CN102643822A - 犬恶丝虫核酸疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种犬恶丝虫核酸疫苗，用于犬恶丝虫病的预防和治疗，同时还提供了该疫苗的制备方法，根据犬恶丝虫保护性抗原基因序列的开放性阅读框设计引物进行PCR，与克隆载体PMD18-T连接；将克隆所得的两个保护性抗原基因分别插入到真核表达载体pVAX1，构建犬恶丝虫核酸疫苗。选用了保护性抗原基因进行了核酸疫苗的研制，以获得免疫保护。犬恶丝虫核酸疫苗能引起机体较强的细胞免疫和体液免疫反应，从而可以达到预防犬恶丝虫病的目的。
Description
技术领域
本发明提供了一种犬恶丝虫核酸疫苗，用于犬恶丝虫病的预防和治疗，同时还提供了该疫苗的制备方法，属于生物制品制备技术领域。
背景技术
犬恶丝虫病是由犬恶丝虫（Dirofilaria immitis）成虫寄生于犬的右心室、肺动脉内，使患犬形成机械性栓塞，影响心肺功能，导致呼吸衰竭、循环和泌尿系统遭受严重损伤的寄生线虫病。犬、猫科动物是本病的天然宿主，野生肉食动物、马属动物、海狸、猩猩、麝鼠、灵长类等偶见感染，还可以感染人类。该病虽经多年研究，迄今尚无理想的防治药物以及预防和治疗办法。因此，利用获得的免疫相关基因制备核酸疫苗以刺激机体产生的免疫应答的免疫干预可能是控制犬恶丝虫病更合适的途径。
发明内容
本发明目的是提供一种犬恶丝虫核酸疫苗，是抗犬恶丝虫的新型疫苗，对于犬恶丝虫病的预防有明显效果。
本发明还提供了该疫苗的制备方法，适用于工业化生产。
本发明公开的犬恶丝虫的保护性抗原基因基因（命名为GSP1），如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述保护性抗原基因的扩增引物，其特征在于：
F1：5’ –GGATCCATGTCGGTGCCAGATCCGGAC- 3’，
S1：5’-CTCGAGTTACAACATCTTAGCGGC- 3’。
本发明提供的犬恶丝虫核酸疫苗，其特征在于：将犬恶丝虫保护性抗原基因插入到真核载体pVAX1，获得了核酸疫苗pVAX1-GSP1。
本发明公开的犬恶丝虫核酸疫苗的制备工艺，包括以下步骤：
根据犬恶丝虫保护性抗原基因序列的开放性阅读框设计引物进行PCR，与克隆载体PMD18-T连接；
将克隆所得的两个保护性抗原基因分别插入到真核表达载体pVAX1，构建犬恶丝虫核酸疫苗；
将构建的核酸疫苗分别转染Hela细胞，经转染细胞的间接免疫荧光、SDS-PAGE电泳、以及 Western blot进行表达产物分析，并对免疫小鼠进行特异性抗体效价以及CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞数量的检测以验证其免疫效果。
本发明积极效果在于：选用了保护性抗原基因进行了核酸疫苗的研制，以获得免疫保护。犬恶丝虫核酸疫苗能引起机体较强的细胞免疫和体液免疫反应，从而可以达到预防犬恶丝虫病的目的。
附图说明：
图1：重组质粒pVAX1-GSP1的酶切鉴定图；
图2：转染细胞的间接免疫荧光 ；
图3：pVAX1- GSP1转染Hela细胞表达产物Western Blot 分析；
图4：重组蛋白疫苗免疫小鼠血清特异性抗体IgG抗体效价测定。
具体实施方式
下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例1：
犬恶丝虫核酸的制备
本发明以犬恶丝虫免疫相关基因GSP1为例，进行真核表达载体的构建。犬恶丝虫核酸疫苗的制备步骤如下：
1、参照GSP1基因序列开放性阅读框及真核表达载体pVAX1图谱设计引物并引入酶切位点。根据目的基因序列，设计两对引物用来扩增GPS1片段：
F1：5’ –GGATCCATGTCGGTGCCAGATCCGGAC- 3’，下划线为BamH I酶切位点。S1：5’-CTCGAGTTACAACATCTTAGCGGC- 3’，下划线为Xho I酶切位点。
2、以制备的含有GPS1插入片段的噬菌体基因组为模板扩增。PCR反应条件：（95℃预变性5min；94℃变性2min，57℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环, 72℃延伸10min），PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将PCR纯化产物克隆分别至PMD18-T载体，经PCR及相对应的酶切鉴定后，送生物公司测序鉴定，结果与（附：筛选的免疫相关GSP1基因序列）相同。
3、凝胶回收各个目的片段然后与用BamHI和XhoI进行双酶切的真核表达载体pVAX1连接，转化细菌，提取质粒并双酶切鉴定真核表达载体pVAX 1-GSP1（如图1）。
4、将重组质粒转染Hela细胞，G418选择培养基筛选。对转染细胞进行间接免疫荧光试验以及重组质粒的Western blotting鉴定（如附图2，3所示）。
试验例1
1、体液免疫检测：30只BALB/c小鼠，随机分成3组。共免疫3次，1次/2周。重组质粒DNA：佐剂=1μg：0.5μL，其余用水补足，混合均匀。免疫途径均为肌肉注射。试验组：重组pVAX1- GSP1，100μg/次，佐剂为司苯甘油；空白对照组：PBS；阴性对照组：pVAX1，100μg/次。分别于免疫前、免疫第14d、免疫第28d和免疫第42d取每组小鼠血清（尾静脉采血，离心收集血清），以犬恶丝虫成虫抗原为包被抗原，常规间接ELISA常规方法操作，检测原核表达的重组蛋白免疫小鼠后的体液免疫水平。SPSS软件统计学分析所得数据。
