CN102643789B - 一种纤维素酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纤维素酶，其包括将Cel12A酶蛋白第61位置的酪氨酸以另外一个氨基酸取代的突变的氨基酸序列，其中所述的用于取代的氨基酸选自苯丙氨酸、丙氨酸或甘氨酸。该纤维素酶可用于食品工业、饲料工业、纺织工业、造纸工业或生物质能工业中。

Description

一种纤维素酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种纤维素酶，特别涉及一种耐热性纤维素酶，还涉及该纤维素酶的应用。

背景技术

纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，也是地球上主要生物质能(biomass energy)的来源，因此，目前许多能够有效分解纤维素的酶蛋白在不同工业上的应用也十分广泛。

纤维素是以葡萄糖为单位，通过β-1，4-糖苷键(β-1，4-glycosidicbond)将葡萄糖分子连接而形成的长链多糖，这些多糖体共同组织排列成紧密的结晶型纤维素，进而抵抗外界的分解作用。然而，生物界中许多草食动物以及微生物等需要将植物细胞壁中的多糖纤维素分解成可以被体内吸收的葡萄单糖，以作为生存能量来源。例如，草食性瘤胃动物的肠胃道中存在着许多不同的共生微生物，包含细菌与真菌，而这些微生物通常通过不同种类的多糖分解酶，例如，纤维素酶或木聚糖酶等共同作用去分解植物细胞壁，进而产生可使动物体内吸收的单糖。

纤维素酶的催化机制主要是通过酸碱反应，将连接两个单糖的β-1，4-糖苷键进行水解作用，进而分解多糖纤维素。而纤维素酶基本上可分成三类，分别为内切葡聚糖酶(endo-glucanase)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase)以及葡萄糖苷酶(β-glucosidase)。内切葡聚糖酶能够随机地将长链纤维素切成许多小片段的寡糖；而外切葡聚糖酶则可从长链纤维素的还原端或非还原端进行分解，其主要产物为纤维二糖；葡萄糖苷酶则可把纤维二糖分解为单糖的葡萄糖。

纤维素酶在工业上的应用十分广泛，无论是在食品、饲料或纺织业，甚至可运用到现在最受关注的生物能源。针对不同工业的应用，纤维素酶也需有符合其不同的适用条件与范围。例如，饲料工业上需要偏酸性以及耐温性的纤维素酶，然而，纺织工业上则侧重于偏碱性的纤维素酶。因此，能够找出更加符合不同工业上所需的纤维素酶也是目前无论是学术或产业界都在努力的目标。

目前在许多相关的研究中，为了得到更佳的酶，除了从自然界中筛选出来之外，就是将现有的酶蛋白加以改造。目前主要有两大改造策略，其一是随机突变或将酶基因随机排列，在特定的作用条件下，筛选出更符合其作用条件的酶蛋白。此策略的好处是无须深入研究酶的结构或作用机制，而是直接在特定的条件下随机去找出更好的酶蛋白。然而，其缺点是需要大量的人力以及时间去进行大量筛选或要有很好的大量筛选方法来配合。另一种改造策略则是通过研究酶结构与作用机制找出对于酶活性或特性具有关键性的氨基酸，并针对这些特定氨基酸进行突变并测试，进而得到功能性更强的改造酶蛋白。此优点是不需花费时间与人力在大量突变与筛选的步骤，但需要先了解此酶的蛋白结构以及其作用机制，才能找出具有改造潜力的特定氨基酸。

不同的工业制备流程需要符合其不同作用环境的酶蛋白来配合且参与。即使纤维素酶在工业上被广泛应用已久，然而许多工业用纤维素酶是从嗜常温菌，如里式木霉(Trichoderma reesei)所筛选出来的，因此耐热性也较差。与此相反，耐热性纤维素酶能够有效地应用于需要高温作用环境的产业上，例如，啤酒制造业或生物能源工业等。耐热性的纤维素酶蛋白相对地其蛋白稳定性也会较高，因此能够在高温环境中稳定存在，甚至作用更好。因此，无论是在作用环境或是后期处理过程中，也不需担心因为高温而破坏了该酶蛋白本身。此外，提高该酶蛋白的活性也是改良工业酶的重点，酶活性越高就代表成本的下降以及利润的提高。

