CN102626405A - 紫杉醇在制备治疗egfr-tki获得性耐药性药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及本发明涉及紫杉醇在制备治疗非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药性药物中的应用。肺癌居全球肿瘤发病和癌症死亡率的第一位。吉非替尼和厄洛替尼在NSCLC中的疗效经常受到获得性耐药的限制，而目前已知的获得性耐药的主要机制为第二代EGFRT790M突变和MET基因获得性扩增。本发明表明，当出现EGFR-TKI获得性耐药后，紫杉醇可能逆转其耐药。也就是说对于那些已从厄洛替尼/吉非替尼治疗中产生获得获得性耐药性的非小细胞肺癌病人，经紫杉醇化疗后，可以再次考虑使用厄洛替尼/吉非替尼治疗，使得厄洛替尼/吉非替尼继续发挥功能，同时紫杉醇也可以对肿瘤进行抑制，从而发挥回转耐药性和协同作用。

Description

紫杉醇在制备治疗EGFR-TKI获得性耐药性药物中的应用

技术领域

本发明涉及紫杉醇在制备治疗非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药性药物中的应用。

背景技术

目前在肿瘤药物治疗过程中获得性耐药性成为世界难题，同时也是治疗肿瘤无效的原因。EGFR-TKI药物（厄洛替尼或吉非替尼）是晚期非小细胞肺癌治疗中非常重要的靶向药物，但其获得性耐药的出现限制了临床的应用，因此需要积极探索获得性耐药的形成机制。EGFR-TKI药物获得性耐药的机制目前仍未完全明确。已有的研究显示，EGFR-TKI获得性耐药的产生可能主要与以下两种机制有关：继发性外显子T790M突变和MET继发性扩增。目前T790M突变耐药研究已取得较好的结果，而对MET扩增所导致耐药的研究仍在探索中。MET癌基因信号扩增可致PI3K/AKT信号持续激活，活化的AKT可磷酸化它的下游分子，从而促进细胞增殖、细胞运动和侵袭、抑制细胞凋亡和导致EGFR-TKI耐药的产生。

到目前为止，没有特别有效的办法解决EGFR-TKI获得性耐药性难题。本发明通过多年研究发现紫杉醇可以治疗EGFR-TKI获得性耐药性发挥作用。

发明内容

发明目的

本发明提供了紫杉醇治疗EGFR-TKI获得性耐药性方面提供新的治疗方案或选择，为将来治疗提供新的思路和方法。

 

技术方案

紫杉醇在制备治疗EGFR-TKI获得性耐药性药物中的应用

有益效果

1、肺癌居全球肿瘤发病和癌症死亡率的第一位。吉非替尼和厄洛替尼在NSCLC中的疗效经常受到获得性耐药的限制，而目前已知的获得性耐药的主要机制为第二代EGFRT790M突变和MET基因获得性扩增。本发明表明，当出现EGFR-TKI获得性耐药后，紫杉醇可能逆转其耐药。也就是说对于那些已从厄洛替尼/吉非替尼治疗中产生获得获得性耐药性的非小细胞肺癌病人，经紫杉醇化疗后，可以再次考虑使用厄洛替尼/吉非替尼治疗，使得厄洛替尼/吉非替尼继续发挥功能，同时紫杉醇也可以对肿瘤进行抑制，从而发挥回转耐药性和协同作用。

具体来说通过CCK-8和流式结果发现，紫杉醇可以抑制肺癌EGFR-TKI耐药细胞株H1975﹑H820和A549增殖，并促进其凋亡。相关分析发现，肿瘤组织survivin表达与p-Akt表达成正相关。我们的Western blot结果提示紫杉醇作用后，H1975、PC-9和H820细胞MET、p-Akt，survivin蛋白的表达下调，而A549细胞未见三种蛋白表达，上述结果提示，H1975、PC-9和H820细胞凋亡与紫杉醇下调MET、p-Akt，survivin蛋白表达有关，A549细胞细胞耐药有其他机制参与。我们用Real-time PCR的方法检测了4种肺癌细胞紫杉醇作用前后miR-1的表达，结果发现，紫杉醇作用后miR-1在H1975﹑PC-9和H820细胞中的表达均较前明显升高，A549细胞中表达无明显变化，提示EGFR-TKI获得性耐药细胞株出现凋亡与microRNA-1（miR-1）表达上调有关。

