CN102630475A - 微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法，它是,它是在直径为7.5cm，长25cm的PVC管中装入500g风干的园土，装入水平隔层60g，再装入280g堆肥；在管中播种0.6g高羊茅种子,播种30d后，将不同浓度的微生物菌剂和10-20mmol/kg堆肥的NTA钠盐水溶液施于堆肥表面，10d后刈割草，测定重金属Cd，Cr，Cu，Pb和Zn的含量变化。本发明的实验结果表明：水平隔层铺与土壤至上、堆肥之下，可以减少垃圾堆肥中的有害物质和重金属向土壤中迁移，使草坪植物在化学螯合剂诱导下或者微生物协同下，增加其吸收堆肥中的重金属的时间和重金属在其体内的富集，并减少重金属向深层土壤的迁移。

Description

微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法

技术领域

本发明属于垃圾堆肥在城市草坪建植技术领域中的应用，涉及采用微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法。

背景技术

近年来，由生活垃圾引发的环境污染问题已成为社会广泛关注的焦点之一。随着我国人民生活水平的日趋提高，城市生活垃圾产生量也随之增加。将生活垃圾堆肥用作草坪基质，不但可以避开食物链，同时又解决了垃圾的出路问题。垃圾堆肥具有良好的理化性质、丰富的养分，是替代土壤作为草坪基质的较理想材料。在我国人口众多，土地资源相对贫乏，以垃圾堆肥用作草坪基质更具有现实意义。一些草坪植物能够在重金属污染较重的基质中生长，且生长速度快、再生能力强，在化学方法和生物方法协同修复垃圾堆肥重金属中具有较大的应用价值。因此垃圾堆肥作为草坪基质的同时，其重金属又能得到草坪植物的修复，这样既增加了垃圾堆肥的应用潜力又提高了其使用的安全性。

目前，我国已初步展开了将生活垃圾堆肥用于园林绿地基质或肥料的科研工作，垃圾堆肥通常以肥料的形式加入土壤，可以改善土壤性质，提高草坪草生物量、叶绿素含量等。但垃圾堆肥中含有高浓度的重金属，在其改善土壤、土壤植物和微生物的同时，也对它们产生危害。所以，提出若想将垃圾堆肥应用于实际必须去除其中的重金属的想法。垃圾堆肥施用过程中，如何防止或者减少重金属进入土壤和地下水产生，已成为要解决的一大问题。

研究发现，添加EDTA可以显著提高重金属在供试草坪植物中的富集量。利用EDTA协同植物修复的同时，由于EDTA以及EDTA与重金属螯合形成的复合物具有很强的溶解性和生物毒性，且在土壤中很难被光、化学物质以及生物降解，所以很可能会引起污染深层土壤及地下水污染等环境问题。但是NTA（Nitrilotriacetic acid），在过去50年一直被应用于除垢剂，在分析化学中用作配位滴定剂和掩蔽剂，在催化动力学分析中常作为活化剂。然而关于微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法，未见文献报道。

微生物修复技术弥补了植物修复法、化学浸提法、化学浸提协同植物修复等方法成本高、施用有局限性等缺点。实验证明弗兰克菌属对一定浓度的Cu、Co、Ni、Cd和Hg敏感性不强。Zhou等（2007）表明菌根能消减由玉米根系吸附的Cu向地上部运输。在微生物培养基中加入了不同浓度的Cu、Hg、Pb、Cd和Cr 5种重金属，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌进行胁迫培养，结果发现Hg、Cd毒性较强，2种细菌的增殖在高浓度时受到抑制，枯草芽孢杆菌更为敏感，当重金属浓度>50 mg/L后，5种重金属对两种细菌的毒性顺序为Hg>Cd >Cu>Cr≈Pb。微生物修复的一个重要特性是能耐受高浓度的重金属离子，常见的如Cu、Zn、Ni等。针对这一特点，目前有研究者开始尝试采用复合菌群来联合进行修复。复合微生物由两种或两种以上微生物按合适比例共同培养组成，能够充分发挥群体的联合作用优势，实验表明接种复合微生物的垃圾堆肥其堆肥化效率显著提高，并且可以提高种子的萌发率。