因此，本发明通过改造基因而改良纤维素酶的活性，相对地减少制造成本，进而有效地提高耐热性纤维素酶在工业上应用价值。

发明内容

本发明的目的在于改造现有的纤维素酶，通过结构分析的方法及点突变技术，有效地提高纤维素酶的作用活性，进而增加纤维素酶的产业价值，并大幅降低成本。

为达到上述目的，本发明的一个实施方式是提供一种纤维素酶，其包含将野生型Cel12A纤维素酶原始蛋白(wild type Cel12Acellulase)第61位置的酪氨酸(Tyrosine)以另外一个氨基酸取代的突变的氨基酸序列，其中所述的用于取代的氨基酸选自苯丙氨酸(Phenylalanine)、丙氨酸(Alanine)或甘氨酸(Glycine)。

附图说明

图1为编码野生型Cel12A纤维素酶的全长的核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列。

图2A至图2C为野生型Cel12A纤维素酶的三维蛋白立体结构及其与寡糖结合的复合体的三维立体结构。

图3为本发明定点突变所采用的引物。

图4为编码突变型Cel12A/Y61F纤维素酶的全长的核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列。

图5为编码突变型Cel12A/Y61A纤维素酶的全长的核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列。

图6为编码突变型Cel12A/Y61G纤维素酶的全长的核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列。

图7为野生型Cel12A纤维素酶原始蛋白与其不同突变型纤维素酶的活性测定结果比较。

图8为野生型Cel12A纤维素酶原始蛋白与突变型Y61G的纤维素酶的最适作用温度活性的比较分析。

具体实施方式

本发明的特征与优点的实施例将在本文得以详述。应该理解的是本发明在不同实施方式下会有各种变化，但是所述的变化并不脱离本发明的保护范围，而且，其中的说明和附图是在本质上对本发明加以说明，而并非限制本发明。

为了增加耐热性纤维素酶的工业应用价值，本发明从耐高温菌种之一的海栖热袍菌(Thermotoga maritima)筛选出Cel12A基因，其所表现的纤维素酶蛋白为一种葡聚糖酶(β-1，4-endoglucanase)，解析所述的纤维素酶蛋白的三维立体结构，再详加分析此结构的活性区，并且将其中的关键性氨基酸突变成其他氨基酸，由此改造蛋白特性，进而提高所述的纤维素酶蛋白的作用活性。以下将详述本发明改造纤维素酶蛋白的方法及由此方法得到的改良纤维素酶蛋白。

首先，选择海栖热袍菌种来源的Cel12A基因(Genbank：CAA93273)作为目标基因，如图1所示的Cel12A纤维素蛋白的全长编码区包含774个核苷酸序列(序列号1)和由其推导的257个氨基酸序列(序列号2)。利用限制酶XbaI和NdeI将Cel12A基因构建到pET16b载体中，并且在基因前端接上6个组氨酸(Histidine)以便于之后的纯化。构建步骤中，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)所用的引物为5′-GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCACCACCACCACCACCACATGGTACTGATGACAAAA-3′(正向引物)和5′-GGAATTCCATATGTTATCATTCTCTCACCTCCAGATCAAT-3′(反向引物)。接着，将构建好的Cel12A pET16b质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(competent cells)内，并由含有100μg/mlAmpicillin的LB培养皿来筛选菌株。把菌株接种到5ml LB培养液中，再放大菌量至200ml LB培养，最终放大到6L的LB培养基中。在OD值到达0.6至0.8时，利用1mM的IPTG诱导而使该野生型Cel12A酶蛋白大量表达。然后，将菌液以6000rpm转速离心10分钟收集起来。利用超音波细胞粉碎机(sonicator)破菌，再以16000rpm离心30分钟，并收集上清液用以准备下一步的纯化。为了得到高纯度的Cel12A酶蛋白，我们通过快速蛋白质液相层析色谱(fast protein liquid chromatography，FPLC)依序利用镍离子层析柱以及DEAE阴离子交换柱分离出蛋白纯度达95％以上的Cel12A酶蛋白，并以5mg/ml蛋白浓度在25mM Tris、150mM NaCl、pH 7.5条件下保存于-80℃。

