CN102633583B - 一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤：(1)在pH为5-9条件下，向双链寡核苷酸溶液中加入二价金属离子无机盐的水溶液，混合均匀，得到双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液；(2)在与步骤(1)相同的pH条件下，将双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液与手性药物溶液混合，吸附；用截留分子量为1000-10000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物为富集的手性药物的另一种对映异构体。本方法利用生物相容性好的双链寡核苷酸实现简便、安全的手性药物拆分，是一种绿色、清洁的手性药物对映异构体拆分新方法。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体的是涉及一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法。
背景技术
随着现代分析测试技术的发展，人们发现越来越多的医药化合物具有手性结构特征，即具有相互呈镜像但彼此不能重合的对映异构体；手性药物的对映异构体通常表现出不同的生理行为，具有不同甚至截然相反的药效[J.Chromat.A，2001，906，3-33]。因此，研究开发具有光学纯度的手性药物已成为医药技术领域研究的重点和难点之一。制备具有光学纯度的手性药物需要依托不对称合成和手性拆分技术，而关键在于设计和研制具有高立体选择性的手性拆分剂。目前，优先结晶法、手性膜拆分法、色谱拆分法、酶拆分法等手性拆分技术已经广泛应用于手性药物对映体的研究和制备中[Anal.Chem.2010，82，4712-4722]。然而现有的这些方法都难以实现单一对映体的高效制备，通常得到的都是不同对映体的混合物。因此，如何调控手性拆分剂以实现对手性药物不同对映异构体的高效分子识别成为当今科学家们亟待研究的一个课题[Nature Materials，2003，2，272-278]。
DNA作为生物体内储存遗传信息的重要物质，因其独特的手性结构特征和分子识别特性，已成为材料和信息科学领域研究的热点[Chirality，2007，19：658-682；Science，2008，321，1795-1799]，特别是利用DNA分子组装体为模板引导蛋白质、量子点、过渡金属等构筑单元的准确定位，以形成多尺度结构特征的、功能化超分子组装体[Nature Nanotechnol.，2006，1，190-194]。另一方面，从化学和生物学的角度，利用分子纳米技术可以调控和设计具有特定组成和特定功能的DNA序列[Nature Reviews Genetics，2006，7，565-576；Angew.Chem.Int.Ed.，2007，46，6226-6236]，使其在手性药物的选择性合成与特异性识别方面显露出诱人的应用前景。
基于DNA二级结构的多样性和可调控性，以及碱基之间相互作用力弱等特点，利用小分子物质，特别是某些金属离子，可以诱导DNA构型发生改变。这种诱导作用与金属离子的类型和浓度、DNA序列的组成和长度以及溶液离子强度都有关系[Nucleic Acids Research，2000，28，2439-2445]。例如，特定碱基组成的核酸序列在Ni2+或精氨的诱导下，其双螺旋结构可以由B型向Z型转变，这种手性结构以及表现出来的光谱特征的改变，为小分子药物特异性识别提供了依据[J.Phys.Chem.B，2011，115，10182-10188；J.Am.Chem.Soc.，2009，131，2046-2047]。另外，金属离子的加入，可以改变DNA序列与小分子药物之间的结合作用，增大或减少DNA对药物的结合能力[J.Fluoresc，2011，21，113-118]。到目前为止，利用特定的双链寡核苷酸序列，通过金属离子的诱导调控作用，对手性药物对映体进行拆分还未曾报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤：
(1)在pH为5-9条件下，向50-4000体积份数的摩尔浓度为0.025-1mmol/L的双链寡核苷酸溶液中加入1体积份数的摩尔浓度为0.01-1mol/L的二价金属离子无机盐的水溶液，在10-40℃下混合均匀，得到双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液；
(2)在与步骤(1)相同的pH条件下，将1-100体积份数的所述双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液与1体积份数的摩尔浓度为0.15-2mmol/L的手性药物溶液混合，吸附15-60分钟；用截留分子量为1000-10000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物为富集的手性药物的另一种对映异构体。
步骤(1)优选为：在pH为5-9条件下，向100-1000体积份数的摩尔浓度为0.05-0.5mmol/L的双链寡核苷酸溶液中加入1体积份数的摩尔浓度为0.05-0.5mol/L的二价金属离子无机盐的水溶液，在20-30℃下混合均匀，得到双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液。
