CN102639707A - 粘液、上皮细胞和其它细胞的细菌粘附和抗粘附 - Google Patents
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Abstract
本发明通常涉及检测、鉴定以及测定粘液和上皮细胞的细菌粘附的方法。具体而言,本发明提供了用于检测和鉴定(例如,肠中存在的)粘液和上皮细胞或者动物中可能存在细菌的其它部分是否存在细菌粘附的测定,以及鉴定和表征粘液和上皮细胞或者动物中可能存在细菌的其它部分的细菌粘附的调节剂(例如,调节剂的效力)的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年7月8日提交的美国临时申请系列第61/223,755号的优先权,通过引用将其全部内容并入本文。
发明领域
本发明通常涉及检测、鉴定以及测定粘液和上皮细胞的细菌粘附的方法。具体而言,本发明提供了用于检测和鉴定(例如,肠中存在的)粘液和上皮细胞或者动物中可能存在细菌的其它部分是否存在细菌粘附的测定,以及鉴定和表征粘液和上皮细胞或者动物中可能存在细菌的其它部分的细菌粘附的调节剂(例如,调节剂的效力)的方法。
发明背景
动物的小肠、呼吸道、尿道以及生殖道的上皮细胞覆盖了相对较厚的粘液层,该粘液层包含粘蛋白、很多小的相关蛋白、糖蛋白、脂质以及糖脂。上皮细胞和粘液含有识别特异性细菌粘附蛋白的受体。细菌对上皮细胞的粘附或紧密结合可以促进建群以及细菌致病性。此外,肠粘液和上皮细胞的细菌粘附似乎对微生物菌群内的个体稳定性很重要。
发明概述
本发明通常涉及检测、鉴定以及测定粘液和细胞(例如,上皮细胞)的细菌粘附和抗粘附的方法。具体而言,本发明提供了用于检测和鉴定粘液(例如,肠粘膜内衬)和上皮细胞的细菌粘附的测定,以及鉴定粘液和上皮细胞的细菌粘附的调节剂的方法。所述测定是非放射性的、微生物学安全的,并且是稳定的、易于运输和保存。
因此,在一些实施方案中,本发明提供了试剂盒,其包含用于测定粘液和/或上皮细胞的细菌粘附的非放射性酶联免疫吸附测定(ELISA)。所述试剂盒不局限于特定组分。在一些实施方案中,所述试剂盒包含固相支持体、包含细菌的样品、所述细菌的特异性一抗以及可检测地标记的二抗,其中所述固相支持体上包被了粘液和/或上皮细胞,所述可检测地标记的二抗对于与所述细菌结合的所述一抗是特异性的。在一些实施方案中,所述试剂盒包含能使所述可检测地标记的二抗可视化的底物。在一些实施方案中,所述可检测地标记的二抗包含酶标记。在一些实施方案中,所述底物是在所述酶标记的存在下能提供比色信号、荧光信号或化学发光信号的组合物。在一些实施方案中,所述可检测地标记的二抗包含与过氧化物酶偶联的猪抗IgG免疫球蛋白。在一些实施方案中,所述比色组合物是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。在一些实施方案中,所述固相支持体是96孔板。在一些实施方案中,所述细菌是大肠杆菌(E.coli)。粘液的实例包括但不限于猪近侧回肠粘液、猪远侧结肠粘液、肉鸡十二指肠粘液和肉鸡盲肠粘液。一抗的实例包括但不限于特异性针对大肠杆菌O和K抗原血清型的HRP偶联多克隆抗体以及特异性针对大肠杆菌O和K抗原血清型的多克隆抗体。二抗的实例包括但不限于亲和纯化的兔抗山羊IgG-HRP、亲和纯化的兔抗山羊IgG-AP、针对山羊IgG的多克隆FITC偶联抗体(H&L)、来自亲和素链霉菌(Streptomyces avidinii)的链霉亲和素-碱性磷酸酶以及来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-过氧化物酶。
在某些实施方案中,本发明提供测定细菌和粘液和细菌和上皮细胞之间的粘附和抗粘附的方法的方法。所述方法不局限于用于测定细菌和粘液和细菌和上皮细胞之间的粘附的特定技术。在一些实施方案中,所述方法包括提供包含细菌的样品和粘液,以及在非放射性比色测定中、在能测定所述细菌和粘液之间的粘附的条件下,使所述包含细菌的样品和所述粘液混合。在一些实施方案中,所述非放射性比色测定是ELISA测定。在一些实施方案中,所述条件包括添加与粘液、上皮细胞或其它细胞结合的细菌的特异性一抗,以及添加可检测地标记的二抗,所述二抗对于与所述细菌结合的所述一抗是特异性的。在一些实施方案中,所述方法包括添加能使与所述一抗结合的所述可检测地标记的二抗可视化的底物。在一些实施方案中,粘液被包被到微量滴定板上。在一些实施方案中,所述可检测地标记的二抗包含酶标记。在一些实施方案中,所述底物是用于在所述酶标记的存在下能提供比色、荧光或化学发光信号的组合物。在一些实施方案中,所述可检测地标记的二抗包含与过氧化物酶偶联的猪抗IgG免疫球蛋白。在一些实施方案中,所述比色组合物是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。在一些实施方案中,所述细菌是大肠杆菌。所述方法不局限于特定一抗或二抗。在一些实施方案中,一抗的实例包括但不限于特异性针对大肠杆菌O和K抗原血清型的HRP偶联多克隆抗体以及特异性针对大肠杆菌O和K抗原血清型的多克隆抗体。二抗的实例包括但不限于亲和纯化的兔抗山羊IgG-HRP、亲和纯化的兔抗山羊IgG-AP、针对山羊IgG的多克隆FITC偶联抗体(H&L)、来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-碱性磷酸酶以及来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-过氧化物酶。
在某些实施方案中,本发明提供了鉴定能调节细菌和粘液之间的粘附的试剂的方法,所述方法包括提供包含细菌的样品、粘液和试剂,以及在非放射性比色测定中、在能测定所述细菌和所述粘液之间的粘附的条件下,使所述包含细菌的样品、所述粘液以及所述试剂混合。所述方法还包括比较在存在和不存在所述试剂时的细菌粘附,以及如果所述测定的粘附高于或低于在不存在所述试剂时所述细菌和所述粘液之间的粘附,则将所述试剂鉴定为所述细菌和所述粘液之间的粘附的调节剂。在一些实施方案中,所述非放射性比色测定是ELISA测定。在一些实施方案中,所述条件包括添加与粘液结合的细菌的特异性一抗。在一些实施方案中,所述条件包括添加可检测地标记的二抗,所述二抗对于与所述细菌结合的所述一抗是特异性的。在一些实施方案中,所述条件包括添加能使与所述一抗结合的所述可检测地标记的二抗可视化的底物。在一些实施方案中,粘液被包被到微量滴定板上。在一些实施方案中,所述可检测地标记的二抗包含酶标记。在一些实施方案中,所述底物是用于在所述酶标记的存在下能提供比色信号、荧光信号或化学发光信号的组合物。在一些实施方案中,所述可检测地标记的二抗包含与过氧化物酶偶联的猪抗IgG免疫球蛋白。在一些实施方案中,所述比色组合物是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。在一些实施方案中,所述细菌是大肠杆菌。一抗的实例包括但不限于特异性针对大肠杆菌O和K抗原血清型的HRP偶联多克隆抗体以及特异性针对大肠杆菌O和K抗原血清型的多克隆抗体。二抗的实例包括但不限于亲和纯化的兔抗山羊IgG-HRP、亲和纯化的兔抗山羊IgG-AP、针对山羊IgG的多克隆FITC偶联抗体(H&L)、来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-碱性磷酸酶以及来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-过氧化物酶。在一些实施方案中,所述试剂选自天然存在的分子、合成衍生的分子和重组衍生的分子。
在某些实施方案中,本发明提供了包含试剂的组合物,其中所述试剂是粘液的细菌粘附的调节剂,并且所述试剂是通过包括以下步骤的方法鉴定出的:提供i)包含细菌的样品、ii)粘液、iii)试剂;在非放射性比色测定中、在能测定所述细菌和所述粘液之间的粘附的条件下,使所述包含细菌的样品、所述粘液以及所述试剂混合;比较在存在和不存在所述试剂时的细菌粘附;以及如果所述测定的粘附高于或低于在不存在所述试剂时所述细菌和所述粘液之间的粘附,则将所述试剂鉴定为所述细菌和所述粘液之间的粘附的调节剂。在一些实施方案中,所述组合物位于饲料中,所述饲料是供选自牲畜、宠物(companion animal)、鱼以及贝壳动物的个体食用的。
附图简要说明
图1显示了利用放射性标记的细菌测定的粘液浓度(mg蛋白/ml)对大肠杆菌ALI84和ALI446粘附的影响。
图2显示了通过利用放射性标记的细菌的闪烁计数测定的一抗对大肠杆菌ALI84的粘附的影响。一抗:HRP=HRP偶联抗大肠杆菌;BP2022=非偶联抗大肠杆菌,生物素=生物素偶联抗大肠杆菌。
图3显示了通过利用放射性标记的细菌的闪烁计数测定的一抗对大肠杆菌ALI446的粘附的影响。一抗:HRP=HRP偶联抗大肠杆菌;BP2022=非偶联抗大肠杆菌,生物素=生物素偶联抗大肠杆菌。
图4显示了3种不同的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)ELISA底物与大肠杆菌(菌株ALI84和ALI446)孵育时的显色。
图5显示了对硝基磷酸苯酯(pNPP)和2,2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(AzBTS)ELISA底物与大肠杆菌菌株ALI84和ALI446孵育时的显色。E=ABTS微孔增强剂。
图6显示了不同的ELISA底物在粘液包被的孔中孵育时的显色。在60分钟时采集照片;在15分钟时,在6个阳性(黄色)孔中观察到弱信号。
图7显示了检测抗体与粘液或平板的非特异性结合时的平板安排。BP2022=抗大肠杆菌一抗;BP2022HRP=过氧化物酶偶联抗大肠杆菌一抗;生物素=生物素偶联抗大肠杆菌一抗。HRP=过氧化物酶偶联二抗;StrHRP=过氧化物酶偶联链霉亲和素。AP=碱性磷酸酶偶联二抗;StrAP=链霉亲和素偶联二抗。在本实验中未使用细菌。
图8显示了抗体与粘液或平板的结合。平板安排在图7中描述。
图9显示了利用一抗和二抗的非特异性结合测试。一抗:HRP=HRP偶联一抗,BP2022=非偶联多克隆抗大肠杆菌一抗;生物素=生物素偶联抗大肠杆菌一抗。二抗:HRP=HRP偶联IgG;StrHRP=HRP标记的链霉亲和素。在本实验中未使用细菌。
图10显示了利用一抗和二抗的非特异性结合测试。平板安排在图9中描述。一抗:HRP=HRP偶联一抗,BP2022=非偶联多克隆抗大肠杆菌;生物素=生物素偶联抗大肠杆菌。二抗:HRP=HRP偶联IgG;StrHRP=HRP标记的链霉亲和素。
图11显示了描述用于优化抗体稀释度和每孔细菌数的条件的表。一抗:HRP偶联一抗,无二抗。
图12显示了从测试抗体稀释度和最佳的每孔细菌数中获得的数据。一抗:HRP偶联一抗,无二抗。平板安排如图11所示。
图13显示了描述用于优化抗体稀释度和每孔细菌数的条件的表。一抗:生物素偶联抗大肠杆菌,二抗:HRP偶联链霉亲和素。
图14显示了从测试抗体稀释度和最佳的每孔细菌数中获得的数据。一抗:生物素偶联抗大肠杆菌,二抗:HRP偶联链霉亲和素。
图15显示了孔中添加106-108个细菌时的ELISA吸光度。添加了对数趋势线。
图16显示了孔中添加0-106个细菌时的ELISA吸光度。
图17显示了A)不同浓度的Bio-Mos对细菌粘附的影响。该影响表示为不添加Bio-Mos时吸光度的百分比;以及B)利用闪烁计数中放射性标记的细菌测定的Bio-Mos对大肠杆菌菌株ALI84的粘附的影响。
图18显示了来自测试每孔细菌数从而寻找检测粘附/附着改变效果的最佳水平的实验的数据(例如,利用Bio-Mos)。
图19显示了来自测试每孔细菌数从而寻找检测粘附/附着改变效果的最佳水平的实验的数据(例如,利用Bio-Mos)。
图20显示了用于检测不同浓度的Bio-Mos之间差异的一抗稀释度的相关数据。
图21显示了在利用不同类型的粘液和多种Bio-Mos浓度的ELISA中的效果。
图22显示了放射性附着测定和ELISA方法中Bio-Mos效果的比较。重复样品之间的平均值的标准误显示为误差棒。
图23显示了不同方式灭活的细菌对包被粘液的平板的粘附。在有和没有Bio-Mos的情况下测定粘附。UV和DMSO灭活的细菌的数据未示出。
图24显示了按照ELISA方法,细菌对新鲜包被的平板上的粘液的粘附。
图25显示了大肠杆菌保存液中的乙醇浓度对细菌对粘液的粘附的影响。
图26显示了在有和没有Bio-Mos的情况下,细菌对不同方式保存的包被粘液的平板的粘附。
图27显示了Bio-Mos对乙醇灭活的大肠杆菌在包被粘液的风干的平板上粘附的影响。重复样品之间的平均值的标准误显示为误差棒。
图28显示了不同Bio-Mos测试水平的不同平板间的绝对变化。同一样品的重复测定(孔)显示为各组柱。
图29显示了不同Bio-Mos测试水平的不同平板间的绝对变化。该图中的4幅图代表在不同的4天进行的测定,但利用的是单一批次的大肠杆菌。同一样品的重复测定(孔)显示为各组柱。
图30的不同图中显示了不同Bio-Mos测试水平的不同平板间的绝对变化。每幅图中的4组柱代表在不同的4天进行的测定,但利用的是单一批次的大肠杆菌。
图31显示了不同Bio-Mos测试水平的不同平板间的相对变化。各个柱代表重复测试孔的平均值,误差棒代表平均值的标准误。测定是在不同的4天进行的,但利用的是单一批次的大肠杆菌。两幅图显示的是相同的数据,但是是以不同方式展现,目的是强调不同平板间的变化(上图)或Bio-Mos的效果(下图)。
图32显示了Bio-Mos效果的不同批次间的相对变化。上图的各个柱代表重复测试孔的平均值,误差棒代表平均值的标准误。测定是全部独立进行的,开始为培养基和缓冲制剂,然后是大肠杆菌培养物。上图显示了测定的信号,下图显示了相对于对照孔的值。
图33显示了为了利用所开发的测定检测出测试处理之间所标明的差异所需的重复孔的数量。
图34显示了在存在和不存在Bio-Mos(2ng/ml)的情况下,对5个独立批次的细菌制备物所测定的信号。
图35显示了信号在存在和不存在Bio-Mos(2ng/ml)的情况下,对5个独立批次的粘液平板所测定的信号粘液。
图36显示了保存1周和2周之后的测试的信号。
图37显示了本发明一个实施方案中的真空密封的平板和安瓿。
定义
为了便于理解本发明,下文中定义了多个术语。
本文所用的术语“粘液”是指由消化道产生并覆盖消化道的一部分的相对较厚的分泌物(例如,由肠上皮细胞产生并覆盖肠上皮细胞)。粘液可以包含一种或多种组分,例如粘蛋白、蛋白、糖蛋白、脂质以及糖脂。粘液还可以包含一种或多种受体(例如,识别特异性粘附蛋白的受体)。细菌与粘液和/或上皮细胞(例如,通过粘液层)的粘附和/或紧密结合可以促进肠粘液和/或上皮细胞的细菌粘附(例如,从而在定居于肠道中的细菌群体中发挥作用)。本发明不限于任何特定类型的粘液或从任何特定来源(例如,动物类型)或位置(例如,消化道的一部分(例如,回肠(例如近侧回肠、远侧回肠等)、十二指肠、盲肠、结肠或消化道其它部分))获得的粘液。
