CN102648287A - 检测pax2用于诊断乳腺癌 - Google Patents
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Abstract
公开了用于监测个体中乳腺疾病的方法。所述方法包括测定获自个体乳腺的细胞中配对盒2基因-比-β-防御素-1基因(PAX2-比-DEFB1)的表达率(“Donald预测因子”或“DPF”)，其中所述PAX2-比-DEFB1表达率与乳腺疾病相关。还公开了用于监测乳腺疾病和测定药物抗性的试剂盒。
Description
本申请要求于2009年8月24日提交的美国申请号12/546,292的优先权。前述申请整体通过引用并入本文。
领域
本申请通常涉及医疗诊断，具体涉及用于诊断各种组织中癌症状态的方法。
背景
乳腺癌是女性最常见的癌症原因，并且在美国是女性第二大常见的癌症死亡原因。虽然多数初期乳腺癌是基于发现乳腺影像异常来诊断的，但是肿块或乳腺组织坚实度的变化也可以是疾病的警报信号。过去几十年内提高乳腺癌风险意识已致使增加进行乳腺摄影筛查的女性数量，导致更早期检测癌症并且由此提高存活率。尽管如此，乳腺癌是45至55岁女性最常见的死亡原因。
乳腺癌可以分成几期。0期是原位癌(包括小叶癌和乳腺导管癌)。I期是浸润性乳腺癌的早期阶段。肿瘤直径不超过2厘米。癌细胞尚未超出乳腺扩散。II期肿瘤包括直径不超过2厘米但已扩散到腋下淋巴结的肿瘤、2至5厘米且可能已扩散到腋下淋巴结的肿瘤，以及大于5厘米(2英寸)但尚未扩散到腋下淋巴结的肿瘤。III期是局部发展的癌。III期进一步被分成IIIA期、IIIB期和IIIC期。IV期是向远处转移的癌。肿瘤已扩散到身体的其他部位。早期阶段的治疗选择不同于晚期选择。
已知许多类型的癌症是由遗传畸变即突变引起。突变的积聚和细胞控制功能的损失致使从正常组织学到早期癌前的进行性表型变化，如上皮内瘤变(IEN)到日益严重的IEN到浅表癌以及最终到浸润性疾病。该过程通常在几年甚至几十年内相对缓慢地发生，虽然在一些情况下可能相对迅速。癌基因依赖是癌细胞对维持恶性表型的单一癌基因的连续活化或过表达的生理依赖。这种依赖发生于标志肿瘤进程的其它变化的环境中。
长时期发展成浸润性癌症提供了临床干预的时机。因此，重要的是鉴定指征癌前疾病的生物标志物，以便可以采取治疗措施预防或延缓浸润性癌症发展。
简述
本发明一方面涉及监测个体中乳腺疾病的方法。所述方法包括测定获自个体乳腺的细胞中配对盒2基因(Paired Box 2 gene)-比-β防御素-1基因(PAX2-比-DEFB1)表达率，其中所述PAX2-比-DEFB1表达率与乳腺疾病相关并且能用作确定治疗进程的预示物。
在一实施方案中，PAX2-比-DEFB1表达率为100∶1或更高是个体存在乳腺癌的指征，而PAX2-比-DEFB1表达率小于100∶1是个体存在非癌或癌前乳腺疾病的指征。
在另一实施方案中，所述测定步骤包括测定相对于对照基因表达水平的PAX2基因表达水平；测定相对于同一对照基因表达水平的DEFB1基因表达水平；以及基于PAX2和DEFB1的表达水平确定PAX2-比-DEFB1表达率。
在一实施方案中，所述方法还包括测定获自患有乳腺疾病的乳腺组织的细胞中雌激素受体/孕激素受体/人表皮生长因子受体2(ER/PR/HER2)的状态。
本发明另一方面涉及用于监测乳腺疾病的试剂盒。在一实施方案中，用于监测乳腺疾病的试剂盒包含：用于检测组织样品中PAX2表达的一对或多对寡核苷酸引物，用于检测组织样品中DEFB1表达的一对或多对寡核苷酸引物，以及如何利用所述引物测定组织样品中PAX2-比-DEFB1表达率的说明书。在另一实施方案中，用于检测PAX2表达的一对或多对寡核苷酸引物包括选自以下的寡核苷酸引物对：SEQ ID NOS：43和47，SEQ ID NOS：44和48和SEQ ID NOS：45和49。在另一实施方案中，用于检测DEFB1表达的一对或多对寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS：35和37。
在另一实施方案中，所述试剂盒还包含一对或多对对照寡核苷酸引物。在一实施方案中，所述一对或多对对照寡核苷酸引物包括用于检测β-肌动蛋白表达的寡核苷酸引物。在优选实施方案中，所述用于检测β-肌动蛋白表达的寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS：34和36。
在另一实施方案中，所述一对或多对对照寡核苷酸引物包括用于检测GAPDH表达的寡核苷酸引物。在优选实施方案中，所述用于检测GAPDH表达的寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS：42和46。
在另一相关实施方案中，所述试剂盒还包含用于PCR反应的一种或多种试剂。
在又一相关实施方案中，所述试剂盒还包含用于RNA提取的一种或多种试剂。
在另一实施方案中，用于监测乳腺疾病的试剂盒包含具有用于检测PAX2和DEFB1表达的寡核苷酸探针的寡核苷酸微阵列，以及如何利用所述寡核苷酸微阵列测定PAX2-比-DEFB1表达率的说明书。
在相关实施方案中，所述试剂盒还包含用于从组织样品中提取RNA的试剂。
本发明另一方面涉及确定用于患有乳腺疾病的个体的治疗方案的方法。所述方法包括以下步骤：测定获自所述患有乳腺疾病个体的乳腺组织的细胞中相对于对照基因表达水平的PAX2基因表达水平，以及基于PAX2基因的相对表达水平确定用于所述个体的治疗方案。
附图简要说明
并入和组成本说明书一部分的附图阐述了所公开方法和组合物的几种实施方案，并与本部分说明一起用于说明所公开方法和组合物的原理。
图1给出β-防御素-1(DEFB1)表达的定量RT-PCR(QRT-PCR)分析。为验证诱导DEFB1表达，进行QRT-PCR。图1A给出比较来自经过根治性前列腺切除术的6名患者的临床样品中的DEFB1相对表达水平。图1B给出在DEFB1诱导之前和之后比较良性和恶性前列腺临床样品、hPrEC细胞和前列腺癌细胞系中的DEFB1相对表达水平。图1C给出分析单个组织切片中良性组织、恶性组织和前列腺上皮内瘤变(PIN)中的DEFB1相对表达水平。图1D给出比较一名患者中良性组织、恶性组织和PIN中的DEFB1表达与良性组织中存在的平均DEFB1表达水平。
图2给出DEFB1诱导膜完整性和细胞形态变化的显微镜分析。通过相差显微镜分析DEFB1诱导48小时之后的DU145、PC3和LNCaP的细胞形态。黑色箭头指示膜波动，白色箭头指示凋亡小体。
图3给出前列腺癌细胞中DEFB1的细胞毒性分析。用PonA处理前列腺细胞系DU 145、PC3和LNCaP来诱导DEFB1表达1-3天，之后进行MTT检测以确定细胞活力。结果表示为平均值±标准偏差，n＝9。
图4给出由DEFB1诱导DU145和PC3细胞的细胞死亡。诱导前列腺癌细胞系DU145(A)和PC3(B)中的DEFB1表达，然后经过膜联蛋白V/FITC/碘化丙啶染色和流式细胞仪分析。碘化丙啶和膜联蛋白V阳性细胞被认为是凋亡的。各图下方给出诱导时间。对于每个时间点，框旁边的数字表示碘化丙啶(PI)-膜联蛋白V+细胞(右下象限)，以及PI+膜联蛋白V+细胞(右上象限)的百分比。数据来自代表三个独立试验的单次试验。
图5给出DEFB1诱导之后的泛-半胱天冬酶(pan-caspase)分析。DU145和PC3细胞用FAM-VAD-FMK-标记的氟甲基酮染色来检测半胱天冬酶活性。DIC下可见每种条件下的细胞。共聚焦显微镜分析显示对照DU145(B)、PC3细胞(F)和LNCaP细胞(J)中没有半胱天冬酶染色。用PonA处理细胞24小时诱导DEFB1显示DU145(D)和PC3(H)中的半胱天冬酶活性。LNCaP(L)中未检测到半胱天冬酶活性。
图6给出PAX2 siRNA处理之后配对盒同源基因2(PAX2)蛋白表达的沉默。图6A给出用PAX2 siRNA双螺旋转染的PC3和DU145细胞在第0日(泳道1)、第2日(泳道2)和第4日(泳道3)的Western印迹分析。图6B给出用PAX2 siRNA双螺旋转染的PC3和DU145细胞在第0日(泳道1)、第2日(泳道2)、第4日(泳道3)和第6日(泳道4)的Western印迹分析。早在处理4日(泳道3)之后DU145细胞中不能检测到PAX2蛋白，处理6日之后PC3细胞中不能检测到PAX2蛋白。将印迹清除并重新探测作为内参的β-肌动蛋白。
图7给出对用PAX2 siRNA处理之后的前列腺癌细胞生长的分析。于第6日通过相差显微镜分析存在于正常生长培养基中的DU145、PC3和LNCaP。用阴性对照siRNA处理对细胞没有影响。然而，用PAX2 siRNA处理之后显著减少全部三种细胞系的细胞数量。
图8给出对siRNA沉默PAX2之后的细胞死亡的分析。用0.5μg的四种PAX2 siRNA或四种非特异的对照siRNA池处理前列腺癌细胞系PC3、DU145和LNCaP 2、4或6天之后，进行MTT检测以测定细胞活力。结果表示为平均值±标准偏差，n＝9。
图9给出对半胱天冬酶活性的分析。用PAX2 siRNA处理之后，用羧基荧光素标记的氟甲基酮染色DU145、PC3和LNCaP细胞来检测半胱天冬酶活性。未处理和处理的细胞的共聚焦显微镜分析显示，细胞用DIC可见。荧光下分析显示，对照DU145(B)、PC3细胞(F)和LNCaP细胞(J)无半胱天冬酶染色。然而，用PAX2 siRNA处理的细胞诱导DU145(D)、PC3(H)和LNCaP(L)中的半胱天冬酶活性。
图10给出对PAX2 siRNA处理之后的凋亡因子的分析。比较未处理对照细胞和用PAX2 siRNA处理6日的细胞中促凋亡因子表达的变化。图10A显示Bcl-2-相关X蛋白(BAX)表达水平在DU145、PC3和LNCaP中增加。图10B显示BH3结构域凋亡诱导蛋白(BID)表达在DU145和LNCaP中增加，但在PC3中改变。图10C显示Bcl-2-相关死亡促进因子(BAD)表达水平在全部三种细胞系中均增加。
图11给出PAX2与DNA识别序列结合的模型。PAX2转录阻遏物结合到直接邻近DEFB1 TATA盒的CCTTG(SEQ ID NO：1)识别位点，从而阻止转录和DEFB1蛋白表达。PAX2蛋白表达的抑制允许正常DEFB1表达。
图12显示DEFB1报告构建体。将来自DU145细胞的由mRNA起始位点上游前160个碱基组成的DEFB1启动子进行PCR扩增，并连接到pGL3荧光素酶报告质粒。
图13给出抑制PAX2导致DEFB1表达。用PAX2 siRNA处理DU145、PC3、LNCaP和HPrEC 48小时。处理之前的QRT-PCR分析显示DU145、PC3和LNCaP中没有DEFB1表达。然而，处理之后全部细胞系中的DEFB1表达恢复。siRNA处理之后PAX2-缺失的HprEC中的DEFB1表达没有变化。
图14给出抑制PAX2导致DEFB1启动子活性增强。产生PC3启动子/pGL3和DU145启动子/pGL3构建体，并分别转染至PC3和DU145细胞。比较由siRNA处理抑制PAX2之前和之后的启动子活性。处理之后，DU145中的DEFB1启动子活性增强2.65倍，PC3中增强3.78倍。
图15给出PAX2与DEFB1启动子结合的ChIP分析。对DUI45和PC3细胞进行ChIP分析。用抗-PAX2抗体免疫沉淀之后，进行PCR以检测含有GTTCC(SEQ ID NO：2)PAX2识别位点的DEFB1启动子区。这证实前列腺癌细胞系中的PAX2转录阻遏物与DEFB1启动子结合。
图16给出PrdPD和PrdHD与DNA的预测结构。将PrdPD结合至DNA(Xu et al.，1995)和PrdHD结合至DNA(Wilson et al.，1995)的结构的协同用于构建两个结构域结合至PH0位点的模型。各结合位点以所示的特定的方向彼此邻接。RED结构域基于PrdPD晶体结构定向。
图17给出不同配对结构域共有序列的比较。在图顶部示出Prd-配对-结构域±DNA复合物晶体学分析中所描述的蛋白±DNA接触的示意图。空框指示α-螺旋，阴影框指示β-折叠，以及粗线指示β-转角。接触的氨基酸由单字母代码给出。仅给出直接接触的氨基酸±碱基。空圈指示大沟接触，而红箭头指示小沟接触。该示意图是配对结构域蛋白所有已知共有序列的比对(仅给出正义链)。共有序列之间的垂直线指示保守的碱基对。位置编号在图底部给出。
图18给出靶向PAX2作为化学预防性策略。异常的PAX2表达是癌症开始和发展的早期事件。发育异常过程中或其它癌前阶段抑制PAX2可以用于癌症预防。
图19给出血管紧张素II(Ang II)对DU145细胞中PAX2表达的影响。为测定AngII对PAX2表达的影响，处理之后监测DEFB1蛋白水平。此时PAX2表达水平早在4小时就增加并且持续到48小时。
图20A给出洛沙坦(Los)对DU145细胞中PAX2表达的影响。用血管紧张素II-1型受体(ATR1)阻断剂洛沙坦处理DU145细胞。QRT-PCR显示处理之后PAX2信息水平降低至少一半。图20B给出血管紧张素II-2型受体(ATR2)阻断剂对DU145细胞中PAX2表达的影响。为测定ATR2受体对PAX2表达的影响，用ATR2受体阻断剂PD123319处理DU145细胞。此时，PAX2表达增加7至8倍。
图21给出Los阻断AngII对DU145细胞中PAX2表达的影响。用5μM AngII处理DU145细胞72小时导致PAX2表达增加2倍。此外，用10μM处理72小时导致表达增加超过3倍。用5μM洛沙坦处理细胞阻抑增殖50％。此外，在用AngII处理之前用洛沙坦处理30分钟阻断AngII对增殖的影响。
图22给出AngII增加DU145细胞增殖。用5μM AngII处理DU145细胞72小时导致增殖增加2倍。此外，用10μM处理72小时导致增殖增加超过3倍。
图23给出Los和MAP激酶抑制剂对DU145细胞中PAX2表达的影响。图23A显示用洛沙坦处理DU145细胞阻抑磷酸化-ERK1/2和PAX2表达；图23B显示MEK激酶抑制剂和AICAR阻抑PAX2蛋白表达；图23C给出MEK激酶抑制剂和洛沙坦阻抑磷酸化-STAT3蛋白表达。
图24给出Los和MEK激酶抑制剂对DU145细胞中PAX2活化的影响。图24A显示用AT1R信号转导抑制剂处理DU145细胞导致磷酸化-PAX2蛋白(其为PAX2的活化形式)水平降低。此外，用AMP激酶诱导剂AICAR处理导致阻抑PAX2表达。图24B显示用Los抑制AT1R信号转导降低磷酸化-JNK水平。然而，AngII增加磷酸化-JNK蛋白水平。
图25给出AngII在hPrEC细胞中增加PAX2表达而降低DEFB1表达。为测定AngII对hPrEC中PAX2水平的影响，处理细胞72和96小时，并通过QRT-PCR检测PAX2和DEFB1表达。此时，AngII处理导致PAX2显著增加至与PC3前列腺癌细胞相似的水平。相反地，AngII处理之后显著降低DEFB1表达。
图26给出AngII信号转导和PAX2前列腺癌的示意图。前列腺癌细胞中的PAX2表达由AT1R信号转导通路调控。具体地，MEK激酶信号转导级联致使PAX2表达增加。此外，AT1R和AngII通过JNK上调PAX2活化作用。
图27给出阻断PAX2表达作为前列腺癌疗法的示意图。图27A给出PAX2表达由AT1R信号转导通路调控。抑制PAX2表达导致DEFB1重新表达和癌细胞死亡。图27B给出阻断AT1R，下游激酶或直接抑制PAX2的化合物提供治疗前列腺癌的新方法。
图28给出用Gleason评分对DEFB1和PAX2表达的比较。比较来自经过根治性前列腺切除术的6名患者的良性临床样品中DEFB1相对表达水平。此时Gleason评分与邻近良性前列腺组织中DEFB1表达水平负相关。相对DEFB1表达水平大于0.005的患者的Gleason评分为6。然而，表达水平小于0.005的患者的Gleason评分为7。
图29给出PAX2-DEFB1比值作为前列腺癌发展的预测因子。对激光捕获显微切割(LCM)的前列腺组织切片进行QRT-PCR以测定相对DEFB1和PAX2表达水平。从正常到PIN到癌症，DEFB1表达水平降低。然而，从正常到PIN到癌症，PAX2表达增加。此外，Gleason评分为6的癌症患者#1457的正常组织和PIN中相对Gleason评分为7的癌症患者#1569具有更多的DEFB1。相反地，患者#1569的癌区域与患者#1457相比具有更高的PAX2水平。
图30给出Donald预测因子(DPF)是基于相对PAX2-DEFB1表达比值。提高前列腺组织的DPF增加了发展前列腺癌的机会。基于DPF，PAX2-DEFB1比值为0至39的组织是正常的(良性)。基于DPF量表，PAX2-DEFB1比值为40至99的组织代表PIN(癌前)。最后，PAX2-DEFB1比值为100至500的组织是恶性的(低于高级别癌症)。
图31给出对人前列腺组织中hBD-1表达的分析。将来自经过根治性前列腺切除术的患者的正常临床样品中的hBD-1相对表达水平进行比较。虚线用作比较从粗略切割和LCM的样本获得的值的参考点，并且相应的Gleason评分在各误差棒上方示出。图31A给出比较由粗略切割获得的组织中的hBD-1表达水平。图31B给出比较由激光捕获显微切割获得的组织中的hBD-1表达水平。
图32给出对前列腺细胞系中hBD-1表达的分析。图32A给出与hPrEC细胞相比，在hBD-1诱导之前和之后前列腺癌细胞系中的hBD-1表达水平。一个星号代表相比hPrEC统计学更高的表达水平。两个星号代表相比hBD-1诱导之前的细胞系统计学显著的表达水平(学生t-检验，p＜0.05)。图32B给出通过免疫细胞化学证实前列腺癌细胞系DU145中的异常hBD-1表达。将hPrEC细胞对hBD-1进行染色作为阳性对照(a：DIC和b：荧光)。用hBD-1转染DU145细胞并诱导18小时(c：DIC和d：荧光)。比例尺＝20μM。
图33给出前列腺癌细胞中hBD-1的细胞毒性分析。用Pon A处理前列腺细胞系DU145、PC3、PC3/AR+和LNCaP来诱导hBD-1表达1-3天，之后进行MTT测定以确定细胞活力。每个误差棒代表一式三份进行三个独立试验的平均值±标准误。
图34给出正常、PIN和肿瘤的LCM人前列腺组织切片中hBD-1和cMYC表达的QRT-PCR分析。每种基因的表达表示为与β-肌动蛋白相比的表达率。图34A给出正常、PIN和肿瘤切片中hBD-1表达水平的比较。图34B给出正常、PIN和肿瘤切片中cMYC表达水平的比较。
图35给出用siRNA敲低PAX2之后的hBD1表达的QRT-PCR分析。hBD-1表达水平表示为与β-肌动蛋白相比的表达率。星号代表与PAX2siRNA处理之前的细胞系相比统计学更高的表达水平(学生t-检验，p＜0.05)。
图36给出PAX2 siRNA处理之后的PAX2蛋白表达的沉默。图36A给出通过Western印迹分析检测HPrEC前列腺原代细胞(泳道1)以及DU145(泳道2)、PC3(泳道3)和LNCaP(泳道4)前列腺癌细胞中的PAX2表达。将印迹清除并重新探测作为内参的β-肌动蛋白，以确保等量上样。图36B给出用PAX2 siRNA双螺旋感染之后DU145、PC3和LNCaP的Western印迹分析，全部证实PAX2表达敲低。同样地，将印迹清除并重新探测作为内参的β-肌动蛋白。
图37给出对用PAX2 siRNA处理之后的前列腺癌细胞生长的分析。在阴性对照非特异siRNA存在下，于第6日通过相差显微镜分析HprEC(A)、LNCaP(C)、DU145(E)和PC3(G)。用PAX2 siRNA处理之后，DU145(D)、PC3(F)和LNCaP(H)的细胞数量显著减少。然而，似乎对HprEC(B)没有影响。比例尺＝20μm。
图38给出对siRNA沉默PAX2之后的细胞死亡的分析。用PAX2siRNA或非特异的阴性对照siRNA处理前列腺癌细胞系PC3、DU145和LNCaP 2、4或6日之后，进行MTT测定。PAX2的敲低导致全部三种细胞系中的相对细胞活力降低。结果表示为平均值±标准偏差，n＝9。
图39给出对半胱天冬酶活性的分析。用PAX2 siRNA处理之后，DU145、PC3和LNCaP细胞用羧基荧光素标记的氟甲基酮染色来检测半胱天冬酶活性。荧光下分析显示对照DU145(A)、PC3细胞(C)和LNCaP细胞(E)中没有半胱天冬酶染色。然而，用PAX2 siRNA处理的细胞中，在DU145(B)、PC3(D)和LNCaP(F)中诱导半胱天冬酶活性。比例尺＝20μm。
图40给出对PAX2 siRNA处理之后的凋亡因子的分析。比较未处理的对照细胞和用PAX2 siRNA处理6天的细胞中促凋亡因子表达的变化。图40A显示在PAX2敲低之后的DU145、PC3和LNCaP中，BAD表达增加。图40B显示BID表达水平在LNCaP和DU145中增加，但在PC3细胞中未增加。图40C显示AKT表达在LNCaP和DU145中降低。然而，PAX2敲低之后的PC3细胞中的AKT表达没有变化。结果表示为平均值±标准偏差，n＝9。星号代表统计学差异(p＜0.05)。
详述
除非另外限定，本文所使用的全部技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常的理解相同的含义。必须注意的是，除非上下文清楚地另外指明，本文和所附权利要求书所使用的“一(a)”、“一(an)”和“所述”包括复数。因此，例如对于“一肽(a peptide)”包括多种这样的肽，对于“所述肽”是指一种或多种肽及本领域技术人员所了解的其等同物等。
本发明一方面涉及监测癌症发展的方法。在某些实施方案中，所述方法涉及监测个体前列腺或乳腺的癌前状态(如上皮内瘤变)及癌症状态。所述方法包括测定获自个体的前列腺或乳腺细胞中配对盒2基因-比-β-防御素-1基因(PAX2-比-DEFB1)表达率，其中所述PAX2-比-DEFB1表达率与前列腺或乳腺疾病相关。基因表达率可以在mRNA水平(例如通过RT-PCR或寡核苷酸阵列)测定，或在蛋白水平(例如通过蛋白免疫印迹杂交或抗体阵列)测定。
在某些实施方案中，PAX2-比-DEFB1表达率在mRNA水平测定，并且在说明书中被称为“Donald预测因子”或“DPF”。
在某些实施方案中，将前列腺的PAX2-比-DEFB1表达率(在RNA水平侧测定)用于区别个体中正常、癌前和癌性的前列腺状态。在一实施方案中，PAX2-比-DEFB1比值为小于40∶1是正常前列腺状态的指征，PAX2-比-DEFB1比值为至少40∶1至小于100∶1是前列腺上皮内瘤变(PIN)的指征，而PAX2-比-DEFB1比值为至少100∶1是前列腺癌的指征。
还提供了用于诊断个体中前列腺癌的方法。所述方法包括检测来自个体的前列腺细胞中PAX2和β-防御素(DEFB1)的水平，其中所述PAX2比DEFB1比值为至少100∶1。
还提供了诊断个体中前列腺上皮内瘤变(PIN)的方法。所述方法包括检测来自个体的前列腺细胞中PAX2和βDEFB1的水平，其中所述PAX2比DEFB1的比值为至少40∶1并小于100∶1。
在某些另外的实施方案中，将乳腺的PAX2-比-DEFB1表达率(在RNA水平)用于区别个体中非癌(良性和/或癌前)和癌性乳腺疾病。在一实施方案中，PAX2-比-DEFB1的比值为小于100∶1是非癌(正常)和/或癌前(乳腺上皮内瘤变(MIN))的指征，而PAX2-比-DEFB1比值为至少100∶1是乳腺癌的指征。