其中所述的microRNA-1（miR-1）存在于大多数动物种系,特异性表达于心肌和骨骼肌细胞，通过作用于组蛋白去乙酰化酶4而促进成肌细胞分化，抑制细胞扩增。新近研究发现在支气管上皮细胞中表达miR-1，在肺癌肿瘤组织及细胞中其表达较低，转染miR-1后能够逆转肺癌细胞A549 and H1299的致瘤特性（包括生长、复制、迁移及肿瘤形成等），伴随诱导阿霉素对A549细胞诱发的凋亡；相反miR-1缺失会导致肿瘤细胞生长，提示miR-1在肺癌的发生、发展过程中发挥重要的抑癌基因的作用 。        

综上所述，细胞实验表明，紫杉醇对两种对EGFR-TKI获得性耐药的肺癌细胞敏感，而对EGFR-TKI原发性耐药的肺癌细胞无明显作用，对临床治疗TKI耐药的病人有指导意义，扩大了EGFR-TKI的应用范围。

附图说明

图1为IC50浓度紫杉醇对H1975﹑PC-9﹑H820和A549细胞MET、p-Akt,survivin蛋白表达的影响；

   图2. H1975﹑PC-9﹑H820和A549细胞中miR-1在IC50浓度紫杉醇作用前后的变化。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

1．细胞培养： H1975细胞为EGFR L858R-T790M突变型，对EGFR-TKI耐药；H820细胞具有MET扩增，对EGFR-TKI耐药；A549细胞表达野生型EGFR基因，EGFR-TKI耐药；PC-9系EGFR-TKI高度敏感细胞，上述H1975、H820、PC-9细胞购自ATCC(美国),A549细胞由本实验室保存。细胞培养应用RPMI-1640培养基(内含10％FBS、谷氨酰胺和青链霉索)传代培养细胞株H1975、H820、A549、PC-9。在37℃、含5% CO2的孵箱中进行细胞培养,每1～2天更换培养液1次。该四种细胞为贴壁细胞，当细胞生长到融合度为90％左右时，使用胰酶消化，并用吸管反复吹打使其离开培养瓶底壁，然后离心收集。收集到的细胞一半用于提取RNA，一半用于提取蛋白。

2、CCK-8法测细胞增殖抑制：选择对数生长期H1975﹑H820﹑A549和PC-9细胞，调整细胞数为2×10⁴个/mL接种于96孔培养板，每孔100μl。24h后加入药物(0, 1，2，4，8，16，32nmol/L)。同时设阴性对照组(培养液中不加药物)，空白对照组(加细胞不加培养液)。每组设5个复孔，在37℃、5% CO2培养箱中培养48h。检测时每孔加入CCK-8 10μl，温育1h后，于波长450nm酶标仪检测吸光度(A)值。实验重复3次并按下列公式计算肿瘤细胞抑制率，抑制率＝（1-实验孔平均OD值/对照孔平均OD值）×100%。

     实验结果：紫杉醇对H1975﹑H820﹑A549和PC-9细胞的生长抑制作用：

    不同浓度紫杉醇作用于肺癌H1975﹑H820﹑A549和PC-9细胞48h后，细胞生长明显抑制，呈现浓度依赖性，延长作用时间未见细胞生长抑制率有明显提高。如表1所示。

 

浓度（nM）

1

2

4

8

16

32

IC50

H1975

69.44 ±3.75

57.11±3.88

36.12 ±2.25

15.69 ±1.37

10.06±0.902

4.68±0.40

3.63±0.559

H820

89.58±4.29

84.2±4.88

62.85±4.49

18.29±1.52

8.81±0.86

1.98±0.18

5.05±0.217

A549

72.89±3.13

67.6±4.19

350.74±3.28

36.37±2.96

29.75±2.89

14.52±1.37

6.124±0.291

PC-9

81.84±4.74

78.71±5.06

61.04±2.94

30.68±2.45

14.85±1.33

7.01±0.65

5.786±0.258

                                       表1紫杉醇作用后的细胞生存率及IC50

Fig 1 The effect of paclitaxel on proliferation of H1975, H820 ,A549 and PC-9 cells. H1975, H820 ,A549 and PC-9 cells were treated for 48 h with varying concentrations (0, 1，2，4，8，16，32 nmol/L) of paclitaxel；

  CCK-8法：文献依据Shimamura T, Lowell AM, Engelman JA, et al..Epidermal growth factor receptors harboring kinase domain mutations associatewith the heat shock protein 90 chaperone and are destabilized following exposure to geldanamycins[J].Cancer Res,2005,65(14):6401-8.

