的编码基因）中特别有用的代表是Tps1p,Tps2p,Tps3p和Tsl1p。

适用于本发明的情况的表达特别是（inter alia）Tps1p的基因改造的微生物的更多细节描述于US-A-5,422,254中，关于相应的改造的微生物的细节参考现有技术的文献。Tps1p是海藻糖-6-磷酸合成酶/磷酸酶复合体的合成酶亚基，合成储存碳水化合物海藻糖。在自然情况下，这种蛋白的表达通过应力条件诱导（例如渗透压）。

Tps2p是酵母海藻糖-6-磷酸合成酶/磷酸酶复合体的磷酸酶亚基，合成储存碳水化合物海藻糖。它的表达通过应力条件诱导（例如渗透压）。

Tps3p是酵母海藻糖-6-磷酸合成酶/磷酸酶复合体的调控亚基，合成储存碳水化合物海藻糖；这种蛋白的表达通过应力条件诱导（例如渗透压）。

Tsl1p是酵母海藻糖-6-磷酸合成酶（Tps1p）/磷酸酶（Tps2p）复合体的大亚基，将尿苷-5'-二磷酸葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸转化成海藻糖。

涉及海藻糖代谢的其他基因已知来自于细菌，特别是E.coli，例如，类似otsA和otsB的海藻糖-6-磷酸合成酶基因。

适用于本发明的其他基因是参与四氢嘧啶代谢的基因。编码在四氢嘧啶合成中发挥作用的蛋白的基因的例子，例如，L-2,4-二氨基丁酸乙酰基转移酶(DABA acetyltransferase)，催化L-2,4-二氨基丁酸(DABA)的乙酰化作用形成具有乙酰辅酶A的γ-N-乙酰-α,γ-二氨基丁酸（gamma-N-acetyl-alpha，gamma-diaminobutyric acid，ADABA),二氨基丁酸-2-氧化戊二酸转氨酶(通过L-谷氨酸盐的转氨作用逆向催化L-天冬氨酸β半缩醛(ASA)转化成L-2,4-二氨基丁酸(DABA))，以及L-四氢嘧啶合成酶（催化γ-N-乙酰-α,γ-二氨基丁酸(ADABA)的环化）。四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢化-2-甲基-4-嘧啶羧酸)是一种极好的渗透保护剂。

四氢嘧啶生物合成基因已知来源于例如嗜盐细菌，比如嗜盐海球菌（Marinococcus halophilus）。特定的例子包括ectA,ectB和ectC；进一步细节可参见“Characterization of genes for the biosynthesis of the compatible soluteectoine from Marinococcus halophilus and osmoregulated expression inEscherichia coli."Louis P.,Galinski E.A.;Microbiology 143:1141-1149(1997)。

适用于本发明的情况的其他基因参与运输机制，例如，导致渗透保护化合物的细胞内摄入升高的各种ATP-依赖型运输蛋白和K+同向和逆向转运蛋白。这种基因的特定的例子已知来自于，例如E.coli，并且包含ProV,ProW,ProX和ProP。ProV,ProW和ProX基因表达的蛋白导致甜菜碱，脯氨酸和/或四氢嘧啶在细胞内的累积，并且是多组分结合蛋白依赖性的（binding-protein-dependent）运输系统(尿蛋白运输proU transporter)的组分，该系统充当甜菜碱/L-脯氨酸的运输者。ProP编码一种能够运输脯氨酸和甜菜碱的渗透保护剂/质子同向转运剂，并且调节渗透保护剂的摄入，以适应渗透压的升高。

适用于根据本发明的改造微生物的另一类基因结构涉及参与以胆碱进行甜菜碱合成的基因。编码胆碱合成酶或甜菜碱-醛脱氢酶的基因的例子的代表已知来源于，例如E.coli，并且包含betA和betB。