还提供了用于诊断个体中乳腺癌的方法。所述方法包括检测来自个体的乳腺细胞中PAX2和DEFB1的水平，其中PAX2比DEFB1比值为至少100∶1是个体中乳腺癌的指征。还提供了用于诊断个体中非癌乳腺疾病(正常和/或MIN)的方法。所述方法包括检测来自个体的乳腺细胞中PAX2和DEFB1的水平，其中PAX2-比-DEFB1比值为小于100∶1是个体非癌乳腺疾病的指征。
在一实施方案中，所述方法还包括测定获自具有乳腺疾病的乳腺组织的细胞中雌激素受体/孕激素受体(ER/PR)的状态。为了确定个体中的乳腺疾病，乳腺组织的ER/PR状态可以与同一组织的PAX2-比-DEFB1比值组合使用。
以下所使用的术语“乳腺上皮内瘤变”包括小叶上皮内瘤变和乳腺导管上皮内瘤变。
本发明的监测和诊断方法向临床医生提供了启动或癌前组织的预示物。该检测的候选者包括处于癌症高风险的患者(基于年龄、种族)。作为诊断，阳性或阴性PAX2测试之后可以通过用生物标志物的其它筛选来确定癌症位置。此外，这些患者可以是用PAX2/DEFB1调节剂治疗的候选者。可选择地，该测试可以用于患者(即那些具有三阴性乳腺癌的患者)，作为她们癌症治疗效果的测量标准，以确定治疗进程或监测癌症复发。
作为另一实例，存在癌症的潜在指示物(如临床医生在直肠指诊过程中发现前列腺的节结)的患者或者那些经历PSA突然增加的患者通常处于“观察等待(Watchful Waiting)”状态。通常很难确定这些患者是否患有癌症或将发展成癌症。检测来自这些患者的样品(如血浆/血清)中PAX2-比-DEFB1比值，可以用于辅助确定获得疑似患有前列腺癌的男性的活组织检查，这可以降低不必要的前列腺活组织检查的数量减少并且可以更早地干预他们的疾病。
前列腺癌
前列腺癌筛选目前由直肠检查和前列腺特异抗原(PSA)水平的测量组成。这些方法缺少特异性，因为直肠指诊在检测者之间有相当大的可变性，而PSA水平可能在良性前列腺增生(BPH)、前列腺炎和其他疾病中提高。
前列腺癌可以利用Gleason系统进行评分(Gleason，et al.1966)。这利用组织构造而非细胞学特征。使用级别1至5(由好至差来区分)，并且结合损伤最频繁和更严重区域的组合评分。除评估肿瘤阶段(分期)之外，Gleason评分提供的预测信息可能是有价值的。2至4和8至10的Gleason评分具有良好的预测值，但是大约四分之三的肿瘤具有中间值。
两种主要系统用于前列腺癌分期：TNM系统和Jewett系统(Benson&Olsson，et al.1989)。分期考虑了肿瘤的任何转移性扩散并且很困难，因为很难评估局部的淋巴结转移或局部浸润。肿瘤大小也很难测量，因为不能通过肉眼区分肿瘤组织与正常前列腺组织，而且因为前列腺没有明显的包膜且由纤维脂肪组织层环绕。
前列腺肿瘤的(T)分期描述为从T1至T4的四类。对于T1，癌症是显微镜可见的，单侧的且不可触知的。医生不能感觉到肿瘤或用成像如经直肠超声看见肿瘤。对BPH的治疗可显露该疾病，或者通过使用穿刺活组织检查来证实，因为PSA提高。对于T2，医生可以用DRE感觉到肿瘤。该疾病似乎限于前列腺的腺体的一侧或两侧。对于T3，肿瘤已发展到腺体外部邻近的组织。对于T4，肿瘤已扩散到身体的其他部位。
因此，目前的筛选方法不能令人满意；没有诊断前列腺癌或者预测或防止其可能的转移性扩散的可靠方法是导致大部分患者死亡的主要原因。
乳腺癌
普遍用于乳腺癌筛选的方法包括自我和临床乳腺检查，x-射线乳腺摄影以及乳腺磁共振成像(MRI)。乳腺癌筛查的最新技术是超声计算机断层成像术，其利用声波形成三维图像并且乳腺癌在不用x-射线乳腺摄影中所用的危险放射线的情况下检测乳腺癌。还可以使用基因测试。用于乳腺癌的基因测试一般包括测试BRCA基因中的突变。这除了对那些有提高乳腺癌风险的患者，通常是不推荐的技术。
女性死亡的主要原因，乳腺癌的发生率，在美国过去这三十年逐渐增加。虽然乳腺癌的发病机理尚不清楚，但是正常乳腺上皮细胞转化成恶性表型可能是遗传因素的结果，尤其是30岁以下的女性(Miki et al.，1994，Science，266：66-71)。最近，BRCA1和BRCA2的发现和表征已扩大了我们对能促进家族乳腺癌的遗传因素的理解。这两个基因座内的生殖细胞系突变与50-85％的乳腺癌和/或卵巢癌的终身风险相关(Casey，1997，Curr.Opin.Oncol.9：88-93；Marcus et al，1996，Cancer 77：697-709)。然而，其它非遗传因素很可能对该疾病的病因也具有重大影响。无论其起因是什么，如果在其进程早期未被检测到，那么乳腺癌发病率和死亡率会显著增加。因而，大量工作已集中于乳腺组织的细胞转化和肿瘤形成的早期检测上。
目前，鉴定乳腺癌的主要方式是通过检测致密肿瘤组织的存在。这可以通过直接检查乳腺外部或通过乳腺摄影或其它X-射线成像方法来实现不同程度的效力(Jatoi，1999，Am.J.Surg.177：518-524)。然而，后面的方法有相当大的代价。每当进行乳腺摄影时，患者承受测试过程中所使用的放射线的电离特性所诱导的较小的患有乳腺肿瘤的风险。此外，该方法昂贵并且技术员的主观解释可能导致不精确，例如，一项研究表明，对于由所调查的一组放射科医生单独解释的一组乳腺影像，大约三分之一存在主要临床分歧。此外，许多女性感到进行乳腺摄影是痛苦的经历。因此，国家癌症研究所并不推荐50岁以下的女性进行乳腺摄影，因为与年纪较大的女性相比，该群体发展成乳腺癌的可能性较低。然而，引人注意的是，虽然50岁以下的女性仅有约22％发生乳腺癌，但数据显示绝经前女性的乳腺癌更具侵袭性。
PAX2
PAX基因是编码核转录因子的九个发育调控基因家族。它们在胚胎发生中起重要作用，并且以非常有序的时空模式表达。它们全部包含编码DNA结合结构域的384个碱基对区域的“配对盒”区，所述“配对盒”区在整个进化过程中是高度保守的(Stuart，ET，et al.1994)。通过许多可直接归因于Pax基因的杂合不足的天然鼠和人类综合症已证实Pax基因对发育过程的影响。Dressier等(1990)已给出PAX2序列。人PAX2蛋白及其变体的氨基酸序列，以及编码这些蛋白的DNA序列列于SEQ ID NOS：58-69(SEQ ID NO：58，由人PAX2基因的外显子1编码的氨基酸序列；SEQ ID NO：59，人PAX2基因启动子和外显子1；SEQ ID NO：60，人PAX2的氨基酸序列；SEQ ID NO：61，人PAX2基因；SEQ ID NO：62，人PAX2基因变体b的氨基酸序列；SEQ ID NO：63，人PAX2基因变体b；SEQ IDNO：64，人PAX2基因变体c的氨基酸序列；SEQ ID NO：65，人PAX2基因变体c；SEQ ID NO：66，人PAX2基因变体d的氨基酸序列；SEQ IDNO：67，人PAX2基因变体d；SEQ ID NO：68，人PAX2基因变体e的氨基酸序列；SEQ ID NO：69，人PAX2基因变体e)。
已检测PAX2表达的癌症的例子列于表1。
表1：表达PAX2的癌症
DEFB1
β-防御素是具有广谱抗微生物活性的阳离子肽，其是上皮细胞和白细胞的产物。有两个外显子的单基因产物表达于上皮表面并且在包括皮肤、角膜、舌、牙龈、唾腺、食道、肠、肾、泌尿生殖道、以及呼吸上皮的位置分泌。至今，已在人类中鉴定和表征了上皮来源的五种β-防御素基因：DEFB1(Bensch et al.，1995)，DEFB2(Harder et al.，1997)，DEFB3(Harder et al.，2001；Jia et al.，2001)，DEFB4和HE2/EP2。
每种β-防御素基因产物的一级结构的特征为小型、六个半胱氨酸基序、高阳离子电荷以及这些特征之外的极度多样性。防御素蛋白最典型的特征是其形成三个二硫键网的六个半胱氨酸基序。β-防御素蛋白的三个二硫键位于C1-C5、C2-C4和C3-C6。相邻半胱氨酸残基之间最常见的间距是6、4、9、6、0。除了位于最接近羧基末端的C5和C6外，β-防御素蛋白的半胱氨酸之间的间距可以相差一个或两个氨基酸。在所有已知的脊椎动物β-防御素基因中，这两个半胱氨酸残基彼此相邻。
β-防御素蛋白的第二个特征是其小型。每种β-防御素基因编码的前蛋白原的大小范围为59至80个氨基酸(平均大小为65个氨基酸)。接着该基因产物通过未知机制剪切形成大小范围为36至47个氨基酸(平均大小为45个氨基酸)的成熟肽。这些范围的例外是包含β-防御素基序并且表达于附睾中的EP2/HE2基因产物。
β-防御素蛋白的第三个特征是高浓度的阳离子残基。成熟肽中带正电荷残基(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)的数量范围为6至14个(平均为9个)。
β-防御素基因产物的最后一个特征是其多样的一级结构但明显保守的三级结构。在该蛋白家族所有已知的成员中，除六个半胱氨酸之外，在给定位置没有一个氨基酸是保守的。然而，有保守的位置似乎对二级和三级结构以及功能是重要的。
尽管β-防御素蛋白的一级氨基酸序列差异很大，但有限的数据表明该蛋白家族的三级结构是保守的。结构核心是三链反向平行的β-折叠，以BNBD-12和DEFB2编码的蛋白作为实例。三条β-链通过β-转角和α-发卡环连接，并且第二β-链还含有β-凸起。当这些结构折叠成其特有的三级结构时，阳离子和疏水残基的随机序列明显聚集成球状蛋白的两个表面。一个表面是亲水的并且含有许多带正电荷的侧链，而另一个表面是疏水的。在溶液中，由DEFB2基因编码的HBD-2蛋白在N-末端附近显示α-螺旋区段，这以前没有被认为是α-防御素或β-防御素BNBD-12的溶液结构。β-防御素蛋白之间，其侧链指向蛋白表面的氨基酸更不保守，而核心β-折叠的三条β-链的氨基酸残基是更高度保守的。
β-防御素肽作为前肽原(pre-pro-peptides)产生，然后剪切以释放C-末端活性肽片段；然而，人β-防御素肽在气道上皮的细胞内加工、贮存和释放途径是未知的。
PAX2-比-DEFB1表达率的测定
本领域内已知的任何方法都可以测量组织中PAX2和DEFB1的表达水平。在某些实施方案中，靶组织中PAX2和DEFB1表达水平通过测定直接来自靶组织如活检样品的细胞中PAX2和DEFB1的水平来测定。在其他实施方案中，靶组织中PAX2和DEFB1表达水平通过间接测定某些体液如血液或血浆中PAX2和DEFB1的水平来测定。
在某些实施方案中，利用来自前列腺或乳腺的细胞样品测量个体的前列腺或乳腺中PAX2和DEFB1的表达水平。细胞样品包括前列腺或乳腺的活检样品以及血液样品。活检是将从靶器官取下小的组织样品用于进一步分析的程序。当来自PSA血液实验的评分增加到与可能存在前列腺癌相关的水平时通常进行前列腺活检。同样地，具有乳腺肿块或疑似乳腺摄影的患者通常进行乳腺活检。
基因表达水平可以在RNA和蛋白水平进行评估。RNA水平可以例如用DNA阵列、RT-PCR和Northern印迹来测量。蛋白水平可以用免疫测定和酶测定来测量。在某些实施方案中，通过测定相对于对照基因表达水平的PAX2基因表达水平，测定相对于同一对照基因表达水平的DEFB1基因表达水平，以及基于PAX2和DEFB1的表达水平计算PAX2-比-DEFB1表达率，来确定PAX2-比-DEFB1表达率。在一实施方案中，对照基因是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因。
寡核苷酸微阵列
寡核苷酸微阵列由排列的一系列多个被称为“特征(feature)”的寡核苷酸微斑点组成，每个斑点包含少量(一般是皮摩尔级别)特定的寡核苷酸序列。特定的寡核苷酸序列可以是基因或其它寡核苷酸元件的一小部分，其在高严紧条件下可用作与cDNA或cRNA样品杂交的探针。通常基于荧光检测荧光团标记的靶标以测定靶标中核酸序列的相对丰度，来检测和定量探针靶标的杂交。
探针一般通过与化学基质的共价键(通过环氧-硅烷、氨基-硅烷、赖氨酸、聚丙烯酰胺等)而连接至固体表面。固体表面可以是玻璃或硅片或微珠。寡核苷酸阵列与其它类型的微阵列的区别仅在于它们测量核苷酸或使用寡核苷酸作为其检测系统的一部分。
为利用寡核苷酸阵列检测靶组织或细胞中的基因表达，从靶组织或细胞纯化目的核酸。核苷酸可以是用于表达谱分析的全部RNA，用于比较杂交的DNA，或与用于表观遗传或调控研究的免疫沉淀(ChIP-on-chip)的特定蛋白结合的DNA/RNA。
在一实施方案中，通过异硫氰酸胍-酚-氯仿提取法(如Trizol)分离总RNA(称为总的，是因为其在细胞核和细胞质内)。纯化的RNA可以用于定性(如通过毛细管电泳)和定量(如通过利用超微量分光光度计)分析。将总RNA用polyT引物或随机引物逆转录成DNA。DNA产物可以通过PCR任意地进行扩增。在RT步骤或扩增后的其它步骤(如果有的话)中向扩增产物添加标记物。标记物可以是荧光标记物或放射性标记物。然后将标记的DNA产物与微阵列杂交。接着洗涤并扫描微阵列。利用本领域所熟知的方法，基于杂交结果测定目的基因的表达水平。
免疫测定
最简单且直接意义的免疫测定是涉及抗体与抗原结合的结合测试。已知许多类型和形式的免疫测定，并且全部都适用于检测所公开的生物标志物。免疫测试的例子是酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫沉淀测定(RIPA)、免疫微球捕获测定、Western印迹、斑点印迹、凝胶移位测定、流式细胞术、蛋白质阵列、多重微珠阵列、磁捕获法、体内成像、荧光共振能量转移(FRET)以及光褪色后荧光复现/定位(FRAP/FLAP)。
一般而言，免疫测定包括在允许形成免疫复合物的有效条件下，根据具体情况，将疑似含有目的分子(如所公开生物标志物)的样品与该目的分子的抗体接触，或者将目的分子的抗体(如所公开生物标志物的抗体)与能够与该抗体结合的分子接触。许多形式的免疫测定中，可以洗涤样品-抗体组合物如组织切片、ELISA平板、斑点印迹或Western印迹，以去除任何非特异结合的抗体物质，允许仅检测一级免疫复合物内特异结合的那些抗体。
放射免疫沉淀测定(RIPA)是利用放射性标记的抗原来检测血清中特异抗体的灵敏测定。允许抗原与血清反应，然后利用专用试剂如，例如蛋白A琼脂糖珠来沉淀。接下来通过凝胶电泳常规分析所结合的放射性标记的免疫沉淀物。放射免疫沉淀测定(RIPA)常常用作诊断HIV抗体存在的验证试验。本领域内RIPA还被称为Farr测定、沉淀素测定、放射免疫沉淀素测定以及放射免疫沉淀分析。
还考虑的是免疫测定，其中将蛋白或蛋白特异抗体结合至固相载体(如管、孔、珠或小室)，与检测载体上蛋白或蛋白特异抗体的方法相结合，从而从样品分别捕获目的抗体或蛋白。这样的免疫测定的例子包括放射性免疫测定(RIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，流式细胞术，蛋白质阵列，多重微珠阵列以及磁捕获法。
蛋白质阵列是利用表面上固定蛋白的固相配体结合测定系统，所述表面包括玻璃、膜、微量滴定孔、质谱仪板以及微珠或其它物体。测定是高度平行的(多重)并且常常是小型化(微阵列，蛋白芯片)的。它们的优点包括快速和可自动化，能高灵敏度、节约试剂以及一次实验产生大量的数据。生物信息学支持是重要的，数据处理需要先进的软件和数据比较分析。然而，软件可以根据所用的DNA阵列改编，正如硬件和检测系统可以的那样。
捕获阵列形成用于表达谱的诊断芯片和阵列的基础。它们使用高亲和力捕获试剂如常规抗体，单结构域，改造的支架，肽或核酸适配子，以高通量方式结合和检测特异靶配体。抗体阵列可商购获得。除常规抗体之外，来自camelids或工程化人等同的单一V-结构域的Fab和scFv片段(Domantis，Waltham，MA)也可以用于阵列中。
非蛋白捕获分子，特别是以高特异性和亲和力与蛋白配体结合的单链核酸适配子也可以用于阵列中(SomaLogic，Boulder，CO)。适配子通过SelexTM程序选自寡核苷酸库，并且它们与蛋白的相互作用可以通过掺入溴脱氧尿苷和UV-活化的交联(光适配子，photoaptamer)由共价连接增强。与配体光交联由于特定空间需要而减少适配子的交叉反应。适配子具有通过自动化寡核苷酸合成而便于生产以及DNA稳定和健全的优点；在光适配子阵列上，通用荧光蛋白染色可以用于检测结合。
可选择的捕获分子阵列是通过“分子印刷”技术制备的阵列，其中肽(例如来自蛋白C-末端)用作模板，以在可聚合基质上产生结构互补的、序列-特异的孔；然后，孔可以特异地捕获具有适当一级氨基酸序列的(变性的)蛋白(ProteinPrintTM，Aspira Biosystems，Burlingame，CA)。
可以用于诊断和表达谱分析中的另一方法是Protein
阵列(Ciphergen，Fremont，CA)，其中固相色谱表面结合具有与混合物如血浆或肿瘤提取物相似的电荷或疏水性特征的蛋白，并且SELDI-TOF质谱分析用于检测残留的蛋白。
其它有用的方法包括通过于芯片上固定大量纯化的蛋白构建大型功能性芯片，以及多重微珠测定。
抗体
术语“抗体”在本文中以广泛意义使用，并且包括多克隆和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子，术语“抗体”还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及人或人源化形式的免疫球蛋白分子或其片段，只要它们有与例如PAX2或DEFB1相互作用，使得PAX2受到抑制而不能与DEFB1相互作用的能力就选择它们。还公开了与参与PAX2和DEFB1相互作用的PAX2或DEFB1的公开区域结合的抗体。利用本文所描述的体外测定或通过类似的方法可以检测抗体的期望活性，之后根据已知的临床检测方法测试它们的体内治疗和/或预防活性。
本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而其余的链与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这种抗体的片段，只要它们表现出期望的拮抗活性(参见美国专利号4,816,567和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。
本文所使用的术语“抗体”还指人抗体和/或人源化抗体。许多非人抗体(例如源自小鼠、大鼠或兔的那些抗体)是人的天然抗原，因而给予人时能产生不想要的免疫应答。因此，在方法中使用人或人源化抗体用于减少给予人的抗体引起不想要的免疫应答的机会。非人抗体的人源化方法是本领域所熟知的。
药物基因组学
在另一实施方案中，将PAX2和/或DEFB1表达谱用于确定乳腺癌的药物基因组学。药物基因组学是指个体的基因型与该个体对外来化合物或药物响应之间的关系。治疗的代谢差异可以通过改变药理活性药物的剂量和血液浓度之间的关系而导致严重的毒性或治疗失效。因而，内科医生或临床医生可考虑应用相关药物基因组学研究中获得的信息来确定是否给予抗癌药物，以及调整用抗癌药物治疗的剂量和/或治疗方案。
由于改变的药物处置和在受影响人体中的异常作用，药物基因组学处理临床上响应于药物的显著的遗传变异。一般而言，可以区分出两种类型的药物基因组学状态。基因状态作为改变药物作用于身体方式(改变药物作用)的单因素传播，或者基因状态作为改变身体作用于药物方式(改变药物代谢)的单因素传播。这些药物基因组学状态能够作为罕见的基因缺失或天然存在的多态性而出现。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷(G6PD)是常见的遗传酶病，其中主要的临床并发症是吸收氧化剂药物(抗-疟疾药、磺胺药物、止痛剂、硝基呋喃)和消耗蚕豆后的溶血。
一种鉴定预测药物响应的基因的药物基因组学方法(所谓“全基因组关联”)主要依赖于由已知基因相关位点(如由人基因组的60,000-100,000个多态或可变位点组成的“双等位基因”的基因标记物图谱，各自具有两种变体)组成的人基因组高分辨率图谱。这样的高分辨率基因图谱可以与统计学上大量的参与II/III期药物试验的个体的各基因组图谱进行比较，以鉴定与特别观察的药物响应或副作用相关的基因。可选择地，这样的高分辨率图谱可以由人基因组的一些千万已知单核苷酸多态性(SNP)的组合形成。本文所使用的术语“SNP”是发生于DNA区段的单核苷酸碱基的常见改变。例如，SNP可能于DNA的每1,000个碱基出现一次。SNP可能与疾病进程相关。然而，绝大多数SNP可能与疾病无关。鉴于基因图谱基于出现这样的SNP，可以将个体分为取决于它们个体基因组的SNP的特定模式的遗传类别。以这样的方式，考虑到遗传相似个体中可能共有的遗传特征，可以对这样的遗传相似的个体组调整治疗方案。因而，将PAX2和/或DEFB 1绘制到乳腺患者的SNP图谱可以允许根据本文所描述的遗传方法更易于鉴定这些基因。
可选择地，可以利用被称为“备选基因方法”的方法来鉴定预测药物响应的基因。根据该方法，若编码药物靶标的基因是已知的，则可以相当容易地在人群中鉴定出该基因的全部共有变体，并且可以确定具有一种形式的基因相对另一基因是否与特定药物响应相关。
如示例性的实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用强度和持续时间的主要决定因素。发现药物代谢酶(如N-乙酰基转移酶2(NAT 2)以及细胞色素P450酶CYP2D6和CYPZC19)的遗传多态性已提供解释为何一些个体未获得预期的药物效应，或者服用标准和安全剂量的药物后显示出过大的药物响应和严重中毒。这些多态性表达于两类表型的人群——广泛代谢者和不良代谢者。普遍的不良代谢者表型在不同人群中是不同的。例如，编码CYP2D6的基因是高度多态的，并且已在不良代谢者中鉴定出几种突变，所述突变全部导致功能性CYP2D6的缺失。CYP2D6和CYP2C19的不良代谢者接受标准剂量时，极其频繁地遭受过大的药物响应和副作用。如果代谢物是活性治疗剂部分，不良代谢者没有显示治疗响应，正如由可待因的CYP2D6-形成的代谢物吗啡介导的其止痛效果所证实。另一极端是对标准剂量无响应的所谓超快代谢者。最近，已鉴定出超快代谢的分子基础是由于CYP2D6基因增殖。
可选择地，可以利用被称为“基因表达谱分析”的方法来鉴定预测药物响应的基因。例如，给予药物的动物的基因表达可以给出与毒性相关的基因通路是否已开启的指征。
由多于一种以上药物基因组学方法所产生的信息可以用于确定预防性或治疗性治疗个体的适当剂量和治疗方案。当应用于剂量或药物选择时，该信息可以避免不利反应或治疗失效，因而增强治疗患乳腺疾病个体时的治疗或预防效力。
在一实施方案中，将个体的PAX2和/或DEFB1表达谱，以及ER/PR状态用于确定对患有乳腺疾病的个体适当的治疗方案。
在另一实施方案中，将PAX2表达水平(一般参照对照基因如肌动蛋白基因或GAPDH基因确定)用于患有三阴乳腺癌(即雌激素受体(ER)阴性，孕酮受体(PR)阴性，人表皮生长因子受体2(HER2)阴性)的患者中来测量癌症疗法的有效性，确定治疗进程或监测癌症复发。
诊断试剂盒
本发明另一方面涉及用于监测乳腺疾病的试剂盒。在一实施方案中，用于监测乳腺疾病的试剂盒包含：用于检测组织样品中PAX2表达的一对或多对寡核苷酸引物，用于检测组织样品中DEFB1表达的一对或多对寡核苷酸引物，以及如何使用所述引物测定组织样品中PAX2-比-DEFB1表达率的说明书。在另一实施方案中，用于检测PAX2表达的一对或多对寡核苷酸引物包括选自以下的寡核苷酸引物对：SEQ ID NOS：43和47，SEQ ID NOS：44和48，以及SEQ ID NOS：45和49。在另一实施方案中，用于检测DEFB1表达的一对或多对寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS：35和37。