 3、流式细胞术检测细胞凋亡率：将四种细胞分别分组为正常对照组，和紫杉醇处理组。用IC50浓度紫杉醇分别处理四种细胞，各细胞作用于紫杉醇48小时；每组重复3次。用不含EDTA的胰酶消化收集细胞（包括凋亡和坏死的细胞），收集细胞总数约106个，并迅速加入1～2ml含小牛的血清培养液中和胰酶（购自GIBCO公司，美国）。1000rpm离心3min，弃上清，PBS重悬，离心2次。加入500ul的Binding Buffer（购自BIPEC公司，美国）悬浮细胞；加入5ul Annexin V-FITC（购自BIPEC公司，美国）混匀后，加入5ul Propidium Iodine（购自BIPEC公司，美国），混匀。室温避光反应15min。1小时内上流式细胞仪检测凋亡率。用未经凋亡诱导处理的正常细胞作为荧光补偿调节。

    实验结果：流式细胞术检测细胞凋亡率

     IC50浓度紫杉醇作用于H1975﹑H820﹑A549和PC-9细胞48h后的凋亡率结果，如表2所示，紫杉醇可促进H1975﹑H820﹑A549和PC-9细胞凋亡。

组别	H1975	H820	A549	PC-9
					紫杉醇处理组	34.99±0.135	38.22±2.517	32.38±3.165	64.35±2.438
对照组	5.29±0.147	4.32±0.074	4.74±0.069	3.35±0.083。

表2. IC50浓度紫杉醇处理后的细胞凋亡率。

Fig 2 Effect of paclitaxel on induction of apoptosis in H1975, PC-9 , H820 and A549 cells. Cells were treated with paclitaxel at the concentration of IC50 for up to 48 h. 

4、 蛋白提取和Western blot：H1975﹑H820﹑A549和PC-9细胞于IC50浓度紫杉醇处理48后小时，弃去培养液，用冰PBS [10nmol/L, PH7.45 ]清洗两次。加入冰细胞裂解液 [50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，20 mmol/L NaF，0.5% NP 40，1% Triton X-100，1 mmol/L PMSF，临用前新鲜加入sigma公司的蛋白酶抑制剂I]，置于冰上裂解5分钟。收集细胞，置于离心管中，4℃下12000 r／min离心20分钟。收集上清，BCA试剂盒（购自碧云天公司，中国）测定蛋白含量，加入5×上样缓冲液（Loading Buffer）使成1×。样品于-80℃冻存。用于Western blot 实验，取30μg蛋白于7.5%、10%和12.3%分离胶上电泳，转膜至0.22或0.45μm的PVDF膜。膜上非特异性的位点用封闭液﹙5%脱脂奶粉或BSA，1%Tween-20的20 mmol/L的TBS溶液﹚室温下封闭2h，单克隆一抗（购自Cell Signaling Technology 公司，美国）4℃孵育过夜。TBST溶液清洗4次，每次10分钟，加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗（购自北京中杉公司，中国）室温下孵育2h。暗室内用ECL试剂盒显影，待蛋白条带显色清晰时，终止反应，曝光洗片。

    实验结果：紫杉醇对H1975﹑PC-9﹑H820和A549细胞MET、p-Akt、survivin蛋白表达的调节

     用Western blot检测H1975﹑PC-9﹑H820和A549细胞用IC50浓度紫杉醇前后MET、p-Akt、survivin蛋白的表达，结果显示（如图1）：H1975﹑PC-9和H820细胞MET、p-Akt、survivin蛋白，经紫杉醇处理后，表达量下降明显，而A549细胞未见三种蛋白表达。H1975﹑PC-9﹑H820三株肺癌细胞中MET、survivin蛋白表达和 Akt 磷酸化水平呈明显正相关(r≥0.997，P < 0.05) ,Akt 磷酸化水平愈高 ,MET、survivin蛋白表达愈高 ,反之亦然。

 5 、Real-time PCR： 应用Trizol提取总RNA。紫外分光光度计测O.D值，计算RNA的浓度。下面所有试剂或试剂盒均为ABI（AppliedBiosystems,USA）公司产品，将RNA用RT试剂盒（P/N 4366596) 在ABI Prism 7900HT系统中反转成cDNA。cDNA在特异的TaqMan探针hsa-miR-1（P/N: 4373090)和内参U6（P/N: 4373381）的参与下被进行定量检测。数据运用公式RQ=2-△△Ct进行分析,每种样本均经过3次独立实验验证。统计学方法 每次实验重复三次以上，数据资料用均数±标准差(±s)表示，用SPSS16.0进行统计学处理，P<0.05表示差异有统计学意义。

Claims (1)

1.紫杉醇在制备治疗EGFR-TKI获得性耐药性药物中的应用。

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