下表列出了在适用于本发明方法的微生物中表达的蛋白的特定例子。

表1

本发明进一步由以下非限制性的实施例进行阐述：

例1：耐受培养基中高浓度NaCl的产正丁醇的酵母菌株的构建

下面的实施例部分，描述了与海藻糖代谢相关的Tps1p基因在酿酒酵母（S.Cerevisiae）中的克隆和过表达，是用于产理想的有机组分的微生物的生化途径的基因改造的通用方法的示例。该例子阐述了基因（例如上表1所列出的基因）是如何被用于构建重组载体用于转化能够使转基因的微生物具有盐的耐受度的基因。

该例子提供的重组酵母宿主细胞具有以下特征：1）该酵母宿主在含有碳源底物的培养基中生长时产生丁醇；2）该酵母宿主细胞包括至少一个基因改造，该基因改造使得该宿主细胞与野生型细胞相比增加了对培养基中至少一种亲水溶质的耐受度。

产正丁醇的S.Cerevisiae菌株的构建

产正丁醇的酵母菌株通过如上所述构建(Steen EJ,Chan R,Prasad N,Myers S,Petzold CJ,Redding A,Ouellet M,Keasling JD:Metabolic engineeringof Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol.Microbial CellFactories 2008,7:36)。

Clostridium beijerinckii NCIMB 8052购自ATCC，产品登录号为51743。C.beijerinckii基因通过基因组DNA克隆得到:thl,编码硫解酶；hbd，3-羟丁酰-辅酶A脱氢酶（3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase）;crt,巴豆酸酶（crotonase）;bcd,丁酰-辅酶A脱氢酶（butyryl-CoA dehydrogenase）;etfA和etfB,双电子转移黄素蛋白A和B（two-electron transferring flavoproteins A&B）;以及AdhE2丁醛脱氢酶。E.coli菌株DH10B和DH5á在表达质粒的构建中被用于细菌转化和质粒扩增。菌株在37°C下在含有100mg氨苄青霉素的LB培养基中培养。S.cerevisiae菌株BY4742,S288C的衍生物,被用作所述酵母菌株的亲本菌株。该菌株在肥沃的YPD培养基中30°C下生长。

采用SLIC方法如上所述进行质粒构建(Li MZ,Elledge SJ:Harnessinghomologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.NatMethods 2007,4(3):251-6)。含有2μ复制原点，用于选择的LEU或HIS基因，GAL1或GAL10启动子，以及CYC1，ADH1，或者PGK1转录终止剂。正丁醇途径的前三个基因被整合进入质粒pESC-LEU(试剂盒Stratagene)中，后四个基因结合至质粒pESC-HIS(试剂盒Stratagene)上。所有基因采用Phusion聚合酶(New England Biolabs)进行PCR扩增。引物设计为具有与质粒插入区域相应的30-bp两边区域，GAL1或GAL10启动子中的一个，以及CYC1,ADH1,或PGK1终止剂。

通过如上所述质粒共转化进入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4743(ATCC 201390)，然后通过SD-LEU-HIS平板筛选进行产正丁醇酵母菌株的构建。酵母转化采用醋酸锂法进行(Gietz,R.D.,and R.A.Woods.2002.Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrierDNA/polyethylene glycol method.Methods Enzymol.350:87-96)。酵母细胞在YPD中生长过夜，然后以1:10稀释加入10mL新鲜YPD，在28°C下振荡培养5小时。然后采用离心收集细胞，无菌水洗涤一次，重悬于100μl无菌水中。然后将50μl细胞悬浮液与115μl 60%聚乙二醇3350,5μl 4M醋酸锂，15μl无菌水，10μl 10mg/ml载体DNA，以及5μl PCR产物混合。将该混合物涡漩30s，42°C下温育40min，然后涂覆于合适的平板上。

耐受培养基中高浓度NaCl的产正丁醇的酵母菌株的构建

采用根据S.cerevisiae S288C菌株制备的基因组DNA克隆Tps1p基因。将Tps1p基因插入pESC-URA(试剂盒Stratagene)质粒中。该基因通过使用Phusion聚合酶(New England Biolabs)进行PCR扩增。引物设计为具有与质粒插入区域相应的30-bp两边区域，GAL1或GAL10启动子中的一个，以及CYC1或ADH1终止剂。