本文所用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白”都是指通过共价“肽连接”连接的氨基酸的一级序列。通常,肽由数个氨基酸组成,通常为2-50个氨基酸并且比蛋白短。术语“多肽”包括肽和蛋白。在一些实施方案中,肽、多肽或蛋白是合成的,而在其它实施方案中,肽、多肽或蛋白是重组的或天然存在的。合成肽是通过体外人工手段产生的肽(即,不是体内产生的)。
术语“样品”和“样本”以其最广泛的含义使用,并且包括获自任何来源的样品或样本。本文所用的术语“样品”是指获自动物(包括人)的生物样品,并且包括液体、固体、组织以及气体。在本发明的一些实施方案中,生物样品包括脑脊髓液(CSF)、浆液、尿液、唾液、血液以及血液产物,例如血浆、血清等。然而,这些实例不应解释为限制可用于本发明中的样品的类型。
本文所用的术语“宿主”和“个体”是指任何动物,包括但不限于所研究、分析、测试、诊断或治疗的人和非人动物(例如狗、猫、牛、马、羊、家禽、鱼、甲壳动物等)。本文所用的术语“宿主”、“个体”和“患者”可交换使用,除非另外指出。
本文所用的术语“抗体(antibody)”(或“抗体(antibodies)”)是指特异性地结合抗原决定子以及特异性地结合蛋白的任何免疫球蛋白,所述蛋白与刺激它们产生的抗原决定子相同或结构上相关。因此,抗体可用于检测刺激它们产生的抗原的测定。单克隆抗体来源于B淋巴细胞(即,B细胞)的单一克隆,并且在结构和抗原特异性上通常是同质的。多克隆抗体来源于产抗体细胞的很多不同克隆,并因此在结构和表位特异性上是异质的,但是都能识别相同抗原。在一些实施方案中,以粗制备物的形式使用单克隆和多克隆抗体,而在优选实施方案中,对这些抗体进行纯化。例如,在一些实施方案中,使用包含于粗制抗血清中的多克隆抗体。同样,术语“抗体”意图包括获自任何来源(例如人、啮齿动物、非人灵长类、兔、山羊、牛、马、绵羊等)的任何免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)。
本文所用的术语“抗原”是指能被抗体识别的任何物质。该术语意图包括任何抗原和“免疫原”(即,诱导抗体形成的物质)。因此,在免疫原反应中,抗体是响应于抗原或抗原部分的存在而产生的。术语“抗原”和“免疫原”是用来指个体大分子或指抗原大分子的同质或异质群体。术语抗原和免疫原意图包括蛋白分子或包含一个或多个表位的蛋白分子部分。在很多情况下,抗原也是免疫原,因此术语“抗原”通常可与术语“免疫原”交换使用。在某些优选实施方案中,免疫原物质在测定中用作抗原来检测免疫动物的血清中合适的抗体的存在。
本文所用的术语“抗原片段”和“抗原部分”以及相似术语是指抗原的一部分。抗原片段或部分通常在大小上会变化,从整个抗原的小百分比至抗原的大百分比,但不是100%。然而,在规定抗原的“至少一部分”时,也考虑到整个抗原也可以存在(例如,并非意图是指受试样品仅含有抗原的一部分)。在一些实施方案中,抗原片段和/或抗原部分包含被抗体识别的“表位”,而在其它实施方案中,这些片段和/或部分不包含被抗体识别的表位。此外,在一些实施方案中,抗原片段和/或部分不是免疫原性的,而在优选实施方案中,抗原片段和/或部分是免疫原性的。
本文所使用的术语“抗原决定子”和“表位”是指与具体抗体可变区接触的抗原部分。当蛋白或蛋白片段(或部分)用于免疫宿主动物时,蛋白的多个区可能诱导与蛋白上的指定区或三维结构(这些区和/或结构被称为“抗原决定子”)特异性地结合的抗体的产生。在某些情况下,抗原决定子与完整抗原(即,用于引发免疫应答的“免疫原”)竞争与抗体的结合。
当涉及抗体和抗原之间的相互作用时,术语“特异性的结合”和“特异性地结合”描述的是依赖于抗原上的特定结构(即,抗原决定子或表位)是否存在的相互作用。换言之,抗体识别并结合抗原的独特的蛋白结构,而并不是总体地结合所有蛋白(即,非特异性的结合)。
本文所用的术语“免疫测定”是指利用至少一种特异性抗体来检测或定量抗原的任何测定。免疫测定包括但不限于Western印迹、ELISA、放射免疫测定以及免疫荧光测定。
本文所用的术语“ELISA”是指酶联免疫吸附测定(或EIA)。多种ELISA方法和应用是本领域已知的,并且在很多文献中有描述(参见,例如,Crowther,″Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)″,inMolecular Biomethods Handbook(分子生物学方法手册),Rapley et al.(eds.),pp.595-617,Humana Press,Inc.,Totowa,N.J.(1998);Harlow andLane(eds.),Antibodies:A Laboratory Manual(抗体:实验手册),Cold SpringHarbor Laboratory Press(1988);Ausubel et al.(eds.),Current Protocols inMolecular Biology(现代分子生物学方法),Ch.11,John Wiley & Sons,Inc.,New York(1994))。此外还有很多商购ELISA测试系统。
本文所用的术语“报告试剂”、“报告分子”、“检测底物”和“检测试剂”是指允许对与抗原结合的抗体进行检测和/或定量的试剂。例如,在一些实施方案中,报告试剂是已与抗体偶联的酶的比色底物。将合适的底物添加至抗体-酶偶联物导致比色信号或荧光信号(例如,在偶联抗体与目的抗原结合之后)的产生。其它报告试剂包括但不限于放射性化合物。该定义还包括利用基于生物素和亲和素的化合物(例如,包括但不限于中和亲和素和链霉亲和素)作为检测系统的一部分。
本文所用的术语“信号”通常是指指示反应发生的(例如,抗体与抗原结合)的任何可检测的过程。考虑到放射性、荧光或比色产物/试剂形式的信号可用于本发明。在本发明的不同实施方案中,定性地评价信号,而在可选实施方案中,定量地评价信号。
本文所用的术语“固相支持体”是指连接诸如抗体、抗原以及其它测试组分的试剂的任何固体或静态材料。例如,在ELISA方法中,微量滴定板的孔提供固相支持体。固相支持体的其它实例包括显微镜载玻片、盖玻片、珠、颗粒、细胞培养皿以及很多其它合适的器具。
本文所用的术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的组合物的量。可以给予有效量和/或将有效量与另一物质在一次或多次给药、施用或剂量中联合,并且有效量并非意图局限于特定的制剂或给药途径。
本文所用的术语“给药(administration)”和“给药(administering)”是指将药物、前药或其它试剂或治疗处理(例如,通过利用本发明的方法鉴定为粘液的细菌粘附的调节剂的试剂)给予个体(例如,个体或体内、体外、或离体细胞、组织以及器官)的行为。示例性的给药途径可以通过眼(经眼)、口(口服)、皮肤(局部或经皮)、鼻(经鼻)、肺(吸入)、口腔粘膜(经颊)、耳、直肠、阴道、注射(例如静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等)等。
本文所用的术语“共同给药(co-administration)”和“共同给药(co-administering)”是指给予个体和/或物质(例如,食物(例如,动物饲料))至少两种试剂(例如,通过利用本发明的方法鉴定为粘液的细菌粘附的调节剂的试剂和一种或多种其它试剂(例如,已知能治疗病原细菌病症的疗法))。在一些实施方案中,两种或更多种试剂或治疗的共同给药是同时的。在其它实施方案中,首先给予第一试剂/治疗,然后给予第二试剂/治疗。本领域技术人员应当理解,使用的各种试剂或治疗的配制和/或给药途径可以不同。本领域技术人员能容易地确定共同给药的合适的剂量。在一些实施方案中,当试剂或治疗共同给药时,分别的试剂或治疗以低于适于其单独给药和/或配制的剂量进行给药和/或配制。因此,共同给药尤其适合于下述实施方案:试剂或治疗的共同给药/共同配制能降低可能有害的(例如,毒性)试剂的所需剂量,和/或两种或更多种试剂的共同给药能使个体通过与其它试剂的共同给药而对其中一种试剂的有益效果敏感。
本文所用的“建群后治疗”或“后施用”是指去除感染性疾病后的治疗。
本文所用的“前施用”和/或“预防性治疗”是指用作预防性措施的治疗(例如,用于预防感染和/或疾病)。
本文所用的术语“疾病”和“病理状态”可交换使用,用于描述与活体动物或其任何器官或组织的正常状态的任何损伤相关的状态、病征和/或症状,所述损伤干扰或改变正常功能的性能并且可以是对环境因素(例如营养不足、工业危害或气候)、对特定感染物(例如蠕虫、细菌或病毒)、对生物体的固有缺陷(例如各种遗传异常)、或对这些因素和其他因素的组合的响应。
本文所用的术语“患病”是指经受具体疾病的个体(例如,动物或人类个体)。本发明并非意图局限于任何特定病征或症状或任何特定疾病。因此,本发明意图包括经历任何疾病阶段(例如,从亚临床表现至完全形成的疾病)的个体,其中所述个体表现出至少部分的与具体疾病有关的指征(例如,病征和症状)。
本文所用的术语“毒性的”是指与毒性物给药前的细胞或组织相比,对个体、细胞或组织的任何不利的或有害的作用。
本文所用的术语“功能性饲料成分(functional feed ingredient)”或“功能性饲料添加剂(functional feed additive)”是指活性剂(例如,鉴定为粘液的细菌粘附的调节剂的试剂)与惰性的或有活性的载体的组合,从而使组合物特别适合于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。
本文所用的术语“载体”是指任何标准载体,包括但不限于磷酸缓冲盐溶液、水、乳化剂(例如,例如油/水或水/油乳化剂)以及各种类型的润湿剂、任何和所有溶剂、分散介质、包被、月桂基硫酸钠、等渗剂和吸收延迟剂、崩解剂(例如,马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)、玉米穗轴、干燥的酒糟、麦麸、酵母(例如,完全废酵母(whole spent yeast))、酵母组分(例如,酵母细胞壁提取物)等。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和辅助剂的实例可参见例如,Martin,Remington′s PharmaceuticalSciences(雷明顿制药科学),第15版,Mack Publ.Co.,Easton,Pa.(1975),通过引用将其并入本文)。
本文所用的术语“消化”是指食物、饲料或其它有机化合物转化为可吸收的形式;通过热和水分或化学作用软化、分解或降解。
本文所用的“消化系统”是指可以发生消化或确实发生消化的系统(包括胃肠系统)。
本文所用的术语“饲料”是指供动物摄取并为动物饮食提供能量和/或养分的物质。饲料的实例包括但不限于全混合日粮(TMR)、草料(forage)、粒料、浓缩物、预混合料、副产物、谷类、酒糟、糖蜜、纤维、草料(fodder)、草、干草、谷仁、叶、粗粉、可溶物以及补充剂。
本文所用的术语“动物”是指动物界的成员。其包括但不限于家畜、农业动物、驯养动物、宠物、海洋动物和淡水动物以及野生动物。
本文所用的术语“药学可接受的盐”是指目标个体(例如,哺乳动物、人、鸟类、牛类、猪类、马类、绵羊类、山羊类、犬类、猫类、鱼类、骆驼类、啮齿类以及鱼和贝壳动物个体,和/或体内或离体、细胞、组织或器官)生理学可耐受的本发明的化合物(例如,包含本发明的活酵母细胞或细胞壁组分)的任何盐(例如,通过与酸或碱的反应获得的盐)。本发明的化合物的“盐”可以来源于无机或有机酸和碱。酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、蚁酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。诸如草酸的其它酸尽管自身不是药学可接受的,但是可用于制备可用作中间体的盐,从而获得本发明的化合物及其药学可接受的酸加成盐。
碱的实例包括但不限于,碱金属(例如,钠)氢氧化物、碱土金属(例如,镁)氢氧化物、氨以及式NW4 +化合物,其中W是C1-4烷基等。
盐的实例包括但不限于:乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、古洛庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐等。盐的其它实例包括与合适的阳离子进行化合的本发明化合物的阴离子,所述阳离子例如Na+、NH4 +以及NW4 +(其中W是C1-4烷基)等。对于治疗应用,本发明化合物的盐预期为药学可接受的。然而,非药学可接受的酸和碱的盐也可以使用,例如,用于制备或纯化药学可接受的化合物。
对于治疗和/或预防应用,本发明化合物的盐预期为药学可接受的。然而,非药学可接受的酸和碱的盐也可以使用,例如,用于制备或纯化药学可接受的化合物。
本文所用的术语“细胞培养物”是指任何细胞体外培养物。该术语包括连续细胞系(例如,具有永生化表型的细胞系)、原代细胞培养物、转化的细胞系、有限细胞系(例如,非转化的细胞)以及任何其它体外维持的细胞群体。
所用的术语“真核生物”是指能与“原核生物”区分开的生物体。该术语意图包括具有表现出真核生物的通常特征的细胞的所有生物体,所述性质例如存在具有核膜边界的真正的核(核中存在染色体)、存在具有膜边界的细胞器以及真核生物中通常能观察到的其它特征。因此,该术语包括但不限于诸如真菌、原生动物以及动物(例如,人)的生物体。
本文所用的术语“体外”是指人工环境,并且指在人工环境中发生的过程或反应。体外环境包括但不限于试管和细胞培养物。术语“体内”是指天然环境(例如,动物或细胞),并且指在天然环境中发生的反应。
本文所用的术语“样品”以最广泛的含义使用。在一种含义中,该术语意图包括获自任何来源的样本或培养物,以及生物样品和环境样品。生物样品可以获自动物(包括人),并且包括包括流体、固体、组织以及气体。生物样品包括血制品,例如血浆、血清等。环境样品包括环境材料,例如表面物质、土壤、水、晶体和工业样品。然而,这些实例不应解释为限制适用于本发明的样品类型。
本文所用的术语“试剂盒”是指包装好的一组材料。
本文所用的“抗粘附(anti-adherence)调节剂”和/或“抗粘附(anti-adhesion)调节剂”是指阻止粘附(例如,阻止化合物与菌毛的粘附和/或阻止细菌与粘液上皮细胞细胞和/或其它类型细胞的粘附)的调节剂。
发明详细描述