在另一实施方案中，所述试剂盒还包含一对或多对照寡核苷酸引物，在一实施方案中，所述一对或多对对照寡核苷酸引物包括用于检测β-肌动蛋白表达的寡核苷酸引物。在优选实施方案中，用于检测β-肌动蛋白表达的寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS：34和36。
在另一实施方案中，所述一对或多对照寡核苷酸引物包括用于检测GAPDH表达的寡核苷酸引物。在优选实施方案中，用于检测GAPDH表达的寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS：42和46。
在另一相关实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种用于PCR反应的试剂。
在又一相关实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种用于RNA提取的试剂。
在另一实施方案中，用于监测乳腺疾病的试剂盒包含具有用于检测PAX2和DEFB1表达的寡核苷酸探针的寡核苷酸微阵列，以及如何使用所述寡核苷酸微阵列测定组织样品中PAX2-比-DEFB1表达率的说明书。
在相关实施方案中，所述试剂盒还包含用于从组织样品中提取RNA的试剂。
本发明进一步通过以下实施例阐述，但所述实施例不应当解释为限制。本申请所引用的全部参考文献、专利和公开申请的内容，以及图和表都通过引用并入本文。
实施例1：人β-防御素-1对晚期前列腺癌是细胞毒性的并且在前列
腺癌肿瘤免疫中起作用
本实施例中，将DEFB1克隆到诱导型表达系统来检测其如何影响正常前列腺上皮细胞以及雄激素受体阳性(AR+)和雄激素受体阴性(AR-)前列腺癌细胞系。诱导DEFB1表达导致AR-细胞DU145和PC3的细胞生长降低，但是对AR+前列腺癌细胞LNCaP的生长没有影响。DEFB1还致使快速诱导半胱天冬酶-介导的凋亡。此处提出的数据首次提供了DEFB1在天然肿瘤免疫中起作用的证据，并且表明其受损将促进前列腺癌的肿瘤发展。
材料与方法
细胞系：于DMEM培养基中培养细胞系DU145，于F12培养基中培养PC3，以及于RPMI培养基中培养LNCaP(Life Technologies，Inc.，GrandIsland，NY)。用于全部三种细胞系的生长培养基补充10％(v/v)的胎牛血清(Life Technologies)。于前列腺上皮细胞基础培养基(Cambrex BioScience，Inc.，Walkersville，MD)中培养hPrEC细胞。所有细胞系均维持在37℃和5％CO2下。
组织样品和激光捕获显微切割：根据机构审查委员会(InstitutionalReview Board)批准的协议，通过Hollings癌症中心肿瘤库获得经过根治性前列腺切除术的知情同意患者的前列腺组织。这包括用于样品的处理、切片、组织学表征、RNA纯化和PCR扩增的指导原则。对冷冻组织切片进行病理检查之后，进行激光捕获显微切割(LCM)以确保所检测的组织样品由纯的良性前列腺细胞群组成。对于所分析的每个组织切片，在含有良性组织的三个不同区域进行LCM，然后合并所采集的细胞。
DEFB1基因的克隆：通过逆转录PCR从RNA产生DEFB1 cDNA。所设计的PCR引物含有ClaI和KpnI限制性位点。DEFB1 PCR产物用ClaI和KpnI消化并连接到TA克隆载体。然后使TA/DEFB1载体通过热激转染大肠杆菌，并选择和扩增单克隆。通过Cell Culture DNA Midiprep(Qiagen，Valencia，CA)分离质粒，并通过自动测序验证序列完整性。然后，将DEFB 1基因片段连接入用ClaI和KpnI消化的pTRE2(用作定向目的的中间载体)。然后用ApaI和KpnI消化pTRE2/DEFB1构建体来切下DEFB1插入物，并将该插入物连接入同样用ApaI和KpnI双重消化的脱皮激素诱导型表达系统的pIND载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。将所述构建体再次转染入大肠杆菌，并且选择和扩增单克隆。分离质粒并且通过自动测序再次验证pIND/DEFB1的序列完整性。
转染：将细胞(1x106)接种到100-mm皮氏培养皿并过夜生长。然后利用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)，用1μg的pVgRXR质粒(表达异源二聚体的蜕皮激素受体)和1μg的pIND/DEFB1载体构建体或空pIND对照载体于Opti-MEM培养基(Life Technologies，Inc.，GrandIsland，NY)中共转染细胞。
RNA分离和定量RT-PCR：为了验证用DEFB1构建体所转染细胞中DEFB1蛋白的表达，用松甾酮A(Pon A)诱导24小时之后，收集RNA。简而言之，使用SV总RNA分离系统(Promega，Madison，WI)从通过胰蛋白酶消化收集的大约1x106细胞中分离总RNA。此时，将细胞裂解并且通过离心柱离心分离总RNA。为了通过LCM收集细胞，使用PicoPureRNA分离试剂盒(Arcturus Biosciences，Mt.View，CA)按照厂商手册分离总RNA。利用随机引物(Promega)将两种来源的总RNA(每个反应0.5μg)逆转录成cDNA。按照厂商手册，将AMV逆转录酶II(每个反应500单位；Promega)用于第一链合成，而Tfl DNA聚合酶用于第二链合成(每个反应500单位；Promega)。在每种情况下，每次使用50pg的cDNA以确保PCR反应。利用来自TaqMan逆转录系统和
Green PCR MasterMix(Applied Biosystems)的MultiScribe逆转录酶对所产生的cDNA进行两步QRT-PCR。
从已公开的DEFB1序列(GenBank登录号U50930)产生用于DEFB1的引物对(表2)。在标准条件下，使用56℃的退火温度进行40个PCR循环。此外，扩增β-肌动蛋白(表3)，作为管家基因来标准化总cDNA的初始含量。DEFB1表达计算为DEFB1与β-肌动蛋白之间的相对表达率，并且与诱导和未诱导DEFB1表达的细胞系，以及LCM良性前列腺组织进行比较。作为阴性对照，还进行了不含cDNA模板的QRT-PCR反应。所有反应均运行三次，一式三份。
表2QRT-PCR引物序列
MTT细胞活力测定：为检测DEFB1对细胞生长的影响，进行代谢物3-(4，5-二甲基噻唑-2基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)测定。将用pVgRXR质粒和pIND/DEFB1构建体或空pIND载体共转染的PC3、DU145和LNCaP细胞接种于96-孔板，每孔1-5x103细胞。接种之后24小时，每日添加含有10μM松甾酮A的新鲜生长培养基来诱导DEFB1表达24、48和72小时，之后根据厂商说明书(Promega)进行MTT测定。反应进行三次，一式三份。
流式细胞术：将用DEFB1表达系统共转染的PC3和DU145细胞于60-mm培养皿中培养，并用10μM松甾酮A诱导12、24和48小时。各孵育期之后，从平板收集培养基(以保留任何分离的细胞)并且与用于洗涤平板的PBS混合。通过胰蛋白酶消化收集残存的附着细胞并且与分离的细胞和PBS混合。然后使细胞于4℃(500xg)离心5分钟使其结团，PBS洗涤两次，并且重新悬浮于含有5μl膜联蛋白V-FITC和5μl PI的100ul1倍膜联蛋白结合缓冲液(0.1M Hepes/NaOH，pH7.4，1.4M NaCl，25mM CaCl2)中。将细胞在黑暗中于RT下孵育15分钟，然后用400μl1倍膜联蛋白结合缓冲液稀释，并且通过FACscan(Becton Dickinson，San Jose，CA)分析。所有反应均进行三次。
显微镜分析：通过相差显微镜分析细胞形态。将不含载体，含有空质粒或DEFB1质粒的DU145、PC3和LNCaP细胞接种于96孔培养板(BD Falcon，USA)。第二天用含10μM松甾酮A的培养基诱导含质粒的细胞48小时，而对照细胞接受新鲜培养基。然后在倒置Zeiss IM35显微镜(Carl Zeiss，Germany)下观察细胞。利用SPOT Insight Mosaic4.2照相机(Diagnostic Instruments，USA)获得细胞视野的相差图。细胞通过32倍放大倍数的相差显微镜法检测，并且将数字图像保存为无压缩的TIFF文件并传输到Photoshop CS软件(Adobe Systems，San Jose，CA)，用于图像处理和硬拷贝显示。
半胱天冬酶检测：利用APO LOGIXTM羧基荧光素半胱天冬酶检测试剂盒(Cell Technology，Mountain View，CA)进行前列腺癌细胞系中的半胱天冬酶活性检测。通过使用不可逆地与活性半胱天冬酶结合的FAM-VAD-FMK抑制剂检测活性半胱天冬酶。简而言之，将含有DEFB1表达系统的DU145和PC3细胞(1.5-3x105)接种于35mm玻璃底微孔培养皿(Matek，Ashland，MA)，并且如先前所描述仅用培养基或用含PonA的培养基处理24小时。接着，将10μl羧基荧光素标记的肽氟甲基酮(FAM-VAD-FMK)的30倍工作稀释液添加到300μl培养基，并添加至每个35mm培养皿。然后于37℃，5％CO2下孵育细胞1小时。接着，将培养基吸出，并用2ml 1倍工作稀释洗涤缓冲液洗涤细胞两次。在微分干涉相差DIC)或488nm激光激发下观察细胞。利用具有Vario 2RGB激光扫描组件的共聚焦显微镜(Zeiss LSM 5 Pascal)和63倍DIC油镜分析荧光信号。
统计学分析：利用非配对值的学生t-检验评估统计学差异。通过双边计算确定P值，并且认为P值小于0.05是统计学显著的。
前列腺组织和细胞系中的DEFB1表达：通过QRT-PCR测量良性和恶性前列腺组织，hPrEC前列腺上皮细胞，以及DU145、PC3和LNCaP前列腺癌细胞中的DEFB1表达水平。检测全部良性临床样品中的DEFB1表达。DEFB1相对表达的平均量为0.0073。此外，hPrEC细胞中DEFB1的相对表达为0.0089。所检测的良性前列腺组织样品和hPrEC中DEFB1表达没有统计学差异(图1A)。对前列腺癌细胞系中的相对DEFB1表达水平的分析显示DU145、PC3和LNCaP中的水平显著更低。作为进一步的参考点，测量来自患者#1215的前列腺组织的邻近恶性切片中相对DEFB1的表达。与来自患者#1215的恶性前列腺组织相比，所观测的三种前列腺癌细胞系中的DEFB1表达水平没有显著差异(图1B)。此外，全部四种样品中的表达水平接近不含模板的阴性对照(证实几乎没有内源性DEFB1表达，未给出数据)。还对用DEFB1表达系统转染的前列腺癌细胞系进行了QRT-PCR。24小时诱导期之后，相对表达水平：DU145为0.01360，PC3为0.01503，以及LNCaP为0.138。通过凝胶电泳验证扩增产物。
对含有良性、PIN和癌的LCM组织区域进行QRT-PCR。DEFB1相对表达：良性区域为0.0146，相比恶性区域为0.0009(图1C)。这表示降低了94％，这再次证实表达的显著下调。此外，分析PIN显示DEFB1表达水平为0.044，其降低了70％。将患者#1457中的表达与六名其他患者的良性区域所见的平均表达水平相比(图1A)，显示1.997的比值，表示多表达了几乎两倍(图1D)。然而，与良性组织中的平均表达水平相比，表达率：PIN为0.0595，以及恶性组织为0.125。
DEFB1引起细胞膜透性和波动：对前列腺癌细胞系中DEFB1的诱导导致DU145和PC3细胞数量的显著减少，但是对LNCaP的细胞增殖没有影响(图2)。作为阴性对照，监测含有空质粒的所有三种细胞系中的细胞增殖。添加PonA之后，在DU145、PC3或LNCaP细胞中没有观测到细胞形态的变化。此外，DEFB 1诱导导致DU145和PC3的细胞形态变化。此时细胞似乎更圆并且显示指征细胞死亡的膜波动。两种细胞系中还出现凋亡小体。
DEFB1表达导致细胞活力降低：MTT测定显示，PC3和DU145细胞中的DEFB1导致细胞活力降低，但是对LNCaP细胞没有显著影响(图3)。24小时之后，相对细胞活力：DU145为72％，以及PC3为56％。诱导48小时之后分析显示DU145的细胞活力为49％，以及PC3的细胞活力为37％。DEFB1表达72小时之后，导致DU145和PC3细胞的相对细胞活力分别为44％和29％。
晚期前列腺癌细胞中DEFB1引起快速半胱天冬酶-介导的凋亡：为了确定DEFB1对PC3和DU145的作用是细胞抑制的的还是细胞毒性的，进行了FACS分析。正常生长条件下，多于90％的PC3和DU145培养物存活且无凋亡(左下象限)，并且没有膜联蛋白V或PI染色(图4)。诱导PC3细胞中DEFB1表达之后，凋亡细胞的数量(右下和右上象限)总计：12小时为10％，24小时为20％，以及48小时为44％。对于DU145细胞，凋亡细胞的数量总计：诱导之后12小时为12％，24小时为34％，以及48小时为59％。含有空质粒的细胞用PonA诱导之后没有观测到凋亡增加(数据未给出)。
通过共聚焦激光显微镜分析测定半胱天冬酶活性(图5)。诱导DU145和PC3细胞中DEFB1的表达，并基于发绿色荧光的FAM-VAD-FMK与活跃发生凋亡的细胞中半胱天冬酶的结合来监测活性。对DIC下细胞的分析显示，0小时时存在存活对照DU145(A)，PC3(E)和LNCaP(I)细胞。通过共聚焦激光在488nm处的激发未产生可检测的绿色染色，表明DU145(B)，PC3(F)或LNCaP(J)中无半胱天冬酶活性。诱导24小时之后，在DIC下再次可见DU145(C)，PC3(G)和LNCaP(K)细胞。荧光下的共聚焦分析显示DU145(D)和PC3(H)细胞中的绿色染色，表明半胱天冬酶活性。然而，LNCaP(L)细胞没有绿色染色，表明没有DEFB1诱导的凋亡。
总之，本研究提供了DEFB1在前列腺癌中的功能作用。此外，这些发现表明DEFB1是参与肿瘤免疫的天然免疫系统的一部分。此处显示的数据证实生理水平表达的DEFB1对AR-激素难治性前列腺癌细胞是细胞毒性的，但是对AR+激素敏感的前列腺癌细胞和对正常前列腺上皮细胞没有细胞毒性。鉴于DEFB1在正常前列腺细胞中是组成型表达的，没有细胞毒性，可能是具有不同表型特征的晚期AR-前列腺癌细胞致使它们对DEFB1细胞毒性敏感。因而，DEFB1是用于晚期前列腺癌，还可能是用于其它癌症治疗的可行治疗剂。
实施例2：siRNA介导的PAX2表达敲低导致不依赖于P53状态
的前列腺癌细胞死亡
本实施例通过RNA干扰检测抑制PAX2表达对p53基因状态不同的前列腺癌细胞的影响。结果证实抑制PAX2导致与p53状态无关的细胞死亡，表明在前列腺癌中存在受PAX2抑制的其它肿瘤阻抑基因或细胞死亡通路。
材料和方法
PAX2的siRNA沉默：为实现有效的基因沉默，合成靶向人PAX2mRNA(登录号NM_003989.1)的四种互补短干扰核糖核苷酸(siRNA)池(Dharmacon Research，Lafayette，CO，USA)。四种siRNA的第二池用作测试PAX2 siRNA特异性的内参。所合成序列中的两条靶向GL2荧光素酶mRNA(登录号X65324)，另两条是非序列特异的(表3)。对于siRNA的退火，在退火缓冲液(100mM乙酸钾，pH 7.4的30mMHEPES-KOH，2mM乙酸镁)中，将35M单链于90℃孵育1分钟，之后于37℃孵育1小时。
表3PAX2 siRNA序列
利用四种siRNA池来抑制PAX2蛋白表达
Western分析：简而言之，细胞通过胰蛋白酶消化收集并用PBS洗涤两次。按照厂商(Sigma)说明书配制裂解缓冲液，然后添加至细胞。在轨道摇床上于4℃孵育15分钟之后，收集细胞裂解物并于12000xg下离心10分钟使细胞碎片结团。收集并定量含蛋白的上清液。接着，将25μg蛋白提取物上样到8-16％梯度SDS-PAGE(Novex)。电泳之后，将蛋白转移到PVDF膜，然后用含5％脱脂奶粉的TTBS(0.05％Tween20和100mM Tris-Cl)封闭1小时。用以1∶2000稀释的兔抗-PAX2一抗(Zymed，San Francisco，CA)探测印迹。洗涤之后，用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗-兔抗体(稀释度1∶5000；Sigma)孵育膜，并且于AlphaInnotech Fluorchem 8900上利用化学发光试剂(Pierce)显现信号检测。作为对照，将印迹清除并用小鼠抗-β-肌动蛋白一抗(1∶5000；Sigma-Aldrich)和HRP-偶联的抗-小鼠二抗(1∶5000；Sigma-Aldrich)重新探测，以及再次显现信号检测。
相差显微镜法：通过相差显微镜法分析PAX2敲低对细胞生长的影响。此时，将1-2x104细胞接种于6孔培养板(BD，Falcon，USA)。第二天仅用培养基、用阴性对照非特异siRNA或PAX2 siRNA处理细胞并让其孵育六天。然后在倒置Zeiss IM 35显微镜(Carl Zeiss，Germany)下放大32倍观察细胞。利用SPOT Insight Mosaic 4.2照相机(DiagnosticInstruments，USA)获得细胞视野的相差图。
MTT细胞毒性测定：根据厂商手册(Promega)，利用Codebreaker转染试剂用0.5μg PAX2 siRNA池或对照siRNA池转染DU145、PC3和LNCaP细胞(1x105)。接着，将细胞悬浮液稀释并以每孔1-5x103细胞接种于96-孔板，让其生长2、4或6日。培养之后，通过测量3-(4，5-二甲基噻唑-2基)-2，5-二苯基溴化四唑MTT(Promega)转化成的有色甲臢产物来测定细胞活力。在多孔扫描分光光度计上于540nm处读取吸光度。
如实施例1所描述进行前列腺癌细胞系中半胱天冬酶活性的检测和定量实时RT-PCR。从公开序列产生用于BAX、BID和BAD的引物对(表4)。于MicroAmp Optical 96-孔反应板(PE Biosystems)中进行反应。在标准条件下，使用60℃的退火温度进行40个PCR循环。通过指数扩增开始的循环数(阈值)和获自三个重复的平均值来确定定量。信号水平与阈值之间存在反向关系。此外，GAPDH作为管家基因来标准化总cDNA的初始含量。基因表达计算为促凋亡基因与GAPDH之间的相对表达率。所有反应均进行一式三份。
表4定量RT-PCR引物
用于扩增PAX2和GAPDH的核酸引物序列
PAX2蛋白的siRNA抑制：为证实siRNA有效靶向PAX2 mRNA，进行Western分析来监测6日处理期间的PAX2蛋白表达水平。使用用PAX2 siRNA池转染一轮的细胞。通过显示第4日DU145(图6a)和第6日PC3(图6b)中的PAX2蛋白敲低的结果证实了特异靶向PAX2mRNA。
PAX2的敲低抑制前列腺癌细胞生长：分析用单独的培养基、阴性对照非特异siRNA或PAX2 siRNA处理6日之后的细胞(图7)。DU145(a)，PC3(d)和LNCaP(g)细胞在仅含培养基的培养皿中全部达到至少90％汇合。用阴性对照非特异siRNA对DU145(b)、PC3(e)和LNCaP(h)的处理对细胞生长没有影响，并且6日之后细胞再次达到了汇合。然而，用PAX2 siRNA处理导致细胞数量显著减少。DU145细胞大约15％汇合(c)，以及PC3细胞仅10％汇合(f)。siRNA处理之后LNCaP细胞5％汇合。
细胞毒性测定：暴露2、4和6日之后，测量细胞活力并表示为处理细胞570-630nm处的吸光度除以未处理对照细胞的吸光度的比值(图8)。处理2日之后的相对细胞活力：LNCaP为77％，DU145为82％，以及PC3为78％。4日之后，相对细胞活力：LNCaP为46％，DU145为53％，以及PC3为63％。处理6日之后，相对细胞活力降低至：LNCaP为31％，PC3为37％，以及DU145为53％。作为阴性对照，用阴性对照非特异siRNA或单独的转染试剂处理6日之后，测量细胞活力。对于两种条件，与正常生长培养基相比，细胞活力的改变在统计学上不显著。
泛半胱天冬酶检测：通过共聚焦激光显微镜分析检测半胱天冬酶活性。用PAX2 siRNA处理DU145、PC3和LNCaP细胞，并基于FAM标记的肽与活跃发生凋亡的细胞中半胱天冬酶的结合(发绿色荧光)来监测活性。在DIC下分析仅用培养基处理的细胞显示，0小时时存在活的DU145(A)，PC3(E)和LNCaP(I)细胞(图9)。通过共聚焦激光在488nm处的激发未产生可检测的绿色染色，表明未处理的DU145(B)，PC3(F)或LNCaP(J)中没有半胱天冬酶活性。用PAX2 siRNA处理4日之后，在DIC下再次显现DU145(C)，PC3(G)和LNCaP(K)细胞。荧光下，处理的DU145(D)，PC3(H)和LNCaP(L)细胞显示绿色染色，表明半胱天冬酶活性。
PAX2抑制对促凋亡因子的影响：用对抗PAX2的siRNA处理DU145，PC3和LNCaP细胞6日，并且测量依赖于和不依赖于p53转录调控的促凋亡基因表达以监测细胞死亡通路。对于BAX：LNCaP中增加1.81倍；DU145中增加2.73倍；以及PC3中增加1.87倍(图10a)。BID的表达水平增加：LNCaP为1.38倍；以及DU145为1.77倍(图10b)。然而，处理之后，PC3中的BID表达水平降低1.44倍(图10c)。BAD分析显示表达增加：LNCaP为2.0倍；DU145为1.38倍，以及PC3为1.58倍。
这些结果证实前列腺癌细胞的存活依赖于PAX2表达。由于p53表达的细胞系LNCaP、p53突变的细胞系DU145以及p53缺失的细胞系PC3中PAX2敲低活化p53之后，检测全部三种细胞系中的半胱天冬酶活性，表明启动程序化细胞死亡。全部三种细胞系中BAX的表达不依赖于p53状态上调。PAX2抑制之后，全部三种细胞系中促凋亡因子BAD的表达也增加。用PAX2 siRNA处理之后，LNCaP和DU145中BID表达增加，而在PC3中竟然降低。这些结果表明，前列腺癌中所观测的细胞死亡受影响但是不依赖于p53表达。通过与p53状态无关的不同细胞死亡通路启动前列腺癌细胞的凋亡表明PAX2抑制其它肿瘤阻抑物。
除了SEQ ID NOS：3-6，抗-PAX2siRNA的其它例子包括但不限于，具有以下序列的siRNA(5’至3’方向)：
ACCCGACTATGTTCGCCTGG(SEQ ID NO：7)，
AAGCTCTGGATCGAGTCTTTG(SEQ ID NO：8)，
ATGTGTCAGGCACACAGACG(SEQ ID NO：9)，
GUCGAGUCUAUCUGCAUCCUU(SEQ ID NO：10)，
GGAUGCAGAUAGACUCGACUU(SEQ ID NO：11)。