发明内容

本发明通过对草坪堆肥基质渗漏体系中重金属富集、淋溶等的研究，系统地探讨在微生物、NTA强化植物修复的同时重金属淋溶迁移的潜在风险，并提出相应的防治方法。

为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容：

一种微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）实验材料准备

试验选用多年生高羊茅（Festuca arundinacea L.）为实验材料；生活垃圾堆肥取自天津市小淀堆肥厂；供试土壤取0-20 cm深的表层土；堆肥和园土经风干后分别过2 mm筛备用；隔层材料为由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成；枯草芽孢杆菌、放线菌分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥；淋溶液：用(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄、K₂SO₄、MgSO₄、Ca(NO₃)₂、Mg(NO₃)₂、H₂SO₄配制出SO₄ ^2-、NO₃ ^-、Cl^-、NH⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺、Na⁺浓度分别为14.96、6.54、1.68、3.71、0.82、1.38、0.64和0.78 mg/L，并用HCl调配pH为5.5-6的淋溶液备用；

（2）实验方法

1）草坪基质堆肥利用与隔层设置

选用PVC管直径为7.5cm， 25cm的长管，管底部固定有直径为0.2 mm的尼龙网以支撑管内的土和堆肥，将管吊起，管的下方配有锥形瓶接渗滤液；

2）在PVC管中装入500g风干的园土，铺平，再装入水平隔层由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成，再装入280g堆肥，铺平于隔层之上；

3）微生物菌剂与草坪基质隔层体系的建立

将0.6 g高羊茅播于PVC管中，播种10d后，

Ⅰ中加入1.4 mL蒸馏水；

Ⅱ中加入0.7 mL牛肉膏蛋白胨培养基和0.7 mL高氏一号培养基；

Ⅲ中加入1.4 mL枯草芽孢杆菌；

Ⅳ中加入1.4 mL放线菌；

Ⅴ中加入0.7 mL液体枯草芽孢杆菌和0.7 mL液体放线菌的复合剂；

接菌后，草坪植物再生长30d，刈割，将刈割下的草坪植物地上部置于80℃的烘箱中烘干至衡重，记地上生物量；

4）刈割第二天用150 mL人工淋溶液，相当于34.0 mm的降水量，进行第一次淋洗，之后每7 d淋洗一次，每次150mL，共4次淋入600 mL，4次分别称重，并收集于同一个锥形瓶中，混合均匀待测；其中高羊茅种植期间均用自来水浇灌，保持其整体田间持水量为60-65%。种植期间室内的温度和相对湿度分别为14-25℃和30-55%，光照强度为350-800μmolžm^-2žs^-1；

5）利用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属Cd、Cr、Cu、Pb和Ni的含量变化。

本发明所述的沸石为天然沸石，筛取粒径小于4mm的；蛭石取自日本弘洋园公司，取粒径小于4mm的；锯末取自加工厂废弃下脚料，以上材料均80℃烘干至恒重，备用。

本发明所述的枯草芽孢杆菌、放线菌均有市售。也可以采用天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥进行分离。其分离的方法为：将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养，用接种针挑取活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50 mL液态的牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养12 h，获得本实验用枯草芽孢杆菌；用接种针挑取活化的放线菌菌种，接入装有50 mL液态的高氏一号培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养96h，获得本实验用放线菌。

本发明进一步公开了所述方法在增加重金属在植物体内的富集阻碍Cd, Cr, Cu和Ni的垂直迁移方面的应用；其方法是采用0.7 mL液体枯草芽孢杆菌和0.7 mL液体放线菌的复合剂以及水平隔层由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成隔层。

本发明的实验结果表明：水平隔层铺与土壤至上、堆肥之下，可以减少垃圾堆肥中的有害物质和重金属向土壤中迁移，使草坪植物在化学螯合剂诱导下或者微生物协同下，增加其吸收堆肥中的重金属的时间和重金属在其体内的富集，并减少重金属向深层土壤的迁移。

本发明采用的枯草芽孢杆菌（拉丁学名Bacillus subtilis：）（保藏号CGMCC N0 2548）,中北生物科技有限公司，对外可以提供。中国专利号为：ZL200710062503.1。

