CN102628829B - 辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌-玻碳电极电化学生物传感器及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌-玻碳电极电化学生物传感器及其构建方法，该生物传感器以玻碳电极为基底，基底上修饰有喇叭花状肌醇六磷酸锌并通过喇叭花状肌醇六磷酸锌将辣根过氧化物酶修饰在电极上，最外层修饰有保护辣根过氧化物酶生物活性的全氟磺酸。本发明的生物传感器能够实现直接电子转移，对H₂O₂的响应时间短，检测限低，灵敏度高，米氏常数较小，能够完成对H₂O₂准确快速测定；同时，其还具有绿色环保、成本低和生物亲和性好等优点。

Description

辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌-玻碳电极电化学生物传感器及其构建方法

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌-玻碳电极电化学生物传感器及其构建方法，主要是将具有优异生物亲和性的植物源喇叭花状肌醇六磷酸锌用于制备过氧化氢生物传感器。 

背景技术

过氧化氢是一种非常重要的化工产品，兼具多种功效如杀菌、漂白、氧化和消毒等。它具有十分广泛的应用价值，因此对过氧化氢含量的测定在很多领域如生物制药、食品科学、工业分析、环境监测和临床化学等具有非常重要的意义。现在检测过氧化氢时采用的主要手段有荧光法、化学发光法、电化学法、光谱法和滴定法等。近年来，电化学方法，尤其是基于酶的直接电化学的无媒介体生物传感器得到了迅速的发展，这是因为用电化学方法研制的过氧化氢生物传感器其制备简单，成本低，并且具有很高的选择性、灵敏度、稳定性及重现性等优点。 

此外，酶在生物体内以及药物和食物中有极为重要的作用，而过氧化氢作为生物体内许多过氧化酶参与酶促反应的副产物，对其浓度进行准确测定则具有十分重要的研究意义。生物传感器具有对酶的分子识别和催化选择功能，用它来检测过氧化氢浓度不但能体现出操作简单，响应快的特点，而且只需少量的试样就可以检测出过氧化氢的浓度。因此，如何在对过氧化氢进行精确检测时充分发挥生物传感器的检测高灵敏性和专一性等优势，是研究者们为之不断努力的目标。 

生物纳米材料具有生物兼容性好、比表面积大和稳定性高等特点，并且其表面所带有的功能基团能对酶的电化学行为产生特有的催化效应。锌是生物必需元素。人体，特别是儿童易产生锌不足而影响健康。在各种补锌盐类中，肌醇六磷酸锌(Zn-IP₆)安全无毒、稳定无异味，有改善食品风味和抗氧化等作用， 无论作为补锌的食品强化剂或制剂，都有显著的优点。用生物肌醇六磷酸盐作为表面处理剂是我国防腐蚀行业首次采用生物工程技术合成的绿色环保防腐蚀产品。借助肌醇六磷酸钠分子结构上含有6个非共平面的磷酸酯键，可以附着在晶体表面，影响晶体的成核和生长，控制肌醇六磷酸锌的形貌和尺寸，从而得到一种喇叭花状的肌醇六磷酸锌。利用肌醇六磷酸锌和辣根过氧化物酶的配位作用将HRP吸附到电极表面，获得了Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE传感器。这种结构的存在可以很好的把HRP包埋在喇叭花状的Zn-IP₆内部，极大的提高了HRP酶在电极表面的负载量，以提供令人满意的微环境来保持HRP的生物活性，实现对H₂O₂的定量测定。 

迄今为止，国内外尚未有利用“绿色经济”喇叭花状的肌醇六磷酸锌制备的检测过氧化氢的生物传感器。所以发明一种检测限低，响应时间短，米氏常数较小，灵敏度高，稳定性好的检测H₂O₂的生物传感器是一个迫切需要解决的重要技术问题。 

发明内容

本发明的目的是提供一种检测限低，响应时间短，米氏常数较小，灵敏度高，稳定性好的检测H₂O₂的生物传感器。 

为达到上述目标，本发明采用如下技术方案： 

辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌-玻碳电极电化学生物传感器的构建，包括以下步骤： 

(1)将肌醇六磷酸钠与氯化锌在酸性溶液中，80～100℃下反应1～2h，冷却至室温，得喇叭花状肌醇六磷酸锌溶液； 

(2)在玻碳电极表面滴加步骤(1)所制得的喇叭花状肌醇六磷酸锌溶液，晾干，得喇叭花状肌醇六磷酸锌修饰的玻碳电极； 

(3)将辣根过氧化物酶(HRP)溶液滴涂固定到步骤(2)所得喇叭花状肌醇六磷酸锌修饰的玻碳电极上，晾干，得辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌修饰的玻碳电极； 