PAX蛋白是进化过程中保守并且能够与特定DNA序列通过被称为“配对结构域(PD)”和“同源结构域(HD)”的结构域结合的转录因子家族。PD是由某些PAX蛋白(如PAX2和PAX6)共享的共有序列。PD指导DNA与位于形成DNA-蛋白复合物的α3-螺旋内的氨基酸结合。对于PAX2，HD内的氨基酸识别CCTTG(SEQ ID NO：1)DNA核心序列并且与其特异地相互作用。预期包括该序列或其互补序列的寡核苷酸为PAX2蛋白的抑制剂。
在一实施方案中，寡核苷酸具有序列V-CCTTG-W(SEQ ID NO：12)，其中V是来自DEFB1的1至35个连续侧翼核苷酸，而W是1至35个核苷酸。核苷酸可以是通常位于DEFB1的PAX2DNA结合位点侧翼的连续核苷酸。可选择地，它们可与DEFB1无关，并且常规选择以避免干扰识别序列。
抑制PAX2与DEFB1启动子结合的寡核苷酸的其它例子包括但不限于，具有以下序列的寡核苷酸(5’至3’方向)：
CTCCCTTCAGTTCCGTCGAC(SEQ ID NO：13)，
CTCCCTTCACCTTGGTCGAC(SEQ ID NO：14)，
ACTGTGGCACCTCCCTTCAGTTCCGTCGACGAGGTTGTGC(SEQ ID NO：15)，
ACTGTGGCACCTCCCTTCACCTTGGTCGACGAGGTTGTGC(SEQ ID NO：16)。
实施例3：PAX2癌基因的抑制导致前列腺癌细胞发生DEFB1-
介导的死亡
鉴定用作开发新型癌症药物靶标的肿瘤-特异分子被认为是癌症研究的主要目标。实施例1证实前列腺癌中存在高频率的DEFB1表达受损，以及诱导DEFB1表达导致雄激素受体阴性-阶段的前列腺癌快速凋亡。这些数据表明DEFB1在前列腺肿瘤阻抑中起作用。此外，鉴于它是正常前列腺上皮细胞的免疫系统的天然存在的成分，预期DEFB1是具有很少至没有副作用的可行治疗剂。实施例2证实抑制PAX2表达导致不依赖于p53的前列腺癌细胞死亡。这些数据表明存在由PAX2抑制的其它促凋亡因子或肿瘤阻抑物。此外，数据表明在前列腺癌中过表达的癌基因因子PAX2是DEFB1的转录阻遏物。本研究的目的是确定DEFB1表达受损是否是由于PAX2癌基因的异常表达，以及抑制PAX2是否能导致DEFB1-介导的细胞死亡。
材料与方法
如实施例1所描述进行RNA分离和定量RT-PCR。从已公开的DEFB1序列(登录号U50930)产生用于DEFB1的引物对。在标准条件下，使用56℃的退火温度进行40个PCR循环。此外，扩增GAPDH作为管家基因来标准化总cDNA的初始含量。DEFB1表达计算为DEFB1与GAPDH之间的相对表达率，并且与siRNA敲低之前和之后细胞系中的PAX2表达进行比较。所有反应均运行三次，一式三份。
DEFB1报告构建体的产生：将pGL3荧光素酶报告质粒用于监测DEFB1报告子活性。此处，DEFB1转录起始位点上游的160个碱基的区域并且包括DEFB1 TATA盒。所述区域还包括PAX2结合所必需的GTTCC(SEQ ID NO：2)序列。设计包含Kpn1和Nhe1限制位点的PCR引物。将DEFB1启动子PCR产物用Kpn1和Nhe1限制消化并连接到同样限制消化的pGL3质粒(图2)。将构建体转染至大肠杆菌，选择并扩增单克隆。分离质粒并通过自动测序验证DEFB1/pGL3构建体的序列完整性。
荧光素酶报告子测定：此时，将1μgDEFB1报告子构建体或对照pGL3质粒转染至1x106DU145细胞。接着，将0.5x103细胞接种于96-孔板的各孔，并让生长过夜。然后添加含有PAX2 siRNA的新鲜培养基或仅添加培养基，并且孵育细胞48小时。通过BrightGlo试剂盒根据厂商手册(Promega)检测荧光素酶，并且用Veritas自动化96-孔发光检测仪读取平板。启动子活性表示为相对发光。
膜透性分析：进行吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EtBr)双重染色来鉴定细胞膜完整性变化，以及通过染色浓缩的染色质鉴定凋亡细胞。AO染色活细胞以及早期凋亡细胞，而EtBr染色膜透性受损的晚期凋亡细胞。简而言之，将细胞接种于2-腔室培养玻片(BD Falcon，USA)。用含有10μM松甾酮A的培养基诱导用空pIND质粒/pvgRXR或pINDDEFB1/pvgRXR转染的细胞24或48小时。对照细胞于24和48小时时提供新鲜培养基。为了测定PAX2抑制对膜完整性的影响，用PAX2siRNA处理单独的含有DU145、PC3和LNCaP的培养玻片并孵育4日。在这之后，细胞用PBS洗涤一次并用2ml AO(Sigma，USA)和EtBr(Promega，USA)(5ug/ml)溶液的混合物(1∶1)染色5分钟。染色之后，再次用PBS洗涤细胞。通过Zeiss LSM 5 Pascal Vario 2激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss Jena，Germany)观测荧光。激发色轮含有BS505-530(绿色)和LP560(红色)滤光器组件，其允许从AO发射的绿光分离至绿色通道，来自EtBr的红光分离至红色通道。对照和DEFB1诱导的细胞之间的各独立试验的激光功率输出和增益控制设置是相同的。由Kr/Ar混合气体激光器提供的激发波长为543nm(对于AO)和488nm(对于EtBr)。玻片于40倍放大倍数下分析，并且将数字图像保存为未压缩的TIFF文件并输出到Photoshop CS软件(Adobe Systems，San Jose，CA)，用于图像处理和硬拷贝显示。
PAX2的ChIP分析：染色质免疫沉淀(ChIP)允许基于转录因子对启动子的体内占据和通过免疫沉淀富集与染色质结合的转录因子来鉴定DNA-结合蛋白的结合位点。使用由Farnham实验室所描述的改进方案；还有在线网址http://mcardle.oncology.wisc.edu/farnham/)。DU145和PC3细胞系过表达PAX2蛋白，但是不表达DEFB1。细胞用含1.0％甲醛的PBS孵育10分钟使蛋白和DNA交联。然后超声处理样品以产生平均长度为600bp的DNA。将用蛋白A Dynabead预清除的超声处理的染色质与PAX2-特异抗体或“无抗体”对照[同型匹配的对照抗体]一起孵育。然后收集所洗涤的免疫沉淀。交联逆转之后，通过PCR利用启动子-特异引物分析DNA来测定DEFB1是否存在于PAX2-免疫沉淀的样品中。设计引物来扩增DEFB1 mRNA起始位点正上游的160bp的区域(其包含DEFB1 TATA盒和功能性GTTCC(SEQ ID NO：2)PAX2识别位点)。对于这些研究，阳性对照包括输入染色质的等分试样的PCR(免疫沉淀之前，但交联逆转)。所有步骤在蛋白酶抑制剂存在下进行。
PAX2的siRNA抑制增加DEFB1表达：siRNA处理之前的DEFB1表达的QRT-PCR分析显示相对表达水平：DU145为0.00097，PC3为0.00001，以及LNCaP为0.00004(图13)。siRNA敲低PAX2之后，相对表达：DU145为0.03294(增加338倍)，PC3为0.00020(增加22.2倍)，以及LNCaP为0.00019(增加4.92倍)。作为阴性对照，PAX2缺失的人前列腺水平细胞系(hPrEC)显示表达水平：处理之前为0.00687，而siRNA处理之后为0.00661，这证实DEFB1表达没有统计学变化。
DEFB1引起细胞膜透性：通过共聚焦分析监测膜完整性(图14)。此时，完整的细胞由于能透过膜的AO染成绿色。此外，具有受损细胞质膜的细胞由不能透过膜的EtBr会染成红色。此处，未诱导的DU145(A)和PC3(D)细胞被AO阳性染色并且发出绿色，但是无EtBr染色。然而，DU145(B)和PC3(E)中的DEFB1诱导在24小时时导致EtBr聚集于细胞质，如通过红色染色所指示的。48小时时，DU145(C)和PC3(F)具有浓缩的细胞核并且显示黄色，这是由于存在分别来自AO和EtBr聚集的绿色和红色染色。
PAX2的抑制导致膜透性：用PAX2 siRNA处理细胞4日，再次通过共聚焦分析监测膜完整性。此时，DU145和PC3具有浓缩的细胞核并且显示黄色。然而，siRNA处理之后，LNCaP细胞的细胞质和细胞核均保持绿色。细胞周围还是红色染色表明维持了细胞膜的完整性。这些发现表明，抑制PAX2导致DU145和PC3发生特异的DEFB1-介导的细胞死亡，但是没有介导LNCaP细胞死亡。LNCaP中观测到的死亡是由于PAX2抑制之后LNCaP中存在野生型p53的反式激活。
PAX2的siRNA抑制增强DEFB1启动子活性：对含有DEFB1/pGL3构建体的DU145细胞中的DEFB1启动子活性的分析显示，与未处理的细胞相比，处理48小时之后相对光单位增加2.65倍。PC3细胞中，与未处理的细胞相比，相对光单位增加3.78倍。
PAX2与DEFB1启动子的结合：对DU145和PC3细胞进行ChIP分析以确定PAX2转录阻遏物是否与DEFB1启动子相结合(图15)。泳道1包含100bp的分子量标志物。泳道2是阳性对照，代表交联和免疫沉淀反应之前从DU145扩增的DEFB1启动子的160bp区。泳道3是阴性对照，代表无DNA进行的PCR。泳道4和5是阴性对照，分别代表用IgG从交联的DU145和PC3进行免疫沉淀反应的PCR。交联之后用抗-PAX2抗体免疫沉淀的25pg DNA(泳道6和8)和50pg DNA(泳道7和9)的PCR扩增分别显示DU145和PC3中160bp的启动子片段。
这些结果证实癌基因因子PAX2阻抑DEFB1表达。阻抑发生于转录水平。此外，对DEFB1启动子的计算分析显示，紧邻DEFB1 TATA盒存在用于PAX2转录阻遏物的GTTCC(SEQ ID NO：2)DNA结合位点(图1)。防御素细胞毒性的一个特点是破坏膜完整性。这些结果表明前列腺癌细胞中DEFB1的异常表达由于损害细胞膜而导致膜电位受损。抑制PAX2蛋白表达之后观测到相同的现象。因此，阻抑PAX2表达或功能导致DEFB1表达的重新建立以及随后的DEFB1-介导的细胞死亡。同样地，本结果建立利用DEFB1通过天然免疫作为用于前列腺癌治疗，还可能是用于其它癌症治疗的定向疗法。
实施例4：DEFB1表达对植入肿瘤细胞的影响
通过将过表达DEFB1的肿瘤细胞注射入裸鼠来评估DEFB1的抗肿瘤能力。将DEFB1克隆至pBI-EGFP载体(其具有双向四环素响应的启动子)。通过将pTet-Off转染至DU145、PC3和LNCaP细胞并且用G418选择来产生Tet-Off细胞系。pBI-EGFP-DEFB1质粒与pTK-Hyg共转染至Tet-off细胞系并且用潮霉素选择。仅使用活力＞90％的单细胞悬浮液。每只动物接受大约500,000个细胞，经皮下给予雌性裸鼠的右侧腹部。有两组，对照组用仅有载体的克隆注射，而一组用过表达DEFB1的克隆注射。由统计学家确定每组35只小鼠。动物每周称重两次，肿瘤生长由卡尺监测，而肿瘤体积利用以下公式计算确定：体积＝0.5x(宽)2x长。当肿瘤大小达到2mm3或植入之后六个月时，所有动物通过过量CO2处死；将肿瘤切除、称重并保存于中性缓冲的福尔马林，用于病理检查。两组之间肿瘤生长的差异通过汇总统计表和图形显示描述表征。用t-检验或非参数等同方法评估统计学显著性。
实施例5：PAX2 siRNA对植入肿瘤细胞的影响
将体外研究中利用的发卡PAX2 siRNA模板寡核苷酸用于检测对体内DEFB1表达上调的影响。使正义和反义链(参见表4)退火并克隆至人U6 RNA pol III启动子控制下的pSilencer 2.1 U6 hygro siRNA表达载体(Ambion)。将所克隆的质粒测序、验证并转染至PC3、DU145和LNCap细胞系。将乱序shRNA克隆并用作本研究的阴性对照。选择抗潮霉素的克隆。将细胞经皮下引入小鼠，并如以上所描述监测肿瘤生长。
实施例6：结合PAX2的小分子抑制剂对植入肿瘤细胞的影响
PAX2结合的DNA识别序列位于DEFB1启动子的核苷酸-75和-71(+1是指转录起始位点)之间。提供了与PAX2 DNA-结合结构域互补的短寡核苷酸。这样的寡核苷酸例子包括含有以下提供的GTTCC(SEQID NO：2)识别序列的20-mer和40-mer寡核苷酸。这些长度是随机选择的，并且预期其它长度作为结合的阻断剂是有效的。作为阴性对照，设计具有乱序序列(CTCTG)(SEQ ID NO：17)的寡核苷酸来验证特异性。用lipofectamine试剂或Codebreaker转染试剂(Promega，Inc)将寡核苷酸转染至前列腺癌细胞和HPrEC细胞。为了证实DNA-蛋白相互作用，双链寡核苷酸用[32P]dCTP标记并进行电泳迁移率测定。此外，通过QRT-PCR和Western分析监测用寡核苷酸处理之后的DEFB1表达。最后，通过如先前所描述的MTT测定和流式细胞术检测细胞死亡。
识别序列#1：CTCCCTTCAGTTCCGTCGAC(SEQ ID NO：13)
识别序列#2：CTCCCTTCACCTTGGTCGAC(SEQ ID NO：14)
乱序序列#1：CTCCCTTCACTCTGGTCGAC(SEQ ID NO：18)
识别序列#3：
ACTGTGGCACCTCCCTTCAGTTCCGTCGACGAGGTTGTGC(SEQ ID NO：15)
识别序列#4：
ACTGTGGCACCTCCCTTCACCTTGGTCGACGAGGTTGTGC(SEQ ID NO：16)
乱序序列#2：
ACTGTGGCACCTCCCTTCACTCTGGTCGACGAGGTTGTGC(SEQ ID NO：19)
本发明的寡核苷酸的其它例子包括：
识别序列#1：5’-AGAAGTTCACCCTTGACTGT-3’(SEQ ID NO：20)
识别序列#2：5’-AGAAGTTCACGTTCCACTGT-3’(SEQ ID NO：21)
乱序序列#1：5’-AGAAGTTCACGCTCTACTGT-3’(SEQ ID NO：22)
识别序列#3：
5’-TTAGCGATTAGAAGTTCACCCTTGACTGTGGCACCTCCC-3’(SEQ ID NO：23)
识别序列#4：
5’-GTTAGCGATTAGAAGTTCACGTTCCACTGTGGCACCTCCC-3’(SEQ ID NO：24)
乱序序列#2：
5’-GTTAGCGATTAGAAGTTCACGCTCTACTGTGGCACCTCCC-3’(SEQ ID NO：25)
该组可选择的抑制性寡核苷酸代表PAX2结合结构域和同源框的识别序列(与CCTTG(SEQ ID NO：1)核心序列一起)。这些包括来自DEFB1启动子的实际序列。
PAX2基因是各种癌细胞(包括前列腺)生长和存活所必需的。此外，抑制PAX2表达导致由天然免疫成分DEFB1介导的细胞死亡。阻抑DEFB1表达和活性通过PAX2蛋白与DEFB1启动子的GTTCC(SEQID NO：2)识别位点的结合来实现。因此，该通路提供用于前列腺癌治疗的可行治疗靶标。在本方法中，序列结合至PAX2 DNA结合位点并阻断PAX2与DEFB1启动子的结合，从而允许DEFB1表达和活性。以上所描述的寡核苷酸序列和实验是其它PAX2抑制剂药物的例子，并且证实用于其它PAX2抑制剂药物设计的模型。
鉴于GTTCC(SEQ ID NO：2)序列存在于白细胞介素-3、白细胞介素-4、胰岛素受体等。PAX2也调控它们的表达和活性。因此，本文所公开的PAX2抑制剂在许多其它的疾病，包括与炎症直接相关的那些疾病包括前列腺炎和良性前列腺增生(BPH)中是有用的。
实施例7：DEFB1表达受损导致肿瘤发生提高
功能受损的小鼠的产生：Cre/loxP系统在阐明前列腺癌发生的潜在分子机制中是有用的。此时，DEFB1 Cre条件性KO用于前列腺内的诱导型破坏。DEFB1 Cre条件性KO包括产生含有位于DEFB1编码外显子侧翼的loxP位点的靶向载体，用该载体靶向ES细胞，并且由这些靶向的ES细胞产生生殖系嵌合小鼠。使杂合体交配成前列腺-特异的Cre转基因，并且将杂合杂交用于产生前列腺-特异的DEFB1 KO小鼠。已发现四种能诱导啮齿动物前列腺癌的基因毒性化合物：N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、N-亚硝基双2-氧丙基胺(BOP)、3，2X-二甲基-4-氨基-联苯(MAB)和2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并-4，5-联吡啶(PhIP)。用这些致癌化合物通过胃内给予或静脉注射处理DEFB1转基因小鼠，用于前列腺腺瘤和腺癌诱导研究。通过组织学、免疫组织学、mRNA和蛋白分析研究前列腺样品中肿瘤生长的差异和基因表达的变化。
GOF小鼠的产生：对于PAX2诱导的GOF小鼠，给予5周龄的PAX2 GOF(双转基因)和野生型(单转基因)同窝小鼠多西环素(Dox)来诱导前列腺-特异的PAX2表达。简而言之，PROBASIN-rtTA单转基因小鼠(四环素-依赖性rtTA诱导剂的前列腺细胞-特异性表达)与我们的PAX2转基因感应系(responder line)杂交。为了诱导，双转基因小鼠通过饮水喂给Dox(500mg/L，新鲜制备，一周两次)。最初的实验利用双转基因小鼠中的转基因建立系(founder line)，验证低背景水平、良好可诱导性和PAX2和EGFP报告子的细胞类型特异性表达。关于实验组大小，每组(野生型和GOF)中5-7只年龄和性别相匹配的个体，具有统计学意义。对于本研究中的全部动物，最初每隔一周采集前列腺组织，用于分析和比较，以确定致癌的时间参数。
PCR基因分型，RT-PCR和qPCR：利用以下PCR引物和条件对PROBASIN-rtTA转基因小鼠进行基因分型：
PROBASIN5(正向)5’-ACTGCCC ATTGCCC AAAC AC-3’
(SEQ ID NO：26)；
RTTA3(反向)5’-AAAATCTTGCCAGCTTTCCCC-3’
(SEQ ID NO：27)；
95℃变性5分钟；之后于95℃、30秒，57℃、30秒，72℃、30秒，进行30个循环；之后于72℃延伸5分钟，产生600bp的产物。
利用以下PCR引物和条件对PAX2诱导型转基因小鼠进行基因分型：
PAX2For 5’-GTCGGTTACGGAGCGGACCGGAG-3’
(SEQ ID NO：28)；
Rev5’IRES 5’-TAACATATAGACAAACGCACACCG-3’
(SEQ ID NO：29)；
95℃变性5分钟；之后于95℃、30秒，63℃、30秒，72℃、30秒，进行34个循环；之后于72℃延伸5分钟，产生460bp的产物。
利用以下PCR引物和条件对永生化小鼠半合子进行基因分型：Immol1，5’-GCGCTTGTGTC GCCATTGTATTC-3’(SEQ ID NO：30)；Immol2，5’-GTCACACCACAGAAGTAAGGTTCC-3’(SEQ ID NO：31)；
于94℃、30秒，58℃、1分钟，72℃、1分30秒，进行30个循环，产生～1kb的转基因条带。对于PAX2敲除小鼠的基因分型，使用以下PCR引物和条件：
PAX2 For 5’-GTCGGTTACGGAGCGGACCGGAG-3’
(SEQ ID NO：32)；
PAX2 Rev 5’-CACAGAGCATTGGCGATCTCGATGC-3’
(SEQ ID NO：33)；
于94℃、1分钟，65℃、1分钟，72℃、30秒，进行36个循环，产生～280bp的条带。
DEFB1肽动物研究：用106活PC3细胞经肩胛骨皮下注射六周龄雄性无胸腺(裸)鼠(购自Charles River Laboratories)。注射后一周，将动物随机分配到以下三组中的一组：组I-对照；组II-经腹膜内注射DEFB1，100μg/日，一周5日，持续2-14周；组III-经腹膜内注射DEFB1，100mg/日，一周5日，持续8-14周。将动物饲养于无菌室，四只一笼，并且每日观察。每间隔10日，通过利用卡尺测量肿瘤，并且通过下式计算肿瘤体积：V＝(LxW2)/2。
实施例8：靶向PAX2表达用于上皮内瘤变和癌症的化学预防
癌症化学预防定义为预防癌症或于癌前状态或更早时期进行治疗。浸润性癌症的长期进程是主要的科学机会，但也是显示备选化学预防性药物的临床益处的经济障碍。因此，近年来化学预防性药剂开发研究的重要组成部分，是鉴定(比癌症)更早期的准确预测药剂的临床益处或降低癌症发病率效应的终点或生物标志物。许多癌症中，IEN是诸如前列腺癌的早期终点。鉴于PAX2/DEFB1通路在IEN过程中，以及或许在更早的组织病理学状态会失控，这使得其成为癌症化学预防的有力的预测性生物标志物和极好的靶标。给出许多阻抑PAX2和增加DEFB1表达的化合物，其可能具有作为前列腺癌化学预防剂的效用。
如表1所示，PAX2基因表达于许多癌症中。此外，已表明几种癌症具有异常的PAX2表达(图18)。通过靶向PAX2表达的化学预防可以对癌症相关死亡产生显著影响。血管紧张素II(AngII)是血压和心血管动态平衡的主要调控因子，并且被认为是有效的丝裂原。AngII通过与两种亚型的受体的结合来介导其生物学效应，所述两种亚型是血管紧张素I型受体(AT1R)和血管紧张素II型受体(AT2R)，它们属于G-蛋白偶联受体超家族，但是具有不同的组织分布和细胞内信号转导通路。除了其对血压的影响外，还显示AngII在包括组织重建如创伤愈合、心肌肥厚和发育的各种病理状况中起作用。事实上，最近研究已显示各种癌细胞或组织(包括前列腺)中的肾素-血管紧张素系统(RAS)的几种成分的局部表达。AT1R的上调为已学会躲避凋亡和生长调控元件的癌细胞提供诸多优势。
材料与方法
试剂和处理：用5或10uM AngII，5uM ATR1拮抗剂Los，5uMATR2拮抗剂PD123319，25uM MEK抑制剂U0126，20uM MEK/ERK抑制剂PD98059或者250μM AMP激酶诱导剂AICAR处理细胞。
如实施例2所描述进行Western分析。用以1∶1000-2000稀释的(抗-PAX2，抗-磷酸化-PAX2，抗-JNK，抗-磷酸化-JNK，抗-ERK1/2或抗-磷酸化-ERK1/2)(Zymed，San Francisco，CA)一抗探测印迹。洗涤之后，膜用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗-兔抗体(稀释度1∶5000；Sigma)孵育，于Alpha Innotech Fluorchem 8900上利用化学发光试剂(Pierce)显现信号检测。作为对照，将印迹清除并用小鼠抗-β-肌动蛋白一抗(1∶5000；Sigma-Aldrich)和HRP-偶联的抗-小鼠二抗(1∶5000；Sigma-Aldrich)重新探测，以及再次显现信号检测。
如实施例1所描述进行QRT-PCR分析。反应于MicroAmp Optical96-孔反应板(PE Biosystems)上进行。在标准条件下，使用60℃的退火温度进行40个PCR循环。通过指数扩增开始的循环数(阈值)和获自三个重复的平均值来确定定量。信号水平与阈值之间存在反向关系。此外，将GAPDH用作管家基因来标准化总cDNA的初始含量。相对表达计算为每种基因与GAPDH之间的比值。所有反应均进行一式三份。