生理生化特性：枯草芽孢杆菌菌体细胞为短杆状，有芽孢，在显微镜下观察菌体的大小为0.4～0.8μm×2.3～3.7μm。菌体细胞呈较粗壮的杆状，排列不整齐。革兰氏染色呈阳性。在固体培养基表面，菌体形成半透明的浅黄色菌落，菌落粘稠，边缘不整齐。

本发明公开的土壤放线菌发酵液与申请号200610122277.7公开的相同。

本发明采用天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥进行分离得出的枯草芽孢杆菌、放线菌与现有文献报道的特性相同，（保藏号CGMCC N0 2548；CCTCC N0 M206067菌株）固未保藏。

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌中具有应用潜力的菌种之一。近年来国内外对于芽孢杆菌应用方面的研究日益增多。放线菌可以促进植物新陈代谢，提高植物抗性。本发明将配制成不同浓度的枯草芽孢杆菌发酵液、放线菌发酵滤接种到草坪建植体系中。通过研究不同浓度的枯草芽孢杆菌发酵滤液、放线菌发酵滤液对高羊茅种子萌发的影响，为草坪植物的生态建植提供依据。

本实验研究结果表明，综合来看复合微生物对增加重金属在植物体内的富集作用，和对阻碍Cd, Cr, Cu和Ni的垂直迁移都最为显著。其中枯草芽孢杆菌对阻碍Pb的垂直迁移最为显著。

本发明更加详细的孩子被方法如下：

1 实验材料与方法

1.1 土壤、堆肥与草坪植物

（1）实验用植物

本试验选用我国北方比较常见的多年生高羊茅（Festuca arundinacea L.）为实验材料。

（2）实验用堆肥和土壤及其理化

生活垃圾堆肥取自天津市小淀堆肥厂。供试土壤取自天津师范大学实验地0-20 cm深的表层土。堆肥和园土经风干后分别过2 mm筛备用。

堆肥理化性质为：pH 7.62，有机质含量12.12%，全氮5.18%，有效磷77.92 mg/Kg，饱和含水量0.76 mL/g。其重金属Cd，Cr，Cu，Pb，Ni背景值分别为1.97，67.00，238.73，172.11，33.42 μg/g。土壤性质为：pH 8.30，有机质含量4.68%，全氮0.21%，有效磷22.03 mg/kg，饱和含水量0.58 mL/g。其重金属Cd，Cr，Cu，Pb，Ni的背景值分别为0.18，2.13，9.33，5.75，2.64 μg/g。

1.2 隔层材料选择

本实验隔层材料为沸石、蛭石、锯末。沸石为天然沸石，筛取粒径小于4mm的；蛭石取自日本弘洋园公司，取粒径小于4mm的。锯末取自加工厂废弃下脚料，以上材料均80℃烘干至恒重，备用。

本实验隔层由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成，装入PVC管中共高4cm。

1.3 菌剂的制备

实验用枯草芽孢杆菌、放线菌分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥。取10 g新鲜堆肥加到90 mL的灭菌水中，配置适宜浓度的堆肥悬浊液，取混合均匀的悬浊液100 μL加入到相应的固体平板培养基上，适温培养，根据菌落形态，挑取和已知枯草芽孢杆菌和放线菌比较相似的菌落进行革兰氏染色法（鉴定细菌）、芽孢染色法（鉴定枯草芽孢杆菌）和印片法（鉴定放线菌）鉴定。根据鉴定结果，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线。

根据生长曲线获得微生物生长至稳定期的时间，得出枯草芽孢杆菌的稳定期为8-18h，放线菌的稳定期为84-108h。用接种针挑取活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50 mL液态的牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养12 h，获得本实验用枯草芽孢杆菌；用接种针挑取活化的放线菌菌种，接入装有50 mL液态的高氏一号培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养96h，获得本实验用放线菌。

1.4 淋溶液制备

根据韩毓（2008）调查全天津市降水pH值范围为4.00-8.24，年均值为5.59，属酸性降水。本实验用(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄、K₂SO₄、MgSO₄、Ca(NO₃)₂、Mg(NO₃)₂、H₂SO₄配制出SO₄ ^2-、NO₃ ^-、Cl^-、NH⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺、Na⁺浓度分别为14.96、6.54、1.68、3.71、0.82、1.38、0.64和0.78 mg/L，并用HCl调配pH为5.59的淋溶液。