所述双链寡核苷酸为优选为序列[(dG-dC)n]2或[(dA-dT)n]2，n为1 0-400。
所述步骤(1)中所述双链寡核苷酸溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液。
所述步骤(1)中所述二价金属离子为铜离子、镍离子、锰离子、镁离子、钙离子、锌离子、钡离子或钴离子，所述无机盐为盐酸盐、硝酸盐或硫酸盐。
所述步骤(2)为：在与步骤(1)相同的pH条件下，将4-40体积份数的所述双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液与1体积份数的摩尔浓度为0.25-1mmol/L的手性药物溶液混合，吸附20-40分钟；用截留分子量为3000-8000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物为富集的手性药物的另一种对映异构体。
所述手性药物为氧氟沙星、布洛芬、华法林、萘普生、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普兰或普萘洛尔。
所述步骤(2)中所述手性药物溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液。
本发明的优点：
本方法利用生物相容性好的双链寡核苷酸实现简便、安全的手性药物拆分，是一种绿色、清洁的手性药物对映异构体拆分新方法。
具体实施方式
下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明作任何限制。
实施例1
一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤：
(1)在pH＝7.2下，向1000μL摩尔浓度为0.05mmol/L的[(dG-dC)20]2溶液中加入1μL的摩尔浓度为0.1mol/L的氯化铜水溶液，在20℃混合均匀，得到[(dG-dC)20]2-铜离子复合物溶液；[(dG-dC)20]2溶液的溶剂为磷酸钠缓冲液；
(2)在pH＝7.2下，将400μL步骤(1)制备的[(dG-dC)20]2-铜离子复合物溶液与100μL摩尔浓度为0.5mmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合，吸附20分钟，外消旋氧氟沙星溶液的溶剂为磷酸钠缓冲液；然后将混合溶液装入到截留分子量为3000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为富集的氧氟沙星的一种对映异构体溶液，[(dG-dC)20]2-铜离子复合物上的吸附物为富集的氧氟沙星的另一种对映异构体。滤液中氧氟沙星的对映体过量值为9.08％。将上述滤液经过步骤(2)重复处理三次后，最终滤液中氧氟沙星的对映体过量值达到35.19％。
实验证明，用本实施例的方法也可用于拆分布洛芬、华法林、萘普生、酮洛芬或氟比洛芬。
实施例2
一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤：
(1)在pH＝8.5下，向1000μL摩尔浓度为0.05mmol/L的[(dG-dC)10]2溶液中加入10μL的摩尔浓度为0.5mol/L的硫酸锌水溶液，在20℃混合均匀，得到[(dG-dC)10]2-锌离子复合物溶液；[(dG-dC)10]2溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液。
(2)在pH＝8.5下，将400μL步骤(1)制备的[(dG-dC)10]2-锌离子复合物溶液与10μL摩尔浓度为2mmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合，吸附40分钟，氧氟沙星溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；然后将混合溶液装入到截留分子量为1000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为富集的氧氟沙星的一种对映异构体溶液，[(dG-dC)10]2-锌离子复合物上的吸附物为富集的氧氟沙星的另一种对映异构体。滤液中氧氟沙星的对映体过量值为10.54％。将上述滤液经过步骤(2)重复处理三次后，最终滤液中氧氟沙星的对映体过量值达到40.11％。
实验证明，本实施例的方法也可用于拆分布洛芬、华法林、萘普生、酮洛芬氟或比洛芬。
实施例3
一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤：
(1)在pH＝8.5下，向1000μL摩尔浓度为0.025mmol/L的[(dA-dT)400]2溶液中加入20μL的摩尔浓度为0.05mol/L的硝酸镁水溶液，在30℃混合均匀，得到[(dA-dT)400]2-镁离子复合物溶液；[(dA-dT)400]2溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液。