胸苷掺入法：通过将[3H]胸苷核苷酸([3H]TdR)掺入DNA来测定细胞的增殖。将0.5x106细胞/孔的DU145细胞悬浮液接种至其合适的培养基。细胞于所示浓度的AngII存在或不存在的条件下孵育72小时。细胞暴露于相同培养基中的37kBq/ml[甲基-3H]胸苷6小时。贴壁细胞通过5％三氯乙酸固定，并于SDS/NaOH裂解缓冲液中裂解过夜。通过Beckman LS3801液闪计数器(Canada)测量放射性。通过细胞收集器(Packard instrument Co.，Meriden，CT)收集悬浮细胞培养物，并且通过1450microbeta液闪计数器(PerkinElmer Life Sciences)测量放射性。
为研究AngII对DU145前列腺癌细胞中PAX2表达的影响，用AngII处理30分钟至48小时之后，检测PAX2表达。如图19所示，AngII处理之后PAX2表达随着时间逐渐增加。通过用Los处理DU145阻断RAS信号转导显著降低了PAX2表达(图20A)。此时，与未处理的对照DU145细胞相比，Los处理之后PAX2表达：48小时为37％，以及72小时为50％(图21)。已知AT2R受体对抗AT1R的作用。因此，检测阻断AT2R受体对PAX2表达的影响。用AT2R阻断剂PD123319处理DU145之后导致PAX2表达增加：48小时为7倍，以及96小时为8倍(图20B)。总的来说，这些发现证实PAX2表达由ATR1受体调控。
已知AngII通过AT1R-介导的MAPK和STAT3磷酸化活化直接影响前列腺癌细胞的增殖。用AngII处理DU145导致增殖率增加2至3倍(图21)。然而，用Los处理使增殖率降低50％。此外，通过用Los预先处理30分钟阻断AT1R受体阻抑AngII对增殖的影响。
为进一步检测AT1R信号转导在调控PAX2表达和活化中的作用，检测阻断MAP激酶信号转导通路的多种成分对PAX2表达的影响。此时，DU145细胞用MEK抑制剂U0126处理导致PAX2表达显著降低(图22)。此外，用MEK/ERK抑制剂PD98059处理同样导致PAX2降低。用Los处理DU145细胞对ERK蛋白水平没有影响，但是降低磷酸化-ERK的量(图23A)。然而，用Los处理DU145导致PAX2表达显著降低。用U0126和PD98059观测到相似的结果。还已知PAX2表达受STAT3调控，STAT3是ERK的下游靶标。用Los，U0126和PD98059处理DU145降低磷酸化-STAT3蛋白的水平(图23C)。这些结果证实，前列腺癌细胞中PAX2通过AT1R调控。
此外，检测AT1R信号转导通过JNK对PAX2活化的影响。用Los，U0126和PD98059处理DU145全部导致磷酸化-PAX2蛋白水平的显著降低或阻抑(图24A)。然而，Los和U0126并不降低磷酸化-JNK蛋白的水平(图24B)。因此，磷酸化-PAX2的降低似乎是由于PAX2水平降低，但并不减少磷酸化。
5-氨基咪唑-4-羧胺-1-β-4-呋喃核糖苷(AICAR)作为AMP-激酶活化剂广泛使用，其调控能量平衡并且响应代谢应激。最近报道显示，利用药理试剂或AMPK过表达来活化AMPK的抗-增殖和促凋亡作用。已表明AMPK活化诱导人胃癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌、胰腺细胞和肝癌细胞的凋亡，并且通过各种机制包括抑制脂肪酸合成途径和诱导应激激酶和半胱天冬酶3来增强小鼠成神经瘤细胞中氧化应激诱导的凋亡。此外，处理PC3前列腺癌细胞增加p21、p27和p53蛋白表达，并且抑制PI3K-Akt通路。所有这些通路由PAX2直接或间接调控。用AICAR处理前列腺癌细胞导致PAX2表达(图23B)以及其活化形式磷酸化-PAX2的阻抑(图24A)。此外，还阻抑调控PAX2表达的磷酸化-STAT3(图23C)。
最后，推测导致PAX2上调和过表达的异常RAS信号转导阻抑DEFB1肿瘤阻抑基因的表达。为研究此点，用AngII处理正常前列腺上皮原代培养物hPrEC，并检测PAX2和DEFB1表达水平。发现正常前列腺细胞相对于前列腺癌细胞中，DEFB1和PAX2表达之间的反向关系。相比PC3前列腺癌细胞中的表达，未处理的hPrEC显示10％的相对PAX2表达。相反地，相比hPrEC中的表达，未处理的PAX2仅显示2％的相对DEFB1表达。用10uM AngII处理72小时之后，相比未处理的hPrEC，DEFB1表达降低35％，以及96小时时，相比未处理的hPrEC细胞，DEFB1表达降低50％。然而，在72小时时，相比未处理的hPrEC细胞，PAX2表达增加66％，以及96小时时PAX2表达增加79％。此外72小时之后，hPrEC中PAX2表达的增加是PC3前列腺癌细胞所观测PAX2水平的77％。AngII处理96小时之后，PAX2表达为PC3中PAX2表达的89％。这些结果证实，失控的RAS信号转导通过前列腺细胞中PAX2表达的上调，阻抑DEFB1表达。
抑制凋亡是关键的病理生理因素，有助于癌症发展。尽管癌症治疗取得重大发展，但在治疗晚期疾病中很少有进展。鉴于癌发生是多年、多级、多通路疾病的进程，通过使用药物或其它药剂来抑制、延缓或逆转该过程的化学预防已被认为是癌症研究中非常有前景的领域。用于前列腺癌化学预防的成功药物治疗，需要在阻抑癌症发展的总目标下使用对靶细胞具有特异效应而对宿主保持最低限度的临床影响的治疗。因此，理解早期癌发生的机制是确定具体治疗效力的关键。异常PAX2表达及其消除凋亡(随后利于肿瘤形成)的重要性，提示其可能是用于前列腺癌治疗的合适靶标。前列腺癌中PAX2由AT1R调控(图26)。其中，失控的RAS信号转导调控导致PAX2癌基因的表达增加和DEFB1肿瘤阻抑物的表达降低。因此，使用AT1R拮抗剂降低PAX2表达并通过DEFB1的重新表达而导致前列腺癌细胞死亡增加(图27)。这些结果提供新的发现，通过肾素-血管紧张素信号转导通路，AMP激酶通路或涉及PAX2蛋白失活的其它方法(即抗-PAX2抗体免疫)靶向PAX2表达可能是用于癌症预防的可行靶标(表5)。
表5用于化学预防抑制PAX2表达所用的化合物
本研究证实，前列腺癌中PAX2癌基因的上调是由于RAS信号转导失控。PAX2表达由通过血管紧张素1型受体介导的ERK1/2信号转导通路调控。此外，用洛沙坦(Los)阻断AT1R阻抑PAX2表达。此外，已表明AMPK活化剂AICAR可能作为潜在的PAX2抑制剂。总的来说，这些研究强有力地暗示这些类别的药物作为PAX2表达的潜在阻抑物，并且可以最终用作新的化学预防剂。
实施例9：PAX2-DEFB1表达水平作为前列腺组织的分级工具和
前列腺癌发展的预测物
材料和方法
QRT-PCR分析：从经过根治性前列腺切除术的患者采集前列腺切片。病理检查之后，进行激光捕获显微切割来分离正常、增殖性上皮内瘤变(PIN)和癌组织区域。如先前所描述进行QRT-PCR来估计表达。各区域中的DEFB1和PAX2表达，并且GAPDH用作内参。
血液采集和RNA分离：对于QRT-PCR，按照厂商手册，将来自每个个体的血液(2.5ml)收集至PAX geneTM Blood RNA管(QIAGEN)。全血与PAX基因稳定试剂彻底混合，并在RNA提取之前于室温下保存6小时。然后根据厂商说明书，利用PAXgeneTM Blood RNA试剂盒(QIAGEN)提取总RNA。为了去除污染基因组DNA，用DNase I(QIAGEN)于25℃下孵育吸附至PAXgeneTM Blood RNA系统离心柱的总RNA样品20分钟，以去除基因组DNA。如先前所述洗脱、定量总RNA并进行QRT-PCR，以比较PAX2和DEFB1的表达比值。
LCM正常组织的QRT-PCR分析证实，与相对DEFB1表达水平小于0.005的那些患者相比，相对DEFB1表达水平大于0.005的患者具有更低的Gleason评分(图28A)。因而，DEFB1表达与Gleason评分之间存在反向关系。相反地，恶性前列腺组织和PIN中PAX2表达与Gleason评分之间存在正相关(图28B)。
计算和比较来自各患者的正常、PIN和癌组织中的PAX2和DEFB1表达水平(图29)。总体而言，PAX2相对于GAPDH内参的表达水平范围：正常(良性)组织为0至0.2，PIN为0.2至0.3，以及癌(恶性)组织为0.3至0.5(图30)。对于DEFB1，与PAX2相比存在反向关系。此时，DEFB1相对于GAPDH内参的表达水平范围：正常(良性)组织为0.06至0.005，PIN为0.005至0.003，以及癌(恶性)组织为0.003至0.001。因此，公开了预测量表(命名为“Donald预测因子”或“DPF”)，其利用PAX2-DEFB1表达比值作为良性、癌前期(PIN)和恶性前列腺组织的预测物。基于DPF，PAX2-DEFB1比值为0至39的组织代表正常(病理良性)。基于DPF量表，PAX2-DEFB1比值为40至99的组织代表PIN(癌前)。最后，PAX2-DEFB1比值为100至500的组织代表恶性(低级别至高级别癌症)。
目前迫切需要用于前列腺癌发展的预测性生物标志物。已知前列腺癌在能通过目前的筛选方法如PSA测试或数字直肠检查进行检测之前，该疾病就已经发作很长时间了。认为能够监测前列腺癌进程及早期发作的可靠的测试应能通过更有效的疾病管理，极大地降低死亡率。本文公开了允许医生提前了解前列腺病理状态的预测指标。DPF评估与前列腺疾病进程相关的PAX2-DEFB1表达率的减小。这种有力的评估不仅能预测患者发展前列腺癌的可能性，而且还可以确认癌恶化前的早期发作。最后，该工具可以允许医生将患有更严重疾病的患者与不严重的那些患者隔离。
鉴定出的癌症-特异性标志物已用于辅助鉴定循环肿瘤细胞(CTC)。还有新的证据证实，为了早期评估辅助疗法的效力，检测外周血中散布的肿瘤细胞可以为肿瘤分期、预测和替代标志物的鉴定提供重要的临床数据。此外，通过比较所有循环细胞的基因表达谱，可以检测分别在“免疫监视”和“癌症存活”中发挥作用的DEFB1和PAX2基因的表达，这两种基因作为早期检测前列腺癌的预测物。
实施例10：宿主防御肽人β-防御素-1的功能性分析：其在癌症
中潜在作用的新认识
材料与方法
组织样品和激光捕获显微切割：前列腺组织获自在进行根治性前列腺切除术之前已提供知情同意的患者。根据机构审查委员会批准的协议，通过Hollings癌症中心肿瘤库获得样品。这包括用于样品的处理、切片、组织学表征、RNA纯化和PCR扩增的指导原则。从外科医生接收前列腺标本并且病理学者迅速于OCT化合物中冷冻。将各OCT块切割以产生待染色和检测的系列切片。鉴定含有良性细胞、前列腺上皮内瘤变(PIN)和癌症的区域，并用于指导我们利用Arcturus PixCell II系统(Sunnyvale，CA)选择来自未染色玻片上的区域。使含有捕获材料的Caps暴露于来自Arcturus Pico Pure RNA分离试剂盒的20μl裂解液并立即处理。RNA定量和定性利用产生5’扩增子的引物组来评估。该引物组包括用于核糖体蛋白L32的引物(3’扩增子和5’扩增子相隔298个碱基)，用于葡萄糖磷酸异构酶的引物(相隔391个碱基)，以及用于葡萄糖磷酸异构酶的引物(相隔842个碱基)。使用来自多种制备组织的样品，这些引物组常规获得0.95至0.80的比值。其它肿瘤和正常样品由病理学者粗略切割，于液氮中速冻并且评估hBD-1和cMYC表达。
hBD-1基因的克隆：利用从已公开的hBD-1序列(登录号U50930)(Ganz，2004)产生的引物，通过逆转录PCR产生hBD-1cDNA。所设计的PCR引物含有ClaI和KpnI限制性位点。hBD-1 PCR产物用ClaI和KpnI消化并连接到TA克隆载体。然后使TA/hBD-1载体通过热激转染到大肠杆菌XL-I Blue菌株，并选择和扩增单克隆。通过Cell Culture DNAMidiprep(Qiagen，Valencia，CA)分离质粒，并通过自动测序验证序列完整性。然后，将hBD-1基因片段连接入用ClaI和KpnI消化的pTRE2(用作定向目的的中间载体)。用ApaI和KpnI消化pTRE2/hBD-1构建体来切下hBD-1插入物。将插入物连接入同样用ApaI和KpnI双重消化的脱皮激素诱导型表达系统的pIND载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。使所述构建体转染大肠杆菌，并选择和扩增单克隆。分离质粒并通过自动测序再次验证pIND/hBD-1的序列完整性。
转染：将细胞(1x106)接种到100-mm皮氏培养皿并且过夜培养。接着，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)，用1μg pVgRXR质粒(表达异源二聚体的蜕皮激素受体)和1μg pIND/hBD-1载体构建体或pIND/β-半乳糖苷酶(β-gal)对照载体于Opti-MEM培养基(LifeTechnologies，Inc.)中共转染细胞。通过用松甾酮A(PonA)诱导β-gal表达和用β-半乳糖苷酶检测试剂盒(Invitrogen)染色细胞来测定转染率。通过计数阳性染色(蓝色)克隆的转染率评估证实，细胞系中60-85％的细胞表达β-半乳糖苷酶。
免疫细胞化学：为了验证hBD-1蛋白表达，将DU145和hPrEC细胞以每个腔室1.5-2x104细胞接种于2-腔室培养玻片(BD Falcon，USA)。用含10μM Pon A的培养基诱导仅用pvgRXR(对照)或用hBD-1质粒转染的DU145细胞18小时，而未转染的细胞接受新鲜的生长培养基。诱导之后，细胞用1倍PBS洗涤并于室温下用4％多聚甲醛固定。然后细胞用1倍PBS洗涤六次并在补充有2％BSA、0.8％正常羊血清(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)和0.4％Triton-X 100的1倍PBS中于室温下封闭1小时。接着，细胞于以1∶1000稀释于封闭溶液的一级兔抗-人BD-1多克隆抗体(PeproTech Inc.，Rocky Hill，NJ)中过夜孵育。在这之后，细胞用封闭溶液洗涤六次，并于室温下在以1∶1000稀释于封闭溶液的Alexa Fluor 488山羊抗-兔IgG(H+L)二抗中孵育1小时。用封闭溶液洗涤细胞六次之后，用Gel Mount(Biomeda，Foster City，CA)密封盖玻片。最后，于微分干涉相差(DIC)和448nm激光激发下观测细胞。通过具有Vario 2 RGB激光扫描组件的共聚焦显微镜(Zeiss LSM 5 Pascal)，利用63倍DIC油镜分析荧光信号。将数字图像传输到Photoshop CS软件(Adobe Systems)，用于图像处理和硬拷贝显示。
如实施例1所描述进行RNA分离和定量QRT-PCR。用于hBD-1和c-MYC的引物对由公开序列产生(表6)。于标准条件下，使用56.4℃(用于hBD-1和c-MYC)和55℃(用于PAX2)的退火温度进行40个PCR循环。此外，扩增β-肌动蛋白(表6)，作为管家基因来标准化总cDNA的初始含量。良性前列腺组织样品中的基因表达计算为与β-肌动蛋白相比的表达率。恶性前列腺组织、hPrEC前列腺原代培养物和前列腺癌细胞系在诱导之前和之后的hBD-1表达水平计算为相对于hPrEC细胞中hBD-1表达的平均水平。作为阴性对照，还进行了不含cDNA模板的QRT-PCR反应。所有反应均最少进行三次。
如实施例1所描述进行MTT细胞活力测定。
如实施例3所描述进行膜完整性分析。用含有10μM Pon A的培养基诱导转染了空质粒或hBD-1质粒的细胞24或48小时，而对照细胞在每个时间点接受新鲜的生长培养基。
如实施例1所描述进行流式细胞术和半胱天冬酶检测。
如实施例2所描述进行PAX2的siRNA沉默。处理之前根据厂商指导，用CodeBreake转染试剂(Promega，Inc.)包被siRNA分子。
统计学分析：利用非配对值的学生t-检验进行统计学分析。通过双边计算确定P值，并且认为P值小于0.05是统计学显著的。通过星号示出统计学差异。
前列腺组织中的hBD-1表达：所分析的前列腺癌冷冻组织切片分析的82％表现出很少或没有hBD-1表达(Donald et al.，2003)。为比较hBD-1表达水平，对通过粗略切割或随机选择的恶性区域附近的正常前列腺组织LCM所获得的正常前列腺组织进行QRT-PCR分析。此时，检测全部粗略切割的正常临床样品中的hBD-1，所述正常临床样品具有代表表达水平相差大约6.6倍的一系列表达(图31A)。LCM捕获的正常组织样品以代表表达相差32倍的范围水平表达hBD-1(图31B)。样品编号与相应的患者特征的匹配显示，在大多数情况下，Gleason评分为6的患者样品中的hBD-1表达水平高于Gleason评分为7的患者样品中的水平。此外，比较通过粗略切割和LCM从同一患者#1343获得的组织中的hBD-1表达水平，证实两种分离技术之间表达相差854倍。因此，这些结果表明LCM为评估前列腺组织中的hBD-1表达提供更灵敏的技术。
前列腺细胞系中的hBD-1表达：为验证用hBD-1表达系统转染之后前列腺癌细胞系中hBD-1的上调，进行QRTPCR。此外，还进行不含模板的阴性对照，并通过凝胶电泳验证扩增产物。此时，与hPrEC细胞相比，前列腺癌细胞系中的hBD-1表达显著更低。诱导24小时之后，与hBD-1诱导之前的细胞系相比，DU145、PC3和LNCaP中hBD-1的相对表达水平显著增加(图32A)。
接着，用Pon A诱导后，通过免疫细胞化学技术验证用hBD-1表达系统转染的DU145细胞中hBD-1的蛋白表达。作为阳性对照，还检测表达hBD-1的hPrEC前列腺上皮细胞。用抗hBD-1的一抗对细胞染色，并基于二抗的绿色荧光监测蛋白表达(图32B)。在DIC下的细胞染色验证hPrEC细胞和DU145细胞的存在在18小时时诱导hBD-1表达。通过共聚焦激光在488nm处产生的激发显示绿色荧光，这表明作为阳性对照的hPrEC中存在hBD-1蛋白。然而，对照DU145细胞和空质粒诱导的DU145细胞没有检测到绿色荧光，这表明没有hBD-1表达。对诱导hBD-1表达的DU145细胞的共聚焦分析显示绿色荧光，这表明用Pon A诱导之后存在hBD-1蛋白。
hBD-1表达导致细胞活力降低：进行MTT测定来评估hBD-1表达对DU145、PC3、PC3/AR+和LNCaP前列腺癌细胞系的相对细胞活力的影响。用空载体的MTT分析在细胞活力上没有表现出统计学显著的变化。hBD-1诱导之后24小时，相对细胞活力：DU145细胞为72％，以及PC3细胞为56％，而48小时之后，细胞活力降低至：DU145细胞为49％，以及PC3细胞为37％(图33A)。hBD-1诱导72小时之后，相对细胞活力进一步降低至：DU145细胞为44％，以及PC3细胞为29％。相反地，对LNCaP细胞的活力没有显著影响。为评估LNCaP中所观测到的对hBD-1细胞毒性的抗性是否是由于雄激素受体(AR)的存在，检测具有异常AR表达的PC3细胞(PC3/AR+)中的hBD-1细胞毒性。此时，PC3/AR+与PC3细胞之间没有差异。因此，数据表明hBD-1特异地对晚期前列腺癌细胞是细胞毒性的。
为了测定hBD-1对PC3和DU145的影响是细胞抑制的还是细胞毒性的，进行FACS分析来测量细胞死亡。在正常生长条件下，多于90％的PC3和DU145培养物存活且不凋亡(左下象限)，并且用膜联蛋白V或PI不染色(图4)。诱导PC3细胞表达hBD-1之后，发生早期凋亡和晚期凋亡/坏死的细胞数量(分别为右下和右上象限)总计：12小时为10％，24小时为20％，以及48小时为44％。对于DU145细胞，发生早期凋亡和晚期凋亡/坏死的细胞数量总计：诱导12小时之后为12％，24小时为34％，以及48小时为59％。用Pon A诱导之后，含有空质粒的细胞中未观测到凋亡增加。膜联蛋白V和碘化丙啶吸收研究已证实，hBD-1对DU145和PC3前列腺癌细胞具有细胞毒活性，并且结果表明凋亡为细胞死亡的机制。
hBD-1致使膜完整性和半胱天冬酶活性变化：研究hBD-1诱导之后所观测的前列腺癌细胞的细胞死亡是否是半胱天冬酶-介导的凋亡。为更好地理解参与hBD-1表达的细胞机制，对诱导hBD-1表达的DU145和LNCaP细胞进行共聚焦激光显微镜分析(图5)。基于发绿色荧光的FAM-VAD-FMK与活跃发生凋亡的细胞中半胱天冬酶的结合和分离来监测泛半胱天冬酶活化。在DIC下的细胞分析表明，0小时时存在活的对照DU145(图5A)和LNCaP(图5E)细胞。通过共聚焦激光在488nm处的激发未产生可检测的绿色染色，表明DU145(图5B)或LNCaP(图5F)对照细胞中没有半胱天冬酶活性。诱导24小时之后，在DIC下再次可见DU145(图5C)和LNCaP(图5G)细胞。荧光下的共聚焦分析显示DU145(图5D)细胞中的绿色染色，表明诱导hBD-1表达之后的泛半胱天冬酶活性。然而，诱导hBD-1表达的LNCaP(图H)细胞中没有绿色染色。因此，诱导hBD-1之后所观测的细胞死亡是半胱天冬酶-介导的凋亡。
所提出的防御素肽抗菌活性的机制是由于孔形成导致破坏微生物膜(Papo and Shai，2005)。为了确定hBD-1表达是否改变膜完整性，通过共聚焦分析检测EtBr吸收。完整细胞由于膜透过AO被染成绿色，而只有细胞质膜受损的细胞由于并入膜不可透过的EtBr而染成红色。对照DU145和PC3细胞用AO呈阳性染色并且发出绿色，但不被EtBr染色。然而，如通过红色染色所指示的，hBD-1诱导24小时的DU145和PC3导致EtBr聚集于细胞质。48小时时，DU145和PC3具有浓缩的细胞核，并且由于分别来自AO和EtBr的绿色和红色的共定位而出现黄色。相反地，诱导48小时之后，通过用AO呈阳性绿色荧光但没有红色EtBr荧光所指示的，LNCaP细胞的膜完整性没有可观测的改变。该发现表明早期和晚期前列腺癌细胞之间响应于hBD-1表达不同而改变膜完整性和透性。
hBD-1和cMYC表达水平的比较：对来自三名患者的LCM前列腺组织进行QRT-PCR分析(图34)。患者#1457中，hBD-1表达显示：由正常至PIN降低2.7倍，由PIN至肿瘤降低3.5倍，以及由正常至肿瘤降低9.3倍(图34A)。同样地，患者#1457的cMYC表达遵循相似的表达模式，其中：由正常至PIN表达降低1.7倍，由PIN至肿瘤降低1.7倍，以及由正常至肿瘤降低2.8倍(图34B)。此外，另外两名患者中的cMYC表达呈现统计学显著的降低。患者#1569由正常至PIN降低2.3倍，而患者#1586由正常至PIN降低1.8倍，由PIN至肿瘤降低4.3倍，以及由正常至肿瘤降低7.9倍。
PAX2抑制之后hBD-1表达的诱导：为进一步检测PAX2调控hBD-1表达的作用，利用siRNA敲低PAX2表达并进行QRT-PCR监测hBD-1表达。用PAX2 siRNA处理的hPrEC细胞显示对hBD-1表达没有影响(图35)。然而，与未处理细胞相比，PAX2敲低导致hBD-1的表达增加：LNCaP为42倍，PC3为37倍，以及DU145为1026倍。作为阴性对照，用非特异siRNA处理的细胞对hBD-1表达没有显著影响。
实施例11：PAX2表达的抑制导致P53状态不同的前列腺癌细
胞产生交替的的细胞死亡通路
材料与方法
细胞系：如实施例1所描述培养p53突变状态不同(表7)的癌细胞系PC3、DU145和LNCaP。