1.5实验方法

（1）草坪基质堆肥利用与隔层设置

PVC管直径为7.5cm，将其分别截成21cm的短管6根，25cm的长管24根。所有管底部都固定有直径为0.2 mm的尼龙网以支撑管内的土和堆肥，将管吊起，管的下方配有锥形瓶接渗滤液。

土壤耕层为0-20cm的表层土。本实验模拟表层土，设置园土高12cm，堆肥高8cm。制备高为20cm的短管6根，高为24cm的长管24根。短管的制备：先装入500g风干的园土，铺平，再装入280g堆肥，铺平于园土之上；长管的制备：装入500g风干的园土，铺平，再装入水平隔层，再装入280g堆肥，铺平于隔层之上。

（2）微生物菌剂与草坪基质隔层体系的建立

草坪植物选用多年生高羊茅。将0.6 g高羊茅播于PVC管中，每组3次重复，处理见表1。播种10 d后，Ⅰ中加入1.4 mL蒸馏水；Ⅱ中加入0.7 mL牛肉膏蛋白胨培养基和0.7 mL高氏一号培养基；Ⅲ中加入1.4 mL枯草芽孢杆菌；Ⅳ中加入1.4 mL放线菌；Ⅴ中加入0.7 mL液体枯草芽孢杆菌和0.7 mL液体放线菌的复合。接菌后，草坪植物再生长30 d，刈割（高羊茅均共生长40 d），将刈割下的草坪植物地上部置于80°C的烘箱中烘干至衡重，记地上生物量。刈割第二天用150 mL人工淋溶液（相当于34.0 mm的降水量）进行第一次淋洗，之后每7 d淋洗一次，每次150 mL，共4次淋入600 mL。4次分别称重，并收集于同一个锥形瓶中，混合均匀待测。

草坪植物种植期间均用自来水浇灌，保持其整体田间持水量为60%。种植期间室内的温度和相对湿度分别为14-25℃和30-55%，光照强度为350-800μmolžm^-2žs^-1。

表1 微生物菌剂接种和隔层处理方案

（4）重金属含量分析

高羊茅草样均称取0.2 g，用10 mL HNO₃和2 mL HClO₄在120-140℃下电热板消化，待棕黄色烟消去，所得溶液用1%硝酸定容到25 mL。渗滤液取20 mL，用8 mL HNO₃和2 mL HClO₄在120-140℃下电热板消化，待棕黄色烟消去，所得溶液用1%硝酸定容到50 mL。最后利用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属（Cd、Cr、Cu、Pb和Ni）含量。

1.6 数据分析

2 结果与分析

2.1 不同微生物菌剂和隔层设置对草坪植物生物量的影响

从表2可以看出隔层可以增加高羊茅的生物量。接种菌剂对草坪植物的生物量有显著的提高（p<0.05）。复合菌剂协同水平隔层（

）对提高高羊茅生物量的影响最为显著，分别比对处理

提高了18.8%和34.2%。

表2 不同处理对草坪植物生物量的影响（g/PVC）

不同处理	高羊茅
			0.661±0.017c
	0.776±0.014b
			0.849±0.019a
	0.875±0.026a
			0.887±0.005a

注：

：无隔层；

：仅接菌剂培养基；

：接种枯草芽孢杆菌；

：接种放线菌；：接种芽孢杆菌和放线菌的复合菌（

-均设置隔层），下同。

2.2 不同微生物菌剂和隔层设置对草坪植物株高的影响

高羊茅的株高在接菌前，可以看出设置隔层显著促进了其株高（p<0.05），接菌后隔层对株高的促进作用也达显著。接菌30d后，

、

、

和分别比

提高了16.1%、29.8%、28.9%和38.5%。

表3不同处理对高羊茅株高的影响(cm)

2.3 不同微生物菌剂和隔层设置对草坪植物富集重金属的影响

重金属在草坪植物体内的浓度和富集量。从表中可以看出设置隔层能增加重金属在植物体内的浓度。只设置隔层但无菌剂下，高羊茅对Cd和Ni的富集最为显著。添加不同的菌剂均能显著（p<0.05）增加重金属在植物草坪体内的富集。其中复合菌剂（