(2)在pH＝8.5下，将400μL步骤(1)制备的[(dA-dT)400]2-镁离子复合物溶液与400μL摩尔浓度为0.15mmol/L的外消旋布洛芬溶液混合，吸附15分钟，布洛芬溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；然后将混合溶液通过截留分子量为10000的超滤膜，滤液为富集的布洛芬的一种对映异构体溶液，[(dA-dT)400]2-镁离子复合物上的吸附物为富集的布洛芬的另一种对映异构体。滤液中布洛芬的对映体过量值为9.81％。将上述滤液经过步骤(2)重复处理三次后，最终滤液中布洛芬的对映体过量值达到33.04％。
实验证明，本实施例的方法也可用于拆分氧氟沙星、酮洛芬、氟比洛芬或西酞普兰。
实施例4
一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤：
(1)在pH＝5.0下，向4000μL摩尔浓度为0.5mmol/L的[(dG-dC)20]2溶液中加入1μL的摩尔浓度为1mol/L的硝酸镍水溶液，在15℃混合均匀，得到[(dG-dC)20]2-镍离子复合物溶液；[(dG-dC)20]2溶液的溶剂为MES缓冲液；
(2)在pH＝5.0下，将1000μL步骤(1)制备的[(dG-dC)20]2-镍离子复合物溶液与100μL摩尔浓度为1mmol/L的外消旋华法林溶液混合，吸附30分钟，华法林溶液的溶剂为MES缓冲液；然后将混合溶液装入到截留分子量为3000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为富集的华法林的一种对映异构体溶液，[(dG-dC)20]2-镍离子复合物上的吸附物为富集的华法林的另一种对映异构体。滤液中华法林的对映体过量值为7.88％。将上述滤液经过步骤(2)重复处理三次后，最终滤液中华法林的对映体过量值达到27.21％。
实验证明，本实施例的方法也可用于拆分氧氟沙星、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普兰或普萘洛尔。
实施例5
一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤：
(1)在pH＝5.8下，向1000μL摩尔浓度为1mmol/L的[(dG-dC)100]2溶液中加入1μL的摩尔浓度为0.01mol/L的氯化锰水溶液，在10℃混合均匀，得到[(dG-dC)100]2-锰离子复合物溶液；[(dG-dC)100]2溶液的溶剂为二甲胂酸钠缓冲液。
(2)在pH＝5.8下，将500μL步骤(1)制备的[(dG-dC)100]2-锰离子复合物溶液与500μL摩尔浓度为1mmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合，吸附30分钟，氧氟沙星溶液的溶剂为二甲胂酸钠缓冲液；然后将混合溶液通过截留分子量为8000的超滤膜，滤液为富集的氧氟沙星的一种对映异构体溶液，[(dG-dC)100]2-锰离子复合物上的吸附物为富集的氧氟沙星的另一种对映异构体。滤液中氧氟沙星的对映体过量值为12.31％。将上述滤液经过步骤(2)重复处理三次后，最终滤液中氧氟沙星的对映体过量值达到34.79％。
实验证明，本实施例的方法也可用于拆分氧氟沙星、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普兰或普萘洛尔。
实施例6
一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤：
(1)在pH＝8.0下，向1000μL摩尔浓度为0.1mmol/L的[(dG-dC)400]2溶液中加入10μL的摩尔浓度为0.3mol/L的硝酸钡水溶液，在40℃混合均匀，得到[(dG-dC)400]2-钡离子复合物溶液；[(dG-dC)400]2溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液。
(2)在pH＝8.0下，将500μL步骤(1)制备的[(dG-dC)400]2-钡离子复合物溶液与500μL摩尔浓度为1mmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合，吸附30分钟，氧氟沙星溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；然后将混合溶液通过截留分子量为10000的超滤膜，滤液为富集的氧氟沙星的一种对映异构体溶液，[(dG-dC)400]2-钡离子复合物上的吸附物为富集的氧氟沙星的另一种对映异构体。滤液中氧氟沙星的对映体过量值为11.45％。将上述滤液按步骤(2)重复处理三次后，最终滤液中氧氟沙星的对映体过量值达到32.25％。
实验证明，本实施例的方法也可用于拆分布洛芬、华法林、萘普生、酮洛芬或氟比洛芬。
实施例7
一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤：
(1)在pH＝9.0下，向1000μL摩尔浓度为0.05mmol/L的(dA-dT)10]2溶液中加入5μL的摩尔浓度为0.05mol/L的硝酸钙水溶液，在20℃混合均匀，得到[(dA-dT)10]2-钙离子复合物溶液；[(dA-dT)10]2溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液。