耐受培养基中高浓度盐（包括NaCl）的产正丁醇的酵母菌株的构建方法为：将pESC-URA-Tps1p质粒转化进入携带有pESC-LEU/pESC-HIS质粒的Saccharomyces cerevisiae BY4743(ATCC 201390)细胞，以表达如上所述的正丁醇途径基因，然后采用SD-LEU-HIS-URA平板筛选。

与对照细胞相比，酵母培养物过表达Tps1p基因（取决于菌株）显示出2-3对数单位的生存能力（in viability of 2 to 3log units）的区别。例2：通过加入亲水化合物实现发酵培养基中丁醇的相分离

该例子阐述了根据例1所制备的细胞的发酵培养基中通过加入亲水化合物实现了丁醇的相分离。

制备各种盐，不同盐浓度的多种酵母发酵培养基。按照惯例，细胞在补充有半乳糖的培养基中30°C下振摇(160rpm)生长。在发酵中，可观察到形成一上层-富含丁醇的相（轻相）和一下层-缺乏醇的相（重相）的相分离现象。该水溶液与溶剂之间的相比（phase ratio）彼此各不相同。两相均进行醇和水的含量分析。

对于正丁醇的检测，向10ml样品中加入含有正戊醇(0.005%v/v)的乙酸乙酯2ml，和一内标，涡漩1min。然后回收乙酸乙酯，采用Thermo TraceUltra gas chromatograph(GC)进行分析，该GC配置有Triplus AS自动进样器和TR-WAXMS柱(Thermo Scientific)。样品采用以下程序在GC上运行：初始温度40°C下保持1.2min，以25°C/min升温至130°C，以35°C/min升温至220°C。最终的定量分析采用Xcalibur软件进行。

有机相的水含量采用Karl-Fischer法进行测定。各个实验中该醇的分配系数通过轻相中的醇浓度除以重相中的浓度计算。所有实验在30°C下进行。

结果概括如下表2所示。

表2

该结果显示，如果发酵培养基中出现氯化钠或氯化钙中的一种，在发酵中即可实现丁醇的分离。

参考文献：

Gietz,R.D.,and R.A.Woods.2002.Transformation of yeast by lithiumacetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.MethodsEnzymol.350:87-96.

Steen EJ,Chan R,Prasad N,Myers S,Petzold CJ,Redding A,Ouellet M,KeaslingJD:Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol.Microbial Cell Factories 2008,7:36.

Li MZ,Elledge SJ:Harnessing homologous recombination in vitro to generaterecombinant DNA via SLIC.Nat Methods 2007,4(3):251-6.

Claims

1.一种从水培养基中回收有机组分的方法，所述水培养基中含有产所述有机组分的微生物，包括步骤：

（a）增加至少一种亲水溶质在所述水培养基的至少一部分中的浓度，使所述有机组分在所述水培养基的该部分中的活性增加至所述有机组分在该部分中至少饱和；

（b）从该部分中形成一富含所述有机组分的液相和一液体的富含水的相；以及

（C）将富含所述有机组分的液相从富含水的相中分离；

其特征在于，所述微生物被基因改造成与未改造的微生物相比能够耐受所述水培养基的所述部分中更高浓度的至少一种亲水溶质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水培养基是发酵肉汤。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述有机组分是醇。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述醇是一种C₃-C₆的一元醇或二元醇。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述C₃-C₆的一元醇选自由：1-丁醇，2-丁醇，叔丁醇，异丁醇，1-戊醇，2-戊醇，3-戊醇，2-甲基-1-丁醇，3-甲基-1-丁醇，2-甲基-2-丁醇，3-甲基-2-丁醇，2,2-二甲基-1-丙醇,1-己醇，2-己醇，3-己醇，2-甲基-1-戊醇，3-甲基-1-戊醇，4-甲基-1-戊醇，2-甲基-2-戊醇，3-甲基-2-戊醇，4-甲基-2-戊醇，2-甲基-3-戊醇，3-甲基-3-戊醇，3,3-二甲基-1-丁醇，2,2-二甲基-1-丁醇，2,3-二甲基-1-丁醇，2,3-二甲基-2-丁醇，3,3-二甲基-2-丁醇以及2-乙基-1-丁醇组成的组中。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述C₃-C₆的二元醇选自由：1,2-丙二醇，1,3-丙二醇，1,2-丁二醇，1,3-丁二醇，2,3-丁二醇以及1,4-丁二醇组成的组中。