）的处理下，对重金属在植物体内的富集最佳，高羊茅对Cd、Cr、Cu、Pb和Ni分别比只设置隔层但无菌剂处理（）的1.60、1.74、1.34、1.72和1.58倍。微生物菌剂协同水平隔层的处理对重金属在植物体内的富集能力大于仅设置水平隔层或者仅添加单一菌剂，从表中也可以看出，复合菌剂增加对重金属的在草坪植物体内的富集作用更为显著。

表4 Cd在草坪植物体内的富集

表5 Cr在草坪植物体内的富集

表6 Cu在草坪植物体内的富集

表7 Pb 在草坪植物体内的富集

表8 Ni 在草坪植物体内的富集

2.4 利用和隔层设置对重金属渗滤行为与格局的影响

表9列出了种植高羊茅的各PVC管渗滤液中重金属的总含量。结果在酸雨作用下，隔层能阻碍重金属的垂直迁移，微生物作用后的草坪植物和水平隔离层对重金属的淋溶迁移有一定的抑制作用。枯草芽孢杆菌对协同高羊茅和水平隔层Cd和Pb的垂直迁移有显著的抑制作用，复合菌对抑制Cr, Cu和Ni的垂直迁移作用最为显著。单施用放线菌也能减少重金属的迁移，但迁移作用不显著。

表9不同菌剂处理高羊茅的PVC管渗滤液中重金属的总量及百分率

3 结论

本实验在堆肥和土壤之间用废弃物铺上隔层，目的是阻碍堆肥中的重金属污染土壤。实验结果表明，水平隔层有助于草坪植物的生长可以增加草坪植物的生物量和株高，同时隔层也增加了植物体内重金属的含量，并且阻碍了重金属随的垂直迁移。

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌中具有应用潜力的菌种之一。放线菌可以促进植物新陈代谢，提高植物抗性。本实验研究结果综合来看复合微生物对增加重金属在植物体内的富集作用，和对阻碍Cd, Cr, Cu和Ni的垂直迁移都最为显著。枯草芽孢杆菌对阻碍Pb的垂直迁移最为显著。

附图说明：

图1为枯草芽孢杆菌的生长曲线；

图2为放线菌的生长曲线。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中枯草芽孢杆菌、放线菌与现有文献（保藏号CGMCC N0 2548；CCTCC N0 M206067菌株）报道的特性相同，有市售，也可以根据实施例1的方法加以获得，从生活垃圾堆肥所得到的枯草芽孢杆菌、放线菌生理生化性质与市售的相同。所采用的牛肉膏蛋白胨固体培养基有市售。平板培养基为：高氏一号的培养基也有市售。

实施例1

菌剂的制备

实验用枯草芽孢杆菌、放线菌分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥。取10 g新鲜堆肥加到90 mL的灭菌水中，配置适宜浓度的堆肥悬浊液，取混合均匀的悬浊液100 μL加入到相应的固体平板培养基上，适温培养，根据菌落形态，挑取和已知枯草芽孢杆菌和放线菌比较相似的菌落进行革兰氏染色法（鉴定细菌）、芽孢染色法（鉴定枯草芽孢杆菌）和印片法（鉴定放线菌）鉴定。根据鉴定结果，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线。

根据生长曲线获得微生物生长至稳定期的时间，得出枯草芽孢杆菌的稳定期为8-18h，放线菌的稳定期为84-108h。用接种针挑取活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50 mL液态的牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养12 h，获得本实验用枯草芽孢杆菌；用接种针挑取活化的放线菌菌种，接入装有50 mL液态的高氏一号培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养96h，获得本实验用放线菌。

实施例2

将枯草芽孢杆菌（保藏号CGMCC N0 2548）接入装有50 mL液态的牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养12 h，获得本实验用枯草芽孢杆菌；

放线菌（保藏号CCTCC N0 M206067）接入装有50 mL液态的高氏一号培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养96h，获得本实验用放线菌。