(2)在pH＝9.0下，将500μL步骤(1)制备的[(dA-dT)10]2-钙离子复合物溶液与500μL摩尔浓度为0.25mmol/L的外消旋布洛芬溶液混合，吸附60分钟，布洛芬溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；然后将混合溶液装入到截留分子量为1000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为富集的布洛芬的一种对映异构体溶液，[(dA-dT)10]2-钙离子复合物上的吸附物为富集的布洛芬的另一种对映异构体。滤液中布洛芬的对映体过量值为6.50％。将上述滤液经过步骤(2)重复处理三次后，最终滤液中布洛芬的对映体过量值达到18.79％。
实验证明，本实施例的方法也可用于拆分氧氟沙星、华法林、萘普生、酮洛芬或氟比洛芬。
实施例8
一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤：
(1)在pH＝7.2下，向1000μL摩尔浓度为0.05mmol/L的[(dG-dC)100]2溶液中加入4μL的摩尔浓度为0.05mol/L的氯化钴水溶液，在35℃混合均匀，得到[(dG-dC)100]2-钴离子复合物溶液；[(dG-dC)100]2溶液的溶剂为HEPES缓冲液。
(2)在pH＝7.2下，将1000μL步骤(1)制备的[(dG-dC)100]2-钴离子复合物溶液与10μL摩尔浓度为2mmol/L的外消旋氟比洛芬溶液混合，吸附40分钟，氟比洛芬溶液的溶剂为HEPES缓冲液；然后将混合溶液通过截留分子量为8000的超滤膜，滤液为富集的氟比洛芬的一种对映异构体溶液，[(dG-dC)100]2-钴离子复合物上的吸附物为富集的氟比洛芬的另一种对映异构体。滤液中布洛芬的对映体过量值为15.26％。将上述滤液经过步骤(2)重复处理三次后，最终滤液中氟比洛芬的对映体过量值达到40.01％。
实验证明，本实施例的方法也可用于拆分布氧氟沙星、布洛芬、萘普生、酮洛芬或普洛萘尔。
Claims (5)
1.一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，其特征包括如下步骤：
（1）在pH为5-9条件下，向50-4000体积份数的摩尔浓度为0.025-1mmol/L的双链寡核苷酸溶液中加入1体积份数的摩尔浓度为0.01-1mol/L的二价金属离子无机盐的水溶液，在10-40℃下混合均匀，得到双链寡核苷酸—金属离子复合物溶液；
（2）在与步骤（1）相同的pH条件下，将1-100体积份数的所述双链寡核苷酸—金属离子复合物溶液与1体积份数的摩尔浓度为0.15-2mmol/L的手性药物溶液混合，吸附15-60分钟；用截留分子量为1000-10000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸—金属离子复合物上的吸附物为富集的手性药物的另一种对映异构体；所述双链寡核苷酸为序列[(dG-dC)n]2或[(dA-dT)n]2，n为10-400；所述二价金属离子为铜离子、镍离子、锰离子、镁离子、钙离子、锌离子、钡离子或钴离子，所述无机盐为盐酸盐、硝酸盐或硫酸盐；所述手性药物为氧氟沙星、布洛芬、华法林、萘普生、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普兰或普萘洛尔。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤（1）为：在pH为5-9条件下，向100-1000体积份数的摩尔浓度为0.05-0.5mmol/L的双链寡核苷酸溶液中加入1体积份数的摩尔浓度为0.05-0.5mol/L的二价金属离子无机盐的水溶液，在20-30℃下混合均匀，得到双链寡核苷酸—金属离子复合物溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是所述步骤（1）中所述双链寡核苷酸溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤（2）为：在与步骤（1）相同的pH条件下，将4-40体积份数的所述双链寡核苷酸—金属离子复合物溶液与1体积份数的摩尔浓度为0.25-1mmol/L的手性药物溶液混合，吸附20-40分钟；用截留分子量为3000-8000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸—金属离子复合物上的吸附物为富集的手性药物的另一种对映异构体。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤（2）中所述手性药物溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液。
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| KR20100130092A (ko) * | 2009-06-02 | 2010-12-10 | 고려대학교 산학협력단 | 키랄 구조의 이부프로펜에 입체선택적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 그 제조방법 |
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