放射性结合测定已被证实能测定肠粘液的细菌粘附,并且某些试剂能有效防止这种粘附(参见,例如,Conway,et al.,1990,Infection andImmunity 58:3178-3182;通过引用将其整体并入本文)。具体而言,被证实能测定肠粘液的细菌粘附的放射性结合测定已进一步表现出Bio-Mos对抑制细菌粘附的效果,Bio-Mos是来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的细胞壁的甘露糖蛋白。然而,还没有非放射性常规方法可用于检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附。本发明的方法和组合物通过提供检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附的非放射性方法而攻克了这些限制。
具体而言,本发明提供了用于测定粘液的细菌粘附和用于测试调节(例如,抑制、促进)粘附的产品的效果的简单且准确的免疫测定。在一些实施方案中,所述免疫测定是Western印迹。在一些实施方案中,所述免疫测定是放射免疫测定。在一些实施方案中,所述免疫测定是免疫荧光测定。在一些实施方案中,所述免疫测定是基于ELISA的测定。基于ELISA的方法是放射性测定的有利备选方案,这是由于其在使用不同的一抗和二抗的组合和用于不同微生物种类的各种比色检测体系中的灵活性。因此,本发明提供了检测和鉴定粘液(例如,肠粘膜内衬)的细菌粘附的基于ELISA的方法。
因此,在一些实施方案中,本发明提供用于监测和/或表征粘液和细菌细胞之间的相互作用(例如结合、附着、亲和力等)的非放射性比色测定。在一些实施方案中,所述非放射性测定与用于相似监测和/或表征的放射性测定的敏感性相同和/或比其敏感性更高。在一些实施方案中,本发明的非放射性比色测定用于监测和/或表征一种或多种受试试剂改变(例如,抑制和/或增强)细菌细胞与粘液的相互作用(例如结合、附着、亲和力等)的能力。
例如,在一些实施方案中,本发明提供监测和/或表征粘液和细菌细胞之间的相互作用(例如结合、附着、亲和力等)的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法(例如,如实施例1-16中所述)。在一些实施方案中,所述测定在室温下进行。在一些实施方案中,所述测定在37℃下进行。在一些实施方案中,按照实施例2-15所述优化所述测定。在一些实施方案中,用粘液包被平板(例如,微量滴定板(例如,MAXISORP平板(例如,具有6、12、24、48、96、128或更多个孔)))。本发明不受限于粘液的类型、来源或量。在一些实施方案中,所用的粘液是动物粘液。在一些实施方案中,粘液获自猪、鸡、牛、马、犬、猫或其它类型动物。在一些实施方案中,粘液获自消化道的一个或多个部分。例如,在一些实施方案中,粘液获自回肠(例如近侧回肠、远侧回肠等)、十二指肠、盲肠、结肠和/或消化道的其它部分。本发明不受限于用于包被平板的粘液的量(例如,取决于平板上孔的数量和/或大小)。在一些实施方案中,粘液被稀释在包被缓冲液中,并然后用于包被平板。在一些实施方案中,所述包被缓冲液是含有1L水的溶液,其中水中溶解了1.6g Na2CO3、2.94g NaHC O3以及0.2g叠氮钠的溶液并且pH调节至9.6,或者是相似的缓冲液。在一些实施方案中,将含有约0.001-0.2mg粘液蛋白/ml包被缓冲液的包被缓冲液用于包被平板上的每个孔,但是也可以使用更多的量(例如0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1.0mg/ml或更多)或更少的量(例如0.0005mg/ml或更少)。在一些实施方案中,将约300μl包被悬液用于包被每个孔,但是也可以使用更大体积的包被溶液(例如400μl、500μl、600μl、700μl或更大)或更小体积的包被溶液(例如200μl、100μl、50μl、25μl或更小)(例如,取决于孔的大小、所需信号的量或其它因素(例如,细菌粘附))。当将包被溶液添加到孔时,允许粘液在恒定温度下(例如,4℃、室温或更高的温度(例如,37℃))下包被每个孔一段时间(例如约1小时、约2小时、约3小时、约6小时、约12小时、约24小时或更长)。在一些实施方案中,在孵育时将平板盖上(例如,为了防止包被溶液蒸发)。有时,在包被期中,制备测试试剂(例如,将要测试改变(例如,抑制和/或增强)细菌与粘液结合的能力的试剂)。将测试试剂稀释在任何合适的缓冲液中(例如,磷酸缓冲液盐溶液(PBS)(例如,将8.0g NaCl、0.2g KCl、1.4g Na2HPO4×2H2O、0.2g KH2PO4溶解于1L水中并调节至pH 7.4而制备的PBS溶液)。本发明不受限于测试试剂的类型。事实上,利用本发明的方法能监测和/或表征多种测试试剂,所述测试试剂包括但不限于本文中描述的试剂。
包被完成后,从孔中去除包被溶液(例如,不混合孔的内容物),并且用合适体积的(例如100ml、200ml、300ml、400ml或更多)洗涤溶液(例如,PBS)洗涤每个孔。
在不破坏细菌完整性的条件下通过收集细菌来制备将要监测和/或表征与粘液的相互作用的细菌。本发明不限于任何特定类型的细菌,也不限于细菌的任何特定生长期。事实上,在本发明的测定中可以监测和/或表征多种细菌,包括但不限于本文描述的细菌类型。将细菌收集好后(例如,通过离心使细菌细胞沉淀),将其重悬于缓冲液(例如,PBS)中至最需的浓度,所述浓度取决于每个孔需要多少细菌。在一些实施方案中,每个孔添加的细菌数为约107,但是每个孔可以添加更多(例如108、109、1010)或更少(例如106、105、104)的细菌。最后洗涤平板后,将细菌添加到孔中。在一些实施方案中,在即将将细菌悬液添加到孔之前,将测试试剂溶液添加到细菌悬液中。如本文所述,测试试剂的量和细胞的量可以变化。将细菌和/或细菌+测试试剂添加到孔中后,允许它们在孔中孵育一段时间(例如1小时、2小时、4小时、8小时或更长)。孵育后,洗涤孔(例如,用PBS洗涤1次、2次、3次或更多次)。洗涤后,将封闭缓冲液(例如,胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、乳或其它合适的封闭剂(例如,稀释在PBS中的10%FBS)添加到每个孔(例如,利用与用粘液包被孔所用的相同体积的封闭缓冲液)。使封闭溶液在恒定温度下(例如4℃、室温或更高温度(例如,37℃))在孔中孵育一段时间(例如约1小时、约2小时、约3小时或更长)。去除封闭缓冲液,然后将一抗(例如,对所监测和/或表征的细菌具有特异亲和力的一抗)添加到孔中。将一抗稀释在(例如,以1∶500、1∶1000、1∶2500、1∶5000或更高比例稀释)封闭缓冲液中。所要添加到孔中的稀释的一抗的体积为约100ml-约400ml(例如,200ml),并且在恒定温度下(例如4℃、室温或更高温度(例如,37℃))在孔中孵育一段时间(例如约1小时、约2小时、约3小时或更长)。本发明不受限于所用的一抗。事实上,可以使用对所监测和/或表征的细菌类型具有特异亲和力的任何抗体。在一些实施方案中,所述一抗是多克隆抗体。在一些实施方案中,所述一抗是单克隆抗体。在一些实施方案中,所述一抗是抗体片段。在一些实施方案中,所述一抗是偶联抗体。例如,在一些实施方案中,所述一抗是生物素偶联的。在一些实施方案中,所述一抗是针对大肠杆菌的生物素偶联多克隆抗体。一抗孵育后,使用洗涤缓冲液(例如,PBS)洗涤孔(例如1次、2次、3次或更多次)。去除洗涤缓冲液,然后将二抗(例如,对一抗具有特异亲和力的二抗)添加到孔中。二抗也在封闭缓冲液中稀释(例如,以1∶500、1∶1000、1∶2500、1∶5000或更高比例稀释)。本发明不受限于所用二抗的类型。在一些实施方案中,所述二抗是多克隆抗体。在一些实施方案中,所述二抗是单克隆抗体。在一些实施方案中,所述二抗是抗体片段。在一些实施方案中,所述二抗是偶联抗体。在一些实施方案中,所述二抗与链霉亲和素偶联。在一些实施方案中,所述二抗是与酶偶联(例如过氧化物酶、磷酸酶等)。所要添加到孔中的稀释的二抗的体积为约100ml-约400ml(例如,200ml),并在恒定温度下(例如4℃、室温或更高温度(例如,37℃))在孔中孵育一段时间(例如约1小时、约2小时、约3小时或更长)。孵育后,用洗涤缓冲液(例如,PBS)洗涤孔(例如2次、3次、4次、5次或更多次)。最后一次洗涤后,将比色底物添加到孔中。本发明不受限于所用底物的类型。示例性的底物包括但不限于,3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)(例如,用于过氧化物酶偶联二抗)、对硝基磷酸苯酯(pNPP)(例如,用于磷酸酶偶联抗体)等。在孔中显色,并进行检测和/或定量(例如,利用分光光度计)。可以通过在任何时间点添加酸性缓冲液(例如,2M H2SO4)来停止显色(例如,为了防止强的颜色信号产生(例如,为了定量细菌附着))。
本发明不限于特定的用于检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附的基于ELISA的方法。在一些实施方案中,提供了下述方法:其中1)用粘液样品包被配置用于基于ELISA的测定的平板,2)将细菌施加到包被粘液的平板,3)施加针对细菌的一抗,4)施加针对一抗的二抗,5)施加液体底物,以及6)测定细菌粘附。在一些实施方案中,在一个或多个所述步骤之间进行洗涤步骤。在一些实施方案中,在一个或多个所述步骤之间施加封闭溶液。所述方法不受限于特定类型或种类的粘液样品、细菌、一抗、二抗、液体底物和/或测定细菌粘附的技术。
检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附的方法不受限于特定类型的细菌。事实上,本发明可以使用任何类型的细菌。细菌的实例包括但不限于,酸杆菌(Acidobacteria)、放线菌(Actinobacteria)、产水菌(Aquificae)、拟杆菌(Bacteroidetes)/绿菌(Chlorobi)、衣原体(Chlamydiae)/疣微菌(Verrucomicrobia)、绿弯菌(Chloroflexi)、产金菌(Chrysiogenetes)、蓝细菌(Cyanobacteria)、脱铁杆菌(Deferribacteres)、异常球菌-栖热菌(Deinococcus-Thermus)、网团菌(Dictyoglomi)、纤维杆菌(Fibrobacteres)、厚壁菌(Firmicutes)、梭杆菌(Fusobacteria)、芽单胞菌(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌(Nitrospirae)、浮霉菌(Planctomycetes)、变形菌(Proteobacteria)、螺旋体(Spirochaetes)、互养菌(Synergistetes)、无壁菌(Tenericutes)、热脱硫杆菌(Thermodesulfobacteria)以及热袍菌(Thermotogae)。在一些实施方案中,所述细菌是病原菌,例如,博代氏杆菌(Bordetella)(例如百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis))、疏螺旋体(Borrelia)(例如博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))、布鲁氏菌(Brucella)(例如流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis))、弯曲菌(Campylobacter)(例如空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni))、衣原体(Chlamydia)(例如肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis))、梭菌(Clostridium)(例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani))、棒状杆菌(Corynebacterium)(例如白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、肠球菌(Ehterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecum))、埃希氏菌(Escherichia)(例如大肠杆菌(Escherichia coli))、弗朗西斯氏菌Francisella)(例如土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis))、嗜血杆菌(Haemophilus)(例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))、螺杆菌(Helicobacter)(例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))、军团菌(Legionella)(例如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila))、钩端螺旋体(Leptospira)(例如问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans))、李斯特氏菌(Listeria)(例如单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes))、分支杆菌(Mycobacterium)(例如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis))、支原体(Mycoplasma)(例如肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae))、奈瑟氏菌(Neisseria)(例如淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis))、假单胞菌(Pseudomonas)(例如绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、立克次体(Rickettsia)(例如立氏立克次体(Rickettsia rickettsii))、沙门氏菌(Salmonella)(例如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、志贺氏菌(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、葡萄球菌(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus))、链球菌(Streptococcus)(例如无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、密螺旋体(Treponema)(例如梅毒螺旋体(Treponema pallidum))、弧菌(Vibrio)(例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae))以及耶尔森菌(Yersinia)(例如鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis))。在一些实施方案中,所述细菌选自已知对猪的粘液具有强的粘附的特定的大肠杆菌菌株(例如,大肠杆菌ALI84和/或ALI446)。