如实施例2所描述进行PAX2的siRNA沉默和Western分析。用以1∶1000稀释的兔抗-PAX2一抗(Zymed，San Francisco，CA)探测印迹。洗涤之后，用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗-兔抗体(稀释度1∶5000；Sigma)孵育膜，并于Alpha Innotech Fluorchem 8900上利用化学发光试剂(Pierce)显现信号检测。作为对照，将印迹清除并用小鼠抗-β-肌动蛋白一抗(1∶5000；Sigma-Aldrich)和HRP-偶联的抗-小鼠二抗(1∶5000；Sigma-Aldrich)重新探测，并再次显现信号检测。
表7前列腺癌细胞系中的p53基因突变
如实施例2所描述进行相差显微镜法和MTT细胞毒性测定。
如实施例1所描述进行泛半胱天冬酶检测和定量实时RT-PCR。从公开序列产生用于BAX、BID、BCL-2、AKT和BAD的引物对(表8)。于Micro Amp Optical 96-孔反应板(PE Biosystems)进行反应。在标准条件下，使用60℃的退火温度进行40个PCR循环。通过指数扩增开始的循环数(阈值)和获自三个重复的平均值来确定定量。信号水平与阈值之间存在反向关系。此外，将GAPDH用作管家基因来标准化总cDNA的初始含量。相对表达计算为各基因与GAPDH之间的比值。所有反应均进行一式三份。
如实施例3所描述进行膜透性测定。用PAX2 siRNA、非特异siRNA或仅用培养基转染PC3和LNCaP细胞。
前列腺细胞中PAX2蛋白表达的分析：通过在HPrEC前列腺原代培养物以及LNCaP、DU145和PC3前列腺癌细胞系中的Western分析检测PAX2蛋白表达。此时，检测所有前列腺癌细胞系中的PAX2蛋白(图36A)。然而，HPrEC未检测出PAX2蛋白。将印迹清除并用作为内参的β-肌动蛋白重新探测以确保上样相等。通过DU145、PC3和LNCaP前列腺癌细胞系中PAX2特异siRNA选择性靶向和抑制之后，同样监测PAX2蛋白表达。用PAX2 siRNA池在6日处理期间转染细胞一轮。PAX2蛋白表达于仅用培养基处理的对照细胞。通过观测所有三种细胞系中PAX2蛋白的敲低证实了特异靶向PAX2 mRNA(图36B)。
PAX2敲低对前列腺癌细胞生长的影响：利用光学显微镜法和MTT测定分析PAX2 siRNA对细胞数量和细胞活力的影响。为检测PAX2 siRNA对细胞数量的影响，仅用培养基、用非特异siRNA或PAX2siRNA于6日期间转染PC3、DU145和LNCaP细胞系。每种细胞系在仅含有培养基的60mm培养皿中达到80-90％汇合。与仅用培养基处理的细胞相比，用非特异siRNA对HprEC、DU145、PC3和LNCaP细胞的处理似乎对细胞生长少有至没有影响(分别为图38A、38C和38E)。用PAX2 siRNA对PAX2-缺失细胞系HprEC的处理似乎对细胞生长没有显著影响(图37B)。然而，用PAX2 siRNA对前列腺癌细胞系DU145、PC3和LNCaP的处理导致细胞数量显著减少(分别为图38D、38F和38H)。
PAX2敲低对前列腺癌细胞活力的影响：暴露2日、4日和6日之后，测量细胞活力。百分比活力计算为用PAX2 siRNA处理的细胞的570-630nm处的吸光度除以未处理对照细胞的570-630nm处的吸光度的比值。作为阴性对照，在用阴性对照非特异siRNA或仅用试剂转染的每次处理之后，测量细胞活力。通过PAX2 siRNA处理之后的百分比活力除以用非特异shRNA处理之后的百分比活力计算相对细胞活力(图38)。处理2日之后，相对细胞活力：DU145为116％，PC3为81％，以及LNCaP为98％。处理4日之后，相对细胞活力降低至：DU145为69％，PC3为79％，以及LNCaP为80％。最后，到6日时，相对细胞活力：DU145为63％，PC3为43％以及LNCaP为44％。此外，还测量仅用试剂转染处理之后的细胞活力。此时，各细胞系在细胞活力上未表现出显著降低。
泛半胱天冬酶活性的检测：通过共聚焦激光显微镜分析检测半胱天冬酶活性。用PAX2 siRNA处理LNCaP、DU145和PC3细胞，并且基于FAM-标记的肽与活跃发生凋亡的细胞中半胱天冬酶的结合(发绿色荧光)来监测活性。仅用培养基处理的细胞分析分别显示活LNCaP、DU145和PC3细胞的存在。通过共聚焦激光在488nm处的激发未产生可检测的绿色染色，表明未处理的细胞中没有半胱天冬酶活性(分别为图39A、39C和39E)。用PAX2 siRNA处理4日之后，荧光下呈现绿色染色的LNCaP、DU145和PC3细胞表明半胱天冬酶活性(分别为图39B、39D和39F)。
PAX2抑制对凋亡因子的影响：用针对PAX2的siRNA处理LNCaP、DU145和PC3细胞4日，并且通过QRTPCR测量促凋亡因子和抗凋亡因子的表达。PAX2敲低之后，BAD分析显示：LNCaP为2倍，DU145为1.58倍，以及PC3为1.375倍(图40A)。BID的表达水平：LNCaP增加1.38倍，以及DU145增加1.78倍，但是阻抑PAX2表达之后观测PC3中的BID没有统计学显著差异(图40B)。处理之后，抗-凋亡因子AKT的分析显示：LNCaP表达下降1.25倍，以及DU145表达下降1.28倍，而观测PC3无变化(图40C)。
膜完整性和坏死分析：通过共聚焦分析监测LNCaP，DU145和PC3细胞的膜完整性。此时，完整细胞由于能透过膜的AO而染成绿色；而由于在细胞质内并入不能透过膜的EtBr，具有受损细胞质膜的细胞会染成红色；以及由于AO和EtBr在细胞核中的共定位，呈现为黄色。未处理的LNCaP、DU145和PC3细胞用AO呈阳性染色并且发出绿色，但是用EtBr未染色。PAX2敲低之后，如通过用AO呈阳性绿色荧光而没有红色EtBr荧光所指示的，LNCaP细胞的膜完整性没有可观测到的变化。这些发现进一步表明，PAX2敲低之后，LNCaP细胞可发生凋亡，但不是坏死性细胞死亡。相反地，DU145和PC3中的PAX2敲低导致EtBr聚集于细胞质，如通过红色染色所指示的。此外，由于分别来自AO和EtBr的绿色和红色的共定位，DU145和PC3具有呈现黄色的浓缩细胞核。这些结果表明，相比LNCaP，DU145和PC3正在发生包括坏死性细胞死亡的交替的细胞死亡通路。
实施例12：乳腺癌细胞系和具有导管或小叶上皮内瘤变的乳腺组
织中的PAX2和DEFB-1表达
测定导管或小叶上皮内瘤变的乳腺活检样品以及以下乳腺癌细胞系中的PAX2和DEFB-1表达：
BT-20：从原发性浸润性导管癌分离；细胞表达E-钙粘附素、ER、EGFR和uPA。
BT-474：从原发性浸润性导管癌分离；细胞表达E-钙粘附素、ER、PR，并且具有增加的HER2/neu。
Hs578T：从原发性浸润性导管癌分离；同样由正常邻近组织建立的细胞系，称为Hs578Bst。
MCF-7：由胸腔积液建立。细胞表达ER，并且是雌激素-响应性乳腺癌细胞的最常见例子。
MDA-MB-231：由胸腔积液建立。细胞为ER-阴性，E-钙粘附素阴性，并且体外测定是高度浸润的。
MDA-MB-361：由脑转移瘤建立。细胞表达ER、PR、EGFR和HER2/neu。
MDA-MB-435：由胸腔积液建立。细胞为ER-阴性，E-钙粘附素阴性，并且在免疫缺陷小鼠中是高度浸润和转移性的。
MDA-MB-468：由胸腔积液建立。细胞具有增加的EGFR，并且是ER-阴性。
SK-BR-3：由胸腔积液建立。细胞具有增加的HER/2neu，表达EGFR以及是ER-阴性。
T-47D：由胸腔积液建立。细胞保持表达E-钙粘附素、ER和PR。
ZR-75-1：由腹水建立。细胞表达ER、E-钙粘附素、HER2/neu和VEGF。
利用实施例9所描述的方法确定PAX2-比-DEFB表达率。
实施例13：乳腺癌细胞中的DEFB1表达
利用实施例1所描述的方法将DEFB1表达于乳腺癌细胞中。如实施例1所描述测定细胞活力和半胱天冬酶活性。
实施例14：对乳腺癌细胞中PAX2表达的抑制
利用实施例2所描述的siRNA抑制乳腺癌细胞中的PAX2表达。如实施例2所描述测定促凋亡基因如BAX、BID和BAD的表达水平，细胞活力和半胱天冬酶活性。
实施例15：DEFB1表达对体内肿瘤生长的影响
通过将过表达DEFB1的乳腺癌细胞注射至裸鼠来评估DEFB1的抗肿瘤能力。用携带DEFB1基因的表达载体转染乳腺癌细胞。选择并克隆表达外源DEFB1基因的细胞。仅使用活力＞90％的单细胞悬浮液。每只动物接受大约500,000个细胞，经皮下给予雌性裸鼠右侧腹部。有两组，对照组用仅有载体的克隆注射，而一组用过表达DEFB1的克隆注射。由统计学家确定每组35只小鼠。动物每周称重两次，肿瘤生长由卡尺监测，而肿瘤体积利用以下公式计算确定：体积＝0.5x(宽)2x长。肿瘤大小达到2mm3或植入之后六个月时，通过过量CO2处死所有动物；将肿瘤切除、称重并保存于中性缓冲的福尔马林，用于病理检查。两组之间肿瘤生长的差异通过汇总统计表和图形显示描述表征。用t-检验或非参数等同方法评估统计学显著性。
实施例16：PAX2 siRNA对体内肿瘤生长的影响
将体外研究中利用的发卡PAX2 siRNA模板寡核苷酸用于检测对体内DEFB1表达上调的作用。使正义和反义链(参见表3)退火并克隆入人U6 RNA pol III启动子控制下的pSilencer 2.1 U6 hygro siRNA表达载体(Ambion)。将所克隆的质粒测序、验证并转染至乳腺癌细胞系。克隆乱序shRNA并用作本研究的阴性对照。选择抗潮霉素的克隆，将细胞经皮下引入小鼠，并且如以上所描述监测肿瘤生长。
实施例17：PAX2结合的小分子抑制剂对乳腺癌细胞的影响
用lipofectamine试剂或Codebreaker转染试剂(Promega，Inc)使实施例6中所描述的可选的抑制性寡核苷酸转染入乳腺癌细胞。为了证实DNA-蛋白相互作用，用[32P]dCTP标记双链寡核苷酸，并进行电泳迁移率测定。用寡核苷酸处理之后，通过QRT-PCR和Western分析监测DEFB1表达。最后，通过如先前所描述的MTT测定和流式细胞术检测细胞死亡。
以上描述仅是为了教导本领域普通技术人员如何实施本发明，并不意欲详述本领域技术人员通过阅读说明书就能显而易见的那些明显的修改和变化。然而，其目的是所有这些明显修改和变化都包括于由以下权利要求书所限定的本发明的范围内。权利要求书意欲涵盖所要求保护的成分和可有效满足预期目的的任何顺序的步骤，除非上下文特别指明相反。
SEQ IDs 1-69
<400>1
ccttg
<400>2
gttcc
<400>3
auagacucga cuugacuucu u
<400>4
aucuucauca cguuuccucu u
<400>5
guauucagca aucuuguccu u
<400>6
gauuugaugu gcucugaugu u
<400>7
acccgactat gttcgcctgg
<400>8
aagctctgga tcgagtcttt g
<400>9
atgtgtcagg cacacagacg
<400>10
gucgagucua ucugcauccu u
<400>11
ggaugcagau agacucgacu u
<400>12
vccttgw
<400>13
ctcccttcag ttccgtcgac
<400>14
ctcccttcac cttggtcgac
<400>15
actgtggcac ctcccttcag ttccgtcgac gaggttgtgc
<400>16
actgtggcac ctcccttcac cttggtcgac gaggttgtgc
<400>17
ctctg
<400>18
ctcccttcac tctggtcgac
<400>19
actgtggcac ctcccttcac tctggtcgac gaggttgtgc
<400>20
agaagttcac ccttgactgt
<400>21
agaagttcac gttccactgt
<400>22
agaagttcac gctctactgt
<400>23
ttagcgatta gaagttcacc cttgactgtg gcacctccc
<400>24
gttagcgatt agaagttcac gttccactgt ggcacctccc
<400>25
gttagcgatt agaagttcac gctctactgt ggcacctccc
<400>26
actgcccatt gcccaaacac
<400>27
aaaatcttgc cagctttccc c
<400>28
gtcggttacg gagcggaccg gag
<400>29
taacatatag acaaacgcac accg
<400>30
gcgcttgtgt cgccattgta ttc
<400>31
gtcacaccac agaagtaagg ttcc
<400>32
gtcggttacg gagcggaccg gag
<400>33
cacagagcat tggcgatctc gatgc
<400>34
cctggcaccc agcacaat
<400>35
gttgcctgcc agtcgccatg agaacttcct ac
<400>36
gccgatccac acggagtact
<400>37
tggccttccc tctgtaacag gtgccttgaa tt
<400>38
gaagucaagu cgagucuauu u
<400>39
gaggaaacgu gaugaagauu u
<400>40
ggacaagauu gcugaauacu u
<400>41
caucagagca caucaaaucu u
<400>42
ccacccatgg caaattccat ggca
<400>43
ctcaggccta tgcaaaaaga gga
<400>44
aacctacgca cctacgtgag gag
<400>45
gacacctgag ctgaccttgg
<400>46
tctagacggc aggtcaggtc aacc
<400>47
gccctccctc caaaggagac
<400>48
cgttcagtcc atcccatttc tg
<400>49
gaggaagtcc agtgtccagc
<400>50
tcagcagtgg agggcaatg
<400>51
cctctgtaac aggtgccttg aat
<400>52
acagcaaacc tcctcacagc c
<400>53
tggagacgtg gcacctcttg
<400>54
tatgataccc gggagatcgt gatc
<400>55
gtgcagatgc cggttcaggt actc
<400>56
tcagccctgg actacctgca
<400>57
gaggtcccgg tacaccacgt
<400>58
Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Arg His
Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro Leu
Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly Val
Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys Val
Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro Gly
Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val Asp
Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp Glu
Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr Val
Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn
<400>59
ttcccccttt ccangagggc ctaatccgtt gcgcgcgcgc acgcggacac acacacacac
acacacacac acacacacac acacacggcc cccatagcca ccgcaactct cagcagcagn
ncctagctcc tctgacccga ggccccaaga cggcgggcac aggaacccct gggacgtcct
ggctccaggc tggacgtagg cggaggtggc aggagtggac aaacccaggc gggtcccacg
acgccccttt cctcgggtct ctccttgttt cagccagccg ctctcgcccc tggtcccctc
ttccctgcgt tagggtcctt tgtctccagc cacctcgcag cctgtccccg cctcggcggc
cctgcccttt gggcctccca gatctctctg gcgggtcccc ctgccttacc agctcccggc
tgtggcgcgc tcttcgcctg ctcctcacat ncacacagct gctgggagag gaggaaggaa
aggcggncgc gccgcggatg gatccgagac ggtagatttg gtgccggctc gcaaactctg
ggaaacttaa ngccggttct tccgcccctc tncaactatg nccagcgcgg cccggtcgcg
cgcgctcacc ccgcggggac cctttccttt tcctgtattt cggctgcggc tgtttcgctt
cctctggtct cccagccttt ggagtggctt ccctggccct gcactccgtt ccctttcggc
cgcccccggc tgtcgcctgc ccccaccctc cgcaggtccc acggtcgcgg cggcgatgac
tgtggaggta acgccgggga cgtcctgggt cagcctgcac cgtctccctc gaccacagcc
cgatgaggcc gcgggctccg ggccggctgc taagagagtt aatcattact tcgccagcga
cactcagcct ccccttccga ctctctcgcc cggcctaggg gaggagggga ggggacagct
ggccaggtgg ggacttcggc ttcgcacaaa ccagcctctt caggcctccc agagacaggt
ggtggcttct cagttccctc ggcaactctc taaggtcctc tttcttcccc tcctgtctct
ccctccttcg agcctcctcc cagccaggcc tctccccacc gtctcctgtc cgctctggct
ttgactgatt aactgcaggt cctgggagaa ccaactttct ttgtttggaa ccggaccgga
cgggatttcc ttccctaggt ctccgccaat gggccagctc ctcccgacgg ttttggcgga
ctggctgaag aggaccgcgc ctgaggccac aattaacccg gctgttggtg gtggtggttg
gggggtgggc agtgaggaat ttaaccgatc ctctagcagc tgcgctggtg cagttgggag
gggggtgcag gaagtgggaa tggaggagtg gcaggaggta tagacagagg gaagaacgat
aaacctggac aggtgtggca tagccaatag aaggggaaac aaaataaaac aggaaggcgg
cgcggggagg aatccccagt aacctttata ggattgaagt tgggtggaaa acgccacctc
ctgccctacc ttagcactca gatccctcct ttacctcttt gtgaaagggt aagagttcag
aaagctggcc atttactcca taatctacta gagaaatgtc tgggtttgca aaatgcctat
tgattagctc catggagtag acaagacagg cgtaattatc cccattttac aggtgagaaa
actgagtctc aaagaagcaa agggactgtg tatgtagtgg ctgtcacttt ttcctgtagg
ctgtggggtg agtggcccct ttagctgtgc agaggtccat gggtatctag ggaggcggta
caggctgtgt ccaggtctga gccagaagta ccagggcctc acggggctcc tagccctttt
agcttgttct ctgttggaca ggaccttcac tcttactctc tagacctgct ggctgggttt
ctcccagctt cgctattttt tcagttccct agtagagtgg cccatgggcg gtagccacct
ggctggcccg tgccactaag aggcagcttt ggtggccaag tggcttgcat tgttgttgct
cctcaaaggg cctgtgaagg gctgggcagg tcgcaaagac ctcttgtgag gggaaagcta
gattaaaggg ggtaaggatc ctggaggata aaggccaagc acgtgcgcct ggactccaca
ggaccaacag accgagcggg cggggccngc tgggagtcag gccccccggg cttcacgcag
ggagcccaaa tattgggaac aaaagcagga aaagaagagt gagagcagga gggagggagg
gagcgaggaa gcagaaatta gggggtctta gatgaaaaaa aaaagaaagt agctttaggg
ggaatgtgct gtggagtgtg aaattgcagc ccatggtgct ccatattgta ccagaagctc
ttccaaaaaa aaaaaaaaaa accatcctcc aacgtgacca gagggccagg cagggggaag
ggcggggaga gaatggggag gaggaggggg aaaggccggg caggagccgg tcaggccttt
ctgcggaagg ggctggggtg taagtttcgg ctccctggga tctgacagcc gagggtatgc
gccctggggt gcgccgggac ccagagggcg agtgagcctc ggttggtcgg ctctggagtt
cggttgtcag aagaactttt atttttcttt ttggtggtga cttctaaaag tgggaataat
ccagaaatga agctcagctg cggagctgca gctctgttct ccctctctcc cctgcctttc