为了利用X-ray结晶学技术解析出Cel12A的蛋白结构，首先通过蒸气扩散法，在室温下以座滴式(sitting drop method)进行养晶。利用不同的晶体筛选组来筛选养晶条件，并通过调整修正方法找出最佳的养晶条件，其为0.2M Ammonium sulfate、25％w/v PEG3350、0.1M Bis-Tris、pH 5.5。另外，我们利用多重同形取代法(multipleisomorphous replacement，MIR)解出相位角。当中，通过不同汞原子衍生物等与蛋白晶体同时浸泡后，将X-ray光源打在晶体上得到不同衍射图谱，再经由计算机运算之后得出正确的相位角，进而解出Cel12A蛋白立体结构。此外，更进一步地将Cel12A蛋白晶体浸泡于含有10mM纤维二糖或纤维四糖的溶液中，再利用X-ray获得衍射图谱，进而得出Cel12A与寡糖物质结合的复合体结构，以深入研究耐高温纤维素酶Cel12A与其分解底物的作用机制。

图2A至图2C表示本发明利用X-ray结晶学技术解析出Cel12A的三维蛋白立体结构及其与寡糖结合的复合体三维立体结构。Cel12A蛋白立体结构属于瑞士卷形式折迭(β-jellyroll fold)，主要由两片β-折迭平板(β-sheet)所组成(如图2A所示)。蛋白结构中的裂缝凹陷处是可容纳底物(substrate)进入的活性区(如图2B所示)，其中有两个氨基酸，分别为第60位置的精氨酸(Arg60)和第61位置的酪氨酸(Tyr61)所组成的弯曲处比较特殊(如图2C所示)，而且从Ramachandran plot中可看到Tyr61是采用一种一般蛋白结构不允许存在的角度，而且这两个氨基酸都能与寡糖产生作用力，由此推测Tyr61的结构对酶活性有重大的意义，于是针对Tyr61进行定点突变(site-directed mutagenesis)，以此找出比野生型Cel12A纤维素酶活性较高的突变蛋白。

为了得到特定氨基酸突变的酶蛋白，我们利用定点突变技术，首先进行聚合酶链式反应步骤，其中所用的突变引物列于图3，其中Y61F指的是第61位点的酪氨酸突变成苯丙氨酸；Y61A是突变成丙氨酸；Y61G是突变成甘氨酸。接着加入限制酶DpnI于37℃下作用，将未突变的野生型模板去除。把限制酶DpnI处理后的质粒转入至大肠杆菌感受态细胞中，并通过测序确认突变成功的突变基因，图4至图6分别表示Cel12A/Y61F、Cel12A/Y61A和Cel12A/Y61G纤维素酶蛋白的核苷酸序列(序列号分别为3、5和7)与由其推导的氨基酸序列(序列号分别为4、6和8)。将突变成功的Cel12A基因转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(competent cells)内，并且进行与如上所述的野生型Cel12A纤维素酶蛋白的相同的表达与纯化步骤而分别得到Cel12A/Y61F、Cel12A/Y61A和Cel12A/Y61G纤维素酶蛋白。

纤维素酶的活性测定方法主要是将1％β-葡聚糖与适当浓度的纤维素酶蛋白(缓冲液为0.1M醋酸钠，pH 5.0)以1∶1比例混合在一起，在85℃下作用10分钟。接着加入1.5倍体积的1％DNS于100℃沸水中作用5分钟，以停止反应且呈色。在OD540波长测定吸光值，再换算成酶活性单位(unit)。其中，酶活性的标准曲线是由葡萄糖标准溶液0-0.25mg/ml制定，而1unit的定义为每分钟释放1μmole产物所需的酶蛋白量。

图7表示野生型Cel12A纤维素酶(wild type Cel12A)原始蛋白与不同突变型的纤维素酶活性结果分析测定比较。活性检测是将这些蛋白样本调整为约150ng/ml的相等蛋白浓度，并以1％β-葡聚糖做为底物，在85℃下反应10分钟。图中不同酶活性是以原始蛋白的酶活性作为100％的基准的条件下进行比较而得。统计分析是利用T-test的双尾分析。在P＜0.05时判定为显著性差异(*)；P＜0.001时判定为显著性差异(**)。图中的误差线是以测定的各种酶蛋白活性值的平均值的标准误差(standard error of the mean，SEM)来表示的。由分析结果可知，将Tyr61突变成苯丙氨酸(Y61F)、丙氨酸(Y61A)或甘氨酸(Y61G)的突变纤维素酶的比活性(unit/mg)都比野生型纤维素酶的比活性高，且都具有显著性差异，其中最高的是将Tyr61突变成甘氨酸(Y61G)的纤维酶，其活性明显地高于野生型纤维素酶活性将近两倍。