本发明不限于在检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附的基于ELISA的方法中制备和/或利用细菌的特定方式。在一些实施方案中,在使用细菌前将其灭活(例如,为了保存的目的),并在测试中将其活化。所述方法不限于特定的灭活细菌的方法。灭活细菌的实例包括但不限于,在冷冻细菌、用乙醇悬浮细菌、用戊二醛悬浮细菌、用福尔马林悬浮细菌、用紫外线照射细菌、用二甲基亚砜悬浮细菌以及为了保存而冷却之前加热细菌。所述方法不限于为了测试目的而将灭活的细菌进行活化的特定方式。在一些实施方案中,通过离心技术活化(例如,收获)细菌。
所述方法不限于用乙醇灭活细菌的特定方式。在一些实施方案中,使细菌生长,并在用乙醇灭活(例如,灭活前一天)之前,将其转移到新鲜培养基中(例如,10%接种物)。然后,通过将乙醇直接添加到细菌培养物(例如,至约40%vol/vol的终浓度(例如,20%vol/vol、30%vol/vol、33%vol/vol、35%vol/vol、37%vol/vol、40%vol/vol、42%vol/vol、45%vol/vol、50%vol/vol、60%vol/vol)而将细菌灭活并保存。在一些实施方案中,用乙醇(例如,至约40%vol/vol的终浓度)灭活的细菌保存在约+4℃下(例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃)。在一些实施方案中,通过离心活化(例如,收获)用乙醇(例如,至约40%vol/vol的终浓度)灭活的细菌(例如,保存在约+4℃下)。在一些实施方案中,将细菌悬浮在磷酸缓冲盐溶液中(例如,PBS)(例如,8.0g NaCl、0.2g KCl、1.4g Na2HPO4×2H2O、0.2g KH2PO4,ad.1000ml MilliQ H2O,pH 7.4)。
检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附的方法不限于特定类型的粘液。事实上,本发明可以使用任何类型的粘液。在一些实施方案中,所用的粘液来自猪(例如,猪结肠粘液)(例如,猪的肠粘液(例如,从约一岁的猪的近侧回肠刮出的))。
本发明不限于在检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附的基于ELISA的方法中制备和/或利用粘液样品(例如,来自猪的粘液)的特定方式。在一些实施方案中,用包被缓冲液悬浮粘液样品。所述方法不限于包被缓冲液的特定配置。在一些实施方案中,所述包被缓冲液包含1.6g Na2CO3(干燥的)、2.94g NaHCO3、0.2g叠氮钠、1L H2O,pH 9.6(通过混合所述组分最后为9.7)。
在一些实施方案中,将粘液样品包被在配置用于基于ELISA的测定的平板上(例如,孔)(例如,96孔板)(例如,96孔MaxiSorp平板)。粘液样品不限于包被配置用于基于ELISA的测定的平板的特定方式。在一些实施方案中,在即将测试之前,将粘液样品直接包被在平板上。在一些实施方案中,将粘液样品预先包被在平板上,以允许测试前长期保存。所述方法不局限于用粘液样品(例如,来自猪肠的粘液)预先包被配置用于基于ELISA的测定的平板的特定方法。在一些实施方案中,通过下述方式用粘液样品预先包被配置用于基于ELISA的测定的平板:用粘液样品包被平板,并随后冷冻包被的平板。在一些实施方案中,通过下述方式用粘液样品预先包被配置用于基于ELISA的测定的平板:用粘液样品包被平板,并随后将包被的平板风干。所述方法不限于使预先包被到配置用于基于ELISA的测定的平板上的粘液样品再水合的特定方式。在一些实施方案中,通过使样品暴露于磷酸缓冲盐溶液(例如,PBS)(例如,8.0gNaCl、0.2g KCl、1.4g Na2HPO4×2H2O、0.2g KH2PO4,ad.1000ml MilliQH2O,pH 7.4)而实现再水合。
检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附的方法不限于特定类型的一抗。在一些实施方案中,一抗针对所测试粘膜粘附的细菌。在一些实施方案中,一抗是针对大肠杆菌O和K抗原血清型的HRP偶联多克隆抗体(Acris目录号BP2022HRP)。在一些实施方案中,一抗是针对大肠杆菌O和K抗原血清型的多克隆抗体(Acris目录号BP2022)。在一些实施方案中,一抗是针对大肠杆菌O和K抗原血清型的生物素偶联多克隆抗体(Acris目录号BP1021B)。
检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附的方法不限于特定类型的二抗。在一些实施方案中,二抗是设置用于检测一抗与细菌的结合,所述细菌是与粘液结合的。因此,在一些实施方案中,二抗是针对一抗的。在一些实施方案中,二抗是亲和纯化的兔抗山羊IgG-HRP(Acris目录号R1317HRP)。在一些实施方案中,二抗是亲和纯化的兔抗山羊IgG-AP(Acris目录号R1317AP)。在一些实施方案中,二抗是针对山羊IgG的多克隆FITC偶联抗体(H&L)(Acris目录号R1317F)。在一些实施方案中,二抗是来自亲和素链霉菌(Streptomyces avidinii)的链霉亲和素-碱性磷酸酶(Sigma目录号S2890)。在一些实施方案中,二抗是来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-过氧化物酶(Sigma目录号S5512)。
在一些实施方案中,将一抗和二抗在封闭溶液中稀释。所述方法不限于特定类型的封闭溶液。在一些实施方案中,封闭溶液是乳。在一些实施方案中,封闭溶液是胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中,封闭溶液是牛血清白蛋白(BSA)。
检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附的方法不限于特定类型的液体底物。在一些实施方案中,将液体底物设置为便于在3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)(Sigma目录号T4319)测定中检测一抗和/或二抗的结合。在一些实施方案中,液体底物是慢动力学形式的TMB(后称为慢TMB)(Sigma目录号T0440)。在一些实施方案中,液体底物是超敏感的TMB(后称为超级TBM)(Sigma目录号T4444)。在一些实施方案中,液体底物是对硝基磷酸苯酯(Sigma目录号N7653)。在一些实施方案中,液体底物是2,2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(AzBTS;Sigma目录号A3219)+ABTS微孔增强剂(Sigma目录号AI227)。
检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附的方法不限于用于测定所述粘液的细菌粘附的特定技术。在一些实施方案中,肉眼测定粘液的细菌粘附(例如,利用成像和/或照相)。在一些实施方案中,利用ELISA平板读数仪测定粘液的细菌粘附。在一些实施方案中,用于测定粘液的细菌粘附的技术对例如吸光度、荧光强度、发光、时间分辨荧光和/或荧光平偏振进行检测、测定和定量。
在一些实施方案中,检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附(例如,基于ELISA的方法)的方法用于鉴定能调节粘液的细菌粘附的试剂。在一些实施方案中,本发明的检测、鉴定和/或测定细菌粘附的方法用于产生和/或鉴定优化的(例如第二代、第三代、第四代或第更多代)组合物(例如,表现出的效力(例如,在防止细菌粘附中的效力)强于前代组合物)。所述方法不限于用于鉴定能调节粘液和/或细胞(例如,上皮细胞)的细菌粘附的试剂的特定技术。在一些实施方案中,将粘液和/或细胞(例如,上皮细胞)的细菌粘附的可能的调节剂与细菌样品共同施加到包被了粘液和/或细胞(例如,上皮细胞)(例如,猪的肠粘液和/或上皮细胞)的平板,然后施加一抗和二抗以及液体底物。在一些实施方案中,通过比较在存在和不存在试剂的情况下的细菌粘附来实现所述试剂的调节活性的表征。例如,将能增加粘液和/或细胞(例如,上皮细胞)的细菌粘附的试剂表征为,例如该具体类型的细菌与该具体类型的粘液和/或细胞(例如,上皮细胞)的粘附促进剂。将能降低粘液和/或细胞(例如,上皮细胞)的细菌粘附表征为,例如该具体类型的细菌与该具体类型的粘液和/或细胞(例如,上皮细胞)的粘附抑制剂。所述方法不限于特定类型或种类的可能试剂。在一些实施方案中,所述试剂是,例如天然存在的分子、合成衍生的分子或重组衍生的分子。
在一些实施方案中,所述方法包括预先施加一种或多种已知能调节粘液或上皮细胞的细菌粘附的试剂作为预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施。例如,在一些实施方案中,所述方法包括预先施加一种或多种已知能抑制粘液的细菌粘附的试剂。本发明的方法不限于已知能抑制粘液和/或细胞(例如,上皮细胞)的细菌粘附的任何特定类型的试剂。例如,在一些实施方案中,已知能抑制粘液的细菌粘附的试剂是Bio-Mos(例如,来源于酿酒酵母的细胞壁的甘露糖蛋白),但是本发明不限于此。在一些实施方案中,通过利用本发明的基于ELISA的方法来鉴定已知能抑制粘液的细菌粘附的试剂。在一些实施方案中,所述方法包括共同施加一种或多种已知能增强粘液的细菌粘附的试剂。所述方法不限于已知能增强粘液的细菌粘附的特定类型的试剂。在一些实施方案中,通过利用本发明的基于ELISA的方法来鉴定已知能增强粘液的细菌粘附的试剂。
在一些实施方案中,所述方法包括共同施加一种或多种已知能调节粘液的细菌粘附的试剂。例如,在一些实施方案中,所述方法包括共同施加一种或多种已知能抑制粘液的细菌粘附的试剂。所述方法不限于已知能抑制粘液的细菌粘附的特定类型的试剂。在一些实施方案中,已知能抑制粘液的细菌粘附的试剂是Bio-Mos(例如,来源于酿酒酵母的细胞壁的甘露糖蛋白)。在一些实施方案中,通过利用本发明的基于ELISA的方法来鉴定已知能抑制粘液的细菌粘附的试剂。在一些实施方案中,所述方法包括共同施加一种或多种已知能增强粘液的细菌粘附的试剂。所述方法不限于已知能增强粘液的细菌粘附的特定类型的试剂。在一些实施方案中,通过利用本发明的基于ELISA的方法来鉴定已知能增强粘液的细菌粘附的试剂。
在一些实施方案中,所述方法包括在去除感染性疾病之后后施加一种或多种已知能调节粘液的细菌粘附或上皮细胞的试剂。例如,在一些实施方案中,所述方法包括后施加一种或多种已知能抑制粘液和/或细胞(例如,上皮细胞)的细菌粘附的试剂。所述方法不限于已知能抑制粘液的细菌粘附的特定类型的试剂。在一些实施方案中,已知能抑制粘液的细菌粘附的试剂是Bio-Mos(例如,来源于酿酒酵母的细胞壁的甘露糖蛋白)。在一些实施方案中,通过利用本发明的基于ELISA的方法来鉴定已知能抑制粘液的细菌粘附的试剂。在一些实施方案中,所述方法包括共同施加一种或多种已知能增强粘液的细菌粘附的试剂。所述方法不限于已知能增强粘液的细菌粘附的特定类型的试剂。在一些实施方案中,通过利用本发明的基于ELISA的方法来鉴定已知能增强粘液的细菌粘附的试剂。
在一些实施方案中,本发明的测定用于鉴定和/或表征肠道和/或尿道细菌(,例如,建群于肠道和/或尿道的粘膜表面的细菌)的抗粘附化合物。在一些实施方案中,所鉴定的抗粘附化合物用于预防和/或治疗疾病和/或疾病的病征和/或症状(例如,沙门氏菌病、子宫炎等(例如,动物中的(例如繁殖动物,例如奶牛、母猪等)))。在一些实施方案中,本发明的测定可以在能使用酶标仪(microplate reader)的任何地方进行,包括但不限于实验室(例如,大学实验室、私人实验室、公共实验室或其它类型的实验室)、现场(例如,牧场、农场或该测定使用者的场所)等。在一些实施方案中,测定和/或测定组分是商业销售的,并由最终使用者(例如,测定的购买者)在其自己的实验室中使用(例如,用于检查产品(例如,抗粘附化合物)的效力、性能和/或一致性)。因此,本发明提供的组合物和方法允许测定的使用者在他的场所(例如,在使用抗粘附化合物(例如,BIO-MOS)的场所)进行化合物(例如,抗粘附化合物)的质量表征。在一些实施方案中,收集利用本发明的测定产生的关于抗粘附化合物的信息(例如效力、质量、一致性等)。在一些实施方案中,利用数据库(例如,在线数据库)或邮件收集信息。在一些实施方案中,将所收集的关于抗粘附化合物的信息和/或数据(例如效力、性能、一致性等)用于质量控制程序中。在一些实施方案中,由抗粘附化合物的提供者和/或生产者使用所收集的关于抗粘附化合物的信息和/或数据(例如效力、性能、一致性等)来监测化合物的活性。在一些实施方案中,将所收集的关于抗粘附化合物的信息和/或数据(例如效力、性能、一致性等)与在抗粘附化合物的使用场所收集的动物健康数据(例如,为了提供关于动物表现的信息)一起使用。在一些实施方案中,通过利用本发明的基于ELISA的方法鉴定出的试剂(例如,被鉴定为粘液的细菌粘附的调节剂)的优选物理形式是适于直接加入动物饲料的干燥松散粉末或作为直接给予动物的补充剂。在其它实施方案中,通过利用本发明的基于ELISA的方法鉴定出的试剂(例如,被鉴定为粘液的细菌粘附的调节剂)的优选物理形式是制粒后给予或通过饮用水给予的液体或膏。