(4)将全氟磺酸(Nafion)溶液滴加到步骤(3)所得的辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌修饰的玻碳电极上，晾干，即得目标产物辣根过氧化物 酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌-玻碳电极电化学生物传感器。 

步骤(1)中肌醇六磷酸钠与氯化锌的摩尔比为1∶5～1∶10。 

步骤(1)中所述酸性溶液为pH为2～3的盐酸溶液。 

步骤(3)中HRP溶液为HRP的PBS溶液，溶液pH为7.0～7.5，HRP的浓度为4～6mg/mL。 

步骤(4)中溶液全氟磺酸溶液为全氟磺酸的PBS溶液，浓度为1wt％～1.5wt％。 

根据以上技术方案制得的辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌-玻碳电极电化学生物传感器，其特征在于，以玻碳电极为基底，基底上修饰有喇叭花状肌醇六磷酸锌并通过喇叭花状肌醇六磷酸锌将辣根过氧化物酶修饰在电极上，最外层修饰有保护辣根过氧化物酶生物活性的全氟磺酸。 

本发明的原理在于：肌醇六磷酸钠分子结构上含有6个非共平面的磷酸酯键，可以附着在晶体表面，影响晶体的成核和生长，控制肌醇六磷酸锌的形貌和尺寸，从而得到一种喇叭花状的Zn-IP₆；利用喇叭花状的肌醇六磷酸锌作为连接剂，通过肌醇六磷酸锌和辣根过氧化物酶的配位作用将HRP吸附到电极表面，获得了Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE传感器。这种结构的存在可以很好的把HRP包埋在喇叭花状的Zn-IP₆内部，极大的提高了HRP酶在电极表面的负载量，以提供令人满意的微环境来保持HRP的生物活性，实现对H₂O₂的定量测定。 

本发明的生物传感器能够实现直接电子转移，对H₂O₂的响应时间短，检测限低，灵敏度高，米氏常数较小，能够完成对H₂O₂准确快速测定；同时，其还具有绿色环保、成本低和生物亲和性好等优点。 

附图说明

图1和图2为肌醇六磷酸锌的场发射扫描电镜(FESEM)图。 

图3为辣根过氧化物酶与肌醇六磷酸锌混合液的场发射扫描电镜(FESEM)图。 

图4为本发明所制得的肌醇六磷酸锌的光电子能谱图。 

图5为本发明所制得的肌醇六磷酸锌的分散液、HRP溶液以及它们的混合物的紫外可见光谱图。 

图6为不同修饰层数的电极的电化学交流阻抗图。 

图7为不同修饰电极的循环伏安图。 

图8为目标传感器Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE对不同浓度H₂O₂的循环伏安图。 

图9为目标传感器Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE在PBS(pH 7.0)中连续加入H₂O₂的计时电流响应曲线，内插图为响应电流与H₂O₂浓度的校正曲线的计时电流图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。 

(1)将1mmol/L的肌醇六磷酸钠溶液加热至沸腾，然后缓慢滴加相同体积pH为2的6mmol/L的ZnCl₂的盐酸溶液，80～100℃条件下反应1h，冷却至室温，得到喇叭花状肌醇六磷酸锌(Zn-IP₆)溶液； 

(2)在抛光处理后的玻碳电极(GCE)表面(7mm²)滴涂3μL 1mmol/L喇叭花状肌醇六磷酸锌溶液，于冰箱内(4℃)晾干，得喇叭花状肌醇六磷酸锌修饰的玻碳电极，记为Zn-IP₆/GCE； 

(3)将3μL 5mg/mL的辣根过氧化物酶(HRP)溶液(pH＝7.0PBS)通过滴涂法固定到喇叭花状肌醇六磷酸锌修饰的玻碳电极上，于冰箱内(4℃)晾干，记为HRP/Zn-IP₆/GCE； 

(4)滴加3μL全氟磺酸的磷酸缓冲液的稀释液(稀释液中全氟磺酸的浓度为1wt％，稀释液pH＝7.0，因为浓度太高将对本发明的传感器生物亲和性有影响)，冰箱内(4℃)晾干后，即制得辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌修饰的玻碳电极，记为Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE。 