另外，为了分析各种酶蛋白的活性的最适温度，将各种酶蛋白分别在55℃至100℃，以每5℃的间隔，在不同温度下进行反应10分钟，然后计算比活性。图8表示野生型Cel12A纤维素酶原始蛋白与其突变型Y61G的最适作用温度活性分析。检测方法中，将两者蛋白浓度均等为约150ng/ml，并以1％β-葡聚醣为底物(substrate)，在不同作用温度之下反应10分钟。图中的Y轴表示是以野生型Cel12A纤维素酶原始蛋白样品在100℃作用温度的活性作为100％，比较该两者蛋白在不同作用温度下的活性。图中的误差线是以测定的各种酶蛋白活性值的平均值的标准误差来表示。由分析结果可知，野生型原始蛋白的作用与突变型Y61G酶蛋白的作用温度趋势没有很大差异，而且Y61G的作用温度适用范围比野生型原始蛋白更宽，例如，70℃时的突变型Y61G作用的活性还有最适作用活性的一半，然而80℃时的野生型Cel12A的作用活性只剩最适作用活性的一半。

由上述结果，将Cel12A中Tyr61突变成Glycine后，不仅能够明显地提高作用活性也有扩大作用温度范围的趋势，而且最适作用温度仍然维持在高温95℃以上。为了验证Y61G活性较高的结果是否能在工业常用的毕赤酵母表达系统中再现，本发明进一步将包含有野生型Cel12A的酶蛋白的质粒与包含有突变型Y61G的质粒分别转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)内表达，再检测其细胞外酶活性。其方法详述如下。

首先，分别将编码Cel12A与Cel12A/Y61G的突变基因利用限制酶EcoRI与NotI构建到pPICZαA载体中，再利用限制酶PmeI把DNA质粒进行线性化后，通过电转化方法将DNA质粒转化到毕赤酵母内。接着将菌液涂布于含有100μg/ml zeocin抗生素的YPD培养皿于30℃下进行培养两天。再挑选菌落并接种到5ml YPD的液体培养基中，在30℃下培养，再次接种到50ml BMGY中于30℃下培养过夜。接着，将培养基换成含有0.5％甲醇的20ml BMMY以诱导蛋白表现，同样培养于30℃下。每隔24小时取样并补充0.5％甲醇。此外，将取样的菌液进行离心并收集上清液，按照如上所述的纤维素酶活性测定方法测定酶活性。结果发现，Y61G纤维素酶的活性显著地高于野生型Cel12A将近两倍。另外，在此真菌系统中两者蛋白的表达量差异不大，因而可推测Y61G活性明显地高于野生型蛋白而并非主要受底物蛋白量多少所影响，而其结果与在大肠杆菌系统中的一致。

为了进一步地放大纤维素酶生产量，我们先将菌株接种到5mlYPD培养至过夜，接着放大到2L于30℃下培养之后，再次放大到含有19L发酵培养基(FBSM)的50L发酵槽内。毕赤酵母的发酵操作，基本上是参考Invitrogen公司的操作手册。发酵过程中，会全程监控温度在30℃并通过添加氨水控制pH值在5.0左右，而溶氧的调控则通过进气量以及转速维持在40％以上。在分批培养(batchculture)后，添加50％甘油让酵母生长到一定的菌量。再把甲醇以梯度递加的方式加进发酵槽中，进而诱导酶蛋白表现。每隔12小时取样一次并收集上清液，进而检测纤维素酶的表达量与活性。结果发现，与野生型Cel12A酶蛋白同样在50L发酵槽下所被诱导出来的活性相比，突变型Y61G酶蛋白的活性随着诱导时间有增加趋势，并且与野生型Cel12A活性的差异越来越大。而最大差距约在诱导120小时，Y61G活性可高于野生型Cel12A将近两倍。

综上所述，为了增加耐热性纤维素酶的工业应用价值，本发明通过Cel12A纤维素酶蛋白的三维立体结构解析，从结构推测在氨基酸序列上第61位置的酪氨酸对此纤维素酶的活性有重大的意义，于是针对Tyr61进行定点突变成苯丙氨酸(Y61F)、丙氨酸(Y61A)或甘氨酸(Y61G)，结果发现Y61F、Y61A或Y61G三种突变蛋白皆能有效地提高纤维素酶的活性。其中，Y61G更能显著性地提升酶活性至将近两倍，并且也不会影响到酶本身的高温作用特性，甚至有扩大作用温度范围的趋势，进而增加了所述的纤维素酶的应用在不同工业上的价值。除了大肠杆菌表达系统外，在工业常用的毕赤酵母表达系统中，无论是在小量摇瓶或是大量生产的发酵技术上，皆能看到突变后的Y61G纤维素酶蛋白活性明显高于野生型纤维素酶蛋白，而非单纯只是酶蛋白产量的提高。