可将包含通过利用本发明的基于ELISA的方法鉴定出的试剂(例如,被鉴定为粘液的细菌粘附的调节剂)的本发明组合物添加到牲畜、宠物、鱼以及贝壳动物的任何商购饲料,包括但不限于,全混合日粮(TMR)、草料、粒料、浓缩物、预混合料、副产物、谷类、酒糟、糖蜜、纤维、草料、草、干草、谷仁、叶、粗粉、可溶物以及补充剂。将包含通过利用本发明的基于ELISA的方法鉴定出的试剂(例如,被鉴定为粘液的细菌粘附的调节剂)的本发明组合物直接掺入动物饲料(例如,商购颗粒饲料)。当直接掺入动物饲料时,添加到动物、鱼、或贝壳动物饲料中的包含通过利用本发明的基于ELISA的方法鉴定出的试剂的组合物的量可以为饲料重量的约0.0125%-约0.4%。在一些实施方案中,添加到动物、鱼、贝壳动物饲料中的组合物的量为饲料重量的约0.025%-约0.2%。或者,将本发明组合物作为补充剂直接给予动物(例如,给予的量为约2.5-约20g/动物/天)。本领域技术人员能立刻理解到,根据动物种类、大小以及本发明组合物所添加的饲料类型,给予的组合物的量可以变化。
可以将包含通过利用本发明的基于ELISA的方法鉴定出的试剂(例如,被鉴定为粘液的细菌粘附的调节剂)的本发明组合物给予任何动物,包括但不限于反刍动物和马类。当与饲料混合时或作为补充剂给予时,包含通过利用本发明的基于ELISA的方法鉴定出的试剂(例如,被鉴定为粘液的细菌粘附的调节剂)的本发明组合物能调节(例如,根据所述试剂而增加或降低)动物中粘液的细菌粘附,从而提高性能和健康并降低疾病发生率。
在一些实施方案中,本发明提供了通过给予个体已知能调节(例如抑制、促进)粘液的细菌粘附的试剂来治疗由病原菌引起的病症的方法。在一些实施方案中,所述试剂是通过利用本发明的基于ELISA的方法而鉴定出的。在一些实施方案中,所述病症由炭疽杆菌(Bacillus anthracis)引起(例如皮肤炭疽、肺炭疽、胃肠炭疽),并且在一些实施方案中,所述方法包括共同给予青霉素、强力霉素和/或环丙沙星。在一些实施方案中,所述病症由百日咳博代氏杆菌引起(例如百日咳、继发性细菌性肺炎),并且在一些实施方案中,所述方法包括共同给予大环内酯类抗生素(例如阿奇霉素、红霉素、克拉霉素)。在一些实施方案中,所述病症由博氏疏螺旋体引起(例如莱姆病),并且在一些实施方案中,所述方法包括共同给予头孢菌素、阿莫西林和/或强力霉素。在一些实施方案中,所述病症由布鲁氏病原菌(例如流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌)引起(例如,布鲁氏菌病),并且在一些实施方案中,所述方法包括共同给予强力霉素、链霉素和/或庆大霉素。在一些实施方案中,所述病症由空肠弯曲菌引起(例如,急性肠炎),并且在一些实施方案中,所述方法包括共同给予环丙沙星。在一些实施方案中,所述病症由肺炎衣原体引起(例如,社区获得性呼吸道感染),并且在一些实施方案中,所述方法包括共同给予强力霉素和/或红霉素。在一些实施方案中,所述病症由鹦鹉热衣原体引起(例如,鹦鹉热),并且在一些实施方案中,所述方法包括共同给予四环素、强力霉素和/或红霉素。在一些实施方案中,所述病症由沙眼衣原体引起(例如,非淋菌性尿道炎(NGU)、沙眼、新生儿包涵体结膜炎(ICN)、性病淋巴肉芽肿(LGV)),并且在一些实施方案中,所述方法包括共同给予阿奇霉素、红霉素、四环素和/或强力霉素。在一些实施方案中,所述病症由以下引起:肉毒梭菌(例如,肉毒中毒)、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌(例如,破伤风)、白喉棒状杆菌(例如,白喉)、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、土拉弗朗西斯氏菌(例如,土拉菌病)、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌(例如,军团病)、问号钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特氏菌、麻风分枝杆菌(例如,汉森氏病)、结核分支杆菌(例如,结核病)、肺炎支原体、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、绿脓假单胞菌、立氏立克次体、伤寒沙门氏菌、宋内志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、梅毒螺旋体、霍乱弧菌以及鼠疫耶尔森菌(例如,鼠疫)。
在一些实施方案中,本发明提供了经设置允许使用者实践本发明的方法(例如,检测、鉴定以及测定粘液的细菌粘附的方法)的试剂盒。在一些实施方案中,所述试剂盒包含一种或多种下述组分:粘液样品、包被了粘液样品的平板、细菌、一抗、二抗、液体底物、洗涤溶液、设置用于分析基于ELISA的测定的装置、说明书、已知能降低粘液的细菌粘附的试剂(例如,Bio-Mos)(例如,通过利用本发明的基于ELISA的方法鉴定出的试剂)、已知能增加粘液的细菌粘附的试剂(例如,通过利用本发明的基于ELISA的方法鉴定出的试剂)以及其它治疗剂(例如,抗生素)。
实施例
提供以下实施例是为了展示和进一步说明本发明的某些优选实施方案和方面,并且不应解释为限制本发明的范围。
实施例1.肠物质的细菌粘附的比色ELISA与放射性检测中所用的材料和方法
细菌菌株
选择了两种大肠杆菌菌株进行开发项目:大肠杆菌ALI84和ALI446。前者最初分离自患病的鸟,后者菌株分离自患有腹泻的猪。选择这些菌株是因为他们表现出对猪的粘液的粘附。使细菌在LB培养基中生长,并在实验前一天将其转移到新鲜培养基(培养物∶培养基为1∶10)。根据培养时间估计细菌数。
抗体
抗体购自Acris Antibodies GmbH,Germany和Sigma Aldrich,Germany。一抗包括:针对大肠杆菌O和K抗原血清型的HRP偶联多克隆抗体(Acris目录号BP2022HRP);针对大肠杆菌O和K抗原血清型的多克隆抗体(Acris目录号BP2022);以及针对大肠杆菌O和K抗原血清型的生物素偶联多克隆抗体(Acris目录号BP1021B)。
二抗包括:亲和纯化的兔抗山羊IgG-HRP(Acris目录号R1317HRP);亲和纯化的兔抗山羊IgG-AP(Acris目录号R1317AP);针对山羊IgG的多克隆FITC偶联抗体(H&L)(Acris目录号R1317F);来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-碱性磷酸酶(Sigma目录号S2890);来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-过氧化物酶(Sigma目录号S5512)。从Sigma-Aldrich,Germany购买即用溶液形式的ELISA底物:3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)(Sigma目录号T4319);慢动力学形式的TMB(后称为慢TMB)(Sigma目录号T0440);超敏感的TMB(后称为超级TBM)(Sigma目录号T4444);对硝基磷酸苯酯(Sigma目录号N7653);2,2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(AzBTS;Sigma目录号A3219)+ABTS微孔增强剂(Sigma目录号AI227)。
缓冲液
起初,使用HEPES-Hanks缓冲液(pH 7.4)来洗涤孔,但是在最后洗涤中,使用PBS以避免红色HEPES-Hanks在ELISA中的干扰。在一些实施方案中,在所用步骤中使用PBS(磷酸盐缓冲盐溶液,pH 7.4)来替代HEPES-Hanks缓冲液。
平板
对于ELISA实验,使用96孔免疫平板(MaxiSorp,Nunc,Denmark,本报道后文称为“Maxisorp平板”)。对于闪烁实验,在闪烁计数中使用聚乙烯对苯二甲酸酯微量滴定板(96孔PET样品平板,1450-401;Wallac Oy,Turku;本文称为“软平板”)。
下文所述的常规放射性结合/附着测定用作比色ELISA的对照。
用于放射性附着测定的细菌放射性标记
使细菌在+37℃下过夜生长,将细菌悬液以1∶10稀释到新批次的LB中,添加甲基-1,-2,3H胸苷(117 I-1Ci/mmol;Amersham)。使细菌在+37℃下孵育2小时,并通过3000g下离心5分钟来收集细菌。将细菌沉淀重悬于HEPES-Hanks缓冲液或PBS中,并用于附着测定中。
放射性附着测定
将200μl稀释的细菌悬液添加到微量滴定孔中,并使平板在+37℃下孵育1小时。通过用300μl HEPES-Hanks缓冲液或PBS洗涤3次来去除未结合的细胞。添加250μl闪烁液,并用闪烁计数仪测定放射性。
粘液分离和固定
用不同浓度的来自不同动物的粘液包被平板。除非另外指出,否则使用来自1岁的猪的近侧回肠的粘液。从肠表面刮出粘液并进行洗涤。将粗制粘液取出物保存在-80℃下,直至使用。对于包被,利用碳酸钠缓冲液(包被缓冲液,pH 9.6)将粘液的蛋白浓度调整为0.0-0.2mg/ml,并测试细菌粘附的最佳粘液浓度。通过将300μl或200μl粘液导入每个350μl孔而将粘液溶液固定在平板上。然后,使平板在+4℃下过夜孵育。通过用300μl HEPES-Hanks缓冲液或PBS洗涤两次来从微量滴定孔去除多余的粘液。
用ELISA底物测试大肠杆菌的非特异性显色中所用的微量离心法
将大肠杆菌新鲜培养物(约108个细菌/ml)分到微量离心管中(约107/管)。将管以3000g离心5分钟,去除上清。将细菌悬浮于700μl ELISA底物中。5分钟后,用分光光度计读取370、405和630nm下的悬液吸光度,然后每15分钟进行读取,直到3小时。
测试一抗特异性中所用的FITC方法
利用荧光显微镜测试一抗(多克隆抗大肠杆菌,BP2022,与FITC偶联二抗相容)的特异性。将108个细菌导入每个微量离心管,并用1ml PBS洗涤3次(并且在洗涤间隔以3000g离心5分钟)。将以1∶100、1∶500、1∶1000稀释于1%BSA/PBS中的一抗导入每个管,并在室温下孵育45分钟。1%BSA/PBS被用作阴性对照。将细菌用PBS洗涤3次,并导入以1∶100、1∶500以及1∶1000稀释于1%BSA/PBS中的二抗(FITC偶联兔抗山羊IgG)。将管在室温下孵育1小时。将细菌用PBS洗涤2次,并用孔径为0.2μm的Whatman BLACK NUCLEPORE膜进行过滤。将滤器用PBS洗涤2次,转移到显微镜载玻片,并用一滴浸油封片。将载玻片保持避光。
基本ELISA流程
下文描述基本流程,但是每个实验中确切的条件在下文描述结果的文中进行描述。将悬浮于缓冲液中的0-107个细菌导入包被粘液的孔中。除非另外指出,否则使用0.1mg/ml的粘液浓度和107个细菌/孔。在一些实验中,将Bio-Mos(Alltech,Nicholasville,KY)与按下述浓度稀释于PBS中的细菌一起添加。
使平板在+37℃或室温下孵育1小时。将平板用缓冲液(PBS或HEPES-Hanks,300μl)洗涤3次。用配制于PBS中的乳、胎牛血清或BSA(牛血清白蛋白)封闭非特异性结合。使平板在+37℃或室温下孵育1小时。去除封闭缓冲液,并导入稀释度为1∶200-1∶100,000的一抗。将抗体在封闭缓冲液中稀释。再使平板在+37℃或室温下孵育1小时,并用PBS或HEPES-Hanks洗涤3次。添加以1∶1000-1∶100000稀释于封闭缓冲液的二抗。使平板在+37℃或室温下孵育1小时。最后孵育之后,用PBS(300μl/孔)将平板洗涤5次以确保完全去除所有游离的二抗。添加底物,并用ELISA读数仪对平板进行读数和/或照相。
实施例2肠粘液浓度
为了鉴定包被悬浮液中粘液的浓度,用具有不同粘液浓度的悬液包被孔。鉴定粘液浓度这一变量对测定可靠性非常重要(例如,如果粘液浓度太低,则细菌可能与平板结合,而不是与粘液结合)。基本方法:放射性附着测定(参见上文中的材料和方法)。平板:96孔PET平板(软平板);粘液:猪近侧回肠,0.0-0.2mg蛋白/ml包被缓冲液;细菌:一块平板上为大肠杆菌菌株ALI84,另一块平板上为大肠杆菌菌株ALI446;107个细菌/孔。缓冲液:HEPES-Hanks;封闭:未封闭;一抗:无;二抗:无;孵育温度:+37℃。通过放射性标记的细菌所测定的粘液浓度对大肠杆菌ALI84和ALI446的影响如图1所示。
图1表明细菌在没有粘液的情况下表现出对孔的最佳粘附。为了证实细菌附着于粘液而不是平板,鉴定并选择相对高的粘液浓度(0.1mg蛋白/ml包被缓冲液)用于后续实验。因此,在一些实施方案中,本发明采用合适的包被孔的粘液浓度(例如,减少和/或消除细菌与平板孔结合的量)。
实施例3一抗对细菌粘附的抑制效应的分析
为了测试一抗是否影响细菌粘附,将包被粘液的孔中的细菌与抗体一起孵育,抗体稀释度从没有抗体至1∶200。基本方法:放射性附着测定(参见材料和方法)。平板:96孔PET平板(软平板);粘液:猪近侧回肠;细菌:一块平板上为大肠杆菌菌株ALI84,另一块平板上为大肠杆菌菌株ALI446。107个细菌/孔;缓冲液:HEPES-Hanks;封闭:未封闭;一抗:HRP=HRP偶联抗大肠杆菌;BP2022=非偶联抗大肠杆菌,生物素=生物素偶联抗大肠杆菌;二抗:无二抗;孵育温度:+37℃。
如图2和3所示,前两种不同的一抗在最低浓度下(以1∶20000稀释)增强细菌对粘液的粘附,但是在1∶200稀释度下轻微减少粘附。可能的原因是,这两种一抗的Fc区是自由地附着粘液,而该区与粘液的结合被第三种抗体的生物素所阻断。在低浓度下,这两种一抗可以发挥作用来使细菌和粘液相联(Fab区结合细菌,Fc区结合粘液)。在较高浓度下,(稀释度1∶200),细菌与粘液的结合减少,因为抗体明显封闭了细菌表面上的粘液结合位点(或粘液上的细菌结合位点)。生物素偶联抗体具有很小的影响;其似乎增强粘附。此外,在本实验中,一抗与细菌一起添加,但是在本文所述的比色附着ELISA方法中,首先单独孵育细菌1小时。因此,在一些实施方案中,当细菌已附着粘液(例如,在不存在抗体的情况下)时,抗体对细菌粘附/结合的影响(例如,抗体实际增加或降低细菌粘附)降低和/或消除。同样,在一些实施方案中,可以使用胎牛血清或其它封闭试剂来封闭非特异性结合。因此,在一些实施方案中,本发明认为,在常规放射性附着测定中,HRP偶联一抗和非偶联一抗能改变(例如,增强或抑制)细菌对粘液的粘附,并且本发明的比色测定不会遭遇这种改变。此外,因为所有受试抗体似乎都适合于本文所述的方法,所以本发明还认为,本发明的结合/附着测定适合于多种抗体(例如,非偶联抗体和偶联抗体)。
实施例4 大肠杆菌与ELISA底物的非特异性显色
测试了两种选定的大肠杆菌菌株与ELISA底物产生非特异性颜色反应的能力。在微量离心管中进行实验,将细菌与底物一起孵育。采用微量离心法(参见实施例1的材料和方法)。
如图4和5所示,细菌产生的颜色很小,并且与仅底物的显色相似。在约5-30分钟的时间段中,没有底物产生显著的颜色反应。因此,在一些实施方案中,本发明认为,本文所述的每种ELISA底物都适用于本发明的粘附/附着测定。
实施例5 粘液与ELISA底物的非特异性显色