tgcttctctt cccttcggac tacttttctc cccttggttc taaatagctt tttcccctct
gaactttaat gcatttaatt tggtccgcgc tgtggggagc atttcctggg gagatgcatt
taatttcgga atttctaatc ccctccctca gaccccggtc ctagctcccc tagccgctcc
ccgggaagtg gaaggaggaa ggcaggtccc ggccacgggg gaggggcgcg gctgggatgc
tcccgcggcc ccctccgtct caccaaggct cagccgcctt cccaagctac tggaggccgg
gcgcctgggc cccgggtcag ggccctgcan gaagaagaga ggcaaccccc gctttctgcc
ttttcttcgc ctgggcaaga aaacgctggg ccagggaact ggaaaccgga aaacaggaga
aagggtttnt ggaaggcanc gggagcgggt ggcagncggg gcancgggca ntggactagg
tctacaccgg cacttcactt ttgcacaaca tgcccagaaa cgcatttgag agccctggag
tcgcgcttgg cttggcttgg ggcgccggtg cgtgggtaca ctcgaggtcg gggtgcctat
ccgccacccc gacacctaca cccagtgcag agcaggcgcg gcccagccag acaaccaggc
cggcagtagc tcggcctgga gggcggaggc aaggttgggg gccgccaggc gcctgggcaa
gcctggcagg gaagggagcc gagaaggcaa aggagccgag atccacaagg aagattnntt
gggcagatca gatgcacaga ggcggctaat gaagcaaatc ccgagatggg tttcagagca
actccccaaa agtttatttt gcctttaaat ttccgcaggg aggcgggctc cttgtttgaa
gtgtaaatgc ccctaggttg gggggtggaa gggccgcttt gaaaacacca gagagaaaag
gttcatttag aggcggacgg gaaaagcaac caaccctgac aggtcggagc ccgggtagtg
tttggggttg ggtngttttc tttctttctc tttcttttcc cctttcctct tctttcttcc
cttttgtgnn ttttnnttgt tttttttntn ttntttttnt ttaantggct ttcttgcttc
cccccacccc tctactagac tctatagaag aaagagaaca gaaaaggggg agtcagagga
gcggccagtg actggatgaa ggccagccct tcatcctgga gccccaggag aaggcagagc
tttggagaaa aggggttcct aatctccagg gagcattact ctttgactct ctagacccag
gaatgggctg gacgctaatg gggaagcggc caggaacccg gcctggcgga agagtgagtg
tccagctagt gcagtgctgg gaagacgatc ccaggagcag gggggactct caggggctac
ctgggaatgg gactatcaga agggtcttta ctcctcanaa ggtgcatgtg aaggacaggt
gtgtgaggac aacttccagc acacttggcg cattaagtcc ccttctctac aaaatggaaa
atccttctcg cccaacatgt gaaaatgctt gttgtgggca cccacatttc atggtacttg
taacatagga catgtctagc tggttctaga aaaatctgtg tctgtgtgga aggggggggg
tttactcaca gctttcttcc ttcaatagtt cacacacccc gagacaaatt cctggatgac
caacttggag agacctgggg caaaggttac tttagttctg agctcctcta aataaggacc
ctttctcaac gttcctttca ccccagttct gggttaatta cttccagtta gtgcgtgttc
gtggggttgt gaggccaaag caaacccggg agcgccatct gcaggcctca agaggaagag
actgacctta gaggctaggc cctgcgtctt caacctctag cccaagggaa ccaacctgcc
tagccaccca agggaagtgg gataggggct gggaggggca ggcggtgagg agtgttttcc
tcccagactt taccccgcag gtggattaag cttattgggc tctggaggat acaggaggga
gggcaaatgc caggatccca gcggacccag gccccacagg agtgagaggc tcagaacctc
gtcccgctga gcctggcctg agctcctcct gaggaataag ggcatcccaa aaacccgggt
acaagacgcc cagtagtagt agttaggctg agtcaggcag gtgcatctct ccccatggta
tctgccgccc aggctccggc cagagggagg ggagcgcgag tccgcggcgc ttccgcgggg
cgcccggaac tgcagacggg ggctggagga atctcggatt cgggctgcaa gagcgctgcg
caagcttcgc cgagccgccc tttcgcagac ccagggaagc ggggggaggg agcgaaggag
ggagagagag ttaaaacatc agcttgaaag tgcccaagat gattttatta agaccgaggg
gaaaattatt ttcatgaaag attctccccg gaatatttct tgtacttaac ccagttagga
agacaaaggg cttctttctg cctggtgcgg tgcgagcgga ccccagcgag caagggagct
agtgccaaag agaactgcgg aggctccggc aggagtgggg acgtccccgt ggttgcgcct
cctgcgctcg ccccggatcc accgagctag cagcgggcgg cgctcagccg cgtccgcagc
ctcctcttct ccccagccgg ggagagccag cctcgtctcc cacatcctct gccgccagcg
acctgcagct ccgcactgtt tccctcccct gtaccccctt cccagtcacc cgagggttca
gaaaccaagt cccccggctc tcccgccatc cgctgggtcc caccgaggca ggtgggtact
cgccggaggt cttcagctcg attctgaacc aagcgttctg gactgcccag acccggtggg
caaggggact ggggaggccc tgcgcacagt cgcgtggaac gggaggggac aagacaaact
gctggacact tttccgtgga atgagaagtg gggggtgcgt gggtgggaag gtacctccgg
agggaaaggc caaagggaag gaccagaaag agaggaagga agagccggga aggaacggaa
gggaactcag agccgagggt ggtggggttg gggctaggga tgcgcactgg gcccggggcc
gcgcggccca ggcgggcact ggccagtgga tggcagggct gggcgagtta gaactgagag
cccggcttca cagcgcagcg cgctccgagg ccctctgtcg ttacctgaat attcattaga
ctgaccgctc tttatcctta tctaacgttt atcttatcgg cgagtttcgt ttctcagtgt
agttttaatc ccgggctccc attccccctc ccccggtccg ctcccctccc tccctcttcc
ttcgccggct gctccctccc tccctccctc ccatttctcc ctcccctgcc ctccccttgc
cggcaccgga gtgacaggct cggggccctc ctcgccgaag ctcggggctc cagcgctggc
gaatcacaga gtggtggaat ctattgcctt tgtctgacaa gtcatccatc tcccggcgcg
gggaggggga ggaggtctgg agggggcttt gcagctttta gagagacaca caccgggagc
cgaggctcca gtctccggcc gagtcttcta gcagccgcaa cccacctggg gccagcccag
agctgccagc gccgctcggc tccctccctc cctcccggcc cttcggccgc ggcggcgtgc
gcctgccttt tccgggggcg ggggcctggc ccgcgcgctc ccctcccgca ggcgccacct
cggacatccc cgggattgct acttctctgc caacttcgcc aactcgccag cacttggaga
ggcccggctc ccctcccggc gccctctgac cgcccccgcc ccgcgcgctc tccgaccacc
gcctctcgga tgaacaggtt ccaggggagc tgagcgagtc gcctcccccg cccagcttca
gccctggctg cagctgcagc gcgagccatg cgcccccagt gcaccccggc ccggcccacc
gccccggggc cattctgctg accgcccagc cccgagcccc gacagtggca agttgcggct
actgcggttg caagctccgg ccaacccgga ggagccccag cggggagcgc agtgttgcgc
cccccgcccc cgcgcgcgcc gcagcagccg ggcgttcact catcctccct cccccaccgt
ccctcccttt tctcctcaag tcctgaagtt gagtttgaga ggcgacacgg cggcggcggc
cgcgctgctc ccgctcctct gcctccccatg gatatgcac tgcaaagcag accccttctc
cgcgatgcac cgtgagtacc cgcgcccggc tcctgtcccg gctcgggctc tccgtcccaa
ccctgtccag t
<400>60
Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly
His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro
Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly
Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys
Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro
Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val
Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp
Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr
Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln
Gln Pro Phe His Pro Thr Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Val Thr Ala
Pro Gly His Thr Ile Val Pro Ser Thr Ala Ser Pro Pro Val Ser Ser
Ala Ser Asn Asp Pro Val Gly Ser Tyr Ser Ile Asn Gly Ile Leu Gly
Ile Pro Arg Ser Asn Gly Glu Lys Arg Lys Arg Asp Glu Val Glu Val
Tyr Thr Asp Pro Ala His Ile Arg Gly Gly Gly Gly Leu His Leu Val
Trp Thr Leu Arg Asp Val Ser Glu Gly Ser Val Pro Asn Gly Asp Ser
Gln Ser Gly Val Asp Ser Leu Arg Lys His Leu Arg Ala Asp Thr Phe
Thr Gln Gln Gln Leu Glu Ala Leu Asp Arg Val Phe Glu Arg Pro Ser
Tyr Pro Asp Val Phe Gln Ala Ser Glu His Ile Lys Ser Glu Gln Gly
Asn Glu Tyr Ser Leu Pro Ala Leu Thr Pro Gly Leu Asp Glu Val Lys
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Thr Asn Pro Glu Leu Gly Ser Asn Val Ser
Gly Thr Gln Thr Tyr Pro Val Val Thr Gly Arg Asp Met Ala Ser Thr
Thr Leu Pro Gly Tyr Pro Pro His Val Pro Pro Thr Gly Gln Gly Ser
Tyr Pro Thr Ser Thr Leu Ala Gly Met Val Pro Gly Ser Glu Phe Ser
Gly Asn Pro Tyr Ser His Pro Gln Tyr Thr Ala Tyr Asn Glu Ala Trp
Arg Phe Ser Asn Pro Ala Leu Leu Ser Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ser Ala
Ala Pro Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Asp Arg His
<400>61
aggctccagt ctccggccga gtcttctcgc agccgcaacc cacctggggc cagcccagag
ctgccagcgc cgctcggctc cctccctccc tcccggccct tcggccgcgg cggcgtgcgc
ctgccttttc cgggggcggg ggcctggccc gcgcgctccc ctcccgcagg cgccacctcg
gacatccccg ggattgctac ttctctgcca acttcgccaa ctcgccagca cttggagagg
cccggctccc ctcccggcgc cctctgaccg cccccgcccc gcgcgctctc cgaccaccgc
ctctcggatg accaggttcc aggggagctg agcgagtcgc ctcccccgcc cagcttcagc
cctggctgca gctgcagcgc gagccatgcg cccccagtgc accccggccc ggcccaccgc
cccggggcca ttctgctgac cgcccagccc cgagccccga cagtggcaag ttgcggctac
tgcagttgca agctccggcc aacccggagg agccccagcg gggagcgcag tgttgcgccc
cccgcccccg cgcgccccgc agcagccggg cgttcactca tcctccctcc cccaccgtcc
ctcccttttc tcctcaagtc ctgaagttga gtttgagagg cgacacggcg gcggcggccg
cgctgctccc gctcctctgc ctccccatgg atatgcactg caaagcagac cccttctccg
cgatgcaccc agggcacggg ggtgtgaacc agctcggggg ggtgtttgtg aacggccggc
ccctacccga cgtggtgagg cagcgcatcg tggagctggc ccaccagggt gtgcggccct
gtgacatctc ccggcagctg cgggtcagcc acggctgtgt cagcaaaatc ctgggcaggt
actacgagac cggcagcatc aagccgggtg tgatcggtgg ctccaagccc aaagtggcga
cgcccaaagt ggtggacaag attgctgaat acaaacgaca gaacccgact atgttcgcct
gggagattcg agaccggctc ctggccgagg gcatctgtga caatgacaca gtgcccagcg
tctcttccat caacagaatc atccggacca aagttcagca gcctttccac ccaacgccgg
atggggctgg gacaggagtg accgcccctg gccacaccat tgttcccagc acggcctccc
ctcctgtttc cagcgcctcc aatgacccag tgggatccta ctccatcaat gggatcctgg
ggattcctcg ctccaatggt gagaagagga aacgtgatga agttgaggta tacactgatc
ctgcccacat tagaggaggt ggaggtttgc atctggtctg gactttaaga gatgtgtctg
agggctcagt ccccaatgga gattcccaga gtggtgtgga cagtttgcgg aagcacttgc
gagctgacac cttcacccag cagcagctgg aagctttgga tcgggtcttt gagcgtcctt
cctaccctga cgtcttccag gcatcagagc acatcaaatc agaacagggg aacgagtact
ccctcccagc cctgacccct gggcttgatg aagtcaagtc gagtctatct gcatccacca
accctgagct gggcagcaac gtgtcaggca cacagacata cccagttgtg actggtcgtg
acatggcgag caccactctg cctggttacc cccctcacgt gccccccact ggccagggaa
gctaccccac ctccaccctg gcaggaatgg tgcctgggag cgagttctcc ggcaacccgt
acagccaccc ccagtacacg gcctacaacg aggcttggag attcagcaac cccgccttac
taagttcccc ttattattat agtgccgccc cccggtccgc ccctgccgct gctgccgctg
cctatgaccg ccactagtta ccgcggggac cacatcaagc ttcaggccga cagcttcggc
ctccacatcg tccccgtctg accccacccc ggagggaggg aggaccgacg cgacgcgatg
cctcccggcc accgccccag cctcacccca tcccacgacc cccgcaaccc ttcacatcac
ccccctcgaa ggtcggacag gacgggtgga gccgtgggcg ggaccctcag gcccgggccc
gccgccccca gccccgcctg ccgcccctcc ccgcctgcct ggactgcgcg gcgccgtgag
ggggattcgg cccagctcgt cccggcctcc accaagccag ccccgaagcc cgccagccac
cctgccggac tcgggcgcga cctgctggcg cgcgccggat gtttctgtga cacacaatca
gcgcggaccg cagcgcggcc cagccccggg cacccgcctc ggacgctcgg gcgccaggag
gcttcgctgg aggggctggg ccaaggagat taagaagaaa acgactttct gcaggaggaa
gagcccgctg ccgaatccct gggaaaaatt cttttccccc agtgccagcc ggactgccct
cgccttccgg gtgtgccctg tcccagaaga tggaatgggg gtgtgggggt ccggctctag
gaacgggctt tgggggcgtc aggtctttcc aaggttggga cccaaggatc ggggggccca
gcagcccgca ccgatcgagc cggactctcg gctcttcact gctcctcctg gcctgcctag
ttccccaggg cccggcacct cctgctgcga gacccggctc tcagccctgc cttgccccta
cctcagcgtc tcttccacct gctggcctcc cagtttcccc tcctgccagt ccttcgcctg
tcccttgacg ccctgcatcc tcctccctga ctcgcagccc catcggacgc tctcccggga
ccgccgcagg accagtttcc atagactgcg gactggggtc ttcctccagc agttacttga
tgccccctcc cccgacacag actctcaatc tgccggtggt aagaaccggt tctgagctgg
cgtctgagct gctgcggggt ggaagtgggg ggctgcccac tccactcctc ccatcccctc