实施例3

（1）实验材料准备

试验选用多年生高羊茅（Festuca arundinacea L.）为实验材料；生活垃圾堆肥取自天津市小淀堆肥厂；供试土壤取0-20 cm深的表层土；堆肥和园土经风干后分别过2 mm筛备用；隔层材料为由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成；枯草芽孢杆菌、放线菌分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥；淋溶液：用(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄、K₂SO₄、MgSO₄、Ca(NO₃)₂、Mg(NO₃)₂、H₂SO₄配制出SO₄ ^2-、NO₃ ^-、Cl^-、NH⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺、Na⁺浓度分别为14.96、6.54、1.68、3.71、0.82、1.38、0.64和0.78 mg/L，并用HCl调配pH为5.5的淋溶液备用；

（2）实验方法（菌株选自实施例1）

1）草坪基质堆肥利用与隔层设置

选用PVC管直径为7.5cm， 25cm的长管，管底部固定有直径为0.2 mm的尼龙网以支撑管内的土和堆肥，将管吊起，管的下方配有锥形瓶接渗滤液；

2）在PVC管中装入500g风干的园土，铺平，再装入水平隔层由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成，再装入280g堆肥，铺平于隔层之上；

3）微生物菌剂与草坪基质隔层体系的建立

将0.6 g高羊茅播于PVC管中，播种10d后，

Ⅰ中加入1.4 mL蒸馏水；

Ⅱ中加入0.7 mL牛肉膏蛋白胨培养基和0.7 mL高氏一号培养基；

Ⅲ中加入1.4 mL枯草芽孢杆菌；

Ⅳ中加入1.4 mL放线菌；

Ⅴ中加入0.7 mL液体枯草芽孢杆菌和0.7 mL液体放线菌的复合剂；

接菌后，草坪植物再生长30d，刈割，将刈割下的草坪植物地上部置于80℃的烘箱中烘干至衡重，记地上生物量；

4）刈割第二天用150 mL人工淋溶液，相当于34.0 mm的降水量，进行第一次淋洗，之后每7 d淋洗一次，每次150mL，共4次淋入600 mL，4次分别称重，并收集于同一个锥形瓶中，混合均匀待测；其中高羊茅种植期间均用自来水浇灌，保持其整体田间持水量为60%。种植期间室内的温度和相对湿度分别为16℃和40%，光照强度为400μmolžm^-2žs^-1；

5）利用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属Cd、Cr、Cu、Pb和Ni的含量变化。其中沸石为天然沸石，筛取粒径小于4mm的；蛭石取自日本弘洋园公司，取粒径小于4mm的；锯末取自加工厂废弃下脚料，以上材料均80℃烘干至恒重，备用。

实施例4

（1）实验材料准备

试验选用多年生高羊茅（Festuca arundinacea L.）为实验材料；生活垃圾堆肥取自天津市小淀堆肥厂；供试土壤取0-20 cm深的表层土；堆肥和园土经风干后分别过2 mm筛备用；隔层材料为由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成；枯草芽孢杆菌、放线菌分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥；淋溶液：用(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄、K₂SO₄、MgSO₄、Ca(NO₃)₂、Mg(NO₃)₂、H₂SO₄配制出SO₄ ^2-、NO₃ ^-、Cl^-、NH⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺、Na⁺浓度分别为14.96、6.54、1.68、3.71、0.82、1.38、0.64和0.78 mg/L，并用HCl调配pH为5.5的淋溶液备用；

（2）实验方法（菌株选自实施例2）

1）草坪基质堆肥利用与隔层设置

选用PVC管直径为7.5cm， 25cm的长管，管底部固定有直径为0.2 mm的尼龙网以支撑管内的土和堆肥，将管吊起，管的下方配有锥形瓶接渗滤液；

2）在PVC管中装入500g风干的园土，铺平，再装入水平隔层由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成，再装入280g堆肥，铺平于隔层之上；

3）微生物菌剂与草坪基质隔层体系的建立

将0.6 g高羊茅播于PVC管中，播种10d后，

Ⅰ中加入1.4 mL蒸馏水；

Ⅱ中加入0.7 mL牛肉膏蛋白胨培养基和0.7 mL高氏一号培养基；

Ⅲ中加入1.4 mL枯草芽孢杆菌；

Ⅳ中加入1.4 mL放线菌；

Ⅴ中加入0.7 mL液体枯草芽孢杆菌和0.7 mL液体放线菌的复合剂；

接菌后，草坪植物再生长30d，刈割，将刈割下的草坪植物地上部置于80℃的烘箱中烘干至衡重，记地上生物量；

4）刈割第二天用150 mL人工淋溶液，相当于34.0 mm的降水量，进行第一次淋洗，之后每7 d淋洗一次，每次150mL，共4次淋入600 mL，4次分别称重，并收集于同一个锥形瓶中，混合均匀待测；其中高羊茅种植期间均用自来水浇灌，保持其整体田间持水量为65%。种植期间室内的温度和相对湿度分别为25℃和55%，光照强度为800μmolžm^-2žs^-1；