测试了来自1岁的猪的5个粘液样品与ELISA底物产生非特异性颜色反应的能力。按照实施例1的材料和方法中所述进行ELISA。平板:软平板;粘液:猪的近侧回肠、中段和远侧回肠以及近侧和远侧结肠;细菌:无细菌;抗体:无抗体;缓冲液:PBS;封闭:1%BSA/PBS封闭1小时;孵育温度:+37℃;底物:所有6种底物如图6所示。
如图6所示,来自猪的回肠的粘液与对硝基磷酸苯酯(pNPP)产生颜色反应,但是来自结肠的粘液不会与对硝基磷酸苯酯(pNPP)产生颜色反应。其它底物不与粘液发生反应。pNPP的颜色产生可能是由于回肠粘液中存在的固有磷酸酶。因此,本发明认为,在一些实施方案中,来自猪的回肠的粘液与对硝基磷酸苯酯(pNPP)产生颜色反应,但是来自结肠的粘液不会与对硝基磷酸苯酯(pNPP)产生颜色反应。其它底物不与粘液发生反应。
实施例6 一抗特异性测试
利用荧光显微镜测试一抗特异性。简而言之,用BSA封闭细菌,首先与一抗孵育,然后与FITC偶联二抗孵育。利用荧光显微镜显示荧光。利用实施例1的材料和方法中所述的FITC方法。
所有添加二抗的样品表现出一些荧光,即使不存在一抗,并且二抗的浓度产生样品之间最显著的差异。因此,本发明认为,在一些实施方案中,利用胎牛血清(FBS)和/或牛血清白蛋白(BSA)能减弱和/或抑制非特异性结合。
实施例7 抗体与粘液或平板的非特异性结合
为了测试抗体是否与无细菌的平板或粘液非特异性地结合,将一抗和二抗添加到包被粘液的平板中。利用实施例1中所述的ELISA方法。使用BSA来封闭非特异性结合。平板:MaxiSorp平板;粘液:猪近侧回肠;细菌:无细菌;封闭:配制于PBS中的1%BSA;缓冲液:PBS;一抗:参见表1;200μl的不同稀释液,该稀释液稀释在配制于PBS中的1%BSA中;二抗:参见表1;200μl的不同稀释液,该稀释液稀释在配制于PBS中的1%BSA中;孵育温度:+37℃;底物:TMB(对于HRP偶联二抗),pNPP(对于AP偶联二抗)。图7和8分别显示了测试抗体与粘液或平板的非特异性结合的平板安排以及非特异性结合的结果。在该实验中未使用细菌。因此,在一些实施方案中,本发明提供抗体与粘液或平板的强的非特异性结合。在一些实施方案中,BSA不是本发明附着测定的合适的封闭试剂。
实施例8 测试封闭试剂以防止抗体的非特异性结合
在不添加任何细菌或一抗的情况下,二抗与粘液/平板强力结合(参见图8)。因此,测试了乳和胎牛血清代替BSA用于封闭非特异性结合。利用实施例1中所述的基本ELISA方法。平板:MaxiSorp平板;粘液:猪近侧回肠;封闭:利用配制于PBS中的5%脱脂乳粉或配制于PBS中的10%胎牛血清在+37℃下封闭1小时;缓冲液:PBS;一抗:参见表2;200μl的配制于封闭缓冲液中的不同稀释液;二抗:参见表2;200μl的配制于封闭缓冲液中的不同稀释液;按照厂商推荐,以1∶1000和1∶10000的稀释度使用链霉亲和素偶联二抗。孵育温度:+37℃;底物:TMB。图9显示了该测定的平板安排。一抗:HRP=HRP偶联一抗,BP2022=非偶联多克隆抗大肠杆菌一抗;生物素=生物素偶联抗大肠杆菌一抗。二抗:HRP=HRP偶联IgG;StrHRP=HRP标记的链霉亲和素。在该实验中未使用细菌。
如图10所示,胎牛血清封闭非特异性结合的效率高于乳。对于生物素-链霉亲和素-复合物的非特异性结合最小,且对于BP2022一抗的非特异性结合最强。根据本实验,选择配制于PBS中的10%胎牛血清用于实验中的封闭。因此,本发明认为,配制于PBS中的10%胎牛血清是本发明附着测定的合适的封闭试剂。
实施例9 细菌与包被粘液的平板的结合
整个ELISA流程(包括粘液和细菌)的优化起始于抗体稀释度和每孔细菌数的优化。利用实施例1中所述的基本ELISA方法。平板:MaxiSorp平板;粘液:猪近侧回肠;细菌:大肠杆菌菌株ALI84和ALI446,每孔细菌数在图11中标明。缓冲液:HEPES-Hanks/PBS;封闭:配制于PBS中的10%胎牛血清;一抗:200μl的配制于封闭缓冲液中的不同稀释液(图11和13);二抗:200μl的配制于封闭缓冲液中的不同稀释液(图13);孵育温度:+37℃;底物:TMB。
如图12和14所示,生物素-链霉亲和素复合物比HRP偶联一抗的特异性更强。未观察到非特异性结合(参见图14,对照,分开的两排)。这证实了实施例8中获得的结果。
因此,决定仅继续使用生物素-链霉亲和素组合。图14表明1∶1000的稀释度能在甚至更少量的细菌上产生反应,并因此选择该稀释度进行其它实验。还优化了一抗的稀释度。图14表明1∶10,000是过于小的二抗(链霉亲和素-HRP)稀释度而不能用于检测少量的细菌(因此,在一些实施方案中,利用1∶1000的稀释度)。
生物素-链霉亲和素组合比其它抗体的特异性更强,并且用于后续实验。因此,本发明认为,在一些实施方案中,107个细菌/孔是用于本发明的附着测定的最佳细菌数,但是也可以使用更多(例如大于107个细菌/孔(例如,108个细菌、109个细菌、1010个细菌或更多))或更少(例如,少于107个细菌/孔(例如106个细菌、105个细菌、104个细菌或更少))的细菌数。1∶1000-1∶10 000的一抗稀释度在本实验中是最佳的,但是一抗的量可以高于或低于该范围。在一些实施方案中,所选的一抗的量不能限制颜色反应。
实施例10 检测细菌数中ELISA的线性
为了估计ELISA方法的线性范围,利用不同的每孔细菌数进行ELISA。利用实施例1中所述的基本ELISA方法。平板:MaxiSorp平板;粘液:猪近侧回肠;细菌:大肠杆菌菌株ALI84,107个细菌/孔;缓冲液:PBS;Bio-Mos:无;封闭:10%胎牛血清;一抗:生物素偶联一抗,以1∶1000稀释于封闭缓冲液;二抗:HRP偶联链霉亲和素,以1∶1000稀释于封闭缓冲液;孵育温度:一个平板为+37℃下,另一平板在室温下;试剂在室温下;底物:TMB。
将620nm处的吸光度相对于细菌数进行绘图。对于高达106个细菌/孔的细菌计数,关系是线性的(参见图16),但是从106至108,最接近的拟合趋势线是对数的(参见图15)。因此,本发明认为,在一定的每孔细菌数下,粘液与细菌结合的能力下降,因为结合位点变为饱和。
因此,在一些实施方案中,本发明的测定在一定范围的每孔细菌细胞数内是线性的(例如,从0至约106个细菌/孔)。在一些实施方案中,本发明提供了附着于每个孔的细菌的高度敏感计算。在一些实施方案中,本发明的方法是标准化的(例如,为了实现可重复的、可比较的结果)。
实施例11 Bio-Mos对细菌粘附的作用
为了测试ELISA方法的线性和分辨度,使用不同浓度的Bio-Mos来阻断细菌细胞对粘液的粘附。将利用实施例1中所述的基本比色ELISA的结果与利用也在实施例1中所述的放射性附着测定获得的结果进行比较。平板:MaxiSorp平板和软平板;粘液:猪近侧回肠;细菌:大肠杆菌菌株ALI84和ALI446,约107个细菌/孔。将相同的放射性标记的细菌的悬液用于两种平板,从而确保平板是相同的;缓冲液:HEPES-Hanks,PBS;Bio-Mos:浓度0-20g/L,稀释于PBS中;封闭(仅MaxiSorp平板):配制于PBS中的10%胎牛血清;一抗(仅MaxiSorp平板):生物素偶联一抗(1∶1000配制于封闭缓冲液);二抗(仅MaxiSorp平板):HRP偶联链霉亲和素(1∶1000配制于封闭缓冲液);孵育温度:+37℃;底物:TMB。
如图17A和17B所示,当使用不同浓度的Bio-Mos时,放射性测定检测到细菌粘附的差异。进行ELISA后,用闪烁计数测定两种平板(5分钟/孔)。图17B表明闪烁计数在进行ELISA之后较低,这提示细菌在ELISA过程中被洗掉。尽管如此,还是观察到Bio-Mos的明确影响。
鉴定出了比色ELISA方法的未预期的特征,即,其能检测出无细菌(对照)的孔和Bio-Mos浓度最大的孔(细菌数最小)之间的附着差异(参见图17A),而Bio-Mos浓度最大的孔的闪烁计数接近于无细菌的对照(图15)。因此,在一些实施方案中,本发明提供了能检测出Bio-Mos浓度最大的孔(细菌细胞数最小)和无细菌(对照)的孔之间的附着/粘附差异的ELISA方法,(例如,在该浓度范围内,比色测定比放射性测定的敏感性高得多)。
实施例12.细菌数对于检测附着改变效应是重要的
本实验的目的是确定用于检测Bio-Mos效果的每孔细菌数。基本方法:ELISA(参见材料和方法);平板:MaxiSorp平板;粘液:猪近侧回肠;细菌:大肠杆菌菌株ALI84和ALI446,0-108/孔;Bio-Mos:浓度为0-20g/L,稀释于PBS中;缓冲液:PBS;封闭:10%胎牛血清;一抗:生物素偶联一抗,1∶1000稀释于封闭缓冲液;二抗:HRP偶联链霉亲和素,1∶1000稀释于封闭缓冲液;孵育温度:+37℃;底物:TMB。
如图18-19所示,我们确定,在一些实施方案中,为了产生可检测的差异,每孔细菌数应当超过105。当使用107个细菌/孔时,能观察到明显的差异。108个细菌/孔也产生明显的差异,但是反应很快就达到终点,并因此会造成变异,因为不可能将底物同时添加到所有孔中。还可能的原因是,在非常高的每孔细菌数下,抗体或底物浓度或粘液结合位点变得有限。因此,使用约107个细菌/孔进行后续试验。对于两种大肠杆菌菌株,非常低浓度的Bio-Mos似乎能增强细菌对粘液的附着。因此,在一些实施方案中,本发明的测定发现,相对低水平的(例如,约0.1至约1.0g/L)的抑制剂(例如,Bio-Mos)去除细菌的效率高于更大量的抑制剂。
实施例13 改进的洗涤方法
直至现在,Nunc免疫洗涤装置被用于洗涤步骤,但是由于重复孔间存在相当大的变异,因此认为该方法是是不够精准的方法。因此,为了最小化样品间的变异,测试了不同的洗涤方法。新的方法是基于摇去液体。基本方法:ELISA(参见材料和方法);平板:MaxiSorp平板;粘液:肉鸡十二指肠;细菌:大肠杆菌菌株ALI84,107个细菌/孔;缓冲液:PBS;Bio-Mos:浓度为0、0.1、1和10,与细菌一起添加;封闭:10%胎牛血清;一抗:生物素偶联一抗,1∶1000配制于封闭缓冲液;二抗:HRP偶联链霉亲和素,1∶1000配制于封闭缓冲液;孵育温度:+37℃;底物:TMB。
如图20所示,新的洗涤方法(“摇动洗涤”)为ELISA方法提供了优异的结果。总的信号更好,并且在不同Bio-Mos浓度之间检测出更大的差异。而且,新的方法更快,并且允许同时处理数个平板。然而,重要的是,在能避免混合孔的内容物的条件下进行本方法。因此,本发明提供了优于常规洗涤方法的新的摇动洗涤法。在摇动洗涤法中,用移液管将洗涤缓冲液添加到孔中,然后轻轻颠倒摇动平板来使孔排空,而不会使溶液从一个孔转移到另一个孔。视需要将其重复多次。
实施例14 一抗浓度
直至现在,1∶1000的一抗稀释度被常规用于放射性测定中,从而确保抗体浓度不会限制ELISA的敏感性。因此,如果本发明的测定意图用于大规模环境,则抗体稀释度可能在测定的设置中起重要作用。测试了一抗稀释度来确定测定的设置大规模进行的可行性。利用实施例1中所述的基本ELISA;平板:MaxiSorp平板;粘液:猪近侧回肠;Bio-Mos:浓度0、5和10g/L,稀释于PBS;细菌:大肠杆菌菌株ALI84,约107个细菌/孔;封闭:配制于PBS中的10%胎牛血清;一抗:200μl的生物素偶联一抗(以1∶1000-1∶10000配制于封闭缓冲液);二抗:200μl的HRP偶联链霉亲和素(1∶1000配制于封闭缓冲液);孵育温度:室温;底物:TMB。
1∶1000的稀释度提供了Bio-Mos水平之间的良好分辨度,但是更小的稀释度也能良好工作。因此,在一些实施方案中,使用1∶1000或更小的(例如1∶900、1∶750、1∶500或更小)的稀释度来提供本发明测定中可辨别的分辨度差异。因此,在一些实施方案中,所选的一抗稀释度能使测定中受试细菌上所有结合位点饱和。在一些实施方案中,如果本发明的测定用于检测非常少量的附着抑制剂(例如,Bio-Mos)(例如,约0.0001g/L-约1.0g/L的浓度)的作用,可以使用更小的一抗稀释度(例如1∶750、1∶500或更小(例如,为了确保抗体浓度不限制显色)。或者,在一些实施方案中,减少每孔细菌数来增加颜色形成。
实施例15 测定反应体积
使用最大的细菌数时,孔中的比色信号非常快速地显色。因此,测定了更小的粘液区域(例如,能结合更少的细菌(例如,从而降低信号强度))是否能降低信号强度。还测定了是否可能通过减小填充包被的孔所需的体积来减少试剂的量。具有较小的粘液区域的孔能良好地工作,并且每孔细菌的检测限与前述实施例中获得的结果相似。显色速度比前述实施例中的更慢。因此,本发明认为,在一些实施方案中,单个孔中粘液的体积可以为约200μl-约300μl(例如,根据所需信号的强度)。在一些实施方案中,粘液的体积可以少于200μl(例如150μl、100μl或更少)或多于300μl(例如350μl、400μl或更多)。在一些实施方案中,本发明认为,较小的粘液包被体积允许使用较少的试剂(例如,与含有300μl粘液的孔所需的试剂量相比,约一半的试剂量对于具有200μl粘液的孔就是足够的),而不会损失测定敏感性和功能(例如,可检测的信号)。因此,本发明提供能保持测定的敏感性和功能且同时能减少试剂消耗相关费用的方法和测定。
实施例16 粘液来源
在之前进行的实验中(例如,实施例1-15),使用猪近侧回肠粘液。为了确定比色检测是否能用于其它粘液来源,在实施例1所述的ELISA测定的设定下,测试了多种其它粘液来源(例如猪近侧回肠、猪远侧结肠、肉鸡十二指肠和肉鸡盲肠)。平板:MaxiSorp平板;粘液:猪近侧回肠和远侧结肠、肉鸡十二指肠和盲肠;细菌:大肠杆菌菌株ALI84,107个细菌/孔;缓冲液:PBS;Bio-Mos:浓度为0、0.1、1和10,与细菌一起添加;封闭:10%胎牛血清;一抗:生物素偶联一抗,1∶1000稀释于封闭缓冲液;二抗:HRP偶联链霉亲和素,1∶1000稀释于封闭缓冲液;孵育温度:+37℃;底物:TMB。
如图21所示,根据所用粘液类型的不同,细菌表现出不同水平的附着(例如,强度和/或亲和力)。例如,受试细菌对获自肉鸡十二指肠和肉鸡盲肠的粘液所表现出的附着几乎大于对获自猪回肠和猪结肠的粘液的附着的两倍。然而,比色测定足够敏感和稳定而能捕捉到不同水平的细菌粘附以及封闭试剂(例如,Bio-Mos)在一定范围的封闭试剂浓度下抑制粘液的细菌粘附的能力。因此,在一些实施方案中,本发明提供了可用于不同类型和/或来源的粘液(例如,来自不同动物和来自消化道的不同部分(例如,肠))的非放射性比色结合测定。
实施例17 放射性测定与比色测定的比较