ccagcctcct cctccggcag gaactgaaca gaaccacaaa aagtctacat ttatttaata
tgatggtctt tgcaaaaagg aacaaaacaa cacaaaagcc caccaggctg ctgctttgtg
gaaagacggt gtgtgtcgtg tgaaggcgaa acccggtgta cataacccct ccccctccgc
cccgccccgc ccggccccgt agagtccctg tcgcccgccg gccctgcctg tagatacgcc
ccgctgtctg tgctgtgaga gtcgccgctc gctggggggg aaggggggga cacagctaca
cgcccattaa agcacagcac gtcctggggg aggggggcat tttttatgtt acaaaaaaaa
attacgaaag aaaagaaatc tctatgcaaa atgacgaaca tggtcctgtg gactcctctg
gcctgttttg ttggctcttt ctctgtaatt ccgtgttttc gctttttcct ccctgcccct
ctctccctct gcccctctct cctctccgct tctctccccc tctgtctctg tctctctccg
tctctgtcgc tcttgtctgt ctgtctctgc tctttcctcg gcctctctcc ccagacctgg
cccggccgcc ctgtctccgc aggctagatc cgaggtggca gctccagccc ccgggctcgc
cccctcgcgg gcgtgccccg cgcgccccgg gcggccgaag gccgggccgc cccgtcccgc
cccgtagttg ctctttcggt agtggcgatg cgccctgcat gtctcctcac ccgtggatcg
tgacgactcg aaataacaga aacaaagtca ataaagtgaa aataaataaa aatccttgaa
caaatccgaa aaggcttgga ftcctcgccc agatctctct cccctgcgag ccctttttat
ttgagaagga aaaagagaaa agagaatcgt ttaagggaac ccggcgccca gccaggctcc
agtggcccga acggggcggc gagggcggcg agggcgccga ggtccggccc atcccagtcc
tgtggggctg gccgggcaga gaccccggac ccaggcccag gcctaacctg ctaaatgtcc
ccggacggtt ctggtctcct cggccacttt cagtgcgtcg gttcgttttg attctttttc
ttttgtgcac ataagaaata aataataata ataaataaag aataaaattt tgtatgtcaa
aaaaaaaaaa aaaaaa
<400>62
Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly
His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro
Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly
Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys
Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro
Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val
Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp
Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr
Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln
Gln Pro Phe His Pro Thr Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Val Thr Ala
Pro Gly His Thr Ile Val Pro Ser Thr Ala Ser Pro Pro Val Ser Ser
Ala Ser Asn Asp Pro Val Gly Ser Tyr Ser Ile Asn Gly Ile Leu Gly
Ile Pro Arg Ser Asn Gly Glu Lys Arg Lys Arg Asp Glu Asp Val Ser
Glu Gly Ser Val Pro Asn Gly Asp Ser Gln Ser Gly Val Asp Ser Leu
Arg Lys His Leu Arg Ala Asp Thr Phe Thr Gln Gln Gln Leu Glu Ala
Leu Asp Arg Val Phe Glu Arg Pro Ser Tyr Pro Asp Val Phe Gln Ala
Ser Glu His Ile Lys Ser Glu Gln Gly Asn Glu Tyr Ser Leu Pro Ala
Leu Thr Pro Gly Leu Asp Glu Val Lys Ser Ser Leu Ser Ala Ser Thr
Asn Pro Glu Leu Gly Ser Asn Val Ser Gly Thr Gln Thr Tyr Pro Val
Val Thr Gly Arg Asp Met Ala Ser Thr Thr Leu Pro Gly Tyr Pro Pro
His Val Pro Pro Thr Gly Gln Gly Ser Tyr Pro Thr Ser Thr Leu Ala
Gly Met Val Pro Gly Ser Glu Phe Ser Gly Asn Pro Tyr Ser His Pro
Gln Tyr Thr Ala Tyr Asn Glu Ala Trp Arg Phe Ser Asn Pro Ala Leu
Leu Ser Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ser Ala Ala Pro Arg Ser Ala Pro Ala
Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Asp Arg His
<400>63
aggctccagt ctccggccga gtcttctcgc agccgcaacc cacctggggc cagcccagag
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aaaaaaa 4207
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His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro
Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly
Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys
Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro
Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val
Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Mer Phe Ala Trp
Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr
Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln
Gln Pro Phe His Pro Thr Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Val Thr Ala
Pro Gly His Thr Ile Val Pro Ser Thr Ala Ser Pro Pro Val Ser Ser
Ala Ser Asn Asp Pro Val Gly Ser Tyr Ser Ile Asn Gly Ile Leu Gly
Ile Pro Arg Ser Asn Gly Glu Lys Arg Lys Arg Asp Glu Asp Val Ser
Glu Gly Ser Val Pro Asn Gly Asp Ser Gln Ser Gly Val Asp Ser Leu
Arg Lys His Leu Arg Ala Asp Thr Phe Thr Gln Gln Gln Leu Glu Ala
Leu Asp Arg Val Phe Glu Arg Pro Ser Tyr Pro Asp Val Phe Gln Ala
Ser Glu His Ile Lys Ser Glu Gln Gly Asn Glu Tyr Ser Leu Pro Ala
Leu Thr Pro Gly Leu Asp Glu Val Lys Ser Ser Leu Ser Ala Ser Thr
Asn Pro Glu Leu Gly Ser Asn Val Ser Gly Thr Gln Thr Tyr Pro Val
Val Thr Gly Arg Asp Met Ala Ser Thr Thr Leu Pro Gly Tyr Pro Pro
His Val Pro Pro Thr Gly Gln Gly Ser Tyr Pro Thr Ser Thr Leu Ala
Gly Met Val Pro Glu Ala Ala Val Gly Pro Ser Ser Ser Leu Met Ser
Lys Pro Gly Arg Lys Leu Ala Glu Val Pro Pro Cys Val Gln Pro Thr
Gly Ala Ser Ser Pro Ala Thr Arg Thr Ala Thr Pro Ser Thr Arg Pro
Thr Thr Arg Leu Gly Asp Ser Ala Thr Pro Pro Tyr
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Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly
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Gly Met Val Pro Gly Ser Glu Phe Ser Gly Asn Pro Tyr Ser His Pro
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Leu Met Pro Pro Pro Gly Pro Pro Leu Pro Leu Leu Pro Leu Pro Met
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Phe Gly Leu His Ile Val Pro Val
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ttcagtgcgt cggttcgttt tgattctttt tcttttgtgc acataagaaa taaataataa 4140
taataaataa agaataaaat tttgtatgtc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 4188
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Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly
His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro
Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly
Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys
Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro
Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val
Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp
Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr
Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln
Gln Pro Phe His Pro Thr Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Val Thr Ala
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Ala Ser Asn Asp Pro Val Gly Ser Tyr Ser Ile Asn Gly Ile Leu Gly
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Tyr Thr Asp Pro Ala His Ile Arg Gly Gly Gly Gly Leu His Leu Val
Trp Thr Leu Arg Asp Val Ser Glu Gly Ser Val Pro Asn Gly Asp Ser
Gln Ser Gly Val Asp Ser Leu Arg Lys His Leu Arg Ala Asp Thr Phe
Thr Gln Gln Gln Leu Glu Ala Leu Asp Arg Val Phe Glu Arg Pro Ser
Tyr Pro Asp Val Phe Gln Ala Ser Glu His Ile Lys Ser Glu Gln Gly
Asn Glu Tyr Ser Leu Pro Ala Leu Thr Pro Gly Leu Asp Glu Val Lys
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Thr Asn Pro Glu Leu Gly Ser Asn Val Ser
Gly Thr Gln Thr Tyr Pro Val Val Thr Gly Arg Asp Met Ala Ser Thr
Thr Leu Pro Gly Tyr Pro Pro His Val Pro Pro Thr Gly Gln Gly Ser
Tyr Pro Thr Ser Thr Leu Ala Gly Met Val Pro Gly Ser Glu Phe Ser
Gly Asn Pro Tyr Ser His Pro Gln Tyr Thr Ala Tyr Asn Glu Ala Trp
Arg Phe Ser Asn Pro Ala Leu Leu Met Pro Pro Pro Gly Pro Pro Leu
Pro Leu Leu Pro Leu Pro Met Thr Ala Thr Ser Tyr Arg Gly Asp His
Ile Lys Leu Gln Ala Asp Ser Phe Gly Leu His Ile Val Pro Val
<400>69
aggctccagt ctccggccga gtcttctcgc agccgcaacc cacctggggc cagcccagag 60
ctgccagcgc cgctcggctc cctccctccc tcccggccct tcggccgcgg cggcgtgcgc 120
ctgccttttc cgggggcggg ggcctggccc gcgcgctccc ctcccgcagg cgccacctcg 180
gacatccccg ggattgctac ttctctgcca acttcgccaa ctcgccagca cttggagagg 240
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tgcagttgca agctccggcc aacccggagg agccccagcg gggagcgcag tgttgcgccc 540
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ccctacccga cgtggtgagg cagcgcatcg tggagctggc ccaccagggt gtgcggccct 840
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aaataataat aataaataaa gaataaaatt ttgtatgtca aaaaaaaaaa aaaaaaa 4257
Claims (24)
1.用于监测个体中乳腺疾病的方法，所述方法包括：
测定获自所述个体乳腺的细胞中配对盒2基因-比-β-防御素-1基因(PAX2-比-DEFB1)的表达率，
其中所述PAX2-比-DEFB1表达率与乳腺疾病相关。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述PAX2-比-DEFB1表达率为100∶1或更高是个体中存在乳腺癌的指征，而PAX2-比-DEFB1表达率小于100∶1是个体中存在非癌或癌前乳腺疾病的指征。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述癌前乳腺疾病是乳腺上皮内瘤变。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述测定步骤包括：
测定相对于对照基因表达水平的PAX2基因表达水平；
测定相对于同一对照基因表达水平的DEFB1基因表达水平；以及
基于PAX2和DEFB1的表达水平确定PAX2-比-DEFB1表达率。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述PAX2、DEFB1和对照基因的表达水平通过定量实时RT-PCR测定。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述PAX2、DEFB1和对照基因的表达水平通过表达微阵列测定。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述对照基因是3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因。
8.如权利要求1所述的方法，其还包括测定获自乳腺组织的细胞中雌激素受体/孕激素受体/人表皮生长因子受体2(ER/PR/HER2)的状态。
9.用于监测个体中乳腺疾病的试剂盒，所述试剂盒包含：
用于检测组织样品中PAX2表达的一对或多对寡核苷酸引物；
用于检测组织样品中DEFB1表达的一对或多对寡核苷酸引物；以及
如何利用所述引物测定组织样品中PAX2-比-DEFB1表达率的说明书。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述用于检测PAX2表达的一对或多对寡核苷酸引物包括选自以下的寡核苷酸引物对：SEQ ID NOS：43和47，SEQ ID NOS：44和48，以及SEQ ID NOS：45和49。
11.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述用于检测DEFB1表达的一对或多对寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS：35和37。
12.权利要求9所述的试剂盒，其还包含一对或多对对照寡核苷酸引物。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述一对或多对对照寡核苷酸引物包括用于检测β-肌动蛋白表达的寡核苷酸引物。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述用于检测β-肌动蛋白表达的寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS：34和36。
15.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述一对或多对对照寡核苷酸引物包括用于检测GAPDH表达的寡核苷酸引物。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述用于检测GAPDH表达的寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS：42和46。
17.如权利要求9所述的试剂盒，其还包含用于PCR反应的一种或多种试剂。
18.如权利要求9所述的试剂盒，其还包含用于RNA提取的一种或多种试剂。
19.用于监测个体中乳腺疾病的试剂盒，所述试剂盒包含：
具有用于检测PAX2和DEFB1表达的寡核苷酸探针的寡核苷酸微阵列；以及
如何利用所述寡核苷酸微阵列测定组织样品中PAX2-比-DEFB1表达率的说明书。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其还包含用于从组织样品中提取RNA的试剂。
21.确定用于患有乳腺疾病的个体的治疗方案的方法，所述方法包括：
测定获自所述患有乳腺疾病的个体的乳腺组织的细胞中相对于对照基因表达水平的PAX2基因表达水平，以及
基于PAX2基因的相对表达水平确定用于所述个体的治疗方案。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述对照基因是肌动蛋白基因或GAPDH基因。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述乳腺疾病是雌激素受体阴性乳腺癌，和/或孕激素受体阴性乳腺癌，和/或人表皮生长因子受体2阴性乳腺癌。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述乳腺疾病是雌激素受体阳性乳腺癌，和/或孕激素受体阳性乳腺癌，和/或人表皮生长因子受体2阳性乳腺癌。
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