7.如前述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述亲水溶质选自由：盐，氨基酸，水溶性溶剂，糖及其组合组成的组中。

8.如前述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述微生物具有导致至少一种渗透剂在所述微生物的细胞质内增强累积的基因改造。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述渗透剂选自由：海藻糖，甜菜碱，脯氨酸，丙三醇和四氢嘧啶组成的组中。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述微生物被改造成表达一种选自由：Tps1,Tps2,Tps3,Tsl1,GPD1,GPD2,HOR2,RHR2ectA,ectB,ectC,otsA,otsB,ProV,ProW,ProX,ProP,betA以及betB组成的组中的一种或多种基因的蛋白。

11.如前述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述微生物选自由细菌和酵母组成的组中。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述酵母选自由：构巢曲霉（Aspergillus nidulans），黑曲霉（Aspergillus niger），米曲霉（Aspergillusoryzae），白色念珠菌（Candida albicans），Chrysosporium lucknowense，禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum），镰孢霉（Fusarium venenatum），乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis），粗糙脉孢菌（Neurospora crassa），安格斯毕赤酵母（Pichia angusta），Pichia finlandica，Pichia kodamae，膜醭毕赤氏酵母（Pichia membranaefaciens），Pichia methanolica，Pichia opuntiae，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），Pichia pijperi，Pichia quercuum，Pichiasalictaria，Pichia thermotolerans,Pichia trehalophila，Pichia stipitis，产二素链霉菌（Streptomyces ambofaciens），金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens），Streptomyces aureus，贝酵母（Saccharomyces bayanus），Saccharomycesboulardi，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），Streptomyces fungicidicus，Streptomyces griseochromogenes，灰色链霉菌（Streptomyces griseus），变铅青链霉菌（Streptomyces lividans），Streptomyces olivogriseus，枝链霉菌（Streptomyces rameus），Streptomyces tanashiensis,Streptomyces vinaceus，以及瑞氏木霉（Trichoderma reesei）组成的组中。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细菌选自由：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacines），产氨短杆菌（Brevibacterium ammoniagenes），Brevibacterium immariophilum，Clostridium beigerinckii，丙酮丁醇梭杆菌（Clostridium acetobutylicum），丁酸杆菌（Clostridium butylicum），阪崎氏肠杆菌（Enterobacter sakazakii），大肠杆菌（Escherichia coli），乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），百脉根根瘤菌（Mesorhizobium loti），绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），Pseudomonas mevalonii，Pseudomonas pudica，Rhodobacter capsulatus，球形红菌（Rhodobacter sphaeroides），深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum），肠道沙门氏菌（Salmonella enterica），伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi），Salmonella typhimurium，痢疾志贺菌（Shigella dysenteriae），弗氏志贺菌（Shigella flexneri），索氏志贺菌（Shigella sonnei），金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及hydrocarbonoclastic bacteria组成的组中。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述hydrocarbonoclasticbacteria选自由食碱菌，解环菌，海杆菌，Neptunomonas,Oleiphilus,Oleispira和Thalassolitus组成的组中。

15.如前述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，进一步包括步骤：

（d）进一步从富含所述有机组分的液相中纯化出所述有机组分。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)包括富含所述有机组分的液相的蒸馏。

17.一种生产有机组分的方法，其特征在于，包括步骤：

（A）在发酵培养基中培养一种微生物以通过所述微生物产生所述有机组分；

（B）采用如权利要求1-16中任一项所限定的从水溶液中回收有机组分的方法，从所述发酵培养基的至少一部分中回收由所述微生物释放到所述发酵培养基中的有机产物。