5）利用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属Cd、Cr、Cu、Pb和Ni的含量变化。其中沸石为天然沸石，筛取粒径小于4mm的；蛭石取自日本弘洋园公司，取粒径小于4mm的；锯末取自加工厂废弃下脚料，以上材料均80℃烘干至恒重，备用。

Claims (4)

1.一种微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）实验材料准备

试验选用多年生高羊茅（Festuca arundinacea L.）为实验材料；生活垃圾堆肥取自天津市小淀堆肥厂；供试土壤取表层土；堆肥和园土经风干后分别过2 mm筛备用；隔层材料为由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成；枯草芽孢杆菌、放线菌分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥；淋溶液：用(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄、K₂SO₄、MgSO₄、Ca(NO₃)₂、Mg(NO₃)₂、H₂SO₄配制出SO₄ ^2-、NO₃ ^-、Cl^-、NH⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺、Na⁺浓度分别为14.96、6.54、1.68、3.71、0.82、1.38、0.64和0.78 mg/L，并用HCl调配pH为5.5-6的淋溶液备用；

（2）实验方法

1）草坪基质堆肥利用与隔层设置

选用PVC管直径为7.5cm， 25cm的长管，管底部固定有直径为0.2 mm的尼龙网以支撑管内的土和堆肥，将管吊起，管的下方配有锥形瓶接渗滤液；

2）在PVC管中装入500g风干的园土，铺平，再装入水平隔层由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成，再装入280g堆肥，铺平于隔层之上；

3）微生物菌剂与草坪基质隔层体系的建立

将0.6 g高羊茅播于PVC管中，播种10d后，

Ⅰ中加入1.4 mL蒸馏水；

Ⅱ中加入0.7 mL牛肉膏蛋白胨培养基和0.7 mL高氏一号培养基；

Ⅲ中加入1.4 mL枯草芽孢杆菌；

Ⅳ中加入1.4 mL放线菌；

Ⅴ中加入0.7 mL液体枯草芽孢杆菌和0.7 mL液体放线菌的复合剂；

接菌后，草坪植物再生长30d，刈割，将刈割下的草坪植物高羊茅地上部置于80℃的烘箱中烘干至衡重，记地上生物量；

4）刈割第二天用150 mL人工淋溶液，相当于34.0 mm的降水量，进行第一次淋洗，之后每7 d淋洗一次，每次150mL，共4次淋入600 mL，4次分别称重，并收集于同一个锥形瓶中，混合均匀待测；其中高羊茅种植期间均用自来水浇灌，保持其整体田间持水量为60-65%；种植期间室内的温度和相对湿度分别为14-25℃和30-55%，光照强度为350-800μmolžm^-2žs^-1；

5）利用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属Cd、Cr、Cu、Pb和Ni的含量变化。

2.权利要求1所述的方法，其中沸石为天然沸石，筛取粒径小于4mm的；蛭石取自日本弘洋园公司，取粒径小于4mm的；锯末取自加工厂废弃下脚料，以上材料均80℃烘干至恒重，备用。

3.权利要求1所述的方法，其中枯草芽孢杆菌、放线菌分离的方法为：将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养，用接种针挑取活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50 mL液态的牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养12 h，获得本实验用枯草芽孢杆菌；用接种针挑取活化的放线菌菌种，接入装有50 mL液态的高氏一号培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养96h，获得本实验用放线菌。

4.权利要求1所述方法在增加重金属在植物体内的富集阻碍Cd, Cr, Cu和Ni的垂直迁移方面的应用；其方法是采用0.7 mL液体枯草芽孢杆菌和0.7 mL液体放线菌的复合剂以及水平隔层由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成隔层。

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