2、细胞免疫水平的检测：于免疫第42d，分别每组处死5只小鼠，无菌摘取脾脏；加入2mLPBS液，于300目筛上研磨，将研磨液吸入试管，加入2mL PBS，室温1000g/min离心10min，弃去上清； PBS液清洗沉淀1次，加蒸馏水1mL，涡旋振荡20s，加入5mL PBS，静置5min；取上清1mL，加入PBS 1mL，1000g/min离心10min，弃上清，向沉淀加入PBS1mL；计数：PBS稀释至含106个/mL细胞的悬液，取其中100μL，加FITC标记的抗CD4+、CD8+ 单抗，避光20min，荧光洗液洗2次，加0.5mL荧光保存液，流式细胞仪检测CD4+、CD8+ T淋巴细胞的数量；SPSS软件统计分析所得数据。
3、分别在免疫前，一免、二免、三免后两周对小鼠尾静脉采血的间接ELISA方法检测犬恶丝虫抗体滴度及其变化结果（见表1及图4）。结果表明：试验组血清IgG滴度随着免疫次数的增加逐渐升高。第三次免疫后IgG滴度与佐剂和空白对照组相比均差异极显著（P<0.01），而佐剂与空白对照组相比差异不显著（P>0.05）。可见，试验组小鼠免疫后能诱导机体产生较强体液免疫应答。
表1 重组核酸疫苗免疫小鼠特异性抗体效价检测
| 组 别 | 免疫前 | 免疫第14d | 免疫第28d | 免疫第42d |
| 试验组A组 | 0.196±0.028 | 0.348±0.015 | 0.535±0.011 | 0.879±0.022 |
| 阴性对照组 | 0.204±0.021 | 0.249±0.017 | 0.237±0.019 | 0.245±0.023 |
| 空白对照组 | 0.201±0.201 | 0.223±0.021 | 0.232±0.072 | 0.222±0.072 |
4、三免后两周对小鼠的T细胞亚类检测结果（见表2），结果表明： pVAX1- GSP1免疫组的CD4+ T细胞亚类数显著高于pVAX1与空白对照组（P＜0.01），CD8+T细胞亚类数也高于pVAX1与空白对照组（P＜0.01）。可见，pVAX1- GSP1免疫组的CD4+和CD8+ T细胞亚类数均显著高于pVAX1与空白对照组（P＜0.01），试验组小鼠免疫后能诱导机体产生较强细胞免疫应答。
表2 试验组和对照组小鼠脾脏CD4
+
和CD8
+
T淋巴细胞数量
| 组 别 | CD4+（%） | CD8+（%） | CD4+/CD8+ |
| 试验组 | 37.06±1.474 a | 10.90±0.852 b | 3.41±0.2158a |
| 佐剂对照组 | 18.88±1.564 | 9.24±1.029 | 2.05±0.148 |
| 空白对照组 | 16.22±1.338 | 9.08±0.549 | 1.79±0.067 |
a表示差异极显著,b表示差异不显著
综合上述实验结果，本发明的犬恶丝虫核酸疫苗pVAX1- GSP1可以用来作为犬恶丝虫病的预防和治疗性疫苗。
Claims (4)
1.一种犬恶丝虫的保护性抗原基因，如SEQ ID NO.1所示。
2. 权利要求1所述基因的扩增引物，其特征在于：
F1：5’ –GGATCCATGTCGGTGCCAGATCCGGAC- 3’，
S1：5’-CTCGAGTTACAACATCTTAGCGGC- 3’。
3. 一种犬恶丝虫核酸疫苗，其特征在于：将犬恶丝虫保护性抗原基因插入到真核载体pVAX1，获得了核酸疫苗pVAX1-GSP1。
4.权利要求3所述犬恶丝虫核酸疫苗的制备工艺，包括以下步骤：
根据犬恶丝虫保护性抗原基因序列的开放性阅读框设计引物进行PCR，与克隆载体PMD18-T连接；将克隆所得的两个保护性抗原基因分别插入到真核表达载体pVAX1，构建犬恶丝虫核酸疫苗；将构建的核酸疫苗分别转染Hela细胞，经转染细胞的间接免疫荧光、SDS-PAGE电泳、以及 Western blot进行表达产物分析，并对免疫小鼠进行特异性抗体效价以及CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞数量的检测以验证其免疫效果。
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| US6248329B1 (en) * | 1998-06-01 | 2001-06-19 | Ramaswamy Chandrashekar | Parasitic helminth cuticlin nucleic acid molecules and uses thereof |
| US6790630B1 (en) * | 1995-04-10 | 2004-09-14 | New England Biolabs, Inc. | DNA and protein from Dirofilaria immitis |
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2011
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