图1和图2是步骤(2)所得的Zn-IP₆/GCE的FESEM图，可以观察到喇叭花状的肌醇六磷酸锌均匀地分散在玻碳片表面。 

图3是辣根过氧化物酶与肌醇六磷酸锌混合液的场发射扫描电镜图。 

HRP包埋在喇叭花状的Zn-IP₆内部，极大的提高了HRP酶在电极表面的负载量，以提供令人满意的微环境来保持HRP的生物活性，实现对H₂O₂的定量测定。 

XPS可以用做元素的定性和定量分析，从而证明化合物的组成。图4为所制得的肌醇六磷酸锌的光电子能谱，由上图可以看出，Zn_2p3、Zn_LMM和P_2p吸收峰的存在证明化合物中含有Zn和P元素，O_1s吸收峰归属于IP₆中的O元素， 而C_1s吸收峰可能来源于玻碳基底和IP₆。在XPS测量中，俄歇峰Zn_LMM探测Zn的化学态灵敏度更高，在界面处，Zn的俄歇修正型的化学位移及俄歇峰峰型的变化、Zn_2p3与Zn_LMM峰积分面积比值的变化，均表明IP₆与ZnCl₂的界面处有明显的成键作用.另外，XPS定量分子证明化合物中Zn和P的摩尔比是1∶1。我们都知道，IP₆中有六个磷酸基团，这也就说明合成的肌醇六磷酸锌中锌离子与肌醇六磷酸根离子的摩尔比为1∶1。 

紫外可见吸收光谱能提供酶或蛋白质构象变化信息，从Soret吸收带的位置以及峰形上可了解酶是否变性。图5分别是所制得的肌醇六磷酸锌分散液、HRP以及它们的混合物的紫外可见吸收曲线。从图中可以看出，肌醇六磷酸锌(a)在紫外可见区域没有明显的吸收峰，肌醇六磷酸锌与HRP混合溶液(c)的紫外可见吸收曲线中，395nm处的吸收峰归属于HRP中三价铁的Soret吸收带，这与HRP(b)的吸收曲线中Soret吸收带的峰位置(396nm)相比，只有1nm的位移，峰形几乎没有变化，这归因于肌醇六磷酸锌与HRP发生配位作用引起的位移。另外，HRP的吸收曲线中，500nm和640nm处的吸收峰分别对应于HRP的Q和CT吸收带，而这两个峰在两者混合溶液的吸收曲线中仍然存在。以上两点表明修饰在肌醇六磷酸锌中的HRP构象几乎没有变化，并仍然保持其原有的生物活性，也证明了肌醇六磷酸锌材料具有一定的生物亲和性。 

电化学交流阻抗技术(EIS)可以根据电极在修饰过程中阻抗的变化表征电极组装的不同阶段，是一种研究表面修饰电极界面性质的有效手段。图6是利用电化学交流阻抗法(EIS)表征了Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE制备过程。曲线(a)是裸玻碳电极的交流阻抗曲线，近似为一条直线，表明裸玻碳电极表面的电子迁移几乎不受什么阻碍，其表面传递的电子受扩散控制；曲线(b)是在裸电极上修饰了Zn-IP₆后的交流阻抗谱，由图可观察到一个微小的半圆，表明Zn-IP₆膜的形成使[Fe(CN)₆]^4-/3-在电极表面的电子转移阻力加大；曲线(c)是自组装HRP之后的交流阻抗谱，由图看出HRP/Zn-IP₆/GCE(c)半径明显增大，是由于HRP是带负电荷的，组装到电极表面，增加了电极表面的负电荷量，同时电极表面修饰层的结构变得更为稠密，阻碍了Fe(CN)₆ ^3-/Fe(CN)₆ ^4-在电极表面的电子传递过程；由曲线(d)可以看出，Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE阻抗弧的半径表明电子在电极表面的迁移更加困难，因此证明HRP成功地固定到了玻碳电极上。紫外可见光谱能够有效的监测亚铁血红素基团吸收带的变化，以 表征其结构的变化。 

图7是(a)裸玻碳电极，(b)Nafion/Zn-IP₆/GCE，(c)Nafion/HRP/GCE和(d)Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE在PBS中的循环伏安(CV)响应信号。实验结果表明，在裸玻碳电极(a)和Nafion/Zn-IP₆/GCE(b)中未观察到任何峰，在曲线(d)Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE上可以观察到一对明显的氧化还原峰，而在(c)Nafion/HRP/GCE上有一对小峰，这说明喇叭花状的Zn-IP₆的存在促进HRP在电极表面的直接电化学行为，为HRP提供一个具有生物相容性的界面，有效地加快HRP的直接电子转移速率。另外，Nafion膜起到了保护HRP生物活性，防止酶流失的作用。 

图8考察了Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE对H₂O₂的电催化性能。从图上可以观察到，在PBS(pH＝7.0)溶液中，当H₂O₂加入到PBS后，Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE中HRP的Fe³⁺的还原峰电流随着H₂O₂浓度的增加而逐渐增大，对应的HRP的Fe²⁺的氧化峰电流逐渐减小乃至消失，表明Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE对H₂O₂具有良好的电催化还原性能，也进一步证明了Zn-IP₆保持了HRP的电催化活性。反应机理总结如下： 