进行同步实验来比较本发明的比色测定中所用的材料和方法与常规放射性测定中使用的材料和方法,以及评价每种测定检测Bio-Mos引起的细菌粘附的差异的能力。平板:MaxiSorp平板和软平板;粘液:猪近侧回肠;Bio-Mos:50μl/孔,不同浓度,稀释于PBS;细菌:约107个细菌/孔。将相同的放射性标记的细菌的悬液用于两种平板,从而确保平板是相同的;封闭(仅MaxiSorp平板):配制于PBS中的10%胎牛血清;一抗(仅MaxiSorp平板):100μl生物素偶联一抗(1∶1000配制于封闭缓冲液);二抗(仅MaxiSorp平板):HRP偶联链霉亲和素(1∶1000配制于封闭缓冲液);孵育温度:室温;底物:TMB;ELISA之后,用闪烁液填充两种平板,并用闪烁计数测定放射性。
使用两种测定的材料和方法,观察到的Bio-Mos的效果非常相似。低浓度的Bio-Mos似乎能增强细菌对粘液的附着。虽然机制对于实施本发明不是必需的并且本发明不限于任何特定的作用机制,但是在一些实施方案中,在最低浓度下,Bio-Mos或其它类型的抑制剂参与细菌聚集体的形成。因此,即使通过测定进行测量时,最低的浓度能增加附着,也可能(例如,对于肠腔)聚集体更易于被从肠中洗掉。因此,低的Bio-Mos或其它抑制剂(例如,通过本文所示的本发明方法鉴定和/或表征的)的浓度可能实际上比较高浓度更有效地和/或同样有效地去除细菌。
如图22所示,在非常低的Bio-Mos浓度下,两种方法的吸光度有一定不同。ELISA线的趋势在非常早的时间点(=低吸光度)是相似的,因此从1.0g/L至0.1g/L的下降趋势不太可能是由于ELISA读数仪的能力的限制。可能的情况是,显色可能会受抗体或底物浓度的限制,但是该假设无法解释从1.0g/L至0.1g/L的轻微下降趋势。
这些结果和其它实施例的结果表明,用0.1g/L或1.0g/L时获得最高的吸光度。因此,本发明认为,在一些实施方案中,变异是由实验之间细菌数的差异造成的。因此,在一些实施方案中,为了可比较的结果,可以使用相同细菌悬液或将培养方法标准化来确保初始细菌数在平行实验中是相似的。因此,在一些实施方案中,减少每孔细菌数可以确保Bio-Mos和/或其它封闭试剂(例如,测试试剂)的浓度是最具限制性的因素,而不是粘液结合位点的数量或抗体或底物浓度。
实施例18 非放射性细菌结合测定
为了进一步测试本文提供的比色ELISA在测定病原体附着中的应用以及评价测试试剂对附着的改变程度,在本发明实施方案的开发过程中进行了实验。因此,进行实验来确定所述测定是否能用于筛选可以或不可以改变(例如,抑制)粘液的细菌附着的测试试剂。因此,进行实验来确定所述测定是否能用于筛选可以或不可以改变(例如,抑制)粘液的细菌附着的测试试剂。简而言之,本发明提供了利用放射性的活病原体的备选方案(例如,本发明的测定不需要使用活的或放射性的细菌(例如,本发明认为,乙醇灭活的细菌可用于附着测定中)),并且还提供了风干的包被粘液的平板。因此,在本发明实施方案的开发过程中产生的方法提供了超过常规方法的显著优势,其在于,在一些实施方案中,本文提供的方法消除了使用活的和/或放射性细菌(例如,病原菌)的需要,并且还消除了每次进行测定时调整细菌密度的需要。
细菌制备物的保存和均一性
如实施例9、10和12所述,附着测定中所用的细菌制备物的密度被确定为反应中的重要变量。在低细菌密度时,信号弱,而在高细菌密度时,信号高出线性范围。根据这些数据确定了,对于连续测定的准确性、敏感性和可比性,需要固定的细菌密度。还确定了标准的细菌悬液(例如,用于不同时进行的一系列测定(例如,在不同天,或在不同周或月中))是否能得到(例如,易于保存、使用以及无致病性)。鉴定并测试了多种细菌保存和灭活方法,包括利用化学固定剂的保存和灭活(例如乙醇、戊二醛、福尔马林、DMSO)、利用UV照射的灭活以及利用冷冻的活细菌悬液。
包被粘液的平板的保存
在前述测定中(例如,实施例1-15),每次进行测定时,用粘液包被96孔板。正如所述,该步骤需要过夜孵育。因此,进行实验来确定是否能替换该耗时过程(例如,用预先包被的,可长期保存的包被粘液的平板来替换)。测试了多种方法,包括冷冻包被的平板以及将平板风干和使用长期保存(例如,用不同的粘液类型)。
方法细菌的培养和灭活
使细菌在37℃下、在Luria培养基中生长,并在预期测试前一天将细菌转移到新鲜培养基中(10%接种物)。测试了多种灭活或保存的细菌不同方法:
冷冻:将生长的细菌培养物在-20℃下冷冻。使用前,将培养物在室温下解冻。利用甘油来冷冻一批细菌以保护细胞免于冷冻时的损伤,但是该方法被中断了,这是因为从甘油中收集细菌会有问题并且产生无用的结果。
乙醇:按照1∶1将99%乙醇添加到Luria培养基中的细菌培养物,从而得到50%乙醇溶液。将悬液在4℃下保存。
戊二醛:以4%的终浓度使用戊二醛。将悬液在4℃下保存。
福尔马林:以4%的终浓度使用甲醛。将悬液在4℃下保存。
UV:将培养物在UV灯下照射30或60分钟。将悬液在4℃下保存。
二甲基亚砜:将DMSO以10%的浓度添加到培养物中。将悬液在4℃下保存。
加热:将培养物在70℃下加热30分钟,然后在4℃下保存。
在即将使用前,通过离心收集细菌。
制备和保存包被粘液的平板
将从小猪的肠刮出的粘液稀释于NaCO3缓冲液(pH 9.6)中,得到0.1-0.3mg粘液蛋白/ml的悬液。将300μl该悬液导入96孔IgA平板的每个孔。将平板在4℃下孵育过夜。
在风干中,将平板用PBS洗涤两次,并在层流柜中过夜干燥。将平板在塑料袋中室温下保存。使用前,将300μl PBS导入每个孔,并允许粘液再水合10分钟,然后通过轻轻颠倒摇动平板来去除PBS。
对于冷冻,将平板与粘液悬液在-20℃下冷冻。使用前,将平板在室温下将解冻,并用PBS洗涤三次。
用粘液过夜包被后,将新鲜的平板用PBS洗涤三次。
结果
利用放射性测定初步筛选细菌保存方法
与利用新鲜细菌的测定相比,三种利用保存的细菌的方法似乎令人满意(参见图23)。这三种方法是乙醇、UV照射和冷冻(其它方法被鉴定为不适合该测定)。UV和DMSO灭活的细菌的数据未在图23中显示,因为使用的是不同的细菌悬液。DMSO灭活显著抑制细菌粘附,而测试细菌的UV照射产生相对好的粘附结果。
除绝对粘附之外,还表征了本方法检测测试试剂对附着的抑制效果的能力。除DMSO和UV照射之外的细菌保存方法的结果显示于图23中。无论选择哪种方法,该测定均能表明Bio-Mos抑制大肠杆菌粘附。
利用所选细菌保存方法的ELISA测定
基于这些结果,在ELISA细菌检测体系中测试3种细菌灭活方法。尽管本发明不受限于任何作用机制并且对于作用机制的理解对于实施本发明不是必需的,但是可能的情况是,通过任何上述方法固定细菌会改变细菌的抗原性质,从而导致基于抗体的方法失败,不能检测受调节的细菌。然而,对于受试细菌制备物,ELISA方法似乎能够工作。在细菌灭活方法中,考虑绝对细菌粘附效果时,如图24所示,UV灭活和冷冻优于乙醇保存。然而,当考虑到实用性时,这些方法具有明显缺点:UV灭活的细菌悬液在未开放时是稳定的,但是当暴露于环境微生物时易于被其它细菌破坏。另一方面,冷冻的细菌仍然是活的,并且在解冻后可以开始生长或具有代谢活性。这会影响测定的准确性和再现性。此外,当使用活细菌时必须考虑安全问题。
优化细菌悬液中的乙醇浓度
尽管利用乙醇保存细菌似乎并不理想,但由于该方法能提供其它益处,所以决定继续尝试开发该方法。最初,利用50%浓度的乙醇,这是基于其杀死细菌的能力。然而,也测试了其它乙醇浓度来测定乙醇浓度对细菌粘附的影响。我们确定,乙醇浓度显著影响细菌粘附的效率。尽管本发明不受限于任何作用机制并且对于作用机制的理解对于实施本发明不是必需的,但在一些实施方案中,本发明认为,乙醇分离或破坏结合所必需的菌毛,或改变细菌的其它抗原性质。当考虑粘附效率时,40%浓度的乙醇表现得显著优于50%的乙醇。反复观察到图25中所示的未预料到的非线性趋势。
包被粘液的平板的保存
通过与细菌粘附在新鲜包被的平板上的能力进行比较,测试了细菌粘附在利用风干和冷冻保存的包被粘液的平板上的能力。在利用放射性标记的细菌的测试中,风干的平板与新鲜包被的平板相当,而冷冻的平板得到稍高的计数。利用本发明的非放射性ELISA方法测试了每种方法。
如图26所示,风干的平板产生的信号弱于冷冻保存的平板和新鲜包被的平板。然而,对于所有使用的方法,Bio-Mos对细菌粘附的影响都是明确的。因此,本发明提供了利用事先制备并保存的包被粘液的平板的方法(例如,风干的或冷冻保存的平板)。
干燥的平板的再水合时间
测试了从1分钟至12小时的时间跨度来在进行测定前使风干的平板再水合。我们确定,再水合时间对测定结果无明显影响,但是为了获得可比较的结果,使用恒定(例如,10分钟)再水合时间来进行所有后续测定。
孔中的粘液浓度
虽然之前已经测试过孔中的粘液浓度,但是仍决定测试利用较高的粘液浓度是否能增强细菌粘附。测试了包被缓冲液中的三种粘液水平;所述水平分别对应于0.1mg蛋白/ml、0.2mg蛋白/ml和0.3mg蛋白/ml。当粘液浓度增加时,细菌粘附明显提高,0.3mg蛋白/ml产生最高的粘附。
利用测试试剂(例如,Bio-Mos)检测细菌粘附的改变
根据初期的闪烁和ELISA实验,利用乙醇灭活的细菌和风干的平板来测试测试试剂(例如,Bio-Mos)的作用及其改变细菌对粘液的粘附的能力。所获得的数据表明,得到的曲线与利用新鲜细菌和平板进行ELISA时获得的曲线高度相似。
对其它粘液类型的适用性
利用其它粘液类型测试了ELISA(利用保存的平板和EtOH灭活的细菌)。利用多种类型的粘液,ELISA产生了有用的数据,所述粘液包括猪近侧回肠、猪远侧结肠、肉鸡十二指肠和肉鸡盲肠的粘液。本发明认为,利用保存的平板和EtOH灭活并保存的细菌的ELISA提供了有用的有关数据,并且测试试剂阻断细菌附着/粘附的能力(例如,Bio-Mos)的效果是相似的,无论是什么来源的粘液。因此,本发明提供了可用于监测和表征粘液的细菌细胞附着/粘附的组合物(例如,乙醇灭活的细菌和风干的包被粘液的平板)和方法(例如,非放射性ELISA),所述组合物和方法易于使用、安全并且材料易于保存和运输。
非放射性细菌结合测定的进一步表征
为了确定本文提供的非放射性测定是否是可靠的、可重复的并且变异性最小,在开发本发明的过程中进行了实验。测试了不同批次的细菌和平板之间的变异,并且确定了测定的可重复性(例如,通过在不同天进行(平板间变异)和监测重复样品的平板内变异)。
方法
细菌的培养和灭活
使细菌在37℃下、在Luria培养基中生长,并在乙醇灭活前一天将细菌转移到新鲜培养基中(10%接种物)。通过将乙醇直接添加到过夜生长的培养物中至40%vol/vol的终浓度来灭活和保存细菌。将悬液保存在4℃下,并在即将使用前通过离心收获。将沉淀悬浮在初始体积的Luria培养基中,获得约108个细菌/ml的悬液。
制备和保存包被粘液的平板
将从小猪的肠刮出的粘液稀释于NaCO3缓冲液(pH 9.6)中,得到0.3mg粘液蛋白/ml的悬液。将300μl该悬液导入96孔IgA平板的每个孔。将平板在4℃下孵育过夜。然后,将平板用PBS洗涤两次,在层流柜中过夜干燥,并将平板在塑料袋中于室温下保存。使用前,将300μl PBS导入每个孔,并允许粘液再水合10分钟,然后通过轻轻颠倒摇动平板来去除PBS。
ELISA方法
允许包被粘液的风干的平板与PBS再水合10分钟,然后添加100μl细菌悬液和100μl配制于PBS中的Bio-Mos悬液或100μl纯PBS。处理的样品随机分配到孔中以避免系统误差。使平板在室温下孵育1小时,避光并防止蒸发。孵育后,将平板用PBS洗涤3次,并添加封闭缓冲液(10%胎牛血清)。如上文所述孵育平板,并排空平板。添加一抗,孵育平板,并如上文所述进行洗涤。添加二抗,并如上文所述进行孵育和洗涤。最后,将TMB底物添加到孔中,允许显色15-30分钟。用硫酸终止反应,并测定450nm处的吸光度。
统计学分析
估计了换算值的变异系数,使得对于每个平板,0样品的平均值为100%。然后,利用用于处理间和处理内变异估计的单因素ANOVA的MSEs,计算了这些1级和2级的换算值的平板内和平板间变异系数估值。对不同的Bio-Mos水平,分别进行了上述估计。进行效力分析来提供对需要多少重复样品来检测两个处理之间的差异的估计。利用风险度u=0.05,效力=0.8或0.9。
结果
从相同平板中分析的重复样品所测定的变异
对于产品评估目的,重要的是,当在相同平板中运行数个重复样品时,测定是可重复的,并因此能提供可靠的测试,测试的检测限是已知的并且被认为足以本测定的实施应用。为了该目的,在用同类粘液包被的平板中并利用单一批次的细菌制备物来进行测定。图28表明,孔与孔之间存在一定变异,但是所添加的Bio-Mos的粘附抑制效应是明确并且重复的。与对照孔的比较表明,1mg/ml和2mg/ml的Bio-Mos水平不同于对照,p值<0.0001。然而,如图28所示,所述两个Bio-Mos水平彼此之间无差异。分别计算了每种处理的变异系数。
从4个不同的粘液平板所测定的变异
对于产品评估目的,重要的是,测定是可重复的。为了确定本测定是否是可重复的(例如,在不同时间、利用相同试剂),在不同的4天,将实验重复4次(数据如图28所示)。每组测试是在不同的天和粘液平板上进行的,但用的是单一细菌制备物。结果显示在图29的4幅图中。不同平板内的平均变异对于平板1、2和3分别为14%、14%和13%,对于平板4高达22%。下文的表1显示了对每个平板中每个测试计算的CV。似乎有这样的趋势:对照孔的CV低于Bio-Mos孔的CV。从所有4个测试平板和所有处理计算出的平均CV为16%(表1)。
表1
从4个不同粘液平板所测定的绝对信号的差异
图30显示了图29中的数据,但是以不同的方式安排,为的是突出不同测试中绝对信号的值。相似地处理平板,但处理是独立的。将样品随机分配到孔中,以避免由于诸如孔位置的因素造成的系统误差。值得注意的是,信号的绝对水平在不同天之间是变化的,即使已经试图按照完全相同的方式重复测定的每个步骤。尽管本发明不限于任何作用机制并且对于作用机制的理解不是实施本发明所必需的,但是在一些实施方案中,变异的原因是由于一个或多个步骤,包括:1.粘液结合;2.孔的洗涤;3.细菌结合;4.洗掉自由细菌;5.一抗的结合;6.洗涤;7.二抗的结合;8.显色反应。然而,本发明认为,尽管显色中有一定变异,但变异是有限的,并且不会影响获得有用的数据(例如,关于一种或多种测试试剂改变(例如,抑制)粘液的细菌结合的能力的数据)。
利用相对信号时,平板与平板之间变异的比较
如果并且当相关对照处理与待测试的产品处于同一平板时,平板与平板之间的变异就不是问题。通过将所有对照孔的平均值定为值为1并且将具有受试化合物的孔的值针对所述平均值进行标准化,将所有信号变为相对值。标准化的结果显示在图31中。当以相对信号的形式提供时,观察到所检测到的Bio-Mos效应的量值在所有平板中接近相同。
不同批次的细菌间的变异
为了测试不同批次的细菌和平板间的变异,制备多个独立生长的细菌培养物,并且还制备了多个独立制造的包被粘液的平板。各个批次是完全独立制备的,其中利用不同批次的PBS、Luria培养基,并且从新的冻存珠长出每个培养物。利用每个独立的平板和培养物进行相似的ELISA测定。本实验的结果显示在图32中。