因此，由于本发明提供的Y61F、Y61A及Y61G三种突变蛋白皆能有效地提升纤维素酶的作用活性，故能增进此纤维素酶的应用价值。尤其对于一些需要耐热纤维素酶所参与的工业而言，更能大大地降低生产成本，因此与野生型的Cel12A相比，更有实际应用在产业上的潜力。

再者，纤维素酶在工业上的应用十分广泛，不论是在食品、饲料或纺织业，甚至可运用到现在最受关注的生物能源。在食品工业上，例如：果汁生产方面，必须要藉由果胶酶分解水果中大量的果胶质，然而果胶质会与纤维素等其他物质共同存在。因此生产制备中，在待澄清的果汁内加入纤维素酶能够帮助果胶酶的作用，进而提高果汁的澄清度。另外在啤酒制成方面，在糖化过程中加入纤维素酶能够有效地分解大麦或小麦等主要原料，尤其制备中是在高温条件下作用，故本发明的耐热纤维素酶更能符合其需求。在饲料工业方面，将液体纤维素酶喷在麸皮类载体上，再与饲料一同拌混，便能帮助动物分解这些含有大量纤维素的饲料，进而促进动物肠道对于植物纤维素的消化与吸收。纺织工业上，纤维素酶主要可应用于纺织品后处理加工，而酶蛋白作用在纺织品的表面上，像是主要对于棉织品的生物抛光(biopolishing)，能够增加其光泽感与手感；还有针对牛仔布的生物石磨(biostoning)，能够不均匀地消除染料，进而形成布料刷色等效果。另外，造纸工业对于纤维素酶的需求同样倾向于耐高温，其中酶的应用则可分为两大方面：其一是在制作纸浆过程中加入纤维素酶将木材等原料分解处理；另外则是在废纸资源利用上的脱墨过程中加入纤维素酶能够有效地将油墨去除。最后，在生物质能工业方面，由于在植物纤维原料的前处理过程是以高温热处理方式居多，因此耐热纤维素酶能够符合其需求。在糖化过程中加入纤维素酶能够有效地将植物纤维素原料分解成可被微生物利用的单糖，让特定的微生物能够利用单糖进行发酵作用，以制造出大量的生物酒精。由此可知，纤维素酶能够应用在许多不同的工业上。其中有些制备的条件是高温环境，也是目前工业常用纤维素酶无法有效作用或是长期耐受的限制，凸显了本发明耐热性纤维素酶的优势，不但大幅增加酶蛋白的活性，更进一步地降低生产成本。故本发明所提出的耐热性纤维素酶极具产业价值。

本发明可为熟知本领域技术人员做各种修饰，但修饰后的技术特征也落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种纤维素酶，其氨基酸序列为将序列号2的第61位置的酪氨酸用另外一个氨基酸取代的突变的氨基酸序列，其中所述取代的氨基酸选自苯丙氨酸、丙氨酸或甘氨酸。

2.如权利要求1所述的纤维素酶，其中编码序列号2所表示的氨基酸序列的基因是来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的Cel12纤维素酶基因。

3.如权利要求1所述的纤维素酶，其中所述的酶是葡聚糖酶。

4.如如权利要求1所述的纤维素酶，其中所述的酶是耐热性纤维素酶。

5.如权利要求1所述的纤维素酶，其中所述的纤维素酶的氨基酸序列为序列号4的氨基酸序列。

6.如权利要求1所述的纤维素酶，其中所述的纤维素酶的氨基酸序列为序列号6的氨基酸序列。

7.如权利要求1所述的纤维素酶，其中所述的纤维素酶的氨基酸序列为序列号8的氨基酸序列。

8.一种编码如权利要求1所述的纤维素酶的核酸分子。

9.一种重组质粒，其包含权利要求8所述的核酸分子。

10.如权利要求1-7中任意一项所述的纤维素酶在工业中的应用，其中所述的工业选自食品工业、饲料工业、纺织工业、造纸工业或生物质能工业。

Images