HRP(Fe^II)+H₂O₂→HRP(Fe^III)+H₂O    (1) 

HRP(Fe^III)+e→HRP(Fe^II)           (2) 

接下来用计时电流法定量的考察了该传感器的性能参数： 

图9是Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE对H₂O₂的响应电流，考虑到灵敏性和选择性，经过对比实验，采用-0.210V作为工作电位。随着H₂O₂浓度的不断增大，还原电流逐渐增大。内插图反映了该传感器在不同H₂O₂浓度下对催化电流的线性校正关系，看出响应电流和过氧化氢的浓度成线性关系，在1.33×10^-7～1.08×10^-5mol L^-1浓度范围内，相关系数为0.994(n＝10)，最低检测限为1×10^-7molL^-1(信噪比S/N＝3)。表观米氏常数(apparent Michaelis-Menten constant， 

)是一种与酶的浓度无关的酶促反应特征常数，它可以表征酶与底物之间亲合力的大小。 

可以通过Lineweaver-Burk方程求得： 

$1/I\text{ss=}{K}_M^{\mathrm{app}}/I\max C+1/I\max$

式中，Iss是加入底物后测得的稳态电流，C是底物浓度，Imax是底物达饱和后测得的最大电流。米氏常数可根据稳态电流的倒数和H₂O₂浓度的倒数作图后，所得到的斜率和截距求得。按此公式测得Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE的米氏常数为 0.085mmol L^-1，此处较低的米氏常数 

远远小于文献中所报道的值，表明用该方法制作的传感器对辣根过化物酶有较高的活性，且具有更大的亲和力。 

将Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE对同一浓度H₂O₂溶液(0.1mmol L^-1)进行测定，重复6组数据的相对标准偏差(R.S.D.)为3.8％。用相同方法所制备的6支不同Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE电极，对H₂O₂溶液(0.1mmol L^-1)的电流检测的相对标准偏差为5.84％，这表明Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE有较好的重现性。 

将修饰好的电极Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE在pH为7.0的PBS溶液中在扫速为100mV^-1下进行循环扫描50圈，峰电位不变，峰电流仅下降1.3％。实验后将修饰电极于4℃下置于pH为7.0的PBS溶液中放置一周，其响应信号基本不变；20天后，其响应信号为初始信号的96％，一个月后，其响应信号仍为初始信号的92％，两个月后，其响应信号为初始信号的85％，这表明Nafion/HRP/Zn-IP₆/GCE具有较好的稳定性。 

实验结果表明该传感器具有令人满意的重现性和稳定性。 

上述电化学实验在CHI 660 D型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)上进行。场发射扫描电子显微镜(FESEM)图利用Hitachi S-4800型扫描电镜拍摄；光电子能谱图由XPS(PHI 5000 Versa Probe)得到；紫外-可见(UV-vis)光谱实验采用UV-8500型紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；其他仪器为FE20实验室pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；SK2200H超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。 

上述实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。 

Claims (2)

1.辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌-玻碳电极电化学生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将肌醇六磷酸钠与氯化锌在酸性溶液中，80～100℃下反应1～1.5h，冷却至室温，得喇叭花状肌醇六磷酸锌溶液；肌醇六磷酸钠与氯化锌的摩尔比为1:5～1:10；所述酸性溶液为pH为2～3的盐酸溶液；

（2）在玻碳电极表面滴加步骤（1）所制得的喇叭花状肌醇六磷酸锌溶液，晾干，得喇叭花状肌醇六磷酸锌修饰的玻碳电极；

（3）将辣根过氧化物酶溶液滴涂固定到步骤（2）所得喇叭花状肌醇六磷酸锌修饰的玻碳电极上，晾干，得辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌修饰的玻碳电极；HRP溶液为HRP的PBS溶液，溶液pH为7.0～7.5，HRP的浓度为4～6mg/mL；

（4）将全氟磺酸溶液滴加到步骤（3）所得的辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌修饰的玻碳电极上，晾干，即得目标产物辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌-玻碳电极电化学生物传感器；溶液全氟磺酸溶液为全氟磺酸的PBS溶液，浓度为1wt%～1.5wt%。

2.根据权利要求1制备的辣根过氧化物酶-喇叭花状肌醇六磷酸锌-玻碳电极电化学生物传感器，其特征在于，以玻碳电极为基底，基底上修饰有喇叭花状肌醇六磷酸锌并通过喇叭花状肌醇六磷酸锌将辣根过氧化物酶修饰在电极上，最外层修饰有保护辣根过氧化物酶生物活性的全氟磺酸。

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