如图32所示,信号的绝对水平在不同实验间是不同的,但是与对照测试的信号相比时,完全独立的研究所产生的数据显示出Bio-Mos对附着的几乎相同的作用(参见图32)。
效力分析
利用实验数据,估计达到预期检测效力所需的重复样品数是可能的。检测效力是表示能提供彼此之间的统计学显著差异的、两种受试化合物或处理的反应之间的差异百分比。图33和下文的表2显示了检测效力和重复样品数之间的关系。
本发明认为,如果比较的是不同批次的测试试剂,则少至5个(或更少)重复样品就足以能得出两种试剂(或其稀释液)是不同的,例如,当产品A抑制50%的粘附,而产品B抑制66%的粘附时,5个重复样品就是足够的。
表2 检测效力的实例
重复样品数 | 检测到的差异 |
5 | 31% |
10 | 22% |
15 | 18% |
基于5%风险水平下的80%效力
实施例19 稳定的功能性细菌制备物和包被粘液的平板的产生
在本发明的实施方案的开发过程中,进行了实验来制备具有下述特征的细菌悬液:菌毛存在和/或保持在能够介导细菌粘附在粘液上的制备的细菌上,其中菌毛非常多并在是结构完整的,从而允许细菌以高亲和力结合和/或粘附粘液;细菌表面抗原保持其免疫学性质,从而允许ELISA中所用的一抗的有效结合以及允许以不改变抗体结合的方式杀伤和/或灭活细菌;和/或以能产生具有长保存期的制备物并允许在ELISA中简单和即刻使用的方式进行细菌制备。
对非放射性细菌结合测定进行改动,包括实施例18的细菌接种物制备。使用侵袭性较低并且更温和的(例如,为了保护菌毛和/或细菌表面抗原(例如,为了抗体结合))双杀方法进行实验。如下文所述,冷冻干燥法利于接种物长期保存。例如,在一些实施方案中,冷冻干燥法允许生产含有精确细菌数的一次性安瓿(例如,与包被粘液的平板在测定中使用(例如,用于试剂盒中))。这些新方法和组合物显著降低了技术人员方面可能发生的错误(例如,在需要测定正确接种物大小时)、降低接种物受污染的风险并且使细菌制备物随时间的变质最小化。冷冻干燥的安瓿在室温下是稳定的,并且可运输(例如,全球性),而不会有丧失功能的风险。
细菌制备方法
使细菌(例如,大肠杆菌F4+(之前为K88)菌株)在37℃下、在LuriaBertani培养基中生长。通过离心收获培养物,将培养物重悬于盐溶液中,并立即进行显微镜计数。通过在65℃下加热45分钟、然后UV照射45分钟来杀死细菌悬浮物。然后,将细菌批次分装到安瓿中并在-80℃下冷冻,每个安瓿含有1×109个细菌细胞。冷冻24小时后,将安瓿冻干并密封。将安瓿在+4℃下保存。通过两种不同的方法确定安瓿中活的大肠杆菌,即,直接接种和使用最大可能数(MPN)。从每批细菌制备5个10倍连续稀释的重复样品,以用于直接接种。使用的培养基是富集的非选择Luria Berthani。37℃下孵育2天后,对菌落进行计数。通过将安瓿内容物直接连续稀释在非选择富集营养培养基中,进行MPN。在3个重复样品中进行MPN(3格MPN)。37℃下孵育2天后,首先记录MPN管中的生长,2周后再次记录。在MPN法中,将细菌安瓿的全部内容物(约109个细胞)悬浮于第一个稀释度最低的管中。因此,在MPN中,单个活细菌应当能被检测出。在平板计数中,将安瓿的内容物悬浮于10ml稀释剂中,取其中的0.1ml铺板。因此,没有生长表示安瓿含有少于100个活的大肠杆菌细胞。测试5个不同批次的细菌制备物(安瓿)的活力。从直接接种和MPN计数两种测试方法获得的结果未显示出有活力的迹象。因此,本发明提供新的双杀方法,该方法提供可重复性高并且高度一致的细菌制备物(例如,如粘液粘附测定中所测定的(参见,例如图34))。
包被粘液的平板的制备和稳定化
在本发明的开发过程中,进行了实验来制备具有下述特征的包被粘液的平板:粘液包被的量在每个平板的孔之间和不同平板之间是相等的;以不会破坏细菌和/或平板上包被的粘液的结合性质的方式来稳定化粘液平板(例如,保护参与结合细菌的粘液表面性质);和/或包被粘液的平板是长期稳定的(例如,室温或更低温度下)(例如,数天、数周、数月、一年或更长),并且随时可用(例如,在ELISA中)。
包被粘液的微量滴定板
通过从远侧小肠(回肠)刮取粘液来从新鲜屠宰的猪获取粘液。通过实施例18中所述的离心来洗涤粘液并使粘液澄清。通过利用购自SIGMA的二喹啉甲酸蛋白测定试剂盒(B9643)进行粘液蛋白的定量。用含有0.1mg粘液蛋白/ml包被缓冲液的粘液缓冲溶液包被Nunc MaxiSorb平板(96孔形式)。在不同天独立地制备各批微量滴定板,并在+4℃下保存,直至测试当天。在这些平板中进行细菌粘附测定(利用和不利用Bio-Mos),从而测试平板与平板之间的变异。平板间的抑制平均值为81.9%,其中各个批次偏离平均值1.5%(参见,例如图35)。
在本发明的开发过程中,进行了其它实验来研究4℃下、真空密封包装中的粘液缓冲溶液中保存1周和2周的粘液平板的稳定性。保存2周后,测试粘液平板来确定它们是否能与细菌制备物用于粘附测定中。结果显示在图36中。测定中的绝对信号显示出强度轻微下降。然而,在之前的研究中,在平板与平板间的变异中也观察到了强度的变异,因此强度的变异可能与平板的保存无关。抗粘附产品Bio-Mos的应用表明:观察到约80%的抑制。因此,本发明提供了制备包被粘液的平板的方法以及所述包被粘液的平板本身,所述平板可以保存并在稍后的时间使用(例如,用于粘附测定)。例如,在一些实施方案中,本发明提供了包被粘液的平板和/或细菌制备物(例如,保存在安瓿中),它们可以单独保存或共同保存(例如,在真空密封的包装中(参见,例如,图37)),其可以成为供商业购买和/或使用(例如,在粘附测定中)。
通过引用将上文说明书中提及的所有出版物和专利并入本文。本发明所述的组合物和方法的各种改动和变化对于本领域技术人员是显而易见的,不会脱离本发明的范围和实质。尽管已经结合具体优选实施方案描述了本发明,但应当理解,不应当将要求保护的本发明过分地局限于这些具体实施方案。事实上,对所描述的实施本发明的方式进行的本领域技术人员显而易见的各种改动也意图包括在本发明的范围内。
Claims (57)
1.试剂盒,包含用于测定粘液和/或上皮细胞的细菌粘附和抗粘附的非放射性酶联免疫吸附测定(ELISA),所述非放射性酶联免疫吸附测定包含:
固相支持体,所述固相支持体上包被了粘液和/或上皮细胞,
包含细菌的样品,
所述细菌的特异性一抗,以及
可检测地标记的二抗,其对于与所述细菌结合的所述一抗是特异性的。
2.如权利要求1所述的试剂盒,还包含能使所述可检测地标记的二抗可视化的底物。
3.如权利要求2所述的试剂盒,其中所述可检测地标记的二抗包含酶标记。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其中所述底物是在所述酶标记的存在下能提供比色信号、荧光信号或化学发光信号的组合物。
5.如权利要求1所述的试剂盒,其中所述可检测地标记的二抗包含与过氧化物酶偶联的猪抗IgG免疫球蛋白。
6.如权利要求4所述的试剂盒,其中所述比色组合物是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。
7.如权利要求1所述的试剂盒,其中所述固相支持体是96孔板。
8.如权利要求1所述的试剂盒,其中所述细菌是大肠杆菌(E.coli)。
9.如权利要求1所述的试剂盒,其中所述粘液选自猪近侧回肠粘液、猪远侧结肠粘液、肉鸡十二指肠粘液和肉鸡盲肠粘液。
10.如权利要求1所述的试剂盒,其中所述一抗是特异性针对大肠杆菌O和K抗原血清型的辣根过氧化物酶(HRP)偶联多克隆抗体。
11.如权利要求1所述的试剂盒,其中所述一抗是特异性针对大肠杆菌O和K抗原血清型的多克隆抗体。
12.如权利要求1所述的试剂盒,其中所述二抗是亲和纯化的兔抗山羊IgG-HRP。
13.如权利要求1所述的试剂盒,其中所述二抗是亲和纯化的兔抗山羊IgG-AP。
14.如权利要求1所述的试剂盒,其中所述二抗是针对山羊IgG的多克隆FITC偶联抗体。
15.如权利要求1所述的试剂盒,其中二抗是来自亲和素链霉菌(Streptomyces avidinii)的链霉亲和素-碱性磷酸酶。
16.如权利要求1所述的试剂盒,其中二抗是来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-过氧化物酶。
17.测定细菌和粘液和/或上皮细胞之间粘附和抗粘附的方法,所述方法包括
a)提供
i)包含细菌的样品和
ii)粘液和/或上皮细胞或其它细胞;以及
b)在非放射性比色测定中、在能测定所述细菌和所述粘液和/或上皮细胞之间的粘附和抗粘附的条件下,使所述包含细菌的样品和所述粘液和/或上皮细胞混合。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述非放射性比色测定是ELISA测定。
19.如权利要求17所述的方法,其中所述条件包括添加与粘液和/或上皮细胞结合的所述细菌的特异性一抗。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述条件包括添加可检测地标记的二抗,所述二抗对于与所述细菌结合的所述一抗是特异性的。
21.如权利要求20所述的方法,其中所述条件包括添加能使与所述一抗结合的所述可检测地标记的二抗可视化的底物。
22.如权利要求17所述的方法,其中将所述粘液和/或上皮细胞包被到微量滴定板上。
23.如权利要求20所述的方法,其中所述可检测地标记的二抗包含酶标记。
24.如权利要求21所述的方法,其中所述底物是用于在所述酶标记的存在下能提供比色信号、荧光信号或化学发光信号的组合物。
25.如权利要求24所述的方法,其中所述可检测地标记的二抗包含与过氧化物酶偶联的猪抗IgG免疫球蛋白。
26.如权利要求24所述的方法,其中所述比色组合物是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。
27.如权利要求17所述的方法,其中所述细菌是大肠杆菌。
28.如权利要求17所述的方法,其中所述粘液选自猪近侧回肠粘液、猪远侧结肠粘液、肉鸡十二指肠粘液和肉鸡盲肠粘液。
29.如权利要求19所述的方法,其中所述一抗是特异性针对大肠杆菌O和K抗原血清型的HRP偶联多克隆抗体。
30.如权利要求19所述的方法,其中所述一抗是特异性针对大肠杆菌O和K抗原血清型的多克隆抗体。
31.如权利要求20所述的方法,其中所述二抗是亲和纯化的兔抗山羊IgG-HRP。
32.如权利要求20所述的方法,其中所述二抗是亲和纯化的兔抗山羊IgG-AP。
33.如权利要求20所述的方法,其中所述二抗是针对山羊IgG的多克隆FITC偶联抗体。
34.如权利要求20所述的方法,其中二抗是来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-碱性磷酸酶。
35.如权利要求20所述的方法,其中二抗是来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-过氧化物酶。
36.鉴定能调节细菌和粘液和/或上皮细胞之间的粘附的试剂的方法,所述方法包括
a)提供
i)包含细菌的样品;
ii)粘液和/或上皮细胞;以及
iii)试剂;和
b)在非放射性比色测定中、在能测定所述细菌和所述粘液和/或上皮细胞之间的粘附的条件下,使所述包含细菌的样品、所述粘液和/或上皮细胞以及所述试剂混合;
c)比较在存在和不存在所述试剂时的所述细菌粘附;以及
d)如果所述测定的粘附高于或低于在不存在所述试剂时所述细菌和所述粘液和/或上皮细胞之间的粘附,则将所述试剂鉴定为所述细菌和所述粘液和/或上皮细胞之间的粘附的调节剂。
37.如权利要求36所述的方法,其中所述非放射性比色测定是ELISA测定。
38.如权利要求36所述的方法,其中所述条件包括添加与所述粘液和/或上皮细胞结合的所述细菌的特异性一抗。
39.如权利要求38所述的方法,其中所述条件包括添加可检测地标记的二抗,所述二抗对于与所述细菌结合的所述一抗是特异性的。
40.如权利要求39所述的方法,其中所述条件包括添加能使与所述一抗结合的所述可检测地标记的二抗可视化的底物。
41.如权利要求36所述的方法,其中将所述粘液被包到微量滴定板上。
42.如权利要求39所述的方法,其中所述可检测地标记的二抗包含酶标记。
43.如权利要求40所述的方法,其中所述底物是用于在所述酶标记的存在下能提供比色信号、荧光信号或化学发光信号的组合物。
44.如权利要求43所述的方法,其中所述可检测地标记的二抗包含与过氧化物酶偶联的猪抗IgG免疫球蛋白。
45.如权利要求43所述的方法,其中所述比色组合物是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。
46.如权利要求36所述的方法,其中所述细菌是大肠杆菌。
47.如权利要求36所述的方法,其中所述粘液和/或上皮细胞选自猪近侧回肠粘液、猪远侧结肠粘液、肉鸡十二指肠粘液和肉鸡盲肠粘液。
48.如权利要求38所述的方法,其中所述一抗是特异性针对大肠杆菌O和K抗原血清型的HRP偶联多克隆抗体。
49.如权利要求38所述的方法,其中所述一抗是特异性针对大肠杆菌O和K抗原血清型的多克隆抗体。
50.如权利要求39所述的方法,其中所述二抗是亲和纯化的兔抗山羊IgG-HRP。
51.如权利要求39所述的方法,其中所述二抗是亲和纯化的兔抗山羊IgG-AP。
52.如权利要求39所述的方法,其中所述二抗针对山羊IgG的多克隆FITC偶联抗体。
53.如权利要求39所述的方法,其中二抗是来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-碱性磷酸酶。
54.如权利要求39所述的方法,其中二抗是来自亲和素链霉菌的链霉亲和素-过氧化物酶。
55.如权利要求36所述的方法,其中所述试剂选自天然存在的分子、合成衍生的分子和重组衍生的分子。
56.包含试剂的组合物,其中所述试剂是粘液和/或上皮细胞的细菌粘附的调节剂,其中所述试剂是通过包括以下步骤的方法鉴定出的:
a)提供
i)包含细菌的样品;
ii)粘液和/或上皮细胞;以及
iii)试剂;和
b)在非放射性比色测定中、在能测定所述细菌和所述粘液和/或上皮细胞之间的粘附的条件下,使所述包含细菌的样品、所述粘液和/或上皮细胞以及所述试剂混合;
c)比较在存在和不存在所述试剂时的所述细菌粘附;以及
d)如果所述测定的粘附高于或低于在不存在所述试剂时所述细菌和所述粘液和/或上皮细胞之间的粘附,则将所述试剂鉴定为所述细菌和所述粘液和/或上皮细胞之间的粘附的调节剂。
57.如权利要求56所述的组合物,其中所述组合物位于饲料中,所述饲料是供选自牲畜、动物、鱼以及贝壳动物的个体食用。
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